CN110526843A

CN110526843A - 抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅱ的化合物及其应用

Info

Publication number: CN110526843A
Application number: CN201910254806.6A
Authority: CN
Inventors: 李文山; 林宜玲; 陈维家; 史曼均
Original assignee: Academia Sinica
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2018-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2019-12-03
Also published as: TW201941770A; TWI711448B; US20190300475A1; US10494334B2

Abstract

本发明是关于一种抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(calcium/calmodulin‑dependent protein kinase II，CaMKII)的化合物及其应用。本发明特别是关于一种新颖的苯磺酰胺(benzenesulfonamide)衍生物以及将其用于制备CaMKII抑制剂的用途。本发明提供式(I)所示的化合物，以及含有该式(I)所示的化合物的医药组合物。本发明亦提供利用该式(I)所示的化合物制备治疗与CaMKII活性相关的疾病或状态如黄病毒感染的医药组合物的用途。

Description

抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II的化合物及其应用

技术领域

本发明是关于一种抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(calcium/ calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)的化合物及其应用。本发明特别是关于一种新颖的苯磺酰胺(benzenesulfonamide)衍生物以及将其用于制备 CaMKII抑制剂的用途。

背景技术

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)是丝氨酸(serine)/苏氨酸(threonine)专一性蛋白激酶，其活性是由钙与钙调蛋白的复合物调节。CaMKII普遍表现于各种组织中，其在神经元、心肌细胞、内皮细胞及免疫细胞中发挥独特作用。 CaMKII活性上升是心血管及神经疾病的关键致病标靶。据报导，CaMKII亦是癌症进展的原因。此外，最近一项研究指出CaMKII介导黄病毒科 (Flaviviridae)一员的日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)的细胞结合及/或细胞进入(参见Simanjuntak et al.，Front Microbiol2017，8：651)。制药公司现今正竞相开发安全且有效的CaMKII抑制剂。然而，CaMKII抑制剂对黄病毒感染的可能作用仍属未知。

登革病毒(dengue virus，DENV)及兹卡病毒(Zika virus，ZIKV)是新兴的经蚊传播黄病毒，其对全球公共健康构成威胁。兹卡病毒对人群的感染可引起广泛的临床特征，从轻度登革热(dengue fever)到严重的登革出血热(dengue hemorrhagic fever)以及危及性命的登革热休克症候群(dengue shock syndrome)。一项新近研究表示，登革病毒感染的流行率增加至每年3.9亿例。尽管已成功控制死亡率，反复发生的登革热疫情对流行病所在国家的社会经济造成了重大影响。同样地，尽管兹卡病毒感染的病例死亡率低，但此感染与基兰-巴瑞症候群(Guillain-Barré syndrome)及包括小头畸形(microcephaly)在内的先天缺陷相关。兹卡病毒感染已然成为国际关注的公卫紧急事件。据报导，在巴西大爆发期间约有4300名婴儿出生时患上小头畸形。

登革病毒及兹卡病毒是有套膜的小病毒，其具有约为11kb的正链RNA 基因组。该基因组编码一多蛋白(polyprotein)，其被加工为三种结构性蛋白 (structuralproteins)，即衣壳(capsid)蛋白、前膜(premembrane，prM)蛋白、及套膜(envelope，E)蛋白，以及七种非结构蛋白(nonstructural proteins)，分别称为 NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5。病毒感染是始于主结构的套膜蛋白与细胞表面受体结合，并且利用细胞内吞作用(endocytosis)进入细胞。细胞内的病毒经历酸诱导的构形变化及膜融合以便释放病毒基因组。病毒 RNA的转译是藉由RNA依赖性RNA聚合反应(RNA-dependent RNApolymerization)来产生病毒RNA复制所需的蛋白质。病毒RNA与病毒蛋白的组装会产生成熟的病毒颗粒，其后透过细胞分泌途径释放。

抗病毒药物及疫苗是控制病毒性疾病的两种主要手段。目前尚无用于登革病毒及兹卡病毒感染的抗病毒药物或疫苗被核准。针对这些黄病毒的疫苗开发正面临挑战，因为与登革病毒或兹卡病毒的E蛋白或prM蛋白结合的现有抗体已被证明会增强免疫个体中的单核细胞被后续病毒感染。在抗病毒药物发展方面，病毒复制所需的病毒及细胞蛋白都是有潜力的标靶。如上所述，CaMKII 是否是合适的抗病毒标靶仍有待厘清。

发明内容

本发明是基于一项意外发现，即新设计的苯磺酰胺衍生物可当作CaMKII 抑制剂，并且可用于治疗与CaMKII活性相关的疾病，例如登革病毒及兹卡病毒感染。

缘此，本发明的一目的在提供一种式(I)所示的化合物：

其中，R₁为氢、具有3至7个成环碳原子的环烷基、具有2至8个成环碳原子与至少1个选自由氮、氧、及硫所组成群组的杂原子的杂环基、或具有 2至3个环且各环具有4至6个环原子的芳基；或R₁与连接R₁的苯环形成具有8至10个成环碳原子的稠合碳双环；R₂为具有4至10个成环碳原子的环烷基、或为选自由噻唑(thiazole)、咪唑(imidazole)、四唑(tetrazole)、咪唑啶 (imidazolidine)、咪唑啉(imidazoline)、异恶唑(isoxazole)、及苯并咪唑 (benzimidazole)所组成群组的杂环基；以及n为1、2、4或6。

