CN110536906A - 低黏度、高浓度的依伏库单抗配制品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含N‑乙酰基精氨酸且当与缺乏N‑乙酰基精氨酸的配制品相比时具有降低的黏度的PCSK9结合多肽的配制品，例如包含依伏库单抗的那些配制品。本文还提供了配制此类组合物的方法，因为这些方法保存某些组分而具有优势。可将此类包含PCSK9结合多肽的配制品给予至患者以治疗和/或预防PCSK9相关疾病、病状及病症。

Description

低黏度、高浓度的依伏库单抗配制品及其制备方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月22日提交的美国临时申请号62/462,266的权益，将其通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请连同电子格式的序列表一起提交。该序列表被提供为创建于2018年1月31日、标题为“A-2112-WO-PCT_sequence_listing_ST25.txt”的文件，并且大小是21KB。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文并入本文。
技术领域
所提出的主题涉及依伏库单抗(evolocumab)和其他PCSK9结合多肽的药物组合物的领域，以及降低此类组合物的黏度的方法。具体地，所提出的主题涉及包含N-乙酰基精氨酸的依伏库单抗和其他PCSK9结合多肽的药物组合物，以及N-乙酰基精氨酸减少高浓度依伏库单抗和其他PCSK9结合多肽配制品的黏度的用途。此外，所披露的主题提出了关于制备此类药物组合物的方法。
背景技术
治疗抗体在用于例如胃肠外注射的给予的溶液中配制。关于在自给予中经皮下给予的产品，需要大于1-2毫升的递送体积的配制品耐受不良。为了解决此问题，抗体能以高浓度(例如70mg/mL至210mg/mL或更大)配制，由此降低剂量的大小。
然而，一些高度浓缩的抗体配制品可成为制造和给予的挑战。例如，在与PCSK9结合的单克隆抗体依伏库单抗()的配制中，超过约70mg/mL的依伏库单抗浓度具有增加的黏度。然而，依伏库单抗的有效剂量为210mg Q2W或420mg Q4W。高黏度配制品不仅难以在制造期间(包括在堆积和填充阶段)处置，而且其难以进入注射器中和注射，使得难以向患者给予且使人不愉快。
为了降低抗体配制品的黏度，未经修饰的精氨酸、甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸氨基酸已添加至抗体组合物中。例如，含有80mg/mL的抗体和75mg/mL至约125mg/mL的精氨酸的抗体配制品可冻干且重构至120-200mg/mL；最终精氨酸浓度可为431mM至718mM(Morichika和Kameoka,2007)。当与对照物相比时，精氨酸降低这些配制品的黏度(Morichika和Kameoka,2007)。此外，精氨酸的效应不足以降低依伏库单抗黏度至所需水平。
本领域中需要用比精氨酸更有效的化合物降低含依伏库单抗和其他PCSK9结合多肽的配制品的黏度。
发明内容
在第一方面中，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含
a.PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
以及
b.N-乙酰基精氨酸，
其中该药物组合物具有至少小于约80cP的黏度。在该第一方面中，该PCSK9结合多肽可为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。此外，在此第一方面中，该药物组合物可具有至少小于约50cP的黏度。该药物组合物可具有约250至约400mOsm/kg，例如约300mOsm/kg的重量渗透浓度，或对人血细胞等渗。该PCSK9结合多肽的浓度可为约140mg/mL至约260mg/mL，例如210mg/mL。该N-乙酰基精氨酸能以约25mM至约230mM，例如140mM至约170mM或140mM的浓度存在。此方面的药物组合物可进一步包含缓冲液，例如选自由乙酸盐、谷氨酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲液或其组合组成的组的缓冲液。该缓冲液能以约5mM至约30mM的浓度存在。在一些情况下，该缓冲液为乙酸钠且以约10mM的浓度存在。此类药物组合物的pH可为约4.8至约6.9，例如约5.4的pH。此方面的药物组合物可进一步包含表面活性剂，例如选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命ETPGS)组成的组的表面活性剂。该表面活性剂能以约0.0001％(w/v)至约1％(w/v)的浓度存在。在此方面的一些药物组合物中，该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)且以约0.01％(w/v)的浓度存在。此外，此方面的药物组合物可进一步包含脯氨酸，其能以约50mM至约150mM，例如90至120mM或约120mM的浓度存在。在一些情况下，此第一方面的药物组合物可进一步包含精氨酸盐，其能以约25mM至约150mM，例如约50mM至约100mM的浓度存在。该精氨酸盐可为例如精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐。在一些情况下，该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐且以约50mM的浓度存在。当在约-30℃或更冷情况下储存于此第一方面的药物组合物中时，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少约两年或甚至五年或更久。在5℃下，该PCSK9结合多肽可在此类药物组合物中稳定持续至少约六个月至约24个月或更久。在25℃下，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少约一个月或更久、三个月或更久或甚至六个月或更久。在40℃下，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少一个月或更久。此第一方面的药物组合物可包含PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物，占总的PCSK9结合多肽浓度的小于约3％，例如2.5％或更少。
在第二方面中，本文披露了一种药物组合物，该药物组合物包含
a.PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
和
b.N-乙酰基精氨酸；
c.精氨酸盐；
d.缓冲液；和
e.表面活性剂
其中该药物组合物具有至少小于约80cP的黏度。
在此第二方面中，该PCSK9结合多肽为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
此第二方面的药物组合物可具有至少小于约50cP的黏度。该药物组合物可具有约250至约400mOsm/kg，例如约300mOsm/kg的重量渗透浓度，或对人血细胞等渗。该PCSK9结合多肽的浓度可为约140mg/mL至约260mg/mL，例如210mg/mL。该N-乙酰基精氨酸能以约25mM至约230mM，例如140mM至约170mM或140mM的浓度存在。此方面的药物组合物可进一步包含缓冲液，例如选自由乙酸盐、谷氨酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲液或其组合组成的组的缓冲液。该缓冲液能以约5mM至约30mM的浓度存在。在一些情况下，该缓冲液为乙酸钠且以约10mM的浓度存在。此类药物组合物的pH可为约4.8至约6.9，例如约5.4的pH。此方面的药物组合物可进一步包含表面活性剂，例如选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)组成的组的表面活性剂。该表面活性剂能以约0.0001％(w/v)至约1％(w/v)的浓度存在。在此方面的一些药物组合物中，该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)且以约0.01％(w/v)的浓度存在。此外，此方面的药物组合物可进一步包含脯氨酸；该脯氨酸能以约50mM至约150mM，例如90至120mM或约120mM的浓度存在。在一些情况下，此第二方面的药物组合物可进一步包含精氨酸盐，其能以约25mM至约150mM，例如约50mM至约100mM的浓度存在。该精氨酸盐可为例如精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐。在一些情况下，该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐且以约50mM的浓度存在。当在约-30℃或更冷情况下储存于此第二方面的药物组合物中时，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少约两年或甚至五年或更久。在5℃下，该PCSK9结合多肽可在此类药物组合物中稳定持续至少约六个月至约24个月或更久。在25℃下，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少约一个月或更久、三个月或更久或甚至六个月或更久。在40℃下，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少一个月或更久。此第二方面的药物组合物可包含PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物，占总的PCSK9结合多肽浓度的小于约3％，例如2.5％或更少。
在第三方面中，本文披露了一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
b.以约140mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
c.以约50mM的浓度存在的精氨酸盐酸盐；
d.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％(w/v)的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
e.浓度为约10mM的乙酸钠。
在此第三方面中，该药物组合物可具有约5.1至约5.7的pH，例如约5.4的pH。该药物组合物可具有至少小于约50cP的黏度。
在第四方面中，本文披露了一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
b.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
c.以约140mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
d.以约63mM的浓度存在的精氨酸盐酸盐；
e.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
f.浓度为约10mM的乙酸钠。
在此第四方面中，该药物组合物可具有约5.1至约5.7的pH，例如约5.4的pH。该药物组合物可具有至少小于约80cP的黏度。
在第五方面中，本文披露了一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
b.以约155mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
c.以约70mM的浓度存在的精氨酸盐酸盐；
d.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％(w/v)的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
e.浓度为约10mM的乙酸钠。
在此第五方面中，该药物组合物可具有约5.1至约5.7的pH，例如约5.4的pH。该药物组合物可具有至少小于约45cP的黏度。
在第六方面中，本文披露了一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
b.以约170mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
c.以约63mM的浓度存在的精氨酸盐酸盐；
d.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
e.浓度为约10mM的乙酸钠。
在此第六方面中，该药物组合物可具有约5.1至约5.7的pH，例如约5.4的pH。该药物组合物可具有至少小于约60cP的黏度。
在第七方面中，本文披露了一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
b.以约155mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
c.以约120mM的浓度存在的脯氨酸；
d.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％(w/v)的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
e.浓度为约10mM的乙酸钠。
在此第七方面中，该药物组合物可具有约5.1至约5.7的pH，例如约5.4的pH。该药物组合物可具有至少小于约60cP的黏度。
在这些第三至第七方面中，当在约-30℃或更冷情况下储存于这些方面的药物组合物中时，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少约两年或甚至五年或更久。在5℃下，该PCSK9结合多肽可在此类药物组合物中稳定持续至少约六个月至约24个月或更久。在25℃下，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少约一个月或更久、三个月或更久或甚至六个月或更久。在40℃下，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少一个月或更久。这些方面的药物组合物可包含PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物，占总的PCSK9结合多肽浓度的小于约3％，例如2.5％或更少。
在前述方面中的任一个中，该药物组合物可为液体。
在第八方面中，本文披露了一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括给予如前述第七方面所述的药物组合物。
在第九方面中，本文披露了一种试剂盒，该试剂盒包含第一至第七方面中的任一个的药物组合物和递送装置。该递送装置可选自由注射器、注射笔、主体注射器和自动注射器组成的组。该试剂盒可进一步包含关于使用该递送装置给予该药物组合物的说明书。
在第十方面中，本文披露了一种制备包含至少140mg/mL的PCSK9结合多肽的PCSK9结合多肽药物组合物的方法，该方法包括向包含该PCSK9结合多肽的药物组合物中添加有效量的N-乙酰基精氨酸，使得当与缺乏N-乙酰基精氨酸的该药物组合物相比时，该药物组合物的黏度降低，并且其中该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
a.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
b.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
c.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
i.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
ii.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
d.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；和
e.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
i.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
ii.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
iii.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠。
在此第十方面中，该药物组合物的黏度小于约80cP，或小于约50cP。此方面的方法的药物组合物可具有约250至约400mOsm/kg，例如约300mOsm/kg的重量渗透浓度，或对人血细胞等渗。该PCSK9结合多肽的浓度可为约140mg/mL至约260mg/mL，例如210mg/mL。该N-乙酰基精氨酸能以约25mM至约230mM，例如140mM至约170mM或140mM的浓度存在。此方面的药物组合物可进一步包含缓冲液，例如选自由乙酸盐、谷氨酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲液或其组合组成的组的缓冲液。该缓冲液能以约5mM至约30mM的浓度存在。在一些情况下，该缓冲液为乙酸钠且以约10mM的浓度存在。此类药物组合物的pH可为约4.8至约6.9，例如约5.4的pH。此方面的药物组合物可进一步包含表面活性剂，例如选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)组成的组的表面活性剂。该表面活性剂能以约0.0001％(w/v)至约1％(w/v)的浓度存在。在此方面的一些药物组合物中，该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)且以约0.01％(w/v)的浓度存在。此外，此方面的药物组合物可进一步包含脯氨酸；该脯氨酸能以约50mM至约150mM，例如90至120mM或约120mM的浓度存在。在一些情况下，此第十方面的药物组合物可进一步包含精氨酸盐，其能以约25mM至约150mM，例如约50mM至约100mM的浓度存在。该精氨酸盐可为例如精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐。在一些情况下，该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐且以约50mM的浓度存在。当在约-30℃或更冷情况下储存于此第十方面的药物组合物中时，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少约两年或甚至五年或更久。在5℃下，该PCSK9结合多肽可在此类药物组合物中稳定持续至少约六个月至约24个月或更久。在25℃下，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少约一个月或更久、三个月或更久或甚至六个月或更久。在40℃下，该PCSK9结合多肽可稳定持续至少一个月或更久。此第十方面的药物组合物可包含PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物，占总的PCSK9结合多肽浓度的小于约3％，例如2.5％或更少。
在第十一方面中，本文披露了一种配制治疗性多肽的方法，该方法包括
a.第一浓缩步骤，其中浓缩第一溶液中的该多肽；
b.第一溶液交换步骤，其中使用透滤将该第一溶液中经浓缩的多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第二溶液中；
c.第二浓缩步骤，其中浓缩该第二溶液中的该多肽；
d.第二溶液交换步骤，其中使用透滤将经浓缩的第二溶液中的该多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第三溶液中；和
e.第三浓缩步骤，其中浓缩该第三溶液中的该多肽；
其中该治疗性多肽包含PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽阻断PCSK9与LDLR结合并且选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGFa结构域的位点重叠。
在此第十一方面的方法中，阻断PCSK9与LDLR结合的该PCSK9结合多肽可为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
此外，在此第十一方面中，在第三浓缩步骤之前，该包含该多肽的溶液的温度可增加至约25℃至约37℃。此外，第一溶液交换步骤可使用至少三个置换体积的该第二溶液来实现。在此第十一方面的一些子方面中，第二溶液交换步骤使用至少四个置换体积的该第三溶液来实现。在其他子方面中，该治疗蛋白的初始浓度为约11mg/mL或更少。另外，治疗性多肽浓度可增加约3倍至约7倍，例如其中该多肽的增加的浓度为约35mg/mL至约70mg/mL。在一些子方面中，在第二浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从第一浓缩步骤增加约2倍至4倍，例如至约140mg/mL。在第三浓缩步骤中，治疗性多肽浓度可从第二浓缩步骤增加约1.5倍至约2倍，例如至约260mg/mL。该治疗性多肽可因此具有与该治疗性多肽的初始浓度相比进一步浓缩至少约19-20倍的最终浓度，例如约210mg/mL。这些浓缩步骤可包含分批补料超滤；此外，该第二溶液和该第三溶液可为同一的。例如，包含N-乙酰基精氨酸的第二或第三溶液可包含精氨酸盐和缓冲液，其中例如，该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM的浓度存在；该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐且以约25mM至约150mM的浓度存在；并且该缓冲液为浓度为约5mM至约30mM的乙酸钠缓冲液。在其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约140至约170mM的浓度存在；该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63至约70mM的浓度存在并且该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。在又其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约140mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。在其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约155mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约70mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。在又其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约170mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。此外，该组合物可进一步包含脯氨酸，其中该脯氨酸以约50mM至约150mM的浓度存在。该第二或第三溶液可具有约4.8至约6.9的pH，例如5.4。在第一和第二溶液交换步骤中，可使用透滤膜，该透滤膜具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
a.大于约350μm但小于或等于约500μm的网眼；
b.大于膜面积的约32％但小于或等于约36％的开放面积；
c.小于约16.2n/cm但大于或等于约12.2n/cm的网目数；
d.大于约270μm但小于或等于约340μm的网线直径；
e.大于约160g/m2但小于或等于180g/m2的基础重量；
f.大于约515μm但小于或等于约610μm的厚度；
g.大于约1138.1g/m2但小于或等于约1919.3g/m2的膜负载；和
h.约60psi的最大补料压力。
此外，表面活性剂可在该第三溶液浓缩之后添加至其中，例如选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)组成的组的表面活性剂。该表面活性剂能以约0.0001％(w/v)至约1％(w/v)的浓度存在。在此方面的一些药物组合物中，该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)且以约0.01％(w/v)的浓度存在。
在第十二方面中，本文披露了一种配制治疗性多肽的方法，该方法包括
a.第一浓缩步骤，其中使用分批补料超滤来浓缩第一溶液中的该多肽；
b.第一溶液交换步骤，其中使用透滤和三个置换体积的第二溶液将该第一溶液中经浓缩的多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸、精氨酸盐和缓冲液的该第二溶液中；
c.第二浓缩步骤，其中使用分批补料超滤来浓缩该第二溶液中的该多肽；
d.第二溶液交换步骤，其中使用透滤将经浓缩的第二溶液中的该多肽和四个置换体积的第三溶液交换至包含N-乙酰基精氨酸、精氨酸盐和缓冲液的该第三溶液中；
e.在该第二溶液交换步骤之后，增加该包含该多肽的溶液的温度至约25℃至约37℃；和
f.第三浓缩步骤，其中使用分批补料超滤浓缩进一步浓缩该多肽；
其中在第一和第二溶液交换步骤中，使用透滤膜，该透滤膜具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
a.大于约350μm但小于或等于约500μm的网眼；
b.大于膜面积的约32％但小于或等于约36％的开放面积；
c.小于约16.2n/cm但大于或等于约12.2n/cm的网目数；
d.大于约270μm但小于或等于约340μm的网线直径；
e.大于约160g/m2但小于或等于180g/m2的基础重量；
f.大于约515μm但小于或等于约610μm的厚度；
g.大于约1138.1g/m2但小于或等于约1919.3g/m2的膜负载；和
h.约60psi的最大补料压力；
并且
其中该治疗性多肽包含PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽阻断PCSK9与LDLR结合并且选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGFa结构域的位点重叠。
此外，在此第十二方面中，第一溶液交换步骤可使用至少三个置换体积的该第二溶液来实现。在此第十二方面的一些子方面中，第二溶液交换步骤使用至少四个置换体积的该第三溶液来实现。在其他子方面中，该治疗蛋白的初始浓度为约11mg/mL或更少。另外，治疗性多肽浓度可增加约3倍至约7倍，例如其中该多肽的增加的浓度为约35mg/mL至约70mg/mL。在一些子方面中，在第二浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从第一浓缩步骤增加约2倍至4倍，例如至约140mg/mL。在第三浓缩步骤中，治疗性多肽浓度可从第二浓缩步骤增加约1.5倍至约2倍，例如至约260mg/mL。该治疗性多肽可因此具有与该治疗性多肽的初始浓度相比进一步浓缩至少约19-20倍的最终浓度，例如约210mg/mL。这些浓缩步骤可包含分批补料超滤；此外，该第二溶液和该第三溶液可为同一的。该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM的浓度存在；该精氨酸盐可为精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐，其中该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约25mM至约150mM的浓度存在；并且该缓冲液为浓度为约5mM至约30mM的乙酸钠缓冲液。在其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约140至约170mM的浓度存在；该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63至约70mM的浓度存在并且该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。在又其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约140mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。在其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约155mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约70mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。在又其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约170mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。此外，该组合物可进一步包含脯氨酸，其中该脯氨酸以约50mM至约150mM的浓度存在。该第二或第三溶液可具有约4.8至约6.9的pH，例如5.4。此外，表面活性剂可在该第三溶液浓缩之后添加至其中，例如选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)组成的组的表面活性剂。该表面活性剂能以约0.0001％(w/v)至约1％(w/v)的浓度存在。在此方面的一些药物组合物中，该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)且以约0.01％(w/v)的浓度存在。
在第十三方面中，本文披露了一种配制治疗性多肽的方法，该方法包括
a.第一浓缩步骤，其中使用分批补料超滤来浓缩第一溶液中的该多肽；
b.第一溶液交换步骤，其中使用透滤将该第一溶液中经浓缩的多肽和三个置换体积的第二溶液交换至该第二溶液中；
c.第二浓缩步骤，其中使用分批补料超滤来浓缩该第二溶液中的该多肽；
d.第二溶液交换步骤，其中使用透滤和四个置换体积的第三溶液将经浓缩的第二溶液中的该多肽交换至该第三溶液中；
e.在该第二溶液交换步骤之后，增加该包含该多肽的溶液的温度至约25℃至约37℃；和
f.第三浓缩步骤，其中使用分批补料超滤浓缩进一步浓缩该多肽；
g.可替代地，添加浓度为约0.01％(w/v)的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)至该第三浓缩步骤的所得溶液中的步骤，
其中该第二和第三溶液包含选自由以下组成的组的溶液：包含约140mM N-乙酰基精氨酸、约50mM精氨酸盐酸盐和约10mM乙酸钠的溶液，该溶液具有约5.2的pH；包含约155mMN-乙酰基精氨酸、约70mM精氨酸盐酸盐和约10mM乙酸钠的溶液，该溶液具有约5.4的pH；和包含约170mM N-乙酰基精氨酸、约10mM乙酸钠的溶液，该溶液具有约5.6的pH；
其中在第一和第二溶液交换步骤中，使用透滤膜，该透滤膜具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
a.大于约350μm但小于或等于约500μm的网眼；
b.大于膜面积的约32％但小于或等于约36％的开放面积；
c.小于约16.2n/cm但大于或等于约12.2n/cm的网目数；
d.大于约270μm但小于或等于约340μm的网线直径；
e.大于约160g/m2但小于或等于180g/m2的基础重量；
f.大于约515μm但小于或等于约610μm的厚度；
g.大于约1138.1g/m2但小于或等于约1919.3g/m2的膜负载；和
h.约60psi的最大补料压力；
并且
其中该治疗性多肽包含PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽阻断PCSK9与LDLR结合并且选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGFa结构域的位点重叠。
附图说明
图1显示在40℃下孵育1个月之后在含有N-乙酰基精氨酸的多种配制品中的高浓度依伏库单抗样品的尺寸排阻层析-高压液相层析(SE-HPLC)的数据图。配制品的关键在x轴上指示：[乙酸盐(mM)]/[N-乙酰基精氨酸(mM)]/[脯氨酸(mM)]。Y轴指示作为高分子量(HMW)物质(依伏库单抗的聚集体和寡聚物)的样品的百分比。
图2显示在25℃下在210mg/mL–1000sec-1剪切速率下依伏库单抗的配制品黏度比较图。
图3A显示由JMP Prediction Profiler软件产生的在40℃下保持一个月的依伏库单抗配制品的SE-HPLC数据图。图3B显示相似数据，除了样品在25℃下保持三个月。
图4显示由在40℃下保持一个月的210mg/mL依伏库单抗配制品的SE-HPLC产生的HMW物质百分比的条形图。配制品随N-乙酰基精氨酸的浓度和精氨酸盐酸盐浓度变化，处于变化的pH下。图5A-5C显示所选择的pH4.8和pH5.4依伏库单抗样品的SE-HPLC层析图，该样品在所指示的温度和时间下(5℃持续六个月(图5A)；25℃持续三个月(图5B)；和40℃持续一个月(图5C))保持且与依伏库单抗脯氨酸配制对照物相比。配制品的关键：[乙酸盐(mM)]/[N-乙酰基精氨酸(mM)]/[精氨酸盐酸盐(mM)]。
图6A和6B显示针对在所指示的温度下(5℃(图6A)；25℃(图6B))保持的所指示的依伏库单抗配制品随时间产生的HMW物质的百分比图。所测试的210mg/mL的依伏库单抗N-乙酰基精氨酸配制品与140mg/mL的依伏库单抗脯氨酸配制对照物相比。配制品的关键：[乙酸盐(mM)]/[N-乙酰基精氨酸(mM)]/[精氨酸盐酸盐(mM)]。
图7A显示由JMP Prediction Profiler软件产生的在40℃下保持一个月的依伏库单抗配制品的阳离子交换层析-高压液相层析(CEX-HPLC)数据图。图7B显示相似数据，除了样品在25℃下保持三个月。关于进一步详情，参见实例。
图8显示由在40℃下保持一个月的210mg/mL依伏库单抗配制品的CEX-HPLC产生的酸性峰百分比的图。
图9A-9B显示如通过光阻液载粒子计数(等于或大于10μM，图9A；或等于或大于25μM，图9B)所确定的，每毫升在5℃、25℃和40℃下保持三个月的多种依伏库单抗配制品的不可见粒子的图。图9C显示如通过光阻液载粒子计数(大于或等于10μM或25μM)所确定的，在5℃或25℃下保持六个月的多种依伏库单抗配制品的不可见粒子的图。
图10显示如通过微流成像(MFI)分析所确定的，通过小于0.70的纵横比(AR)过滤的多种依伏库单抗配制品的不可见粒子的图。
图11显示保持规定的时间和温度的多种依伏库单抗配制品的黏度的概述图，如其中T0表示初始黏度值所指示。
图12显示图和表格，其显示了pH和缓冲液彼此不同的依伏库单抗配制品随时间(长达三个月)的pH值。样品保持在40℃下。
图13A-13C显示SE-HPLC数据图，其证明了在4℃(图13A)、25℃(图13B)和40℃(图13C)下持续长达三个月，pH对pH和缓冲液不同的210mg/mL依伏库单抗配制品的HMW物质百分比的影响。除了10mM各列出的缓冲液以外，样品均含有165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。
图14显示在配制之后即刻在变化pH下的依伏库单抗配制品的寡聚物水平图。
图15显示层析图，该层析图显示了pH和缓冲液不同的依伏库单抗配制品在40℃下保持三个月之后的蛋白分子的多种大小。(LMW＝低分子量物质)。
图16A-16C显示pH和缓冲液不同的210mg/mL依伏库单抗配制品随时间的CEX-HPLC分析(％主峰)的数据图。图16A显示在5℃下保持的样品随时间的主峰百分比，而图16B显示在25℃下保持的样品的相同类型数据且图16C显示在40℃下保持的样品的相同类型数据。除了10mM各列出的缓冲液以外，样品均含有165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。
图17显示在40℃下保持的pH和缓冲液不同的210mg/mL依伏库单抗配制品随时间的CEX-HPLC分析的数据图，测量了酸性物质在这些配制品中的百分比。除了10mM各列出的缓冲液以外，样品均含有165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。
图18显示在25℃下保持三个月的pH和缓冲液不同的210mg/mL依伏库单抗配制品的CEX-HPLC数据的层析图，显示了酸性和碱性以及主峰物质。除了10mM各列出的缓冲液以外，样品均含有165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。
图19显示pH和缓冲液不同的多种依伏库单抗配制品的肽定位数据的层析图，该样品已在40℃下保持一个月。除了10mM各列出的缓冲液以外，样品均含有165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。
图20显示概述了数项实验的结果的图，该实验分析了在40℃下1个月之后在pH和缓冲液不同的配制品中的依伏库单抗。所有样品均含有10mM缓冲液、165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。关于进一步详情，参考该图和实例。
图21A-21B显示如通过光阻液载粒子计数(等于或大于10μM，图21A；或等于或大于25μM，图21B)所确定的，每毫升在5℃、25℃和40℃下保持两个月的pH和缓冲液不同的多种依伏库单抗配制品的不可见粒子的图。图21C-21D显示在5℃或25℃下保持六个月的pH和缓冲液不同的依伏库单抗配制品的不可见粒子(大于或等于10μM，图21C；大于或等于25μM，图21D)的图。除了10mM各列出的缓冲液以外，样品均含有165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。
图22显示如通过微流成像(MFI)所确定，pH和缓冲液不同的依伏库单抗配制品的不可见粒子的图。除了10mM各列出的缓冲液以外，样品均含有165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。
图23显示对在25℃下保持6个月的pH和缓冲液变化的210mg/mL依伏库单抗配制品进行的降低的毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rCE-SDS)分析的结果图。除了10mM各列出的缓冲液以外，样品均含有165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。
图24显示pH和缓冲液不同的依伏库单抗配制品的黏度与pH之间的关系的图。所有样品均含有10mM缓冲液、165mM N-乙酰基精氨酸、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％聚山梨醇酯-80。
图25A-25C显示如通过在5℃(图25A)、25℃(图25B)和40℃(图25C)下保持所指示的时间的不同依伏库单抗配制品的SE-HPLC所测量的HMW物质百分比的图。配制品的关键：[乙酸盐(mM)]/[N-乙酰基精氨酸(mM)]/[精氨酸盐酸盐(mM)]。
图26A-26C显示如通过在5℃(图26A)、25℃(图26B)和40℃(图26C)下保持所指示的时间的不同依伏库单抗配制品的CEX-HPLC所测量的酸性峰百分比的图。配制品的关键：[乙酸盐(mM)]/[N-乙酰基精氨酸(mM)]/[精氨酸盐酸盐(mM)]。
图27显示与初始水平(T0)相比，通过在5℃、25℃和40℃下保持三个月的不同依伏库单抗配制品的降低的毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rCE-SDS)获得的Pre–LC+LC+HC(LC＝轻链，HC＝重链)百分比的图。配制品的关键：[乙酸盐(mM)]/[N-乙酰基精氨酸(mM)]/[精氨酸盐酸盐(mM)]。
图28显示三种不同浓度的依伏库单抗的不同依伏库单抗配制品的黏度图；黏度数据在所指示的温度下使用流变仪在高达90,000sec-1的剪切速率下确定。配制品的关键：[乙酸盐(mM)]/[N-乙酰基精氨酸(mM)]/[精氨酸盐酸盐(mM)]。
图29显示三种NAR配制品缓冲液中的依伏库单抗UF/DF通量数据的图。
图30显示在UF1/DF1(UF/DF-70和UF/DF-35)中在具有35mg/mL和70mg/mL的依伏库单抗的依伏库单抗UF/DF过程中HMW物质形成百分比的图。该图还显示在针对该两种初始浓度的依伏库单抗的过程的各步骤中以mg/mL计的依伏库单抗浓度。
图31A-31F显示在pH5.2(图31A和31B)、pH5.4(图31C和31D)和pH5.6(图31E和31F)下含NAR配制品中的依伏库单抗的SE-HPLC(图31A、31C和31E)和CEX-HPLC(图31B、31D和31F)的图。这些图还显示在UF/DF过程期间在多个步骤处的HMW物质百分比、LMW物质百分比和依伏库单抗百分比。
图32显示来自在2℃-8℃和室温下的池保持研究的依伏库单抗NARDS样品的HMW物质形成百分比。
图33显示来自在高温下的池保持研究的依伏库单抗NAR OC样品的HMW物质形成百分比的图
图34显示在不同温度下依伏库单抗NAR配制品的黏度测量值的图。
图35A-35C显示用于实例9的所有研究配制品在4℃(图35A)、25℃(图35B)和40℃(图35C)下孵育长达6个月之后的SE-HPLC数据图。图35D展示呈条形图的40℃SE-HPLC数据(在图35C中显示为线图)，使得配制品之间的聚集水平的比较更加可辨识。
图36A-36F显示用于实例9的研究配制品的CEX-HPLC数据图，显示了在4℃(图36A(％酸性)、图36B(％碱性))、25℃(图36C(％酸性)、图36D(％碱性))和40℃(图36E(％酸性)、图36F(％碱性))下孵育长达三个月之后％酸性和％碱性峰随时间的改变。
图37A-37D显示在30℃(图37A(％主峰)、图37B(％LMW物质))和40℃(图37C(％主峰)、图37D(％LMW物质))下孵育长达三个月之后用于实例9的研究配制品随时间的％主峰和％LMW物质的rCE-SDS数据图。
图38A-38D显示在4℃和40℃下孵育长达三个月之后用于实例9的研究配制品通过使用HIAC的光阻粒子计数获得的不可见粒子数据图。图38A：HIAC-≥10μm-4℃；图38B：HIAC-≥25μm-4℃；图38C：HIAC-≥10μm-40℃；和HIAC-≥25μm-40℃。
具体实施方式
诸位发明人已意外地发现，与未乙酰化精氨酸相比，精氨酸衍生物N-乙酰基精氨酸(NAR)更加有效地降低包含高浓度(大于100mg/mL，例如140mg/mL和更大)依伏库单抗的药物组合物的黏度。具有50cP或更低黏度的药物组合物经得起制造和患者给予而无显著复杂化，而较高黏度制剂难以处置(例如当注射器经填充时)和给予。虽然已知未经修饰的精氨酸会降低高蛋白浓度配制品的黏度，但精氨酸谷氨酸盐仅降低可相当的含脯氨酸依伏库单抗(210mg/mL)配制品的黏度达50cP(从159cP至109cP)，实质上高于50cP或更低的靶标。此外，单独精氨酸单盐酸盐(精氨酸盐酸盐)添加不会实现此目的，使该含脯氨酸配制品的黏度从159cP降低至70cP。然而，NAR实现进一步降低黏度至58cP的意外效应—相对于脯氨酸配制品超过101cP的降低，并且当与精氨酸盐酸盐组合(以增加NAR的溶解度且实现等渗配制品)时，实现低于50cP的黏度；实际上，该目的经超出7cP，该配制品具有43cP的黏度。参见图2。由于NAR溶解度局限于低于230mM，必需另一赋形剂来实现用于皮下给予的等渗配制品。精氨酸的盐酸盐比例如谷氨酸盐的其他精氨酸盐更有效降低依伏库单抗黏度的意外发现对于使配制品黏度降至最低至关重要。
另一意外发现在于在NAR和精氨酸盐酸盐存在下可见的pH依赖性依伏库单抗稳定性和黏度效应。在高温下在低于5.0的pH下可见依伏库单抗聚集速率的显著增加。此外，随着pH从pH5.1增加至6.9，观察到黏度的pH依赖性减少。
诸位发明人进一步发现，两步骤超滤/透滤(UF/DF)过程可制备该含NAR、高依伏库单抗浓度药物配制品，与传统一步骤传统过程相比NAR材料具有显著节省。该方法允许显著成本节省，因为NAR比精氨酸盐酸盐贵约十倍。
定义
前述一般描述和以下详细描述均仅为示例性和解释性的且不具限制性。除非另外特定地规定，否则单数的使用包括复数。除非另外规定，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式(例如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不具限制性。除非另外特定地规定，否则例如“元素”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的元素和组分与包含超过一个子单元的元素和组分。术语“部分(portion)”的使用可包括一种部分(moiety)的部分或整个部分。当提及数值范围(例如，1-5)时，明确地包括所有介于中间的值，例如1、2、3、4和5，以及其分数，例如1.5、2.2、3.4和4.1。
“约(About)”或“约(～)”意指当修饰一个量时(例如，“约”3mM)，围绕该经修饰的量的变化可发生。这些变化可通过多种方式，例如典型测量和处置程序、因疏忽所致的错误、成分纯度及其类似方式而发生。
“N-乙酰基精氨酸”(NAR)意指式1的分子。
在药物组合物的情况下，“添加剂”意指天然地并非材料(例如，原料药)的部分而是故意地添加以实现一些特定目的(例如，保藏、黏度降低、稳定化)的物质。
“类似物”是指相对于亲本序列具有插入、缺失或取代，同时如使用生物分析所确定的仍实质上维持亲本序列的生物活性的氨基酸序列。类似物包括具有经修饰糖基化的多肽、无糖基化的多肽。配制品还可包括天然地存在或类似物多肽的衍生物，该衍生物已经化学修饰，例如以附接水溶性聚合物(例如，PEG化)、放射性核素或其他诊断或靶向或治疗部分。
“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白，并且包括例如嵌合、人源化、人和双特异性抗体。完整抗体一般将包含至少两条全长重链和两条全长轻链。抗体序列可单独地来源于单一物质，或可为“嵌合的”，即，该抗体的不同部分可来源于两种不同物质。“抗体”还包括包含两条实质上全长重链和两条实质上全长轻链的抗体，条件是这些抗体保持与包含两条全长轻链和重链的抗体相同或相似的结合和/或功能。例如，在重链和/或轻链的N-末端和/或C-末端处具有1、2、3、4或5个氨基酸残基取代、插入或缺失的抗体包括在定义中，条件是这些抗体保持与包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体相同或相似的结合和/或功能。抗体包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体和合成抗体。
典型抗体结构单元包含四聚体。每个这样的四聚体典型地由两对同一的多肽链构成，每对具有一条全长“轻”链(约25kDa)和一条全长“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分典型地包括约100或110个或更多个氨基酸的可变区，该可变区典型地负责抗原识别。每条链的羧基末端部分典型地限定可负责效应子功能的恒定区。轻链典型地分类为κ和λ轻链。重链典型地分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG抗体具有数种亚类，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有包括IgM1和IgM2的亚类。IgA类似地细分为包括IgA1和IgA2的亚类。在全长轻链和重链内，典型地，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约十个或更多个氨基酸的“D”区。每个轻链/重链对的可变区典型地形成抗原结合位点。
该可变区典型地展现由三个高变区(还称作互补决定区或CDR)连接的相对保守框架区(FR)的相同的一般结构。来自每对的两条链的CDR典型地通过框架区比对，其可实现结合至特定表位。从N-末端至C-末端，轻链可变区和重链可变区均典型地包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸指派给各结构域典型地是根据Kabat(Kabat,Wu,Perry,Gottesman和Foeller,1991；Kabat,Wu,Reid-Miller,Perry和Gottesman,1987)或Chothia(Chothia和Lesk,1987；Chothia等人,1989)的定义。
代替全长抗体，还可使用抗体的“片段”或“抗原结合片段”。“抗体片段”是指Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv片段，其含有足以赋予特异性抗原结合至靶蛋白(如PCSK9)的免疫球蛋白的至少一个CDR。
抗体重链可在抗体轻链不存在下结合抗原。抗体轻链可在抗体重链不存在下结合抗原。抗体结合区可在抗体轻链不存在下结合抗原。抗体结合区可在抗体重链不存在下结合抗原。个别可变区可在其他可变区不存在下特异性结合抗原。
重链中的CDR区典型地称作H1、H2和H3，并且在从氨基末端至羧基末端的方向上顺序地编号。轻链中的CDR区称作L1、L2和L3，并且在从氨基末端至羧基末端的方向上顺序地编号。
术语“轻链”包括全长轻链和具有足以赋予结合特异性的可变区序列的其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于该多肽的氨基末端处。轻链包括κ链和λ链。
术语“重链”包括全长重链和具有足以赋予结合特异性的可变区序列的其片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端处，并且CH结构域位于羧基末端处，其中CH3最接近该多肽的羧基末端。重链可具有任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