在本发明的一实施例中，R₁为氢以及n为1。在一较佳实施例中，该化合物如下式之一所示：

及

在本发明的另一实施例中，R₁为氢；R₂为环庚烷基；以及n为2、4或6。

在本发明的另一实施例中，R₂为环庚烷基以及n为1。在一较佳实施例中，该化合物如下式之一所示：

及

本发明的另一目的在提供一种医药组合物，包含至少一如上定义的化合物，以及一药学上可接受的载体。

本发明的又一目的在提供一种抑制细胞中CaMKII活性的方法，包含将该细胞接触一有效量的式(I)化合物，或接触一含有该有效量式(I)化合物的医药组合物。

本发明的又一目的在提供一种式(I)化合物的用途，是用于制备治疗与 CaMKII活性相关的疾病或状态的医药组合物。.

该与CaMKII活性相关的疾病或状态是指相比未患病个体，与一需要治疗个体的特定细胞或组织中的CaMKII活性增加有因果关是的疾病或状态。这种疾病或状态亦包括由CaMKII活性引起及/或加剧的症状。在一实施例中，所述疾病或状态为一黄病毒感染，其中该黄病毒是选自由登革病毒、兹卡病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒(West Nilevirus)、黄热病病毒(yellow fever virus)、及其任意组合所组成的群组。在另一实施例中，所述疾病或状态为一癌症，例如肺癌、乳癌、前列腺癌、及结肠癌。在又一实施例中，所述疾病或状态是为一心血管疾病或状态，例如心律不整(arrhythmia)、缺血-再灌流损伤(ischemia-reperfusion injury)、及心脏衰竭(heart failure)。在又一实施例中，所述疾病或状态为一神经疾病，例如阿兹海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、及癫痫(epilepsy)。

本发明的又一目的在提供一种抑制黄病毒进入细胞的方法，包含将该细胞接触一有效量的式(I)化合物。

在本发明的一实施例中，该黄病毒是选自由登革病毒、兹卡病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、及其任意组合所组成的群组。

本发明揭露式(I)化合物可有效抑制CaMKII促成的蛋白质磷酸化，并且改进登革病毒或兹卡病毒感染动物的存活状况。因此，本发明提供了治疗与 CaMKII活性相关的疾病或状态的新策略。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式。下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非用以限定本发明的范围。任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1A是先导化合物1中假定会影响抗病毒活性及细胞毒性的四个子结构，包括一苯基部分、一苯磺酰胺部分、一末端环、以及该苯磺酰胺部分与该末端环之间的一连接单元；

图1B是制得具有磺酰胺及氟苯单元的先导化合物1及类似物2的流程图；

图1C是藉由在4-甲氧基苯磺酰胺的N-取代基位置引入质子(H)及甲基 (CH₃)基团来代替原始苯环，产生不同取代的磺酰胺3及4的流程图；

图1D是合成苯磺酰胺类似物5-16的流程图；

图2A是不同剂量的化合物9对BE(2)C细胞的细胞毒性作用图；该细胞是以指定剂量的化合物9处理，并且对其进行LDH细胞毒性试验、XTT细胞增殖试验、及台盼蓝(Trypanblue)细胞计数；*表示基于学生T检定、与溶剂对照相比为P＜0.05；

图2B是BE(2)C细胞在有或无指定剂量化合物9的情况下感染第2型登革病毒(DENV-2)，并且对其进行DENV-2 NS3蛋白与细胞核的免疫染色后的免疫荧光影像图；

图2C是以西方墨点法分析图2B中细胞的DENV-2 NS3蛋白及β-肌动蛋白 (β-actin；作为样品注入对照)的蛋白质含量图；NS3蛋白相对于肌动蛋白的比例是以溶剂对照进行标准化；

图2D是图2B中细胞的培养物上清液的病毒效价图；*和**分别表示基于学生T检定、与溶剂对照相比为P＜0.05及P＜0.01；

图2E是BE(2)C细胞在有或无指定剂量化合物9的情况下感染兹卡病毒 (ZIKV)48小时，并且对其进行ZIKV E蛋白与细胞核的免疫染色后的免疫荧光影像图；

图2F是图2E中细胞的ZIKV E蛋白及β-肌动蛋白(作为样品注入对照)的蛋白质含量图；E蛋白相对于肌动蛋白的比例是以溶剂对照进行标准化；

图2G是图2E中细胞的培养物上清液的病毒效价图；*和**分别表示基于学生T检定、与溶剂对照相比为P＜0.05及P＜0.01；

图3A是BE(2)C细胞在病毒吸附期间(感染后0至3小时，标示为0-3hpi)或病毒吸附后(感染后3至24小时，标示为3-24hpi)有或无指定剂量化合物9的情况下感染DENV-2，并以西方墨点法分析该细胞的DENV-2 NS3蛋白及β-肌动蛋白 (作为样品注入对照)的蛋白质含量图；NS3蛋白相对于肌动蛋白的比例是以溶剂对照进行标准化；