每个单独的免疫球蛋白链典型地由数个“免疫球蛋白结构域”构成，每个免疫球蛋白结构域由大约90至110个氨基酸组成且具有特征性折叠模式。这些结构域为抗体多肽的基础单元。在人中，IgA和IgD同种型含有四条重链和四条轻链；IgG和IgE同种型含有两条重链和两条轻链；且IgM同种型含有五条重链和五条轻链。重链C区典型地包含一个或多个可负责效应子功能的结构域。重链恒定区结构域的数目取决于同种型。IgG重链例如含有三个C区结构域，称作CH1、CH2和CH3。在某些情况下，抗PCSK9抗体为IgG1或IgG2或IgG4亚型。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，典型地在重链中包括大约氨基末端120至130个氨基酸且在轻链中包括约100至110个氨基末端氨基酸。抗体的可变区典型地确定特定抗体对其靶标的特异性。
“抗原”意指能够通过例如PCSK9结合多肽(包括例如抗体或其结合片段)的选择性结合剂结合的分子或分子的一部分。在一些情况下，抗原能够用于动物中以产生能够结合抗原的抗体。抗原可具有一种或多种能够与不同PCSK9结合多肽相互作用的表位。
“精氨酸盐”意指精氨酸的盐。实例包括精氨酸单盐酸盐(Arg盐酸盐)、精氨酸乙酸盐(Arg乙酸盐)和精氨酸谷氨酸盐(Arg谷氨酸盐)。
“缓冲液”意指任何药学上可接受的缓冲液，包括乙酸盐、谷氨酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲液，及其盐。
当用于竞争相同表位的抗体的情况下时，“竞争”意指如通过如下测定所确定的抗体之间的竞争，其中正在测试的抗体预防或抑制(例如，降低)参考抗体(例如，配体或参考抗体)与共同抗原(例如，PCSK9或其片段)的特异性结合。许多种类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一抗体竞争，例如：使用多种或技术认可的试剂和标记的固相直接或间接免疫测定。竞争性抑制通过在测试抗体存在下确定结合到固体表面或细胞的标记的量来测量。测试抗体通常过量存在。通过竞争测定鉴别的抗体包括与参考抗体结合相同表位的抗体和就发生位阻而言结合足够接近由参考抗体结合的表位的相邻表位的抗体。通常，当竞争抗体过量存在时，其将抑制(例如，降低)参考抗体与共同抗原的特异性结合达至少40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％或75％或更高。在一些情况下，结合被抑制达至少80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-97％或97％或更高。
“透滤”、“DF”和类似术语意指使用超滤膜(即，可区别具有不同形状和大小的分子的半透膜)从含有例如多肽或其他生物分子的溶液或混合物移除、置换盐或溶剂或降低盐或溶剂的浓度。
在过滤的情况下，“置换体积(DV)”意指与滞留物体积相比引入单元操作中的透滤缓冲液的体积。
“表位”包括能够通过例如抗体的PCSK9结合多肽结合的任何决定子。表位为抗原中通过靶向抗原的PCSK9结合多肽结合的区，并且当该抗原为蛋白质时，包括直接地接触该PCSK9结合多肽的特定氨基酸。表位决定子可包括例如氨基酸、糖侧链、磷酰基和磺酰基的分子的化学活性表面分组且可具有特定三维结构特征和特定电荷特征。一般而言，对特定靶标抗原具特异性的抗体在蛋白质或其他高分子的复杂混合物中优先地识别靶标抗原上的表位。
“赋形剂”意指在处方中作为稀释剂或运载体或当药物以丸剂形式给予时为了产生形式或同一性添加的或多或少惰性物质；例如，简单糖浆、植物胶、芳族粉末、蜂蜜和多种酏剂。
“补料交叉流”意指补料流动速率(L/h)除以膜面积(m2)。
在过滤的情况下，“通量(LMH)”意指公升每小时每平方公尺膜面积(L/h/m2)。
在含有治疗性多肽的药物配制品的情况下，“高分子量物质”或“HMW物质”意指大于原始治疗性多肽的治疗蛋白，如通过技术认可的测定所确定的。HMW物质包括治疗性多肽的寡聚物和治疗性多肽的聚集体。
在过滤的情况下，“滞留体积(HUV)”意指TFF系统的线路体积，包括滤筒的线路体积。
“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较该序列所确定的。“同一性百分比”意指在经比较的分子中氨基酸或核苷酸之间的同一的残基的百分比且是基于正在比较的分子中的最小分子的大小来计算。关于这些计算，优选地通过特定数学模型或算法来寻址比对的间隙(若存在)。这些技术为本领域中熟知的。
在计算同一性百分比时，典型地比对正在比较的序列以使该序列之间的最大匹配升至最高。
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可导致仅使该两个序列的短区匹配，并且此小比对区可具有极高序列同一性，即使在两个全长序列之间无显著关系。因此，所选择的比对方法可在必要时经调节以引起跨靶标多肽的所需数目的相邻氨基酸(例如，50个氨基酸)的比对。
二十种常规氨基酸、非天然氨基酸(例如α-,α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)还可为用于PCSK9结合多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。
保守氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其典型地通过化学肽合成而非通过生物系统中的合成来并入。这些包括肽模拟物和其他逆转或反向形式的氨基酸部分。
在对抗原结合蛋白或PCSK9蛋白作出改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。根据每种氨基酸的疏水性和电荷特征，确定了其亲水指数。本领域中了解亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予交互性生物功能中的重要性。某些氨基酸可由具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代且仍保持相似生物活性。
相似氨基酸的取代可基于亲水性有效地进行。还可基于亲水性从一级氨基酸序列鉴别表位。这些区还称作“表位核心区”。
在含有治疗性多肽的药物配制品的情况下，“低分子量物质”或“LMW物质”意指小于原始治疗性多肽的多肽，如通过技术认可的测定所确定的。LMW物质包括该治疗性多肽的片段。
如“抗PCSK9中和抗体”中所用的“中和抗体”或“中和靶标的抗体”是指结合靶标且预防或降低该靶标生物活性的抗体。这可以例如通过直接地阻断靶标上的结合位点或通过结合靶标且改变靶标经由间接方式(例如靶标中的结构或能量改变)结合的能力来进行。在评估抗体或其免疫功能片段的结合和/或特异性时，当过量的抗体使与配体结合的结合配偶体的量减少至少约1％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-97％、97％-98％、98％-99％或更高(如在体外竞争性结合测定中所测量的)时，抗体或片段可实质上抑制靶标与其结合配偶体结合。在PCSK9抗体的情况下，这种中和分子可削弱PCSK9与LDLR结合的能力。在一些情况下，中和能力经由竞争测定来表征或描述。在一些情况下，中和能力以IC50或EC50值描述。在一些情况下，这些抗体通过结合PCSK9且预防PCSK9与LDLR结合，或降低PCSK9与LDLR结合的能力来进行中和。在一些情况下，这些抗体通过结合PCSK9，同时仍允许PCSK9与LDLR结合，从而预防或降低PCSK9介导的LDLR降解来进行中和。因此，在一些情况下，中和抗体可仍允许PCSK9/LDLR结合，但预防或降低后续PCSK9涉及的LDLR降解。中和导致降低LDL-C(和/或其他脂质，例如ApoB、Lp(a)等)。除抗体外的PCSK9结合多肽，包括该PCSK结合多肽的变体可具有这些相同活性。
“PCSK9结合多肽”意指结合9型蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin(PCSK9)蛋白的多肽。在一些情况下，PCSK9结合多肽阻断PCSK9与低密度脂质受体(LDLR)的结合。这种阻断性PCSK9结合多肽可为单克隆抗体(mAb)且可为以下之一：
a.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的mAb(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
b.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的mAb；
c.mAb，该mAb包含：
i.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
ii.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
d.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的mAb，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
e.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的mAb，该表位与通过包含以下的抗体结合的表位重叠：
i.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
ii.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
iii.其中该mAb的该表位进一步与LDLR的表皮生长因子样重复序列A(EGF-A)结构域的位点重叠；或
f.包含重链多肽的mAb，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
i.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
ii.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
所指示的氨基酸序列在表1中提供，该表还提供了依伏库单抗的重链可变区和轻链可变区。依伏库单抗重链和轻链全长核苷酸序列在表2中给出，该表还给出了依伏库单抗HCVR和LCVR的核苷酸序列。
表1
PCSK9和PCSK9结合多肽序列
表2
依伏库单抗多核苷酸序列
依伏库单抗为CAS登录号1256937-27-5。
不影响其PCSK9结合和抑制特性的依伏库单抗变体显示于表3中。
表3
依伏库单抗变体HCVR和LCVR序列
“药物组合物”或“药物配制品”及其类似术语意指例如生物活性蛋白(例如，PCSK9结合多肽)的药学上有活性的药物的组合物，通常无菌，该组合物适用于给予，例如胃肠外给予(包括静脉内、肌肉内、皮下、烟雾化、肺内、鼻内或鞘内)至有需要的受试者且仅包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂和由美国联邦药物管理局或其他外国国家机关认为安全的其他添加剂。药物配制品包括液体，例如可直接地给予的水溶液，和冻干粉末，该粉末可通过在给予之前添加稀释剂而重构成溶液。
“多肽”或“蛋白质”意指具有原生蛋白的氨基酸序列的高分子，即由天然存在和非重组细胞产生的蛋白质；或通过经遗传工程改造的或重组细胞产生，并且包含具有原生蛋白的氨基酸序列的分子，或具有原生序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。该术语还涵盖如下氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸为相应天然存在的氨基酸和聚合物的化学类似物。“多肽片段”是指如与全长原生蛋白相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。如与原生蛋白相比，此类片段还可含有经修饰的氨基酸。片段可为约5至500个氨基酸长。例如，片段可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合结构域。在PCSK9结合抗体的情况下，有用片段包括但不限于CDR区、重链和/或轻链的可变结构域、抗体链的一部分或仅其可变区(包括两个CDR)。
“预防”(例如症状、疾病或病症的发作)不需要消除事件的可能性。相反，它表示在化合物或方法存在下事件发生的可能性已降低。在治疗意义上的预防包括预防性治疗和应用，其中预防会降低受试者将发展病症或其他风险因素的风险。
“稳定药物配制品”、“稳定配制品”或“药物配制品为稳定的”是指当与对照配制品样品相比时，当在约-30℃(或更冷)至约5℃或至约40℃下储存至少1个月或2个月或三个月或6个月或1年或2年或5年或更久时，展现增加有限的聚集和/或降低不超过5％的生物活性损失的PCSK9结合多肽的药物配制品。配制品稳定性可由本领域普通技术人员使用多种标准测定来确定，包括尺寸排阻HPLC(SEC-HPLC)、阳离子交换HPLC(CEX-HPLC)、通过光阻检测不可见粒子(“HIAC”)和/或视觉检查。典型地，储存温度越温暖，该配制品的储存期限越短。
用于评估降解的技术根据药物配制品中的蛋白质的身份而变化。示例性技术包括尺寸排阻层析(SEC)-HPLC以检测例如聚集；逆相(RP)-HPLC以检测例如蛋白质片段化；离子交换-HPLC以检测例如蛋白质的电荷改变；质谱分析；荧光光谱法；圆二色性(CD)光谱法；傅立叶变换红外光谱法(FT-IR)；和拉曼光谱法以检测蛋白质构型改变。所有这些技术可单独地或组合使用以评估药物配制品中的蛋白质降解且确定该配制品的储存期限。当在2℃-8℃下储存时，本文所披露的药物配制品典型地展现两年内增加不超过约2％至约3％的降解(例如，片段化、聚集或解折叠)。
“受试者”或“患者”可互换使用且包括人和非人动物受试者，以及具有经正式诊断的病症的受试者、无正式识别的病症的受试者、接受医疗照顾的受试者和处于发展病症的风险中的受试者。
“表面活性剂”意指表面活性药剂，包括通常称作湿润剂、表面张力降低剂、洗涤剂、分散剂、乳化剂和季铵防腐剂的物质。表面活性剂在下文中进一步论述。
“切向流过滤”或“TFF”意指如下过程，其中溶液切向地穿越跨过超滤膜(即，可区别不同大小和形状的分子的半透膜)，其中较低分子量盐和/或溶质在压力下穿越通过。
“治疗有效量”是指经确定在受试者中产生治疗反应的PCSK9抗原结合多肽的量。此类治疗有效量容易由普通技术人员确定。
在过滤的情况下，“跨膜压力(TMP)”意指从该膜的补料至滤液侧的平均差压且可通过等式(1)表述：
“治疗”和提供“治疗”包括提供治疗性治疗。治疗不需要病症的完全治愈且涵盖其中治疗会降低症状或潜在风险因素的情况。
“超滤(Ultrafiltration)”、“超滤(ultrafiltering)”、“UF”和相似术语意指使用区别不同形状和大小的分子的半透膜来分离分子与不同分子，或浓缩相似或实质上相同分子。
PCSK9结合的“变体”意指如下氨基酸序列，其中相对于另一多肽序列，一个或多个氨基酸残基插入至该氨基酸序列中、从该氨基酸序列缺失和/或被取代至该氨基酸序列中。变体包括融合蛋白。
“黏度”意指流体流动的阻力，并且可在既定剪切速率下以厘泊(cP)或毫帕·秒(mPa·s)的单位测量，其中1cP＝1mPa·s。黏度可通过使用黏度计，例如BrookfieldEngineering(马萨诸塞州伯勒(Middleboro，MA))刻度盘读数黏度计，或流变仪，例如m-VROCTM流变仪或TA仪器(特拉华州纽卡斯尔(New Castle，DE))AESR-G2锥板流变仪来测量。黏度可使用任何其他方法和以本领域中已知的任何其他单位(例如，绝对、运动或动态黏度)测量。无论用于确定黏度的方法如何，赋形剂配制品对对照配制品中的黏度降低百分比在既定剪切速率下降保持大致相同。
组合物和方法的组分
PCSK9结合多肽
包括依伏库单抗在内的PCSK9结合多肽的描述已经充分描述(Chan等人,2012)。
9型蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin(PCSK9)为调节低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白的水平时所涉及的丝氨酸蛋白酶(Horton,Cohen和Hobbs,2007；Seidah和Prat,2007)。PCSK9为丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶(S8)家族中的激素原-蛋白原转化酶(Seidah等人,2003)。示例性人PCSK9氨基酸序列在表1中显示为SEQ ID NO:3，其为PCSK9的前蛋白形式(未经加工)。PCSK9蛋白还可包括全长PCSK9蛋白的片段。PCSK9蛋白的结构已得到解决(Cunningham等人,2007；Piper等人,2007)。PCSK9包括信号序列、N-末端原结构域、枯草杆菌蛋白酶样催化结构域和C-末端结构域。
PCSK9结合多肽为包含一个或多个互补决定区(CDR)的多肽。在一些PCSK9结合多肽中，CDR被嵌入至框架区中，该框架区使一个或多个CDR定向，以致实现CDR的适当PCSK9结合特性。PCSK9结合多肽可干扰、阻断、降低或调节PCSK9与LDLR之间的相互作用。此类PCSK9结合多肽表示为“中和性”。PCSK9与LDLR之间的结合可仍发生，即使PCSK9结合多肽为中和性的且结合PCSK9。例如，PCSK9结合多肽预防或降低PCSK9对LDLR的不利影响而不阻断PCSK9上的LDLR结合位点。因此，PCSK9结合多肽可调节或改变PCSK9使LDLR降解的能力，而不会预防PCSK9与LDLR之间的结合。该PCSK9结合多肽可描述为“非竞争性中和”。中和性PCSK9结合多肽能以预防PCSK9与LDLR结合的位置或方式而结合PCSK9。该PCSK9结合多肽可描述为“竞争性中和”。PCSK9中和剂可导致更大量的游离LDLR存在于受试者中，引起更多LDLR结合LDL，并且由此降低受试者中的LDL的量。这又导致存在于受试者中的血清胆固醇的量降低。
一些PCSK9结合多肽可抑制PCSK9介导的活性(包括结合)。PCSK9结合多肽还可抑制PCSK9与LDLR之间的相互作用和由PCSK9介导的其他生理效应。PCSK9结合多肽可为人的，例如全人PCSK9抗体。
一些PCSK9结合多肽可与PCSK9的催化结构域结合。PCSK9结合多肽还可与PCSK9的成熟形式结合。在其他情况下，PCSK9结合多肽可与PCSK9的原结构域结合。PCSK9结合多肽在一些情况下可选择性地与PCSK9的成熟形式结合。在一些情况下，PCSK9结合蛋白结合该催化结构域，以致PCSK9无法结合或有效地与LDLR结合。一些PCSK9结合多肽不会与该催化结构域的C-末端结合。在其他情况下，PCSK9结合多肽不会与该催化结构域的N-末端结合。在其他情况下，PCSK9结合多肽不会与PCSK9蛋白的N-或C-末端结合。在一些情况下，PCSK9结合多肽与通过抗PCSK9抗体结合的表位中的任一个结合。在一些情况下，这可以通过候选抗体与参考抗体(例如依伏库单抗)之间的竞争测定来确定。在一些情况下，PCSK9结合多肽与PCSK9的特定构型状态结合以便预防PCSK9与LDLR相互作用。在一些情况下，PCSK9结合多肽与PCSK9的V结构域结合。在一些情况下，PCSK9结合多肽与PCSK9的V结构域结合并且预防(或降低)PCSK9与LDLR结合。在一些情况下，PCSK9结合多肽与PCSK9的V结构域结合，并且虽然其不会预防(或降低)PCSK9与LDLR结合，但PCSK9结合多肽预防或降低经由PCSK9对LDLR介导的不利活性。
在一些情况下，PCSK9结合多肽包含一个或多个CDR(例如，1、2、3、4、5或6个CDR)。在一些情况下，PCSK9结合多肽包含(a)多肽结构和(b)一个或多个插入和/或连接到该多肽结构的CDR。该多肽结构可采取多种不同形式。例如，它可为或包含天然存在的抗体或其片段或变体的构架，或可为合成的。
PCSK9结合多肽的多肽结构可为抗体或来源于抗体，包括单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(抗体模拟物)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称作“抗体缀合物”)，和每个分别的部分或片段。在一些情况下，PCSK9结合多肽为抗体的片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv)。
某些PCSK9结合多肽特异性地或选择性地与人PCSK9结合。在一些情况下，PCSK9结合多肽特异性地或选择性地与具有SEQ ID NO:3的残基153-692或由该残基组成的人PCSK9蛋白结合。在一些情况下，PCSK9结合多肽特异性地与PCSK9蛋白的至少一个片段和/或全长PCSK9蛋白(具有或不具有信号序列)结合。
在一些情况下，这些抗体包括至少一条可变重链和一条可变轻链。在其他情况下，这些抗体含有两条同一的轻链和两条同一的重链。例如，抗体或PCSK9结合多肽可包括一条重链和一条轻链、两条重链、或两条轻链。在一些情况下，PCSK9结合多肽包含来自表1中列出的序列(SEQ ID NO:4-9)中的至少一个的1、2和/或3个重链和/或轻链CDR(或由其组成)。在一些情况下，所有六个CDR(来自轻链的CDR1-3(CDRL1、CDRL2、CDRL3)和来自重链的CDR1-3(CDRH1、CDRH2和CDRH3))均为PCSK9结合多肽的部分。在一些情况下，1、2、3、4、5个或更多个CDR包括在PCSK9结合多肽中。在一些情况下，来自表1中的序列中的CDR的一个重链和一个轻链CDR包括在PCSK9结合多肽中。在一些情况下，另外的区段包括在PCSK9结合多肽中。
PCSK9结合多肽可由如表2中关于依伏库单抗所示的核酸序列编码。
在一些情况下，PCSK9结合多肽结合(但不会阻断)与SEQ ID NO:3的PCSK9具有至少50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、95％-99％同一性或具有更大同一性百分比的PCSK9变体。在一些情况下，PCSK9结合多肽结合(但不会阻断)此类变体。在一些情况下，PCSK9结合多肽与PCSK9的此类变体结合并且预防其与LDLR相互作用。在一些情况下，PCSK9结合多肽与PCSK9的变体结合并且预防其与LDLR相互作用。在一些情况下，PCSK9的变体为人变体，例如在位置474处、E620G和/或E670G处的变体。在一些情况下，在位置474处的氨基酸为缬氨酸。
人源化PCSK9结合多肽(例如，抗体)
PCSK9结合多肽可包含人源化抗体和/或其部分。
人源化抗体在人中实质上为非免疫原性的且具有与来自产生该人源化抗体的另一物种的抗体实质上相同的对靶标的亲和力。
抗体修饰可设计以实现增加的对靶标的结合亲和力和/或降低该抗体在接受者中的免疫原性。在某些情况下，人源化抗体经修饰以消除糖基化位点以便增加该抗体对其同源抗原的亲和力。例如“再成形”、“超嵌合”或“镶面/表面重建”的技术可用于产生人源化抗体。此类技术典型地通过降低外来残基的数目而降低抗体免疫原性，但不会预防在重复给予这些抗体之后的抗遗传型和抗异型反应。本领域中已知降低免疫原性的其他方法。
PCSK9抗体的轻链和重链可变区的CDR可移植至来自相同或另一物种的框架区(FR)。该轻链和重链可变区的CDR可移植至共有人FR。在一些情况下，PCSK9抗体重链或轻链的FR可来自不同重链或轻链的FR置换。抗体的经移植的可变区可与如下恒定区一起使用，该恒定区不同于PCSK9抗体的恒定区。经移植的可变区可为单链Fv抗体的部分。
PCSK9结合多肽变体
有用的其他抗体为通过表1中所示的可变重链和可变轻链的组合或子部分形成的上文所列出的PCSK9结合多肽的变体且包含各自与表1中的序列(整个序列或该序列的子部分，例如一个或多个CDR)的氨基酸序列具有至少50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-97％、97％-99％或99％以上同一性的可变轻链和/或可变重链。在一些情况下，此类抗体包括至少一条重链和一条轻链，而在其他情况下，这些变体形式含有两条同一的轻链和两条同一的重链(或其子部分)。
在某些情况下，PCSK9结合多肽包含含有如下可变区的重链，该可变区包含与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，PCSK9结合多肽包含与来自序列SEQ ID NO:4-9中的至少一个中的CDR的一个或多个CDR具有至少90％、90％-95％和/或95％-99％同一性的序列。在一些情况下，存在1、2、3、4、5或6个CDR(各自与以上序列具有至少90％、90％-95％和/或95％-99％同一性)。
在某些情况下，PCSK9结合多肽包含含有如下可变区的轻链，该可变区包含与SEQID NO:11或15的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在其他情况下，PCSK9结合多肽包含含有如下可变区的重链，该可变区包含与SEQID NO:10或14的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列。
熟练技术人员能够使用熟知技术确定PCSK9结合多肽的合适变体。在某些情况下，本领域普通技术人员可鉴别该分子中可通过靶向据信对于活性不重要的区域进行改变而不破坏活性的合适区域。在某些情况下，可鉴别这些分子中在相似多肽之间保守的残基和部分。在某些情况下，即使对于生物活性或对于结构重要的区域还可受保守性氨基酸取代而不破坏该生物活性或不会不利地影响多肽结构。
另外，本领域普通技术人员可回顾鉴别相似多肽中对于活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于该比较，可预测蛋白质中如下氨基酸残基的重要性，这些氨基酸残基对应于相似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基。本领域普通技术人员可对此类经预测重要的氨基酸残基选择化学上相似的氨基酸取代。
本领域普通技术人员还可关于相似的PCSK9结合多肽中的三维结构分析该结构和氨基酸序列。鉴于该信息，本领域普通技术人员可关于抗体的三维结构预测其氨基酸残基的比对。在某些情况下，本领域普通技术人员可选择不对经预测在该蛋白质的表面上的氨基酸残基进行基团改变，因为此类残基可涉及于与其他分子的重要相互作用中。此外，本领域普通技术人员可产生在各所需氨基酸残基处含有单一氨基酸取代的测试变体。这些变体可接着使用本领域中已知的活性测定进行筛选。此类变体可用于收集关于合适变体的信息。例如，若观察到特定氨基酸残基的改变导致受破坏、不合需要地降低或不合适的活性，则可避免具有该改变的变体。换言之，基于从此类常规实验收集的信息，本领域普通技术人员可容易地确定其中应避免单独或与其他突变组合的进一步取代的氨基酸。
在某些情况下，PCSK9结合多肽变体包括如下糖基化变体，其中与亲本多肽的氨基酸序列相比，糖基化位点的数目和/或类型已发生改变。在某些情况下，蛋白变体包含比原生蛋白多或少的数目的N连接糖基化位点。另外的优选抗体变体包括半胱氨酸变体，其中与亲本氨基酸序列相比，一个或多个半胱氨酸残基缺失或由另一氨基酸(例如，丝氨酸)取代。当抗体必须再折叠成生物活性构型时，例如在不溶性包涵体的分离之后，半胱氨酸变体可为有用的。半胱氨酸变体一般具有比原生蛋白少的半胱氨酸残基，并且典型地具有偶数以使由未配对半胱氨酸引起的相互作用降至最低。
竞争性PCSK9结合多肽
可使用与依伏库单抗或功能片段竞争结合通过依伏库单抗(其与PCSK9特异性结合)结合的表位的PCSK9结合多肽。此类PCSK9结合多肽还可结合相同表位PCSK9结合多肽或重叠表位。与依伏库单抗竞争或结合相同表位的PCSK9结合多肽和片段显示相似的功能特性。因此，作为特定实例，所提供的PCSK9结合多肽包括与具有依伏库单抗的所有六个CDR(SEQ ID NO:4-9)或分别地SEQ ID NO:2和1的两条轻链和两条重链的抗体或PCSK9结合多肽竞争的那些。
示例性表位
提供抗PCSK9抗体所结合的SEQ ID NO:3(人PCSK9多肽)的表位。在依伏库单抗(和依伏库单抗变体，具有SEQ ID NO:14的HCVR和SEQ ID NO:15的LCVR)的情况下，其为S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238。
PCSK9结合多肽(例如，抗体)的制备
可使用某些策略来操纵抗体的固有特性，例如抗体对其靶标的亲和力。此类策略包括使用编码抗体的多核苷酸分子的位点特异性或随机诱变以产生抗体变体。在某些情况下，在该产生之后筛选展现所需改变(例如，增加或减少的亲和力)的抗体变体。
突变诱发策略中靶向的氨基酸残基可为在CDR或FR中的那些。
在某些情况下，抗体变体的较小且更有效地经筛选的文库是通过将随机或定点诱变限制于CDR中的超突变位点而产生，这些超突变位点为对应于在体细胞亲和力成熟过程期间倾向于突变的区域的位点。
抗体可在细胞系中表达。编码特定抗体的序列(例如编码SEQ ID NO:1和2的多肽的多核苷酸，例如SEQ ID NO:12和13的多核苷酸)可用于使合适的哺乳动物宿主细胞转化。转化可通过任何已知的用于将多核苷酸引入宿主细胞中的方法进行。所用的转化程序取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域中熟知的且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将一个或多个多核苷酸囊封于脂质体中和将DNA直接微注射至细胞核中。
作为用于表达的宿主可获得的哺乳动物细胞系是本领域中熟知的且包括可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)的多种永生化细胞系，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、人上皮肾293细胞和多种其他细胞系。
在某些情况下，抗体通过21B12杂交瘤细胞系产生(Jackson等人,2009)。在某些情况下，PCSK9结合多肽以小于大约1nM的解离常数(KD)与PCSK9结合，例如1000pM至100pM、100pM至10pM、10pM至1pM和/或1pM至0.1pM或更低。
PCSK9结合多肽可包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型中的至少一个的免疫球蛋白分子。在某些情况下，PCSK9结合多肽包含人κ轻链和/或人重链。在某些情况下，该重链具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同种型。在某些情况下，PCSK9结合多肽已经克隆用于哺乳动物细胞中的表达。在某些情况下，PCSK9结合多肽包含除IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型的恒定区中的任一个外的恒定区。
在某些情况下，PCSK9结合多肽包含人λ轻链和人IgG2重链。在某些情况下，PCSK9结合多肽包含人λ轻链和人IgG4重链。在某些情况下，PCSK9结合多肽包含人λ轻链和人IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在其他实施例中，PCSK9结合多肽包含人κ轻链和人IgG2重链。在某些情况下，PCSK9结合多肽包含人κ轻链和人IgG4重链。在某些情况下，PCSK9结合多肽包含人κ轻链和人IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在某些情况下，PCSK9结合多肽包含接合至如下恒定区的抗体可变区，该恒定区既非IgG2同种型的恒定区也非IgG4同种型的恒定区。在某些情况下，PCSK9结合多肽已经克隆用于哺乳动物细胞中的表达。
在依伏库单抗的情况下，该抗体为IgG2-λ人单克隆抗体；具有λ轻链四二硫化物的γ2重链-二硫化物。依伏库单抗在Asn-291和Asn-291”处经糖基化且在残基22'-90'、22”-90”、22'-96'、22”-96”、129-214'、129”-214”、137'-196'、137”-196”、142-198、142”-198”、217-217'、218-218'、221-221”、224-224”、255-315、255”-315”、361-419和361”-419”之间具有二硫桥。
在某些情况下，依伏库单抗的重链和轻链或具有SEQ ID NO:14和15的HCVR和LCVR的抗体的那些重链和轻链的保守性修饰可产生具有类似于来自杂交瘤系21B12的抗体的那些特征的功能和化学特征的PCSK9抗体。相反，PCSK9抗体的功能或化学特征的实质性修饰可通过选择重链和轻链的氨基酸序列中的取代来实现，该取代在其对维持(a)取代区域中分子骨架的结构，例如，呈薄片或螺旋构型，(b)该分子在靶标位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小的影响方面显著不同。
例如，保守性氨基酸取代可涉和用非原生残基取代原生氨基酸残基，以致对此位置处的氨基酸残基的极性或电荷具有少量影响或无影响。
PCSK9结合多肽通常包含一种或多种多肽。多种表达载体/宿主系统中的任一个均可用于表达编码包含一种或多种PCSK9结合多肽组分或PCSK9结合多肽本身的多肽的多核苷酸分子。此类系统包括微生物，例如用重组噬菌体、质体或黏接质体DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜嵌纹病毒CaMV、烟草嵌纹病毒TMV)转染或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质体)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
包含一种或多种PCSK9结合多肽组分或PCSK9结合多肽本身的多肽可从多种表达系统纯化；此类技术是本领域普通技术人员所熟知的。
药物配制品组分
在一些实施例中，包含PCSK9结合多肽的药物配制品包含超过一种不同的PCSK9结合多肽。在某些实施例中，药物配制品包含超过一种PCSK9结合多肽，其中PCSK9的抗原结合蛋白结合超过一种表位。在一些实施例中，多种抗原结合蛋白将不会彼此竞争与PCSK9结合。在一些实施例中，该药物配制品包含依伏库单抗。
PCSK9结合多肽可连接至半衰期延长性运载体。此类运载体包括聚乙二醇(PEG)、肝糖(例如，PCSK9结合多肽的糖基化)和葡聚糖。
可接受的配制品组分优选地在所用的剂量和浓度下对接受者无毒。药物配制品可包含用于修饰、维持或保持该组合物的例如pH、容积渗透浓度、黏度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的药剂。
例如，合适的配制品材料包括氨基酸(例如脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、甘氨酸、谷酰胺或天冬酰胺)；抗微生物；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐、碳酸氢盐、磷酸钠、乙酸钠(“NaOAC”)、Tris-HCl、Tris缓冲液、柠檬酸盐、磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲的生理食盐水(即，PBS缓冲液)或其他有机酸)；增积剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；复合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-环糊精或羟基丙基β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露糖、海藻糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成盐反荷离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例如普朗尼克(pluronics)、PEG、山梨聚糖酯，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80的聚山梨醇酯、曲拉通、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选地氯化钠或氯化钾；甘露糖醇山梨糖醇)；递送运载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。
在一方面中，该药物配制品包含高浓度的PCSK9结合多肽。在某些实施例中，PCSK9结合多肽浓度在约70mg/mL至约260mg/mL的范围内，例如约70mg/mL、约80mg/mL、约90mg/mL、约100mg/mL、约110mg/mL、约120mg/mL、约130mg/mL、约140mg/mL、约150mg/mL、约160mg/mL、约170mg/mL、约180mg/mL、约190mg/mL、约200mg/mL、约210mg/mL、约220mg/mL、约230mg/mL、约240mg/mL、约250mg/mL或约260mg/mL。在一些实施例中，依伏库单抗的浓度在约140mg/mL至约210mg/mL的范围内，例如约140mg/mL、约150mg/mL、约160mg/mL、约170mg/mL、约180mg/mL、约190mg/mL、约200mg/mL、约210mg/mL、约220mg/mL、约230mg/mL、约240mg/mL、约250mg/mL或约260mg/mL。
在另一方面中，该药物配制品包含至少一种具有约pH7.0-8.5的缓冲剂，例如乙酸钠、磷酸盐、磷酸盐缓冲的生理食盐水(“PBS”)、组氨酸和/或Tris缓冲液。该缓冲液用于维持生理学上合适的pH。另外，该缓冲液可增强该药物配制品的等渗性和化学稳定性。在某些实施例中，该缓冲剂在约5mM至约100mM的范围内，例如约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100nM缓冲剂。在某些实施例中，该缓冲剂为NaOAC。在某些实施例中，该缓冲剂为NaOAC且以约10mM的浓度存在。在其他实施例中，该缓冲液为谷氨酸钠。在某些实施例中，该缓冲剂为谷氨酸钠且以约10mM的浓度存在。在又其他实施例中，该缓冲剂为磷酸盐缓冲液。在某些实施例中，该磷酸盐缓冲液以约10mM的浓度存在。在又其他实施例中，该缓冲剂为组氨酸。在这些实施例中的一些中，该组氨酸缓冲液以约10mM的浓度存在。该药物配制品的有用pH值包括约4至约7，或约4.8至约6.9，或约5.0至约5.5，或约5，或约5.4。
在某些实施例中，该药物配制品为等渗的，其中重量渗透浓度在约250至约400mOsm/kg之间的范围内，例如约250mOsm/kg、约260mOsm/kg、约270mOsm/kg、约280mOsm/kg、约290mOsm/kg、约300mOsm/kg、约310mOsm/kg、约320mOsm/kg、约330mOsm/kg、约340mOsm/kg、约350mOsm/kg、约360mOsm/kg、约370mOsm/kg、约380mOsm/kg、约390mOsm/kg或约400mOsm/kg。重量渗透浓度为溶质与体积流体的比率的量度。换言之，其为每千克溶液中分子和离子(或分子)的数目。在某些实施例中，重量渗透浓度为300mOsm/kg。重量渗透浓度可通过渗压计，例如Advanced Instruments2020多样品渗压计(马萨诸塞州诺伍德(Norwood，MA))来测量。该Advanced Instruments 2020多样品渗压计通过使用凝固点降低法来测量重量渗透浓度。溶液中的渗压剂浓度越高，其将凝固时所处的温度降低越多。重量渗透浓度还可使用任何其他方法并且以本领域中已知的任何其他单位(例如线性外推)测量。在其他实施例中，该药物配制品对人血细胞(例如红血球)等渗。
在仍另一方面中，该药物配制品包含至少一种表面活性剂聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)。在某些实施例中，该药物配制品包含表面活性剂，其浓度为每体积(w/v)配制品约0.0001重量％至约10重量％/的范围内，例如该配制品的约0.0001％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％、约5％或约10％的表面活性剂(w/v)。在某些实施例中，该药物配制品包含聚山梨醇酯80，其浓度在配制品的约0.0001％至约1％w/v的范围内。在某些实施例中，该药物配制品包含聚山梨醇酯80，其浓度为配制品的约0.01％w/v。在其他实施例中，该配制品包含 F-68，其浓度在配制品的约0.0001％至约1％w/v的范围内。在某些实施例中，该药物配制品包含 F-68，其浓度为配制品的约0.01％w/v。在仍其他实施例中，该配制品包含维他命E TPGS，其浓度在配制品的约0.0001％至约1％w/v的范围内。在某些实施例中，该药物配制品包含维他命E TPGS，其浓度为配制品的约0.01％w/v。
该药物配制品可包含至少一种稳定剂，例如聚羟基烃(包括山梨糖醇、甘露糖醇、甘油和卫矛醇)和/或二糖(包括蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖)和/或氨基酸(除包括精氨酸盐(例如精氨酸单盐酸盐)和精氨酸的乙酰基衍生物(例如N-乙酰基精氨酸)的那些配制品以外且可包括例如脯氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和牛磺酸)和或苯甲醇；该聚羟基烃和/或二糖和/或氨基酸和/或苯甲醇总计为配制品的约0.5％至约10％w/v。该药物配制品可包含脯氨酸，例如约10mM至约200mM，例如约50mM至约150mM，例如约90mM至约120mM，例如约120mM。
在一方面中，该药物配制品具有如在室温(即，25℃)下所测量小于约80厘泊(cP)的黏度水平。在某些实施例中，该药物配制品具有小于约70cP、约60cP、约50cP、约40cP、约30cP、约25cP、约20cP、约18cP、约15cP、约12cP、约10cP；约8cP、约6cP、约4cP；约2cP；或约1cP的黏度水平。
在一方面中，该药物配制品如通过至少一种稳定性测定所测量的为稳定的，例如检查PCSK9结合多肽随时间的生物物理或生物化学特征的测定。药物配制品稳定性可使用SEC-HPLC测量。SEC-HPLC基于其流体动力学体积的差异分离蛋白质。具有较大流体动力学蛋白质体积的分子比具有较小体积的分子更早洗脱。在SEC-HPLC的情况下，与对照样品相比，稳定药物配制品展现HMW物质的仅约5％增加，例如与对照样品相比HMW物质的仅约4％、仅约3％、仅约2％、仅约1％、仅约0.5％增加。
可替代地或另外的，稳定性可使用阳离子交换HPLC(CEX-HPLC)来测量。CEX-HPLC基于其表面电荷的差异分离蛋白质。在设定pH下，抗PCSK9ABP的带电同型在阳离子交换管柱上经分离且使用盐梯度洗脱。洗脱剂通过紫外光(UV)吸光度来监测。带电同型分布通过以总的峰面积的百分比形式确定各同型的峰面积来评估。在CEX-HPLC的情况下，与对照样品相比，稳定药物配制品展现主同型峰的仅约5％减少，例如与对照样品相比主同型峰的仅约3％至约5％减少；与对照样品相比主同型峰的仅约4％减少、仅约3％减少、仅约2％减少、仅约1％减少、仅约0.5％减少。
又可替代地或另外的，配制品稳定性可使用通过光阻检测不可见粒子(HIAC)来测量。含有光阻传感器(HIAC/Royco HRLD-150或相等物)和液体取样器的电子、液载粒子计数系统(HIAC/Royco 9703(哈希公司(Hach Company)；科罗拉多州洛夫兰(Loveland，CO))或相等物)定量既定测试样品中的粒子的数目及其大小范围。当液体中的粒子在光源与检测器之间传递时，其削弱或“遮掩”落在该检测器上的光束。当粒子的浓度位于传感器的正常范围内时，这些粒子逐个被检测。各粒子传递通过检测区会降低光检测器上的入射光且该光检测器的电压输出即刻降低。电压的改变作为电脉冲记录，该电脉冲由该仪器转化为所存在的粒子的数目。该方法为非特异性的且测量粒子(无论其起源如何)。所监测的粒子大小一般为10μm，和25μm。在HIAC的情况下，与对照样品相比，稳定药物配制品展现每个容器(或单元)中仅6000个10μm粒子，例如与对照样品相比每个容器(或单元)中仅5000个、仅4000个、仅3000个、仅2000个、仅1000个10μm粒子。在其他情况下，与对照样品相比，稳定药物配制品展现每个容器(或单元)中仅600个25μm粒子，例如与对照样品相比每个容器(或单元)中仅500个、仅400个、仅300个、仅200个、仅100个、仅50个25μm粒子。
药物配制品稳定性还可使用视觉评估来评估。视觉评估为定性方法，其用于描述样品的可见物理特征。该样品针对检查室的黑色和/或白色背景来观察，视所评估的特征(例如，颜色、澄清度、粒子或外来物质的存在)而定。样品还针对乳白色参考标准和颜色参考标准来观察。在视觉评估的情况下，与对照样品相比，稳定药物配制品不展现颜色、澄清度、粒子或外来物质的存在的显著改变。
示例性药物配制品
表4显示PCSK9结合多肽的示例性药物配制品。在一些配制品中，给出范围，并且在子实例(例如，1.1)中，给出特定实例。
治疗应用
例如依伏库单抗的PCSK9结合多肽可用于多种治疗应用。例如，PCSK9结合多肽有用于治疗与PCSK9相关的病状，例如胆固醇相关病症(血清胆固醇相关病症)，例如高胆固醇血症。PCSK9结合多肽可有用于治疗与PCSK9活性相关的后果、症状和/或病理。
与分子或分子组的升高水平(包括胆固醇(包括血清胆固醇)、LDL、LDLR、PCSK9、VLDL-C、脱辅基蛋白B(“ApoB”)、脂蛋白A(“Lp(a)”)、三酸甘油酯、HDL-C、非HDL-C和总胆固醇水平)相关、涉及该升高水平或可受该升高水平影响的病症可通过使用本文所披露的依伏库单抗药物组合物来治疗和/或预防和/或降低该病症在受试者中的风险的方法来解决。所披露的依伏库单抗组合物可用于调节这些分子或分子组的水平，例如降低这些分子或分子组的量。例如，所披露的依伏库单抗组合物可用于从异常高水平或从甚至正常水平减少这些分子或这些分子的组的量的方法中，即胆固醇(包括血清胆固醇)、LDL、LDLR、PCSK9、VLDL-C、ApoB、Lp(a)、三酸甘油酯、HDL-C、非HDL-C和总胆固醇水平的量可降低。
“胆固醇相关病症”(包括“血清胆固醇相关病症”)包括以下任一个或多个：家族性高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症、高脂血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠心病、中风、心血管疾病、阿尔兹海默氏病和一般异常血脂症，该异常血脂症可例如通过升高的总血清胆固醇、升高的LDL、升高的三酸甘油酯、升高的VLDL和/或低HDL显示。原发性和继发性异常血脂症的一些非限制性实例包括代谢综合征、糖尿病、家族性组合高脂血症、家族性高三酰甘油血症、家族性高胆固醇血症(包括杂合高胆固醇血症、纯合高胆固醇血症)、家族缺陷性载脂蛋白B-100；多基因高胆固醇血症；残粒移去障碍病、肝脂肪酶缺乏；以下任一个继发的异常血脂症：饮食不慎重，甲状腺功能减退，包括雌激素和助孕素疗法、β-阻断剂和噻嗪类利尿剂的药物；肾病综合征、慢性肾衰竭、库欣氏综合征、原发性胆汁性肝硬化、糖原贮积症、肝瘤、胆汁郁积、肢端肥大症、胰岛素瘤、单一性生长激素缺乏和酒精诱导的高三酰甘油血症。所披露的依伏库单抗组合物还可用于治疗和/或预防和/或降低动脉粥样硬化疾病的风险，例如心血管死亡、非心血管或全因死亡、冠心病、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、中风(缺血性和出血性)、心绞痛或脑血管疾病以及急性冠状动脉综合征、心肌梗塞和不稳定心绞痛。所披露的依伏库单抗组合物还可用于降低致命和非致命心脏病发作、致命和非致命中风、某些类型的心脏手术、用于心脏衰竭的住院、患有心脏病的患者中的胸痛和/或由于已确立的心脏病(例如先前心脏病发作、先前心脏手术)而引起的心血管事件和/或具有动脉堵塞的迹象的胸痛和/或移植相关血管疾病。在一些情况下，所披露的依伏库单抗组合物可用于预防或降低归因于升高的CRP或hsCRP的心血管风险的方法中。在一些实施例中，该ABP和方法可用于降低复发性心血管事件的风险。
一般可由使用他汀类解决(可治疗或可预防)的疾病或病症还可受益于所披露的依伏库单抗组合物的应用。此外，可受益于胆固醇合成或增加的LDLR表达的预防的病症或疾病还可使用所披露的依伏库单抗组合物治疗。另外，所披露的依伏库单抗组合物的使用可尤其有用于治疗糖尿病。不仅糖尿病为冠心病的风险因素，而且胰岛素增加PCSK9的表达。即，患有糖尿病的人具有升高的血浆脂质水平(其可与高PCSK9水平相关)且可受益于降低那些水平。
在PCSK9结合多肽用于治疗性应用的情况下，PCSK9结合多肽可抑制、干扰或调节PCSK9的一种或多种生物活性。例如，PCSK9结合多肽可特异性结合人PCSK9和/或实质上抑制人PCSK9与LDLR结合达至少约20％-40％、40％-60％、60％-80％、80％-85％或更多(例如，通过在体外竞争性结合测定中测量结合)。在一些情况下，PCSK9结合多肽具有小(更紧密地结合)于10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13M的Kd。在一些情况下，PCSK9结合多肽具有小于1μM、1000nM至100nM、100nM至10nM、10nM至1nM、1000pM至500pM、500pM至200pM、小于200pM、200pM至150pM、200pM至100pM、100pM至10pM、10pM至1pM的关于阻断LDLR与PCSK9结合的IC50。
药物配制品能以组合疗法，即与其他药剂组合进行给予。该组合疗法可包含与至少一种抗胆固醇剂组合的PCSK9结合多肽。药剂包括体外合成制备的化学配制品、抗体、抗原结合区及其组合和缀合物。在某些实施例中，药剂可充当激动剂、拮抗剂、别构调节物或毒素。在某些实施例中，药剂可用于抑制或刺激其靶标(例如，受体或酶活化或抑制)，并且由此促进增加的LDLR表达或减少血清胆固醇水平。
PCSK9结合多肽可在用胆固醇降低(血清和/或总胆固醇)剂治疗之前、与该治疗并行和在该治疗之后给予。例如，PCSK9结合多肽可预防性给予以预防或减轻高胆固醇血症、心脏病、糖尿病和/或任何胆固醇相关病症的发作。此外，PCSK9结合多肽可给予用于现有高胆固醇血症病状的治疗。在一些情况下，PCSK9结合多肽的给予可延迟该病症和/或与该病症相关的症状的发作。在一些情况下，向缺乏胆固醇相关病症或其子集中的任一个的任何症状的受试者提供PCSK9结合多肽。
PCSK9结合多肽可与特定治疗剂一起使用以治疗多种胆固醇相关病症，例如高胆固醇血症。鉴于该病状和所需治疗水平，可给予两种、三种或更多种药剂。此类药剂可通过包括在同一配制品中而一起提供。可替代地，此类药剂可独立地配制且必要时，通过包括在治疗试剂盒中而一起提供。在另一实例中，此类药剂可独立地提供。
剂量和给药方案