图3B是在有或无指定剂量化合物9的情况下，ZIKV结合及进入BE(2)C细胞的数量图；*及**分别表示基于学生T检定、与溶剂对照相比为P＜0.05及P ＜0.01；

图3C是在有或无指定剂量化合物9的情况下，DENV-2或ZIKV结合 BE(2)C细胞的数量图；

图3D是在有或无指定剂量化合物9的情况下，ZIKV进入BE(2)C细胞的数量图；虚线表示侦测极限(DL)；

图4A是化合物9(标示为C9)的实时治疗对感染DENV-2的Stat1^-/-小鼠的存活状况的保护作用图；治疗日以箭头标记；

图4B是化合物9(C9)的实时治疗对感染ZIKV的Stat1^-/-小鼠的存活状况的保护作用图；治疗日以箭头标记；

图4C是由图4A-4B中经过不同处理的小鼠采集得血清样品的病毒效价图；*及**分别表示基于学生T检定、与溶剂对照相比为P＜0.05及P＜0.01；

图4D是化合物9(C9)的8小时延迟治疗对感染DENV-2的Stat1^-/-小鼠的存活状况的保护作用图；治疗日以箭头标记；

图4E是化合物9(C9)的8小时延迟治疗对感染ZIKV的Stat1^-/-小鼠的存活状况的保护作用图；治疗日以箭头标记；

图5A是化合物9在CaMKII中的嵌合构形图；

图5B是化合物9与CaMKII的指定胺基酸残基间的氢键(虚线)及疏水交互作用(实线)图；

图6A的化合物9及KN-62对CaMKII活性的抑制作用图；*和**分别表示基于学生T检定、与溶剂对照相比为P＜0.05及P＜0.01；

图6B是化合物7、8、及16对CaMKII活性的抑制作用图；*和**分别表示基于学生T检定、与溶剂对照相比为P＜0.05及P＜0.01。

具体实施方式

除非另有定义，本文中使用的所有技术与科学术语及缩写的含义与本发明所属领域熟习技艺人士的一般理解相同。

定义

本文给出的数值为近似值，并且实验数据可在20％的范围内变化，较佳为在10％的范围内变化，最佳为在5％的范围内变化。因此，「约」及「近似」等用语是指在一给定数值或范围的20％范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

除非另有定义，术语「环烷基(cycloalkyl)」是指一具有3至10个成环碳原子的非芳香族碳环，而所谓成环碳原子是彼此键结以形成环的碳原子。该环可以是饱和的(saturated)或具有一个或多个碳-碳双键。环烷基的例子包括但不限于环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环戊烯基、环己烷基、环己烯基、及环庚烷基，以及桥联(bridged)与笼形(caged)的饱和环基团，例如降冰片烷基 (norbornyl)及金刚烷基(adamantyl)。

术语「碳环(carbocycle)」是指一含有3至14个成环碳原子的饱和碳环、部分饱和碳环、或芳香环系统。碳环通常含有3至10个成环碳原子，例如环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烷基、环己烯基、环己二烯基、及苯基。或者，碳环可以是稠合的二个或三个碳环，例如萘基 (naphthalenyl)、四氢萘基(tetrahydronaphthalenyl)、茚基(indenyl)、异茚基 (isoindenyl)、双环癸烷基(bicyclodecanyl)、蒽基(anthracenyl)、菲(phenanthrenyl)、苯并萘基(benzonaphthenyl，亦称萉基(phenalenyl))、芴基(fluorenyl)、及十氢萘基(decalinyl)。

术语「杂环(heterocycle)」是指一含有3至14个成环原子的饱和环状、部分饱和环状、或芳香环系统，其中至少一个成环原子是杂原子，即氧、氮、或硫。杂环可以是单环、双环、或三环系统，其可包括稠合环。杂环的例子包括但不限于氮呯(azepine)、吡咯(pyrroles)、噻吩(thiophene)、咪唑(imidazole)、呋喃(furan)、噻唑(thiazole)、异噻唑(isothiazole)、异恶唑(isoxazole)、吲哚(indole)、吡啶(pyridine)、哒嗪(pyridazine)、吡嗪(pyrazine)、哌啶(piperidine)、哌嗪 (piperazine)、四氢呋喃(tetrahydrofuran)、四氢哌喃(tetrahydropyran)、1，4-二恶烷(1，4-dioxane)、三唑(triazoles)、四唑(tetrazole)、苯并咪唑(benzimidazole)、苯并噻唑(benzothiazole)、苯并嘧啶(benzopyrimidine)、噻二唑(thiadiazole)、嘌呤 (purine)、及喹啉酮(quinolone)。

除非另有定义，术语「芳基(aryl)」是指一含有一个或二至三个分离或稠合环的取代基，其中至少一个环是五元或六元的碳芳香环，例如苯。芳基取代基可具有6至18个碳原子。芳基取代基的例子包括苯基、萘基、及蒽基。芳基取代基的例子还包括一C₄-C₆碳环或一与苯基、萘基、或蒽基稠合的四至六元杂环，例如四氢萘基、茚基、异茚基、二氢茚基(indanyl)、菲基、苯并萘基、及芴基。芳基取代基可以是取代的(substituted)或未取代的(unsubstituted)。「取代的」是指一基团中的一个或多个氢原子各自独立地被相同或不同的取代基所取代。典型的取代基包括但不限于-X、-R^1a、-O^-、＝O、-OR^1a、-SR^1a、-S^-、＝S、-NR^1aR^1b、＝NR^1a、-CX₃、-CF₃、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO₂、＝N₂、-N₃、-S(O)₂O^-、-S(O)₂OH、-S(O)₂R^1a、-OS(O₂)O^-、-OS(O)₂R^1a、-P(O)(O^-)₂、 -P(O)(OR^1a)(O^-)、-OP(O)(OR^1a)(OR^1b)、-C(O)R^1a、-C(S)R^1a、-C(O)OR^1a、 -C(O)NR^1aR^1b、-C(O)O^-、-C(S)OR^1a、-NR^2aC(O)NR^1aR^1b、-NR^2aC(S)NR^1aR^1b、-NR^2aC(NR^1a)NR^1aR^1b、-C(NR^1a)NR^1aR^1b、-S(O)₂NR^1aR^1b、-NR^2aS(O)₂R^1a、 -NR^2aC(O)R^1a、及-S(O)R^1a，其中各X独立地为卤素；各R^1a及R^1b独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基(arylalkyl)、取代的芳基烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基(cycloheteroalkyl)、取代的杂环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、-NR^2aR^2b、-C(O)R^2a、或-S(O)₂R^2a；任选地，R^1a及R^1b与连接该二者的原子一起形成一个或多个杂环烷基、取代的杂环烷基、杂芳基、或取代的杂芳基环；R^2a及R^2b独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、环烷基、取代的环烷基，杂环烷基、取代的杂环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、或取代的杂芳基烷基；或任选地，R^2a及R^2b与连接该二者的氮原子一起形成一个或多个杂环烷基、取代的杂环烷基、杂芳基、或取代的杂芳基环。在某些实施例中，一三级胺或芳香族氮可以被一个或多个氧原子取代以形成相应的氮氧化物。

本文揭露的化合物可经由任何适合的途径给予有需要的个体，较佳的给药方式是适应这类途径的医药组合物。举例而言，给药方式可以是口服、经黏膜、或肠内给药，或者肠外给药，包括肌肉内、皮下、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、鼻内及眼内注射。

本文中所用术语「有效量」是指赋予接受治疗个体治疗效果所需的活性成分的量。如本领域熟习技艺人士所知，有效剂量将依据给药途径、使用赋形剂、及可能与其他治疗性处置共同使用而变化。

本文中所用术语「药学上可接受的载体」是指与组合物的活性成分兼容(较佳地，能够稳定活性成分)并且对有待治疗的个体无害的任何载体。药学上可接受的载体或赋形剂可包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫胺酸(methionine)；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵(octadecyldimethylbenzylammonium chloride)、六甲基氯化铵 (hexamethonium chloride)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵 (benzethonium chloride)、苯酚、苯甲醇、如对羟基苯甲酸甲酯的对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、及间甲酚；低分子量(少于约10个残基)的多肽；胺基酸，例如甘胺酸(glycine)、麸酰胺酸 (glutamine)、天冬酰胺酸(asparagine)、组胺酸(histidine)、精胺酸(arginine)或离胺酸(lysine)；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；单醣、双醣、及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖(mannose)、葡聚醣(dextran)、蔗糖、甘露醇(mannitol)、海藻糖(trehalose)、及山梨醇(sorbitol)；螯合剂如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)；成盐相对离子，例如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；及非离子性界面活性剂，例如 TWEEN^TM(聚山梨醇酯)、PLURONICS^TM(泊洛沙姆(poloxamer))、或聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG)。

术语「个体」是指需要治疗与CaMKII活性相关的疾病或状态(例如黄病毒感染)的哺乳动物。该个体是人类或非人类，例如灵长类、小鼠、狗、猫、牛、马、兔、猪等。

方法及材料

化学物鉴定

除非另有说明，所有试剂及溶剂均从商业来源获得并按购买时形式使用。四氢呋喃(tetrahydrofuran，THF)是在惰性氮气下从钠/二苯甲酮羰基中新蒸馏出。 ¹H核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)及¹³C NMR光谱是以Bruker AVIII-400、AV-400、或AV-500记录。质子化学位移以百万分率(ppm)为单位，其是相对于氘代氯仿(deuteriochloroform)中残留的CHCl₃在7.24ppm的单峰。碳化学位移以百万分率为单位，其是相对于CDCl₃(77.0ppm)及丙酮-d₆(29.1 ppm)的内部¹³C讯号。高分辨率质谱(highresolution mass spectra，HRMS)是使用Waters LCT Premier XE(Waters公司，Manchester，英国)及Bruker New ultrafleXtreme(Bruker，Bremen，德国)而获得。分析型薄层层析(thin layer chromatography，TLC)是在硅胶60F₂₅₄(Merck)上进行。管柱层析(column chromatography)是在硅胶60(230-400目)(Merck)上进行。藉由正相高效液相层析(high-performance liquid chromatography，HPLC)确定化合物的纯度高于95％， HPLC是使用Waters 1525二元系统，配合Waters 2489双λ吸光侦测器以及 Purospher STAR Si(5μm)(Merck)与Venusil XBP Silica(Agela Technologies)管柱。冲提液为乙酸乙酯及己烷。所有化合物的侦测是在254nm。