给予至患者的PCSK9结合多肽(例如mAb，如依伏库单抗)的量为治疗有效量。PCSK9结合蛋白的典型剂量可在约0.1μg/kg至高达约100mg/kg或更高的范围内。在某些情况下，该剂量可在0.1μg/kg直至约100mg/kg；或1μg/kg直至约100mg/kg；或5μg/kg直至约100mg/kg；或1mg/kg至约50mg/kg；或2mg/kg至约20mg/kg；或2mg/kg至约10mg/kg的PCSK9结合多肽范围内。
PCSK9结合多肽的量(或剂量)可在至少约10mg至约1400mg；或约14mg至约1200mg；或约14mg至约1000mg；或约14mg至约800mg；或约14mg至约700mg；或约14mg至约480mg；或约20mg直至约480mg；或约70mg直至约480mg；或约80mg至约480mg；或约90mg至约480mg；或约100mg至约480mg，或约105mg至约480mg；或约110mg至约480mg；或约115mg至约480mg；或约120mg至约480mg；或约125mg至约480mg；或约130mg至约480mg；或约135mg至约480mg；或约140mg至约480mg；或约145mg至约480mg；或约150mg至约480mg；或约160mg至约480mg；或约170mg至约480mg；或约180mg至约480mg或约190mg至约480mg或约200mg至约480mg；或约210mg至约480mg；或约220mg至约480mg；或约230mg至约480mg；或约240mg至约480mg；或约250mg至约480mg；或约260mg至约480mg；或约270mg至约480mg；或约280mg至约480mg；或约290mg至约480mg；或约300mg至约480mg；或约310mg至约480mg；或约320mg至约480mg；或约330mg至约480mg；或约340mg至约480mg；或约350mg至约480mg；或约360mg至约480mg；或约370mg至约480mg；或约380mg至约480mg；或约390mg至约480mg；或约400mg至约480mg；或约410mg至约480mg；或约420mg至约480mg；或约430mg至约480mg；或约440mg至约480mg；或约450mg至约480mg；或约460mg至约480mg；或约470mg至约480mg的PCSK9结合多肽范围内。
给药的频率将考虑PCSK9结合多肽和/或在配制品中的任何另外的治疗剂的药物动力学参数。临床医师可给予该配制品直至达到实现所需效应的剂量。该配制品能以单一剂量，或随时间以两个、三个、四个或更多个剂量(其可含有或可不含有等量的PCSK9结合多肽)，或经由植入装置或导管以连续输注液给予。该配制品还可用针和注射器经皮下或经静脉内递送。关于皮下递送，笔递送装置以及主体注射器和自动注射器递送装置可递送包含PCSK9结合多肽的药物配制品。
在某些情况下，至少约10mg；或高达约14mg；或高达约20mg；或高达约35mg；或高达约40mg，或高达约45mg，或高达约50mg；或高达约70mg的PCSK9结合多肽的剂量一周一次(QW)被给予至有需要的患者。
在其他情况下，至少约70mg，或高达约100mg；或高达约105mg，或高达约110mg；或高达约115mg，或高达约120mg；或高达约140mg；或高达约160mg；或高达约200mg；或高达约250mg；或高达280mg；或高达300mg；或高达350mg；或高达400mg；或高达420mg的PCSK9结合多肽的剂量每隔一周一次(或每两周；“Q2W:”)被给予至有需要的患者。
在某些其他情况下，至少约250mg；或高达约280mg；或高达约300mg；或高达约350mg；或高达约400mg；或高达约420mg；或高达约450mg；或高达480mg的PCSK9结合多肽的剂量每四周一次(“Q4W”)(或一个历月一次)被给予至有需要的患者。
例如，依伏库单抗能以210mg剂量Q2W给予。可替代地，依伏库单抗能以420mg剂量Q4W给予。视所治疗的病状的情况而定，这些药物剂量均可每周给予。
在一些情况下，与给药前血清LDL胆固醇水平相比，血清LDL胆固醇水平降低达至少约15％。在一些实施例中，血清LDL胆固醇水平降低达至少约20％，或达至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至更高。
储存和试剂盒
包含PCSK9结合多肽且具有或不具有至少一种另外的治疗剂的配制品可通过混合具有所需纯度程度的所选择配制品与任选的配制剂而经制备用于以经冻干的饼或水溶液形式储存。此外，包含PCSK9结合多肽且具有或不具有至少一种另外的治疗剂的配制品可使用适当赋形剂配制为冻干物。
一旦该药物配制品已配制，其可作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或经冻干粉末储存于无菌小瓶中。此类配制品能以即用形式或以在给予之前重构的形式(例如，冻干形式)储存。在一些情况下，该PCSK9结合多肽配制品可储存于例如合适储存袋(例如，如通过德国哥廷根的赛多利斯公司(Sartorius(Gottingen，DE))制造)的容器中或聚碳酸酯大玻璃瓶中。一旦该药物配制品已配制，其还可作为呈即用形式的溶液或悬浮液储存于经预填充注射器(PFS；例如2.25mLPFS)中，以及储存于玻璃小瓶(例如5cc玻璃小瓶)中。
在某些实施例中，提供用于产生单一剂量给予单元的试剂盒。在某些实施例中，该试剂盒可含有具有经干燥蛋白质的第一容器和具有水性配制品的第二容器。在某些实施例中，包括含有单一和多腔室的经预填充注射器(例如，液体注射器和冻干制剂注射器)的试剂盒。
包含N-乙酰基精氨酸的PCSK9结合多肽配制品的超滤/透滤
PCSK9结合多肽可在所披露的UF/DF方法中配制至约210g/L。例如，在所披露的方法中，70g/L(或35g/L)的第一透滤(DF1)浓缩物经透滤三次且浓缩至140g/L。接着，140g/L的第二透滤(DF2)浓缩物经透滤四次且浓缩至260g/L的浓度。经浓缩的池接着用配制品冲洗从系统回收至210g/L的最终浓度。
在所披露的方法中，约70mg/mL和约35mg/mL的第一超滤(UF1)浓度在实例中显示出对最终原料药(DS)中的HWM(％)不具有显著影响。此外，在所披露的方法中，在DF阶段仅必需七个置换体积的DF来确保透滤完成。所披露的UF/DF过程概述于表5和6中。
表5
UF/DF一般程序和操作参数
表6
UF/DF过程操作参数
因此，本文披露了一种配制PCSK9结合多肽，例如阻断PCSK9与LDLR结合的PCSK9结合多肽的方法，该方法包括
a.第一浓缩步骤，其中浓缩第一溶液中的该多肽；
b.第一溶液交换步骤，其中使用透滤将该第一溶液中经浓缩的多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第二溶液中；
c.第二浓缩步骤，其中浓缩该第二溶液中的该多肽；
d.第二溶液交换步骤，其中使用透滤将经浓缩的第二溶液中的该多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第三溶液中；和
e.第三浓缩步骤，其中浓缩该第三溶液中的该多肽；
在第三浓缩步骤之前，包含该多肽的溶液的温度可增加至约25℃至约37℃，例如约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃和约37℃。此外，第一溶液交换步骤可使用至少三个置换体积的该第二溶液实现；在一些情况下，可使用另外的置换体积，例如四个、五个或六个置换体积。第二溶液交换步骤可使用至少四个置换体积的该第三溶液实现；然而，可使用另外的置换体积，包括五个、六个或七个置换体积。PCSK9结合多肽的初始浓度可为约11mg/mL或更低，例如低于1mg，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或约11mg/mL。另外，PCSK9结合多肽浓度可增加约3倍至约7倍，例如约3倍、4倍、5倍、6倍或约7倍。例如，该多肽的增加的浓度为约35mg/mL至约70mg/mL或更高，例如约35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或约70mg/mL或更高。在第二浓缩步骤中，PCSK9结合多肽浓度从第一浓缩步骤增加约2倍至4倍(例如约2倍、3倍或约4倍)，例如至约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、250或约300mg/mL。在第三浓缩步骤中，PCSK9结合多肽浓度可从第二浓缩步骤增加约1.5倍至约2倍，例如至约140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、200、250或约300mg/mL，例如约260mg/mL。PCSK9结合多肽可因此具有与该治疗性多肽的初始浓度相比进一步浓缩至少约19-20倍的最终浓度，例如约210mg/mL。这些浓缩步骤可包含分批补料超滤；此外，该第二溶液和该第三溶液可为同一的。
包含N-乙酰基精氨酸的第二或第三溶液(例如，“NAR溶液”)可包含精氨酸盐和缓冲液，其中例如该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM，例如约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225或约230mM的浓度存在；该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐且以约25mM至约150mM，例如约25、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或约150mM的浓度存在；并且该缓冲液为乙酸钠缓冲液，其浓度为约5mM至约30mM，例如约5、10、15、20、25或约30mM。在其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约140至约170mM的浓度存在；该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63至约70mM(例如约63、64、65、66、67、68、69或约70mM)的浓度存在并且该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。例如，该N-乙酰基精氨酸能以约140mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。在其他子方面中，该N-乙酰基精氨酸以约155mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约70mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。在又另一实例中，该N-乙酰基精氨酸以约170mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。
此外，该组合物(包括NAR溶液)可进一步包含脯氨酸，其中该脯氨酸以约50mM至约150mM，例如约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或约150mM的浓度存在。该第二或第三溶液可具有约4.8至约6.9，例如约4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或约6.9，例如5.3、5.4或5.5的pH。在第一和第二溶液交换步骤中，可使用透滤膜，该透滤膜具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
a.大于约350μm但小于或等于约500μm，例如约350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或约500μm的网眼；
b.大于膜面积的约32％但小于或等于约36％(例如约32、33、34、35或约36％)的开放面积；
c.小于约16.2n/cm但大于或等于约12.2n/cm，例如约16.2、16、15.8、15.6、15.4、15.2、15、14.8、14.6、14.4、14.2、14、13.8、13.6、13.4、13.2、13、12.8、12.6、12.4或约12.2n/cm的网目数；
d.大于约270μm但小于或等于约340μm，例如约270、280、290、300、310、320、330或340μm的网线直径；
e.大于约160g/m2但小于或等于180g/m2，例如约160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180g/m2的基础重量；
f.大于约515μm但小于或等于约610μm的厚度；
g.大于约1138.1g/m2但小于或等于约1919.3g/m2的膜负载；和
h.约60psi的最大补料压力。
此外，表面活性剂可在该第三溶液浓缩之后添加至其中，例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)。在一些情况下，该表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物( F-68)或D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)。该表面活性剂可在每体积(“w/v”)配制品约0.0001重量％至约10重量％的浓度范围内，例如该配制品的约0.0001％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％、约5％或约10％的表面活性剂(w/v)。在某些实施例中，该药物配制品包含聚山梨醇酯80，其浓度在配制品的约0.0001％至约1％w/v的范围内。在某些实施例中，该药物配制品包含聚山梨醇酯80，其浓度为配制品的约0.01％w/v。在其他实施例中，该配制品包含 F-68，其浓度在配制品的约0.0001％至约1％w/v的范围内。在某些实施例中，该药物配制品包含 F-68，其浓度为配制品的约0.01％w/v。在仍其他实施例中，该配制品包含维他命E TPGS，其浓度在配制品的约0.0001％至约1％w/v的范围内。在某些实施例中，该药物配制品包含维他命E TPGS，其浓度为配制品的约0.01％w/v。
以下实例部分仅举例给出且并非为了以任何方式限制本发明或权利要求书而陈述。
实例
除非另外注明，否则黏度测量使用TA仪器(特拉华州纽卡斯尔)AESR-G2锥板流变仪来进行。
实例1-实验设计(DOE)研究；优化含有N-乙酰基精氨酸的依伏库单抗配制品
起始实验设计(DOE)研究以优化含有N-乙酰基精氨酸的依伏库单抗配制品。针对黏度、经预填充注射器挤压力、稳定性、pH和重量渗透浓度测试十一种配制品。关于初始配制品参数的数据显示于表7中。
基于图1所示的一个月40℃数据使乙酸盐浓度降至最低以降低聚集速率。使脯氨酸浓度增加至120mM以使该配制品等渗。选择N-乙酰基精氨酸(155mM)以在黏度降低与在4℃下在170mM下可见的N-乙酰基精氨酸的结晶之间实现平衡。数据还指示了在聚山梨醇酯-80(80；聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)、 F-68(聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)和维他命E TPGS(D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐)之间变化的表面活性剂不会引起黏度或稳定性的显著差异。
基于这些数据，发现10mM乙酸盐、155mM N-乙酰基精氨酸、120mM脯氨酸、0.01％聚山梨醇酯-80(pH5.4)的配制品适用于高浓度(例如，190-210mg/mL)依伏库单抗的黏度降低配制品。表8中提供的数据指示了此配制品等渗且具有低黏度。
表8
关于10mM乙酸盐、155mM N-乙酰基精氨酸、120mM脯氨酸、0.01％聚山梨醇酯-80 (pH5.4)、和190-210mg/mL的依伏库单抗的配制品的零时数据
实例2-DOE研究以评估赋形剂浓度、pH和缓冲液的影响
实例2-4针对经过优化以尽可能多地降低黏度同时使对聚集、去酰胺化和其他稳定性指示因素的任何影响降至最低的配制品。
N-乙酰基精氨酸(NAR)基于其在赋形剂筛选研究(参见例如实例1)中降低黏度的卓越效应加以选择。NAR的浓度受其在2℃-8℃下的溶解度限制。基于稳定性研究选择在透滤(DF)缓冲液中155mM的NAR浓度，该稳定性研究显示在高达175mM的浓度下NAR未结晶。精氨酸盐酸盐(70Mm)添加至该DF缓冲液中以实现具有最低黏度的等渗药物产品配制品且改良NAR的溶解度。选择配制品pH为5.4以使依伏库单抗的聚集和去酰胺化降至最低。缓冲液和表面活性剂(乙酸盐/聚山梨醇酯-80)显示对依伏库单抗配制品黏度和稳定性的最低影响。
进行三种主要研究以研究依伏库单抗在NAR/精氨酸盐酸盐配制品中的稳定性。其为：
1.DOE研究以评估赋形剂浓度、pH和缓冲液(乙酸盐对谷氨酸盐)的影响(实例2)。
2.设计宽pH研究以评估pH(5.1-6.9)对黏度/稳定性的影响(实例3)。
3.按比例缩小研究以评估顶部配制品候选物的稳定性，包括药物产品制造单元操作的影响(实例4)。
结果
确立≤50cP的黏度靶标作为靶标。配制品黏度筛选指示了NAR为降低黏度的最有效赋形剂。然而，归因于有限NAR溶解度，使用NAR和精氨酸盐酸盐的组合来实现等渗配制品且满足具有小于或等于50cP的黏度的210mg/mL依伏库单抗配制品目标。在筛选期间经评估的所选择配制品的概述显示于图2中。
设计DOE研究以评估NAR/精氨酸盐酸盐浓度、pH和缓冲液物质对210mg/mL依伏库单抗稳定性和黏度的影响。针对各样品的配制品变量显示于表9中。该研究设计包括155-175mM的NAR浓度、50-100mM的精氨酸盐酸盐浓度和4.8至5.4的pH。该研究还包括在10mM下的乙酸盐与谷氨酸盐缓冲液之间的比较。该研究包括140mg/mL的脯氨酸配制品对照物，其由同一批作为NAR/精氨酸盐酸盐样品的起始材料制备且填充于PFS中。样品使用0.2μmPVDF过滤器经无菌过滤且以约2.0mL的填充体积人工填充于玻璃PFS中。
针对pH、浓度、重量渗透浓度和黏度的数据列表于表10中。观察到就所有样品而言，pH值接近靶标。该研究中的重量渗透浓度覆盖256-392mOsm/kg的范围。黏度看来显示在较高pH下朝向较低黏度的不一致趋势。
表10
来自DOE的pH、浓度、重量渗透浓度和黏度数据
使用JMP统计学分析软件(SAS公司；北卡罗来纳州凯瑞市(Cary，NC)；图3A和3B)对尺寸排阻高压液相层析(SE-HPLC)数据的分析披露了在40℃下持续1个月，pH和精氨酸盐酸盐浓度对主峰百分比的损失的显著影响(图3A)。较低pH和较高精氨酸盐酸盐浓度引起主峰的较大损失，这主要归因于聚集体峰和在较小程度上寡聚物峰的增加。组合的两个峰经分类为高分子量(HMW)物质。图4显示了针对1个月、40℃时间点，pH和精氨酸盐酸盐对HMW物质的百分比的影响。与pH5.4样品相比，在pH4.8样品中可见显著较高水平的HMW物质的百分比。此外，与pH5.4相比，引起较高百分比的HMW物质的较高精氨酸盐酸盐浓度的效应在pH4.8下显著更加增强。
图5A-5C显示分别与在5℃下持续6个月、在25℃下持续三个月和在40℃下持续1个月的140mg/mL脯氨酸对照物相比，所选择的pH4.8和pH5.4样品的SE-HPLC层析图。这些层析图显示相对于pH5.4，在pH4.8下增加的聚集体水平的趋势。这些层析图还指示了与140mg/mL脯氨酸对照物相比，关于210mg/mL NAR/精氨酸盐酸盐样品的降解形式是相当的，不过关于210mg/mL NAR/精氨酸盐酸盐样品观察到较快聚集速率。
尽管在40℃下可见pH和精氨酸盐酸盐浓度依赖性差异，在此实验中研究的所有配制品均显示在5℃下持续长达6个月和在25℃下持续长达1个月时是相当的HMW物质百分比(图6A、6B)。
对所选择的样品进行使用液相层析-质谱(LC-MS)分析的胰蛋白酶肽定位。肽图HPLC-紫外光(UV)层析图在视觉上与脯氨酸依伏库单抗配制品对照物和依伏库单抗参考标准相比。相对于对照物在NAR/精氨酸盐酸盐样品中未观察到新峰(图8)。另外，通过质谱法检测的化学修饰的分析显示在NAR/精氨酸盐酸盐样品与对照物之间无显著改变。进行相对定量且N55和N33去酰胺化以及M246和M422氧化的百分比显示于表11中。相对于pH5.1NAR/精氨酸盐酸盐和pH5.0脯氨酸样品，在pH5.4NAR/精氨酸盐酸盐样品中可见略微较高水平的N55去酰胺化，与通过CEX可见的酸性峰的增加一致。N33(互补决定区(CDR)中的潜在去酰胺化位点)看来不在所评估的pH范围和条件下显示去酰胺化的显著增加。在ASC处孵育之后，与210mg/mL NAR/精氨酸盐酸盐样品相比，140mg/mL脯氨酸对照物样品的M246和M422氧化速率较高。
不可见粒子通过光阻液载粒子计数和微流成像(MFI)未显示与所研究的配制品变量相关的显著趋势(图9A-9C和图10)。不可见粒子计数在210mg/mL NAR/精氨酸盐酸盐样品与140mg/mL脯氨酸对照物之间是相当的。
图11编辑了在零时、三个月和六个月时间点来自此研究的黏度数据。数据指示对于所有配制品，黏度在5℃和25℃下保持稳定长达六个月。40℃样品显示黏度的pH依赖性增加，其与在40℃下通过SE-HPLC可见的HMW物质百分比的增加相关(图4)。
观察结果
在研究中点配制(10mM缓冲液、165mM NAR、75mM精氨酸盐酸盐)处实现大致等渗配制品(约300mOsm/kg)
增加pH导致在加速储存之后聚集体百分比的减少，如使用尺寸排阻层析(SEC)所观察的；以及去酰胺化的增加和较高百分比的酸性物质，如通过阳离子交换所检测的。
精氨酸盐酸盐浓度在pH4.8下对稳定性具有较大影响(在25℃和40℃下导致增加的聚集)且在pH5.4下其影响降至最低。
乙酸盐和谷氨酸盐在其对稳定性和黏度的影响方面是相当的。
对于5℃和25℃下长达三个月和40℃下一个月的时间点，关于NAR/精氨酸盐酸盐对脯氨酸对照物，通过所选择的样品的肽定位未观察到新峰。
黏度在5℃和25℃下保持稳定长达六个月。
NAR在5℃下保持可溶于配制品中，其中DF缓冲液浓度高达175mM且精氨酸盐酸盐浓度在50-100mM之间。
实例3–pH研究
设计pH研究以进一步调查在较宽范围内的pH的影响。该研究包括具有5.1-6.9的靶标pH范围的配制品。用于各样品的pH和缓冲液列于表12中。所有样品均用10mM缓冲液、165mM NAR、75mM精氨酸盐酸盐、0.01％聚山梨醇酯-80以210mg/mL配制。样品使用0.2μmPVDF过滤器经无菌过滤且以2.0mL的填充体积人工填充于玻璃PFS中。
表12
具有165mM NAR、75mM精氨酸盐酸盐和0.01％(w/v)聚山梨醇酯-80的依伏
库单抗(210mg/mL)配制品的pH和缓冲液变量
结果
在40℃下在零时和经三个月各样品的pH值显示于图12中。
图13A-13C分别显示在4℃、25℃和40℃下持续长达三个月通过SE-HPLC发现的pH对HMW物质百分比(寡聚物百分比+聚集体百分比)的影响。5℃和25℃数据显示在具有变化的pH的配制品之间的最小差异化。关于pH6.6和pH6.9配制品，与pH相关的最显著差异为从零时起较高水平的HMW物质百分比。图14显示零时寡聚物水平对pH的曲线。随着增加pH观察到寡聚物的略微向上趋势，其中在pH6.3以上观察到更急剧增加。寡聚物水平在较低pH下降至最低。
如先前在DOE研究(实例2)中所见，HMW物质百分比关于所研究的各pH在40℃下随时间增加，其中较低pH与较高初始增加速率相关。
根据在40℃、三个月时间点处的SE-HPLC层析图的比较，在减少的pH下出现增加的聚集体峰水平(图15)。
图16A-16C显示在5℃(图16A)、25℃(图16B)和40℃(图16C)下持续长达六个月通过CEX-HPLC发现的pH对主峰百分比的影响。在5℃、六个月时间点处，关于pH≤6.0的样品不存在主峰百分比的显著改变，而关于pH≥6.3的样品观察到主峰百分比的减少(图16A)。图16B和图16C中在ASC处的CEX-HPLC数据指示了主峰百分比随增加pH而减少且减少速率在pH>6.0下显著地加速。
图17显示在40℃下CEX主峰百分比的pH依赖性减少系归因于酸性物质百分比的增加。
在25℃、三个月时间点处的CEX-HPLC层析图的比较可见于图18中。酸性峰百分比随增加pH增高且具有大于6.3的pH的样品的层析形式存在显著改变。
在40℃下储存持续1个月之后对样品进行使用液相层析-质谱(LC-MS)分析的胰蛋白酶肽定位。肽图HPLC-UV层析图(图19)在视觉上与参考标准和跨pH范围相比。另外，通过质谱法进行的化学修饰分析未显示与pH相关的显著改变，除了N55和N33去酰胺化。N55和N33去酰胺化以及M246和M422氧化的相对定量水平显示于表13中。在增加的pH下，N55去酰胺化百分比和N33去酰胺化百分比的水平的增加与CEX-HPLC数据中可见的增加的酸性峰百分比水平相关。看来pH对M246或M422的氧化水平并无显著影响。
表13
依伏库单抗的去酰胺化和氧化
一个月40℃样品的生物测定结果连同初始主峰百分比(CEX-HPLC)以及N55百分比和N33百分比(未去酰胺化)在图20中作图。
不可见粒子通过光阻液载粒子计数(图21A-21C)和MFI(图22)未显示与pH相关的显著趋势。
图23中的数据显示在25℃下持续长达六个月，pH对片段化或其他降解具有最小影响，如通过降低的毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rCE-SDS)分析所测量的。图23中的轻链前加轻链+重链百分比(preLC+LC+HC)显示在pH范围的边缘处的略微减少。较低pH样品含有略微较高百分比的中间分子量(MMW)物质，而较高pH样品含有略微较高百分比的HMW物质。低分子量(LMW)物质百分比在pH范围内是相当的。