细胞株

实施例中使用的所有细胞均购自美国典型培养物保存中心(American TypeCulture Collection，ATCC)，包括幼仓鼠肾BHK-21细胞(ATCC CCL-10)、蚊 C6/36细胞(ATCC CRL-1660)、非洲绿猴肾上皮细胞(Vero；ATCC CRL-1587)、及人神经母细胞瘤BE(2)C细胞(ATCC CRL-2268)。

构建DENV-2-eGFP报导病毒

为评估候选化合物的抗病毒活性，建构一具有SP6启动子的DENV-2感染性选殖株(SP6-Den2)。简言之，自DENV-2PL046病毒株(GenBank登录号： AJ968413.1)萃取基因组RNA并用于反转录聚合酶链锁反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)以产生五个cDNA片段，其分别含有第1-1512、1342-4250、4132-6375、4522-9368、及6838-10723个核苷酸。将这些cDNA片段选殖至pJET1.2载体的多接头(polylinker)位点，而后凭借限制酶与接合(ligation)的标准策略，利用pBR322载体产出病毒全长cDNA选殖株。为建构一DENV-2-eGFP报导病毒，将一包含eGFP cDNA及猪铁士古病毒(Teschovirus，PTV1)2A序列的DNA片段插入该SP6-Den2的5′UTR 及DENV-2的ATG起始密码子之间。以单引子PCR突变对该SP6-Den2的环化序列(cyclization sequence，CS)进行沉默突变。将编码DENV-2衣壳蛋白的前34个胺基酸及含有该环化序列的DNA序列藉由PCR及钝端连合(blunt end ligation)插入该SP6-Den2感染性选殖株。该选殖株最终含有重复的衣壳蛋白单元，其后接着eGFP-PTV2A及DENV-2基因组的5′端，而该DENV-2基因组具有保守突变的环化序列(SP6-Den2 C34-eGFP-2A 5′CS mut)。将该DENV-2报导病毒的病毒RNA自SP6启动子在体外转录。利用微脂体Lipofecramine 2000(Thermo Fisher Scientific)将病毒RNA转染至BHK-21细胞中以产生 DENV-2报导病毒。该报导病毒是在蚊C6/36细胞中完成扩增。

以细胞为基础的抗DENV-2筛选

人类神经母细胞瘤BE(2)C细胞是培养于添加10％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)的RPMI 1640培养基(Gibco)。进行筛选前，将BE(2)C细胞接种于一具有透明平底的黑色96孔盘(Corning Costar 3603)。该细胞是在有或无不同剂量指定化合物的情况下，以感染倍率(MOI)为1的DENV-2-eGFP报导病毒感染24小时。使用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)作为溶剂对照。经过处理的细胞以4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定，并以Hoechst染色细胞核。评估候选化合物的抗病毒活性时，利用ImageXpress MicroXLS高含量分析系统(Molecular Devices)测量细胞培养物的eGFP表现。指示病毒感染的eGFP相对荧光强度以溶剂对照的百分比表示。

细胞毒性试验

使用细胞毒性检测试剂组(LDH)(Roche)、细胞增殖试剂组(XTT)(Roche)、及台盼蓝(Trypan blue)细胞计数试验来评估候选化合物对BE(2)C细胞的细胞毒性。简言之，细胞以指定剂量的候选化合物处理过夜后用于该三种试验。进行LDH和XTT试验时，使用酵素连结免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)读取仪(MolecularDevices)测定样品在490nm的吸光值。进行台盼蓝细胞计数试验时，使用血球计数器测定活细胞的数目。实验数据以溶剂对照标准化并且表示为百分比。

抗病毒试验

体外试验中使用分离自中国台湾登革热患者的DENV-2 PL046病毒株(GenBank登录号：AJ968413.1)及中国台湾疾病控制中心提供的ZIKV PRVABC59病毒株(GenBank登录号：KU501215)。BE(2)C细胞在有或无不同剂量化合物9的情况下以MOI为0.1的DENV-2或ZIKV感染48小时。化合物9的抗病毒活性的评估是利用免疫荧光试验(immunofluorescence assay，IFA)、西方墨点法(Western blotting)、及病毒蚀斑形成试验(plaque-forming assay，PFA)。检测DENV-2 NS3蛋白或ZIKV E蛋白的表现时，是分别将细胞与抗DENV NS3蛋白抗体或抗黄病毒E蛋白抗体共培养。免疫荧光试验中使用连结AlexaFluor-488的抗小鼠二级抗体(Molecular Probes)及用于细胞核染色的Hoechst(Molecular Probes)。经染色的细胞以倒立荧光显微镜(Olympus 1X71)观察。西方墨点法是使用抗β蛋白抗体(Chemicon)及连结山葵过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗小鼠二级抗体(Jackson ImmunoResearch)，并藉由增强型化学发光试剂(ECL；Pierce)侦测讯号。感染性DENV-2及ZIKV颗粒的数量是分别利用BHK-21及Vero细胞的病毒蚀斑形成试验来测量。病毒效价表示为 Log蚀斑形成单位(plaque-forming unit，PFU)/mL，并用于确定半数最大有效浓度(EC₅₀)。EC₅₀的计算是使用本技术领域已知的方法，参见例如Alexander，B.et al.A simple and accurate mathematical method for calculationof the EC50.J Pharmacol Toxicol 1999，41，55-58。

病毒结合/进入试验

进行病毒结合/进入试验时，在有或无指定剂量化合物9的情况下，使 DENV-2(MOI，5)或ZIKV(MOI，10)在室温震荡下吸附BE(2)C细胞90分钟。进行病毒结合试验时，在有或无化合物9的情况下，使DENV-2或ZIKV在4℃ 震荡下吸附BE(2)C细胞90分钟。进行病毒进入试验时，首先使DENV-2或 ZIKV在4℃吸附BE(2)C细胞90分钟。以冷培养基温和清洗细胞后，在有或无化合物9的情况下于37℃培养细胞60分钟以允许病毒进入。其后，用酸性甘胺酸溶液(0.1M，pH＝3)处理细胞5分钟以便使未进入细胞的病毒失去活性，并用冷的汉克氏平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)清洗细胞。利用细胞刮刀收集细胞，并使细胞通过27-G针头7次以释放吸附的病毒。细胞裂解物在12,000rpm离心1分钟，其上清液用于病毒蚀斑形成试验以测定病毒结合及/或进入的数量。

动物研究

小鼠实验是经实验动物照护及使用部门批准并依据相关规定进行。小鼠在异氟醚(isoflurane)麻醉下接受感染以使动物痛苦最小化。动物研究中使用由 Ching-Juh Lai博士(美国国家卫生研究院)提供的小鼠脑中连续继代的DENV-2 新几内亚C株(NGC-N)及ZIKV PRVABC59病毒株。数组6周龄Stat1^-/-小鼠在尾部个别经静脉感染1×10⁵PFU的DENV-2，或者在脚掌个别经皮下感染5×10⁴ PFU的ZIKV。为研究经口服途径给药的化合物9的抗病毒功效，将小鼠分成数组以接受不同治疗：磷酸缓冲盐溶液(phosphate bufferedsaline，PBS；载体对照)；在感染时施予2、4、或8mg化合物9/kg体重/天(实时治疗)；或在感染后8小时施予2、4、或8mg化合物9/kg体重/天(8小时延迟治疗)。其后，在感染后直至第6天每天对小鼠施用PBS或相同剂量的化合物9。每天检查小鼠的严重症状，包括肢体麻痹。患有严重肢体麻痹的小鼠予以安乐死，其作为动物存活的终点。小鼠存活率以存活百分比表示。在感染后第3天以放血法 (phlebotomy)自小鼠脸部静脉采集血清样品，并藉由病毒蚀斑形成试验测定病毒载量。

嵌合(docking)运算分析

分子嵌合是使用在线嵌合网络服务器SwissDock进行，并使用UCSF chimera程序将其可视化以预测配体分子与整个标靶蛋白之间的交互作用。人类CaMKII的X-射线晶体结构是自蛋白质数据库(PDB编号：2VZ6)下载，并经过去除靛玉红E804(Indirubin E408)与非极性氢原子及添加极性氢原子的修饰，以模拟药物标靶蛋白。作为配体分子的化合物9的结构是以ChemSketch 软件(ACD Inc)制作。

CaMKII生化试验

化合物7、8、9、或16对纯化的人类CaMKII(具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列)活性的抑制作用是利用免疫试验测量，该试验是依据制造商使用说明书(CycLex CaM kinaseII Assay Kit，MBL Internationl Corp)进行。该免疫试验足够灵敏以半定量测量CaMKII的活性，其涉及在Ca²⁺、钙调蛋白、Mg²⁺、及ATP存在下使纯化的人类CaMKII与激酶受质(syntide-2，以下称合成肽2) 反应。简言之，将含有或不含指定剂量化合物7、8、9、或16的激酶反应缓冲液添加至一微量多孔盘。一市售的CaMKII抑制剂KN-62(Selleckchem，S7422)被用作阳性对照。不含Ca²⁺的激酶反应缓冲液被用作阴性对照。其后，该微量多孔盘的试验孔洞与连结HRP的抗磷酸化合成肽2抗体共培养，然后加入合成肽2。在室温下培养15分钟后停止磷酸化反应。使用ELISA读取仪 (Molecular Devices)测定样品在450nm的吸光值。实验数据以溶剂对照标准化并且表示为百分比。