最后，如图24所示，在黏度与pH之间存在良好线性关系，其中每个pH单位具有6.6cP的减少。
观察结果
增加pH导致(1)在40℃下减少的聚集速率，(2)较高初始寡聚物水平，(3)在25℃和40℃下增加的去酰胺化速率，和(4)较低黏度。pH看来对可见或不可见粒子不具有显著影响，pH看来对片段化或其他降解还不具有显著影响，如通过rCE-SDS所测量的。
实例4–按比例缩小研究
三种配制品经受商业可制造性和稳定性评估。配制品候选物经受多种单元操作，在稳定置放之前仿真商业制造。
结果
确定各配制品原料药的物理特性。
确定pH比用于各配制品的DF缓冲液pH高约0.17。用于配制品3的DF缓冲液比靶标高0.14，其导致DSpH比靶标高0.31。
在5℃、25℃和40℃下关于药物产品稳定性的SE-HPLC(HMW物质百分比)结果显示于图25A-25C中。在5℃和25℃下关于所有三种样品的HMW物质百分比的增加速率是相当的，而在40℃下关于样品1(具有较低pH)的聚集速率略微较高。
CEX-HPLC数据显示于图26A-26C中且显示在先前研究中观察到的酸性峰百分比的预期pH和温度依赖性增加(参见先前实例)。
图27中所示的rCE-SDS数据显示在所测试的所有温度和时间点处关于按比例缩小配制品中的每个的PreLC+HC+LC百分比的可相当水平。
在5℃和25℃下持续长达四个月，浊度水平并未显著改变，但在40℃下4个月之后却增加。
关于各配制品，按比例缩小样品浓度被调节至200、210和220mg/mL。样品通过m-VROCTM流变仪(瑞欧森公司(RheoSense)；加利福尼亚州圣拉蒙(San Ramon，CA))在高达90,000sec-1的剪切速率下且在18℃至28℃的温度下进行测试。图28中的数据跨22-52cP的黏度范围且说明了蛋白质浓度、温度和配制品变化对黏度的影响。
观察结果
通过SE-HPLC发现的HMW物质百分比水平和聚集速率与在先前研究(例如，参见先前实例)中所观察到的那些一致。
通过CEX-HPLC发现的主峰、酸性峰和碱性峰百分比水平和改变速率与在先前研究中所观察到的那些一致。
rCE-SDS数据显示在RSC和ASC处长达三个月无显著片段化或其他降解实例5-包含N-乙酰基精氨酸的配制品中的依伏库单抗的超滤/透滤
材料和方法
小规模超滤/透滤(UF/DF)开发实验使用具有Ultracel PLCTK膜、30kD分子量截止值的3卡匣(D筛网，0.11m2；EMD密理博公司(EMD Millipore)；马萨诸塞州比勒利卡(Billerica，MA))。实验在切向流过滤(TFF)过程系统(磐度公司(PendoTECH)；新泽西州普林斯顿(Princeton，NJ))上进行。实验在室温(22.2±2℃)下进行。
UF/DF开发实验以小规模进行以评估具有不同pH值的三种NAR配制品缓冲液且比较其在浓缩期间的渗透通量数据。使用两个DF步骤以便关于减少NAR的消耗节省成本。在UF1/DF1步骤中进行另外的实验以关于在UF/DF过程期间的高分子量形成上评估两种靶标浓度(35mg/mL和70mg/mL)。未评估其他UF/DF操作参数。UF/DF实验的一般程序描述于表14中。
表14
UF/DF一般程序和操作参数
使用具有1.5(cm)-1(g/L)-1的消光系数的可变路径长度分光亮度计(SoloVPE系统；SoloVPE公司；新泽西州布里奇沃特(Bridgewater，NJ))进行A280测量。
用于评估产品池质量的分析方法包括SE-HPLC、rCE-SDS和CEX-HPLC。
NAR：Ac-精氨酸-OH，生物化学公司(Biochem)目录号-E-1025
NAR配制品缓冲液研究结果
此实验在UF/DF过程中评估了三种NAR配制品缓冲液。该UF/DF过程遵循一般指导方针：(1)依伏库单抗经由分批补料浓缩(UF1)浓缩至70mg/mL且用3个置换体积透滤至NAR配制品缓冲液(DF1)中；(2)该蛋白质进一步浓缩至140mg/mL(UF2)且用4个置换体积透滤至NAR配制品缓冲液(DF2)中；(3)该蛋白质经过量浓缩至靶标约260mg/mL且在37℃下从该系统回收。蛋白质负载/膜面积关于NAR pH5.4为1468g/m2且关于NAR pH5.2和5.6为800g/m2。
该通量数据相对于浓度作图且在所有NAR配制品缓冲液中进行比较。另外，通过从各透滤步骤取样来分析赋形剂水平以研究透滤性能且确定最小置换体积。
结果和观察结果
使用来自该UF/DF研究的通量数据以产生在图29中显示的滤液通量对浓度曲线。通量分布在这三种NAR配制品缓冲液中是相当的。通量随着用缓冲液交换至NAR配制品缓冲液(DF1和DF2)中的蛋白质增加，但随着蛋白质浓度的增加显著减少(UF1、UF2和OC)。归因于不同膜面积，用于UF/DF的总过程时间在NAR pH5.4中为约20小时且在NAR pH5.2和5.6中为10小时。相似的通量分布结果显示了NAR配制品缓冲液对过程通量无显著影响。依伏库单抗原料药(DS)小规模UF/DF研究的概述显示于表15中。
在透滤步骤(DF1和DF2)处以各置换体积(1至7DV)取样以测试透滤性能且确定最小置换体积。表16中的代表性样品分析来自依伏库单抗NAR pH5.4UF/DF研究。结果显示了在五个置换体积之后，透滤至NAR pH5.4中基本上完成。
表15
依伏库单抗DS小规模UF/DF研究的概述
表16
在各DF步骤处在依伏库单抗UF/DFNAR pH54中的赋形剂水平
实例6-监测在依伏库单抗配制品的UF/DF期间的DS浓度和HMW形成
该实验的目的在于评估在分批补料浓缩/透滤(UF1/DF1)中的靶标浓度，并且确定该靶标浓度以使UF/DF操作期间的HMW形成降至最低。该UF/DF过程遵循表17中列出的一般指导方针。依伏库单抗(11-mg/mL)经由分批补料浓缩(UF1)浓缩至35mg/mL或70mg/mL。蛋白质负载/膜面积为800g/m2且NAR配制品缓冲液包括10mM乙酸盐、155mM N-乙酰基精氨酸、70mM精氨酸盐酸盐(pH5.3)。
另外，从各UF/DF步骤取得蛋白质样品用于产品池质量分析以便评估UF/DF操作。使用产品池质量数据来研究不同UF1/DF1产品浓度对HMW形成的影响。
材料和方法
参考实例5。
结果和观察结果
图30显示了比较在UF1/DF1(UF/DF-70和UF/DF-35)中在具有35mg/mL和70mg/mL的依伏库单抗UF/DF过程中的HMW(％)形成的图。最初，UF/DF-70-UF1中的HMW物质(％)比UF/DF-35-UF1高0.2％，但在UF1之后HMW(％)是相当的且在最终DS中相同。结果指示了HWM物质为可逆的且UF1中的靶标浓度不会对最终DS中的HWM物质形成具有显著影响。据推荐，70mg/mL为靶标浓度以降低池体积。
实例7-对来自小规模UF/DF的三种NARDS进行的池保持研究
在此实例中，监测配制至三种NAR配制品缓冲液中的三个批次的依伏库单抗的稳定性。将10mL的各DS样品保持于2℃-8℃下。在图31-A-31F中所示的各时间点，取出约1mL样品且装运至2℃-8℃下用于分析测试。
结果和观察结果
在2℃-8℃下依伏库单抗NAR依伏库单抗的SE-HPLC和CEX结果显示于图36和37中。CEX和rCE-SDS结果产生了可相当结果。与补料材料中的1.1％相比，从NAR pH5.2、5.4和pH5.6产生的DS批次在UF/DF操作期间分别具有1.4％、1.5％和1.7％HMW物质。在图32中对％HMW物质作图以持续11周比较依伏库单抗补料材料和NARDS。所有三个配制品批次均具有0.4％-0.5％的HMW(％)物质增加。这些DS批次在2℃-8℃下稳定至少7天。
实例8-在37℃、39℃、42℃和45℃下对依伏库单抗HMPCPD1NAR过量浓缩(260g/L)进行的过程中池保持研究
评估在37℃、39℃、42℃和45℃下过程中依伏库单抗过量浓缩(260g/L)的稳定性。30mL OC样品在具有设定控制温度的室中在水浴中孵育。在图33和34中所示的各时间点，取出约1mL样品，冷冻，并且在干冰上装运用于分析。在较高温度下在OC样品上测量黏度值且与在23℃和25℃下所保持的那些相比。
结果和观察结果
SE-HPLC结果显示了依伏库单抗NAR OC在37℃、39℃和42℃下稳定三个小时，但在45℃下不稳定，如图33所示。CEX和rCE-SDS结果是相当的。图34显示了当温度增加时，OC的黏度减少且当温度从37℃增加至42℃时，黏度降低达19％(达14.7cP)。
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实例9-配制品稳健性DOE研究
设计配制品稳健性实验设计(DOE)研究来调查在规定设计空间内的配制品变量对依伏库单抗稳定性的影响。研究变量包括依伏库单抗浓度、NAR浓度、精氨酸盐酸盐浓度和pH。表17中列出的十八种配制品使用0.2μmPVDF过滤器经无菌过滤且填充于2.0mL玻璃经预填充注射器中。在多种温度下孵育之后，通过指示稳定性的分析方法的数组测试样品。除表17中列出的组分以外，所有配制品均还包括10mM乙酸钠和0.01％(w/v)聚山梨醇酯-80。
表17
研究设计
*配制品包括10mM乙酸钠和0.01％(w/v)聚山梨醇酯-80，如文中所注明
表18显示了针对研究配制品中的每个所测量的依伏库单抗浓度、pH值和赋形剂浓度。均接近表17中列出的靶标水平。
表18
初始药物产品配制品数据
结果和观察结果
为了评估聚集，在4℃(图35A)、25℃(图35B)和40℃(图35C和35D)下孵育0-6个月之后对表18中所示的配制品进行SE-HPLC分析。数据指示了关于4℃和25℃条件下的所有配制品，％HMW物质的增加速率相似，但在加速40℃胁迫条件下观察到对聚集的pH依赖性影响。观察到在pH5.1下的较低pH样品在40℃下具有最快聚集速率，而具有pH5.7的样品经观察具有最慢聚集速率(图35C和35D)。观察到在40℃下在pH5.4下的样品具有在pH5.1和5.7的那些样品之间的中间聚集速率，但这些速率更类似于关于pH5.7的样品所观察到的较低聚集速率(图35C和35D)。
使用CEX-HPLC检查pH随时间(长达三个月)对％酸性峰和％碱性峰的影响，关于4℃的数据显示于图36A(酸性峰)和36B(碱性峰)中；关于25℃的数据显示于图36C(酸性峰)和36D(碱性峰)中；且关于40℃的数据显示于图36E(酸性峰)和36F(碱性峰)中。如关于25℃和40℃样品的数据所示(图36C-36F)，观察到pH影响这些配制品中的％酸性峰和碱性峰。关于具有pH5.7的样品的数据以％酸性峰的较高增加速率紧密地类集，而关于具有pH5.1的样品的数据显示最低增加速率。观察到两种具有pH5.4的样品具有直接地在具有pH5.1和pH5.7的那些样品的所观察到的速率之间的降解速率。％碱性峰改变的趋势看来不太明显，但由在40℃下孵育的样品观察到在较低pH下朝向较高％碱性峰水平的趋势。
使用rCE-SDS和SE-HPLC分析来测定在30℃或40℃下持续长达三个月这些配制品中的依伏库单抗的片段化或其他降解；图37A-37B提供关于在30℃下孵育的样品的数据，并且图37C-37D显示关于在40℃下孵育的样品的数据。未观察到与此研究的设计空间内的配制品组成相关的rCE-SDS数据的显著趋势。
在4℃和40℃下孵育之后，通过使用HIAC的光阻粒子计数随时间对这些配制品确定不可见粒子的存在和量持续长达三个月；这些数据显示于图38A-38D中。(图38A(大于或等于10μm)和38B(大于或等于25μm的粒子)显示了关于保持于4℃下的样品的结果；图38C(大于或等于10μm)和38D(大于或等于25μm的粒子)显示了关于保持于40℃下的样品的结果)。由这些数据，未观察到与所研究的配制品变量相关的不可见粒子计数的显著趋势。
根据此实例，数据证明了在所研究的狭窄配制品设计空间内，未观察到在4℃或25℃下储存期间对稳定性的显著影响。在40℃与pH相关的数据表明pH影响聚集速率，如通过SE-HPLC所检测的；以及酸性物质百分比和在较小程度上碱性物质百分比，如通过CEX-HPLC所检测的。
示例性实施例
本文披露了包含依伏库单抗的药物组合物的示例性实施例，其中此类组合物包含N-乙酰基精氨酸且该药物组合物具有至少小于约80cP的黏度(例如通过流变仪，例如TA仪器(特拉华州纽卡斯尔)AESR-G2锥板流变仪所测量)。此外，本文披露了配制例如依伏库单抗的治疗性多肽的方法，其中此类组合物包含NAR。
实施例1：一种药物组合物，该药物组合物包含
a.PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
和
b.N-乙酰基精氨酸，
其中该药物组合物具有至少小于约80cP的黏度。
实施例2：如实施例1所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
实施例3：如实施例2或3所述的药物组合物，其中该药物组合物具有至少小于约50cP的黏度。
实施例4：如实施例2或3所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约250至约400mOsm/kg的重量渗透浓度。
实施例5：如实施例4所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约300mOsm/kg的重量渗透浓度。
实施例6：如实施例5所述的药物组合物，其中该药物组合物对人血细胞等渗。
实施例7：如实施例1所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽以约140mg/mL至约260mg/mL的浓度存在。
实施例8：如实施例2所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽浓度为约210mg/mL。
实施例9：如实施例1-8中任一项所述的药物组合物，其中该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM的浓度存在。
实施例10：如实施例9所述的药物组合物，其中该N-乙酰基精氨酸以约140mM至约170mM的浓度存在。
实施例11：如实施例10所述的药物组合物，其中该N-乙酰基精氨酸以约140mM的浓度存在。
实施例12：如实施例1-11中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含缓冲液。
实施例13：如实施例13所述的药物组合物，其中该缓冲液选自由乙酸盐、谷氨酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲液或其组合组成的组。
实施例14：如实施例13所述的药物组合物，其中该缓冲液以约5mM至约30mM的浓度存在。
实施例15：如实施例14所述的药物组合物，其中该缓冲液为乙酸钠且以约10mM的浓度存在。
实施例16：如实施例1-15中任一项所述的药物组合物，其中该pH为约4.8至约6.9。
实施例17：如实施例11所述的药物组合物，其中该pH为约5.4。
实施例18：如实施例1-17中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含表面活性剂。
实施例19：如实施例18所述的药物组合物，其中该表面活性剂选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)组成的组。
实施例20：如实施例19所述的药物组合物，其中该表面活性剂以约0.0001％(w/v)至约1％(w/v)的浓度存在。
实施例21：如实施例20所述的药物组合物，其中该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯且以约0.01％(w/v)的浓度存在。
实施例22：如实施例1-21中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含脯氨酸。
实施例23：如实施例22所述的药物组合物，其中该脯氨酸以约50mM至约150mM的浓度存在。
实施例24：如实施例23所述的药物组合物，其中该脯氨酸以约90mM至约120mM的浓度存在。
实施例25：如实施例22或23所述的药物组合物，其中该脯氨酸以约120mM的浓度存在。
实施例26：如实施例1-25中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含精氨酸盐。
实施例27：如实施例26所述的药物组合物，其中该精氨酸盐以约25mM至约150mM的浓度存在。
实施例28：如实施例27所述的药物组合物，其中该精氨酸盐以约50mM至约100mM的浓度存在。
实施例29：如实施例26所述的药物组合物，其中该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐。
实施例30：如实施例29所述的药物组合物，其中该精氨酸盐酸盐以约50mM的浓度存在。
实施例31：如实施例1-30中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约-30℃或更冷情况下时稳定持续至少约2年。
实施例32：如实施例31所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约5年。
实施例33：如实施例1-30中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约5℃下时稳定持续至少约6个月。
实施例34：如实施例33所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约24个月。
实施例35：如实施例1-30中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约25℃下时稳定持续至少约1个月。
实施例36：如实施例35所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约三个月。
实施例37：如实施例35所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约6个月。
实施例38：如实施例1-30中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约40℃下时稳定持续至少约1个月。
实施例39：如实施例1-38中任一项所述的药物组合物，其中该组合物在小于约3％的PCSK9结合多肽浓度下包含该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物。
实施例40：如实施例39所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物以小于约2.5％的该PCSK9结合多肽浓度存在。
实施例41：一种药物组合物，该药物组合物包含
a.PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
和
b.N-乙酰基精氨酸；
c.精氨酸盐；
d.缓冲液；和
e.表面活性剂
其中该药物组合物具有至少小于约80Cp的黏度(例如通过流变仪，例如TA仪器(特拉华州纽卡斯尔)AESR-G2锥板流变仪所测量)。
实施例42：如实施例41所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
实施例43：如实施例41或42所述的药物组合物，其中该药物组合物具有至少小于约50cP的黏度。
实施例44：如实施例41或42所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约250至约400mOsm/kg的重量渗透浓度。
实施例45：如实施例44所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约300mOsm/kg的重量渗透浓度。
实施例46：如实施例45所述的药物组合物，其中该药物组合物对人血细胞等渗。
实施例47：如实施例41或42所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽以约140mg/mL至约260mg/mL的浓度存在。
实施例48：如实施例47所述的药物组合物，其中PCSK9结合多肽浓度为约210mg/mL。
实施例49：如实施例41-48中任一项所述的药物组合物，其中该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM的浓度存在。
实施例50：如实施例49所述的药物组合物，其中该N-乙酰基精氨酸以约140mM至约170mM的浓度存在。
实施例51：如实施例50所述的药物组合物，其中该N-乙酰基精氨酸以约140mM的浓度存在。
实施例52：如实施例41或42所述的药物组合物，其中该缓冲液选自由乙酸盐、谷氨酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲液或其组合组成的组。
实施例53：如实施例52所述的药物组合物，其中该缓冲液以约5mM至约30mM的浓度存在。
实施例54：如实施例53所述的药物组合物，其中该缓冲液为乙酸钠且以约10mM的浓度存在。
实施例55：如实施例41或42中任一项所述的药物组合物，其中该pH为约4.8至约6.9。
实施例56：如实施例55所述的药物组合物，其中该pH为约5.4。
实施例57：如实施例41或42所述的药物组合物，其中该表面活性剂选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)组成的组。
实施例58：如实施例57所述的药物组合物，其中该表面活性剂以约0.0001％(w/v)至约1％(w/v)的浓度存在。
实施例59：如实施例57所述的药物组合物，其中该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯并且以约0.01％(w/v)的浓度存在。
实施例60：如实施例41或42所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含脯氨酸。
实施例61：如实施例60所述的药物组合物，其中该脯氨酸以约50mM至约150mM的浓度存在。
实施例62：如实施例61所述的药物组合物，其中该脯氨酸以约90mM至约120mM的浓度存在。
实施例63：如实施例62所述的药物组合物，其中该脯氨酸以约120mM的浓度存在。
实施例64：如实施例41或42所述的药物组合物，其中该精氨酸盐以约25mM至约150mM的浓度存在。
实施例65：如实施例64所述的药物组合物，其中该精氨酸盐以约50mM至约100mM的浓度存在。
实施例66：如实施例64所述的药物组合物，其中该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐。
实施例67：如实施例66所述的药物组合物，其中该精氨酸盐酸盐以约50mM的浓度存在。
实施例68：如实施例41-67中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约-30℃或更冷情况下时稳定持续至少约2年。
实施例69：如实施例68所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约5年。
实施例70：如实施例41-67中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约5℃下时稳定持续至少约6个月。
实施例71：如实施例70所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约24个月。
实施例72：如实施例41-67中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约25℃下时稳定持续至少约1个月。
实施例73：如实施例72所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约三个月。
实施例74：如实施例73所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约6个月。
实施例75：如实施例41-67中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约40℃下时稳定持续至少约1个月。
实施例76：如实施例41-75中任一项所述的药物组合物，其中该组合物在小于约3％的PCSK9结合多肽浓度下包含该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物。
实施例77：如实施例76所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物以小于约2.5％的该PCSK9结合多肽浓度存在。
实施例78：一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
b.以约140mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
c.以约50mM的浓度存在的精氨酸盐酸盐；
d.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％(w/v)的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
e.浓度为约10mM的乙酸钠。
实施例79：如实施例78所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约5.1至约5.7的pH。