统计分析

除非另有说明，数据表示为平均值±标准偏差，并藉由变异数分析(ANOVA) 及Bonferroni事后检定(Bonferroni post-hoc test)互为比较。统计上显著性设定为P值＜0.05或＜0.01。利用SigmaPlot v10.0(Systat软件)描述性分析存活曲线。利用Prismv5.0(GraphPad软件)测定基于对数秩检定(log-rank test)的存活时间中位数(T₅₀)及P值。对于西方墨点法，利用ImageJ软件(美国国家卫生研究院) 定量条带强度。

实施例1

候选化合物1-16的合成

以下及显示于下方图1B～图1D的方法是举例说明本发明的一些化合物的合成方法。先导化合物1包含四个子结构，包括一苯基部分、一苯磺酰胺主体部分、一末端环、及一连接单元(图1A)。从先导化合物1开始，制备四个系列的衍生化合物2-16以探讨结构-抗病毒活性关系。

如图1B所示，首先，为制得具有磺酰胺及氟苯单元的先导化合物1及类似物2，藉由作为起始材料的酸17及苯胺(aniline)的缩合反应及透过偶合剂O- 苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(O-benzotriazol-1-yl -N，N，N′，N′-tetramethyluroniumhexafluorophosphate，HBTU)及二异丙基乙胺 (diisopropylethylamine，DIPEA)形成酰胺18。当以氢化铝锂完全还原后，使用胺19与4-甲氧基苯磺酰氯(4-methoxybenzenesulfonyl chloride)反应以形成磺酰胺2。最终，在可提高反应效率的分子筛存在下，使用重铬酸吡啶盐 (pyridinium dichromate，PDC)将类似物2的羟基氧化成酮1。图1B所指反应试剂及条件简述如下：(a)HBTU，DIPEA，THF，8小时，室温，92％；(b)LiAlH4， THF，4小时，90℃，90％；(c)4-甲氧基苯磺酰氯，Et₃N，THF，60℃，4小时，75％；(d)PDC，二氯甲烷(dichloromethane，DCM)，8小时，室温，70％。

如图1C所示，藉由在4-甲氧基苯磺酰胺的N-取代基位置引入质子(H)及甲基(CH₃)基团来代替原始苯环，可产生不同取代的磺酰胺3及4。氯化物20 在过量迭氮化钠及催化量的碘化钾存在下，再藉由活性炭上的钯及氢气将其选择性还原，可转化为相应的胺22。胺22及4-甲氧基苯磺酰氯的缩合反应会得到磺酰胺3。磺酰胺4的制备始于使用多聚甲醛令胺22形成亚胺，而后以硼氢化钠选择性还原，接着在相同条件下形成磺酰胺。图1C所指反应试剂及条件简述如下：(a)KI，NaN₃，二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)，4小时，90℃；(b)Pd/C，H₂，MeOH，8小时，室温；(c)4-甲氧基苯磺酰氯，Et₃N， THF，60℃，4小时，48％；(d)(1)HCHO，NaOMe，MeOH，90℃，4小时， (2)NaBH₄，MeOH，室温，4小时，63％；(e)4-甲氧基苯磺酰氯，Et₃N，THF， 60℃，4小时，78％。

化合物1-4的化学结构，其结构上的差异在于连接单元中的酮基以及苯基部分。

如图1D所示合成苯磺酰胺类似物5-16，其是衍生自对先导化合物的苯基、末端环、连接单元、及苯磺酰胺部分予以修饰。图1D中，胺24的R₁’为苯基，胺25的R₁’为环己烷基，胺26的R₁’为四氢萘基，胺27的R₁’为4- 环己烷基苯基；化合物36的R₁’为苯基，R₂’为甲氧基；化合物37的R₁’ 为苯基，R₂’为三氟甲氧基；化合物38的R₁’为苯基，R₂’为苯氧基；化合物39的R₁’为苯基，R₂’为甲基；化合物40的R₁’为环己烷基，R₂’为甲氧基；化合物41的R₁’为四氢萘基，R₂’为甲氧基；化合物42的R₁’为4- 环己烷基苯基，R₂’为甲氧基。

在90℃及氢化钠存在下藉由相应的胺24-27氨解γ-丁内酯 (γ-butyrolactone)可得到羧酰胺28-31，其被LiAlH₄还原会产出二级胺32-35。此外，不同取代的苯磺酰氯与胺32-35缩合，然后在重铬酸吡啶盐存在下进行温和氧化，会分别得到醛43-49。将过量的格林纳试剂(Grignard reagent)加入相应的醛43-49会得到二级醇50-56，其被重铬酸吡啶盐溶液进一步氧化以获得各别目标化合物5-16，其R1′、R2′、及R3′基团显示于表1。图1D所指反应试剂及条件简述如下：(a)(1)NaH，THF，30分钟，90℃，(2)丁内酯，THF， 8小时，90℃，90％；(b)LiAlH₄，THF，8小时，90℃；(c)取代的苯磺酰氯， Et₃N，THF，60℃，4小时，76％；(d)PDC，DCM，8小时，室温，65％；(e)(1) R₂Br，Mg，THF，2小时，室温，(2)醛，THF，60℃，2小时，60％；(f)PDC， DCM，8小时，室温。