实施例80：如实施例78或79所述的药物组合物，其中该药物组合物具有至少小于约50Cp的黏度(例如通过流变仪，例如TA仪器(特拉华州纽卡斯尔)AESR-G2锥板流变仪所测量)。
实施例81：一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
b.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
c.以约140mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
d.以约63mM的浓度存在的精氨酸盐酸盐；
e.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
f.浓度为约10mM的乙酸钠。
实施例82：如实施例81所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约5.1至约5.7的pH。
实施例83：如实施例81或82所述的药物组合物，其中该药物组合物具有至少小于约80Cp的黏度(例如通过流变仪，例如TA仪器(特拉华州纽卡斯尔)AESR-G2锥板流变仪所测量)。
实施例84：一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
b.以约155mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
c.以约70mM的浓度存在的精氨酸盐酸盐；
d.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％(w/v)的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
e.浓度为约10mM的乙酸钠。
实施例85：如实施例84所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约5.1至约5.7的pH。
实施例86：如实施例84或85所述的药物组合物，其中该药物组合物具有至少小于约45Cp的黏度(例如通过流变仪，例如TA仪器(特拉华州纽卡斯尔)AESR-G2锥板流变仪所测量)。
实施例87：一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
b.以约170mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
c.以约63mM的浓度存在的精氨酸盐酸盐；
d.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
e.浓度为约10mM的乙酸钠。
实施例88：如实施例87所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约5.1至约5.7的pH。
实施例89：如实施例87或88所述的药物组合物，其中该药物组合物具有至少小于约60Cp的黏度(例如通过流变仪，例如TA仪器(特拉华州纽卡斯尔)AESR-G2锥板流变仪所测量)。
实施例90：一种药物组合物，该药物组合物包含
a.浓度为约195-225mg/mL的PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
b.以约155mM的浓度存在的N-乙酰基精氨酸；
c.以约120mM的浓度存在的脯氨酸；
d.浓度为约0.005％(w/v)至约0.015％(w/v)的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)；和
e.浓度为约10mM的乙酸钠。
实施例91：如实施例90所述的药物组合物，其中该药物组合物具有约5.1至约5.7的pH。
实施例92：如实施例90或91所述的药物组合物，其中该药物组合物具有至少小于约60Cp的黏度(例如通过流变仪，例如TA仪器(特拉华州纽卡斯尔)AESR-G2锥板流变仪所测量)。
实施例93：如实施例78-92中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约-30℃或更冷情况下时稳定持续至少约2年。
实施例94：如实施例93所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约5年。
实施例95：如实施例78-92中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约5℃下时稳定持续至少约6个月。
实施例96：如实施例95所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约24个月。
实施例97：如实施例78-92中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约25℃下时稳定持续至少约1个月。
实施例98：如实施例97所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约三个月。
实施例99：如实施例98所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约6个月。
实施例100：如实施例78-92中任一项所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽当储存于约40℃下时稳定持续至少约1个月。
实施例101：如实施例78-92中任一项所述的药物组合物，其中该组合物在小于约3％的PCSK9结合多肽浓度下包含该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物。
实施例102：如实施例101所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物以小于约2.5％的该PCSK9结合多肽浓度存在。
实施例103：如实施例1-102中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物为液体。
实施例104：一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括给予如实施例1-103中任一项所述的药物组合物。
实施例105：一种试剂盒，该试剂盒包含如实施例1-103中任一项所述的药物组合物，以及选自由注射器、注射笔、主体注射器和自动注射器组成的组的递送装置。
实施例106：如实施例105所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含关于使用该递送装置给予该药物组合物的说明书。
实施例107：一种制备包含至少140mg/mL的PCSK9结合多肽的药物组合物中的PCSK9结合多肽的方法，该方法包括向包含该PCSK9结合多肽的药物组合物中添加有效量的N-乙酰基精氨酸，使得当与缺乏该N-乙酰基精氨酸的该药物组合物相比时，该药物组合物的黏度降低，并且其中该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
a.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
b.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
c.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
i.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
ii.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
d.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；和
e.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
iii.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
iv.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
v.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠。
实施例108：如实施例107所述的方法，其中该药物组合物的黏度小于80Cp(例如通过流变仪，例如TA仪器(特拉华州纽卡斯尔)AESR-G2锥板流变仪所测量)。
实施例109：如实施例108所述的方法，其中该药物组合物的黏度小于50cP。
实施例110：如实施例107-109中任一项所述的方法，其中该药物组合物具有约250至约400mOsm/kg的重量渗透浓度。
实施例111：如实施例110所述的方法，其中该药物组合物具有约300mOsm/kg的重量渗透浓度。
实施例112：如实施例111所述的方法，其中该药物组合物对人血细胞等渗。
实施例113：如实施例107所述的方法，其中该PCSK9结合多肽以约180mg/mL至约260mg/mL的浓度存在。
实施例114：如实施例113所述的方法，其中PCSK9结合多肽浓度为约210mg/mL。
实施例115：如实施例107-114中任一项所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM的浓度存在。
实施例116：如实施例115所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约140mM至约170mM的浓度存在。
实施例117：如实施例115所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约140mM的浓度存在。
实施例118：如实施例107-117中任一项所述的方法，该方法进一步包含缓冲液。
实施例119：如实施例118所述的方法，其中该缓冲液选自由乙酸盐、谷氨酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲液或其组合组成的组。
实施例120：如实施例119所述的方法，其中该缓冲液以约5mM至约30mM的浓度存在。
实施例121：如实施例120所述的方法，其中该缓冲液为乙酸钠且以约10mM的浓度存在。
实施例122：如实施例107-121中任一项所述的方法，其中该pH为约4.8至约6.9。
实施例123：如实施例122所述的方法，其中该pH为约5.4。
实施例124：如实施例107-123中任一项所述的方法，该方法进一步包含表面活性剂。
实施例125：如实施例124所述的方法，其中该表面活性剂选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)组成的组。
实施例126：如实施例125所述的方法，其中该表面活性剂以约0.0001％(w/v)至约1.0％(w/v)的浓度存在。
实施例127：如实施例126所述的方法，其中该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯且以约0.01％(w/v)的浓度存在。
实施例128：如实施例107-127中任一项所述的方法，该方法进一步包含脯氨酸。
实施例129：如实施例128所述的方法，其中该脯氨酸以约50mM至约150mM的浓度存在。
实施例130：如实施例129所述的方法，其中该脯氨酸以约90mM至约120mM的浓度存在。
实施例131：如实施例130所述的方法，其中该脯氨酸以约120mM的浓度存在。
实施例132：如实施例107-131中任一项所述的方法，该方法进一步包含精氨酸盐。
实施例133：如实施例132所述的方法，其中该精氨酸盐以约25mM至约150mM的浓度存在。
实施例134：如实施例133所述的方法，其中该精氨酸盐以约50mM至约100mM的浓度存在。
实施例135：如实施例133所述的方法，其中该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐。
实施例136：如实施例135所述的方法，其中该精氨酸盐酸盐以约50mM的浓度存在。
实施例137：如实施例107-136中任一项所述的方法，其中该PCSK9结合多肽当储存于约-30℃或更冷情况下时稳定持续至少约2年。
实施例138：如实施例137所述的方法，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约5年。
实施例139：如实施例107-136中任一项所述的方法，其中该PCSK9结合多肽当储存于约5℃下时稳定持续至少约6个月。
实施例140：如实施例139所述的方法，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约24个月。
实施例141：如实施例107-136中任一项所述的方法，其中该PCSK9结合多肽当储存于约25℃下时稳定持续至少约1个月。
实施例142：如实施例141所述的方法，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约三个月。
实施例143：如实施例142所述的方法，其中该PCSK9结合多肽稳定持续至少约6个月。
实施例144：如实施例107-136中任一项所述的方法，其中该PCSK9结合多肽当储存于约40℃下时稳定持续至少约1个月。
实施例145：如实施例107-136中任一项所述的方法，其中该组合物在小于约3％的PCSK9结合多肽浓度下包含该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物。
实施例146：如实施例145所述的方法，其中该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物以小于约2.5％的该PCSK9结合多肽浓度存在。
实施例147：一种配制治疗性多肽的方法，该方法包括
a.第一浓缩步骤，其中浓缩第一溶液中的该多肽；
b.第一溶液交换步骤，其中使用透滤将该第一溶液中经浓缩的多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第二溶液中；
c.第二浓缩步骤，其中浓缩该第二溶液中的该多肽；
d.第二溶液交换步骤，其中使用透滤将经浓缩的第二溶液中的该多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第三溶液中；和
e.第三浓缩步骤，其中浓缩该第三溶液中的该多肽；
其中该治疗性多肽包含PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽阻断PCSK9与LDLR结合并且选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
i.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238；
ii.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
3.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
4.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
5.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGFa结构域的位点重叠。
实施例148：如实施例147所述的方法，其中阻断PCSK9与LDLR结合的该PCSK9结合多肽为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
实施例149：如实施例147所述的方法，其中在该第三浓缩步骤之前，该包含该多肽的溶液的温度增加至约25℃至约37℃。
实施例150：如实施例147所述的方法，其中该第一溶液交换步骤使用至少三个置换体积的该第二溶液来实现。
实施例151：如实施例147所述的方法，其中该第二溶液交换步骤使用至少四个置换体积的该第三溶液来实现。
实施例152：如实施例147所述的方法，其中该治疗蛋白的初始浓度为约11mg/mL或更少。
实施例153：如实施例147所述的方法，其中在该第一浓缩步骤中，治疗性多肽浓度增加约3倍至约7倍。
实施例154：如实施例153所述的方法，其中该多肽的增加的浓度为约35mg/mL至约70mg/mL。
实施例155：如实施例147所述的方法，其中在该第二浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从该第一浓缩步骤增加约2倍至4倍。
实施例156：如实施例155所述的方法，其中该增加的多肽浓度为约140mg/mL。
实施例157：如实施例147所述的方法，其中在该第三浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从该第二浓缩步骤增加约1.5倍至约2倍。
实施例158：如实施例157所述的方法，其中该增加的多肽浓度为约260mg/mL。
实施例159：如实施例147所述的方法，其中该治疗性多肽具有与该治疗性多肽的初始浓度相比进一步浓缩至少约19-20倍的最终浓度。
实施例160：如实施例159所述的方法，其中该治疗性多肽的最终浓度为约210mg/mL。
实施例161：如实施例147所述的方法，其中这些浓缩步骤包括分批补料超滤。
实施例162：如实施例147所述的方法，其中该第二溶液和该第三溶液为同一的。
实施例163：如实施例147所述的方法，其中该包含N-乙酰基精氨酸的第二或第三溶液包含精氨酸盐和缓冲液。
实施例164：如实施例163所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM的浓度存在；该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐且以约25mM至约150mM的浓度存在；并且该缓冲液为浓度为约5mM至约30mM的乙酸钠缓冲液。
实施例165：如实施例164所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约140至约170mM的浓度存在；该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63至约70mM的浓度存在并且该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。
实施例166：如实施例164所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约140mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。
实施例167：如实施例164所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约155mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约70mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。
实施例168：如实施例164所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约170mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。
实施例169：如实施例165或166所述的方法，该方法进一步包含脯氨酸，其中该脯氨酸以约50mM至约150mM的浓度存在。
实施例170：如实施例163-169中任一项所述的方法，其中该第二或第三溶液具有约4.8至约6.9的pH。
实施例171：如实施例170所述的方法，其中该pH为约5.4。
实施例172：如实施例147所述的方法，其中在该第一和第二溶液交换步骤中，使用透滤膜，该透滤膜具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
a.大于约350μm但小于或等于约500μm的网眼；
b.大于膜面积的约32％但小于或等于约36％的开放面积；
c.小于约16.2n/cm但大于或等于约12.2n/cm的网目数；
d.大于约270μm但小于或等于约340μm的网线直径；
e.大于约160g/m2但小于或等于180g/m2的基础重量；
f.大于约515μm但小于或等于约610μm的厚度；
g.大于约1138.1g/m2但小于或等于约1919.3g/m2的膜负载；和
h.约60psi的最大补料压力。
实施例173：如实施例147-172中任一项所述的方法，其中在将该第三溶液浓缩之后，将表面活性剂添加至该第三溶液中。
实施例174：如实施例173所述的方法，其中该表面活性剂选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(TritonX-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)组成的组且以约0.0001％至约1％的浓度存在。
实施例175：如实施例175所述的方法，其中该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)且以约0.01％(w/v)的浓度存在。
实施例176：一种配制治疗性多肽的方法，该方法包括
a.第一浓缩步骤，其中使用分批补料超滤来浓缩第一溶液中的该多肽；
b.第一溶液交换步骤，其中使用透滤和三个置换体积的第二溶液将该第一溶液中经浓缩的多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸、精氨酸盐和缓冲液的该第二溶液中；
c.第二浓缩步骤，其中使用分批补料超滤来浓缩该第二溶液中的该多肽；
d.第二溶液交换步骤，其中使用透滤将经浓缩的第二溶液中的该多肽和四个置换体积的第三溶液交换至包含N-乙酰基精氨酸、精氨酸盐和缓冲液的该第三溶液中；
e.在该第二溶液交换步骤之后，增加该包含该多肽的溶液的温度至约25℃至约37℃；和
f.第三浓缩步骤，其中使用分批补料超滤浓缩进一步浓缩该多肽；
其中在第一和第二溶液交换步骤中，使用透滤膜，该透滤膜具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
g.大于约350μm但小于或等于约500μm的网眼；
h.大于膜面积的约32％但小于或等于约36％的开放面积；
i.小于约16.2n/cm但大于或等于约12.2n/cm的网目数；
j.大于约270μm但小于或等于约340μm的网线直径；
k.大于约160g/m2但小于或等于180g/m2的基础重量；
l.大于约515μm但小于或等于约610μm的厚度；
m.大于约1138.1g/m2但小于或等于约1919.3g/m2的膜负载；和
n.约60psi的最大补料压力；
并且
其中该治疗性多肽包含PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽阻断PCSK9与LDLR结合并且选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGFa结构域的位点重叠。
实施例177：如实施例176所述的方法，其中在该第三浓缩步骤之前，该包含该多肽的溶液的温度增加至约25℃至约37℃。
实施例178：如实施例176所述的方法，其中该治疗蛋白的初始浓度为11mg/mL或更少。
实施例179：如实施例176所述的方法，其中在该第一浓缩步骤中，治疗性多肽浓度增加约3倍至约7倍。
实施例180：如实施例179所述的方法，其中该多肽的增加的浓度为约35mg/mL至约70mg/mL。
实施例181：如实施例176所述的方法，其中在该第二浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从该第一浓缩步骤增加约2倍至4倍。
实施例182：如实施例181所述的方法，其中该增加的多肽浓度为约140mg/mL。
实施例183：如实施例176所述的方法，其中在该第三浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从该第二浓缩步骤增加约1.5倍至约2倍。
实施例184：如实施例183所述的方法，其中该增加的多肽浓度为约260mg/mL。
实施例185：如实施例176所述的方法，其中该治疗性多肽具有与该治疗性多肽的初始浓度相比进一步浓缩至少约19-20倍的最终浓度。
实施例186：如实施例185所述的方法，其中该治疗性多肽的最终浓度为约210mg/mL。
实施例187：如实施例176所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM的浓度存在；该精氨酸盐为精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐且以约25mM至约150mM的浓度存在，并且该缓冲液为浓度为约5mM至约30mM的乙酸钠缓冲液。
实施例188：如实施例188所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约140至约170mM的浓度存在；该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63至约70mM的浓度存在并且该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。
实施例189：如实施例188所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约140mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。
实施例190：如实施例188所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约155mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约70mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。
实施例191：如实施例188所述的方法，其中该N-乙酰基精氨酸以约170mM的浓度存在，该精氨酸盐酸盐、精氨酸乙酸盐或精氨酸谷氨酸盐以约63mM的浓度存在，该乙酸钠缓冲液以约10mM的浓度存在。
实施例192：如实施例176所述的方法，该方法进一步包含脯氨酸，其中该脯氨酸以约50mM至约150mM的浓度存在。
实施例193：如实施例176-192中任一项所述的方法，其中该第二或第三溶液具有约4.8至约6.9的pH。
实施例194：如实施例193所述的方法，其中该pH为约5.4。
实施例195：如实施例176-194中任一项所述的方法，其中在将该第三溶液浓缩之后，将表面活性剂添加至该第三溶液中。
实施例196：如实施例195所述的方法，其中该表面活性剂选自由聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，例如 F-68和其他)、山梨聚糖烷基酯()、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚和D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸盐(维他命E TPGS)组成的组且以约0.0001％至约1％的浓度存在。
实施例197：如实施例196所述的方法，其中该表面活性剂为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(聚山梨醇酯80)且以约0.01％(w/v)的浓度存在。
实施例198：一种配制治疗性多肽的方法，该方法包括
a.第一浓缩步骤，其中使用分批补料超滤来浓缩第一溶液中的该多肽；
b.第一溶液交换步骤，其中使用透滤将该第一溶液中经浓缩的多肽和三个置换体积的第二溶液交换至该第二溶液中；
c.第二浓缩步骤，其中使用分批补料超滤来浓缩该第二溶液中的该多肽；
d.第二溶液交换步骤，其中使用透滤和四个置换体积的第三溶液将经浓缩的第二溶液中的该多肽交换至该第三溶液中；
e.在该第二溶液交换步骤之后，增加该包含该多肽的溶液的温度至约25℃至约37℃；和
f.第三浓缩步骤，其中使用分批补料超滤浓缩进一步浓缩该多肽；
g.可替代地，添加浓度为约0.01％(w/v)的聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯至该第三浓缩步骤的所得溶液中的步骤，
其中该第二和第三溶液包含选自由以下组成的组的溶液：包含约140mM N-乙酰基精氨酸、约50mM精氨酸盐酸盐和约10mM乙酸钠的溶液，该溶液具有约5.2的pH；包含约155mMN-乙酰基精氨酸、约70mM精氨酸盐酸盐和约10mM乙酸钠的溶液，该溶液具有约5.4的pH；和包含约170mM N-乙酰基精氨酸、约10mM乙酸钠的溶液，该溶液具有约5.6的pH；
其中在第一和第二溶液交换步骤中，使用透滤膜，该透滤膜具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
h.大于约350μm但小于或等于约500μm的网眼；
i.大于膜面积的约32％但小于或等于约36％的开放面积；
j.小于约16.2n/cm但大于或等于约12.2n/cm的网目数；
k.大于约270μm但小于或等于约340μm的网线直径；
l.大于约160g/m2但小于或等于180g/m2的基础重量；
m.大于约515μm但小于或等于约610μm的厚度；
n.大于约1138.1g/m2但小于或等于约1919.3g/m2的膜负载；和
o.约60psi的最大补料压力；
并且
其中该治疗性多肽包含PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽阻断PCSK9与LDLR结合并且选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGFa结构域的位点重叠。
实施例199：如实施例104所述的方法，其中该受试者具有选自由以下组成的组的疾病或病症：
胆固醇相关疾病或病症，其选自由以下组成的组：家族性高胆固醇血症(包括包括杂合高胆固醇血症、纯合高胆固醇血症、家族缺陷性载脂蛋白B-100；多基因高胆固醇血症)、非家族性高胆固醇血症、高脂血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠心病、中风、心血管疾病、阿尔兹海默氏病和异常血脂症(包括原发性和继发性异常血脂症，例如代谢综合征、糖尿病、家族性组合高脂血症、家族性高三酰甘油血症；残粒移去障碍病、肝脂肪酶缺乏；继发于以下的异常血脂症：饮食不慎重，甲状腺功能减退，包括雌激素和助孕素疗法、β-阻断剂和噻嗪类利尿剂的药物；肾病综合征、慢性肾衰竭、库欣氏综合征、原发性胆汁性肝硬化、肝糖贮积病、肝瘤、胆汁郁积、肢端肥大症、胰岛素瘤、单一性生长激素缺乏或酒精诱导的高三酰甘油血症；
动脉粥样硬化疾病，其选自由以下组成的组：心血管死亡、非心血管或全因死亡、冠心病、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、中风(缺血性和出血性)、心绞痛、脑血管疾病以及急性冠状动脉综合征、心肌梗塞和不稳定心绞痛；和
可使用他汀类解决的疾病或病症。
实施例200：如实施例104所述的方法，其中该治疗该受试者包含降低选自由以下组成的组的病状的风险：致命和非致命心脏病发作、致命和非致命中风、心脏手术、用于心脏衰竭的住院、患有心脏病的受试者中的胸痛和/或由于已确立的心脏病而引起的心血管事件、归因于升高的CRP或hsCRP的心血管病状和复发性心血管事件。
实施例201：如实施例1-103中任一项所述的药物组合物，该药物组合物用作药物。
实施例202：如实施例201所述的药物组合物，其中该药物用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症：
胆固醇相关疾病或病症，其选自由以下组成的组：家族性高胆固醇血症(包括包括杂合高胆固醇血症、纯合高胆固醇血症、家族缺陷性载脂蛋白B-100；多基因高胆固醇血症)、非家族性高胆固醇血症、高脂血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠心病、中风、心血管疾病、阿尔兹海默氏病和异常血脂症(包括原发性和继发性异常血脂症，例如代谢综合征、糖尿病、家族性组合高脂血症、家族性高三酰甘油血症；残粒移去障碍病、肝脂肪酶缺乏；继发于以下的异常血脂症：饮食不慎重，甲状腺功能减退，包括雌激素和助孕素疗法、β-阻断剂和噻嗪类利尿剂的药物；肾病综合征、慢性肾衰竭、库欣氏综合征、原发性胆汁性肝硬化、肝糖贮积病、肝瘤、胆汁郁积、肢端肥大症、胰岛素瘤、单一性生长激素缺乏或酒精诱导的高三酰甘油血症；
动脉粥样硬化疾病，其选自由以下组成的组：心血管死亡、非心血管或全因死亡、冠心病、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、中风(缺血性和出血性)、心绞痛、脑血管疾病以及急性冠状动脉综合征、心肌梗塞和不稳定心绞痛；和
可使用他汀类解决的疾病或病症。
实施例203：如实施例202所述的方法，其中该药物用于降低选自由以下组成的组的病状的风险：致命和非致命心脏病发作、致命和非致命中风、心脏手术、用于心脏衰竭的住院、患有心脏病的受试者中的胸痛和/或由于已确立的心脏病而引起的心血管事件、归因于升高的CRP或hsCRP的心血管病状以及复发性心血管事件。
缩写
参考文献
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种药物组合物，该药物组合物包含
a.PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:l的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，以及
b.N-乙酰基精氨酸，
其中该药物组合物具有至少小于约80cP的黏度。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽以约140mg/mL至约260mg/mL的浓度存在。
4.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽浓度为约210mg/mL。
5.如权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM的浓度存在。
6.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含缓冲液。
7.如权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含表面活性剂。
8.如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含脯氨酸。
9.如权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含精氨酸盐。
10.如权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中该组合物在小于约3％的该PCSK9结合多肽浓度下包含该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物。
11.如权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物为液体。
12.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括给予如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物。
13.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，以及选自由注射器、注射笔、主体注射器和自动注射器组成的组的递送装置。
14.一种制备包含至少140mg/mL的PCSK9结合多肽的药物组合物中的PCSK9结合多肽的方法，该方法包括向包含该PCSK9结合多肽的药物组合物中添加有效量的N-乙酰基精氨酸，使得当与缺乏该N-乙酰基精氨酸的该药物组合物相比时，该药物组合物的黏度降低，并且其中该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
a.包含具有SEQ ID NO:l的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
b.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
c.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
i.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14中的CDR3的重链CDR3，以及
ii.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ IDNO:15中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15中的CDR3的轻链CDR3；
d.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；和
e.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
i.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
ii.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区。
15.一种配制治疗性多肽的方法，该方法包括
a.第一浓缩步骤，其中浓缩第一溶液中的该多肽；
b.第一溶液交换步骤，其中使用透滤将该第一溶液中经浓缩的多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第二溶液中；
c.第二浓缩步骤，其中浓缩该第二溶液中的该多肽；
d.第二溶液交换步骤，其中使用透滤将经浓缩的第二溶液中的该多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第三溶液中；和
e.第三浓缩步骤，其中浓缩该第三溶液中的该多肽；
其中该治疗性多肽包含PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽阻断PCSK9与LDLR结合并且选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:l的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ ID NO:15中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:l中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区。
16.如权利要求14所述的方法，e.ii，其中阻断PCSK9与LDLR结合的该PCSK9结合多肽为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
17.如权利要求14所述的方法，e.ii，其中在第三浓缩步骤之前，该包含该多肽的溶液的温度增加至约25℃至约37℃。
18.如权利要求14所述的方法，e.ii，其中在该第一浓缩步骤中，治疗性多肽浓度增加约3倍至约7倍。
19.如权利要求14所述的方法，e.ii，其中在该第二浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从该第一浓缩步骤增加约2倍至4倍。
20.如权利要求14所述的方法，e.ii，其中在该第三浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从该第二浓缩步骤增加约1.5倍至约2倍。
21.如权利要求14所述的方法，e.ii，其中该治疗性多肽具有与该治疗性多肽的初始浓度相比进一步浓缩至少约19-20倍的最终浓度。
22.如权利要求14所述的方法，e.ii，其中这些浓缩步骤包括分批补料超滤。
23.如权利要求15至22中任一项所述的方法，其中该第二或第三溶液具有约4.8至约6.9的pH。
24.如权利要求14所述的方法，e.ii，其中在该第一和第二溶液交换步骤中，使用透滤膜，该透滤膜具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
a.大于约350μm但小于或等于约500μm的网眼；
b.大于膜面积的约32％但小于或等于约36％的开放面积；
c.小于约16.2n/cm但大于或等于约12.2n/cm的网目数；
d.大于约270μm但小于或等于约340μm的网线直径；
e.大于约160g/m2但小于或等于180g/m2的基础重量；
f.大于约515μm但小于或等于约610μm的厚度；
g.大于约1138.1g/m2但小于或等于约1919.3g/m2的膜负载；和
h.约60psi的最大补料压力。
25.如权利要求14.e.ii至24中任一项所述的方法，其中在将该第三溶液浓缩之后，将表面活性剂添加至该第三溶液中。

Claims (25)

1.一种药物组合物，该药物组合物包含
a.PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ IDNO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠；
以及
b.N-乙酰基精氨酸，
其中该药物组合物具有至少小于约80cP的黏度。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽以约140mg/mL至约260mg/mL的浓度存在。
4.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中该PCSK9结合多肽浓度为约210mg/mL。
5.如权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中该N-乙酰基精氨酸以约25mM至约230mM的浓度存在。
6.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含缓冲液。
7.如权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含表面活性剂。
8.如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含脯氨酸。
9.如权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含精氨酸盐。
10.如权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中该组合物在小于约3％的该PCSK9结合多肽浓度下包含该PCSK9结合多肽的高分子量聚集体或寡聚物。
11.如权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物为液体。
12.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括给予如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物。
13.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，以及选自由注射器、注射笔、主体注射器和自动注射器组成的组的递送装置。
14.一种制备包含至少140mg/mL的PCSK9结合多肽的药物组合物中的PCSK9结合多肽的方法，该方法包括向包含该PCSK9结合多肽的药物组合物中添加有效量的N-乙酰基精氨酸，使得当与缺乏该N-乙酰基精氨酸的该药物组合物相比时，该药物组合物的黏度降低，并且其中该PCSK9结合多肽选自由以下组成的组：
a.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链多肽的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
b.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
c.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
i.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
ii.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQID NO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
d.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237和D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237和D238；以及
e.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
i.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
ii.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
iii.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGF-A结构域的位点重叠。
15.一种配制治疗性多肽的方法，该方法包括
a.第一浓缩步骤，其中浓缩第一溶液中的该多肽；
b.第一溶液交换步骤，其中使用透滤将该第一溶液中经浓缩的多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第二溶液中；
c.第二浓缩步骤，其中浓缩该第二溶液中的该多肽；
d.第二溶液交换步骤，其中使用透滤将经浓缩的第二溶液中的该多肽交换至包含N-乙酰基精氨酸的第三溶液中；和
e.第三浓缩步骤，其中浓缩该第三溶液中的该多肽；
其中该治疗性多肽包含PCSK9结合多肽，该PCSK9结合多肽阻断PCSK9与LDLR结合并且选自由以下组成的组：
i.包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体(依伏库单抗)，或其抗原结合片段；
ii.与依伏库单抗竞争结合PCSK9的单克隆抗体；
iii.单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1.包含以下互补决定区(CDR)的重链多肽：作为SEQ ID NO:14或16中的CDR1的重链CDR1；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR2的重链CDR2；作为SEQ ID NO:14或16中的CDR3的重链CDR3，以及
2.包含以下CDR的轻链多肽：作为SEQ ID NO:15或17中的CDR1的轻链CDR1；作为SEQ IDNO:15或17中的CDR2的轻链CDR2；和作为SEQ ID NO:15或17中的CDR3的轻链CDR3；
iv.与PCSK9的以下残基中的至少一个结合的单克隆抗体，该PCSK9包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T1897、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238；
v.在PCSK9上的表位处与PCSK9结合的单克隆抗体，该表位与通过如下抗体结合的表位重叠，该抗体包含：
1.SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的重链可变区；和
2.SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的轻链可变区，并且
3.其中该单克隆抗体的该表位进一步与LDLR的EGFa结构域的位点重叠。
16.如权利要求15所述的方法，其中阻断PCSK9与LDLR结合的该PCSK9结合多肽为包含重链多肽的单克隆抗体，该重链多肽包含以下互补决定区(CDR)：
a.分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；和
b.分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
17.如权利要求15所述的方法，其中在该第三浓缩步骤之前，该包含该多肽的溶液的温度增加至约25℃至约37℃。
18.如权利要求15所述的方法，其中在该第一浓缩步骤中，治疗性多肽浓度增加约3倍至约7倍。
19.如权利要求15所述的方法，其中在该第二浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从该第一浓缩步骤增加约2倍至4倍。
20.如权利要求15所述的方法，其中在该第三浓缩步骤中，治疗性多肽浓度从该第二浓缩步骤增加约1.5倍至约2倍。
21.如权利要求15所述的方法，其中该治疗性多肽具有与该治疗性多肽的初始浓度相比进一步浓缩至少约19-20倍的最终浓度。
22.如权利要求15所述的方法，其中这些浓缩步骤包括分批补料超滤。
23.如权利要求15至22中任一项所述的方法，其中该第二或第三溶液具有约4.8至约6.9的pH。
24.如权利要求15所述的方法，其中在该第一和第二溶液交换步骤中，使用透滤膜，该透滤膜具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
a.大于约350μm但小于或等于约500μm的网眼；
b.大于膜面积的约32％但小于或等于约36％的开放面积；
c.小于约16.2n/cm但大于或等于约12.2n/cm的网目数；
d.大于约270μm但小于或等于约340μm的网线直径；
e.大于约160g/m2但小于或等于180g/m2的基础重量；
f.大于约515μm但小于或等于约610μm的厚度；
g.大于约1138.1g/m2但小于或等于约1919.3g/m2的膜负载；和
h.约60psi的最大补料压力。
25.如权利要求15至24中任一项所述的方法，其中在将该第三溶液浓缩之后，将表面活性剂添加至该第三溶液中。
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