化合物5-10的化学结构，其结构上的差异在于末端环。

化合物11-13的化学结构，其结构上的差异在于苯磺酰胺部分；

化合物14-16的化学结构，其结构上的差异在于苯基部分。

表1

候选化合物1-16的制备方法详述如下。

1.1制备化合物2，N-(4-(4-氟苯基)-4-羟基丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺酰胺(N- (4-(4-fluorophenyl)-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)

将苯胺(2mL，21.93mmol)溶液、酸17(4.30g，21.93mmol)、HBTU(9.15 g，24.12mmol)及DIPEA(7.64mL，43.86mmol)的THF(60mL)溶液在室温下搅拌8小时。减压干燥该反应混合物，并藉由管柱层析纯化得酰胺18，其为白色固体(5.47g，92％)。在室温及氩气下将氢化铝锂(696mg，18.40mmol)悬浮于THF(100mL)。在0℃及氩气下滴加酰胺18(2g，7.36mmol)的THF(10mL) 溶液超过30分钟。接着，该反应混合物在90℃搅拌8小时，然后以乙酸乙酯及水萃取，经硫酸镁干燥，并且真空浓缩。由此得到胺19，其为灰色油状物(1.72 g，90％)，无需进一步纯化而直接用于下一步骤。将4-甲氧基苯磺酰氯(1.59g， 7.71mmol)、三乙胺(triethylamine；2.15mL，15.42mmol)、及胺19(2g，7.71mmol) 的THF(60mL)溶液在60℃搅拌8小时。该反应混合物以乙酸乙酯及水萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥并且真空浓缩。所得残余物进行快速管柱层析，然后进行正相HPLC以获得纯产物2，其为一无色油状物(2.48g，75％)。¹H NMR (400MHz，CDCl₃)δ1.42-1.54(m，2H)，1.78-1.84(m，2H)，3.55-3.60(m，2H)，3.88 (s，3H)，4.68(t，J＝6.4Hz，2H)，6.91(d，J＝8.4Hz，2H)，7.01-7.04(m，4H)， 7.26-7.31(m，5H)，7.50(d，J＝8.4Hz，2H)；¹³C NMR(100MHz，丙酮-d₆)δ24.3， 36.3，50.0，55.3，71.9，114.0，114.5，114.7，127.6，127.6，128.8，128.8，129.7，130.3， 139.5，142.1，161.8(d，J＝251Hz)。HRMS(ESI)：C₂₃H₂₄NO₄FS(M+Na)⁺计算值452.1308，实测值452.1301。

1.2制备化合物1，N-(4-(4-氟苯基)-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺酰胺(N- (4-(4-fluorophenyl)-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)

将重铬酸吡啶盐(0.91g，2.43mmol)溶液及含分子筛(1.0g)的化合物 2(0.8g，1.87mmol)的二氯甲烷(DCM；30mL)溶液在室温下搅拌8小时。该反应混合物以乙酸乙酯及水萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥并且真空浓缩。所得残余物进行快速管柱层析，然后进行正相HPLC以获得纯化合物1，其为一白色固体(70％)：熔点93-94℃。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ1.82-1.89(m， 2H)，3.09-3.12(t，J＝7.0Hz，2H)，3.66-3.69(t，J＝6.2Hz，2H)，3.87(s，3H)，6.91 (d，J＝8.4Hz，2H)，7.08-7.15(m，4H)，7.31-7.33(m，3H)，7.51(d，J＝8.0Hz， 2H)，7.96-7.99(m，2H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ22.3，35.0，49.6，55.6，55.75， 114.0，115.6(d，J＝22Hz)，128.0，128.7，129.1，129.7，130.6，130.7，133.3，139.0， 162.9，165.7(d，J＝253Hz)，197.7。HRMS(ESI)：C₂₃H₂₂NO₄FS(M+Na)⁺计算值450.1151，实测值450.1146。

1.3制备化合物3，N-(4-(4-氟苯基)-4-氧代丁基)苯磺酰胺 (N-(4-(4-fluorophenyl)-4-oxobutyl)benzenesulfonamide)

将迭氮化钠(1.06g，16.24mmol)、氯化物20(1.3mL，8.12mmol)、及碘化钾(134mg，0.81mmol)的DMF(30mL)溶液在90℃搅拌8小时。该反应混合物以乙酸乙酯及水萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥并且真空浓缩。所得粗残余物21无需进一步纯化即可使用。将残余物21(2g，9.65mmol)及钯/活性炭(0.21g，0.97mmol)的MeOH(10mL)溶液在室温及氢气(1bar)下搅拌8小时。过滤该反应混合物可得到胺22。将4-甲氧基苯磺酰氯(2.19g，10.62mmol) 与三乙胺(2.94mL，21.12mmol)的混合物加入胺22(在前一步骤是溶解于 MeOH中)的无水THF(50mL)溶液，且该混合物在60℃搅拌8小时。该反应混合物以乙酸乙酯及水萃取，然后经硫酸镁干燥，并且真空浓缩。所得残余物进行快速管柱层析，然后进行正相HPLC以获得纯化合物3，其为一白色固体 (48％)：熔点84-85℃。¹H NMR(400MHz，丙酮-d₆)δ1.85-1.92(m，2H)， 3.00-3.03(m，2H)，3.05-3.10(m，2H)，3.88(s，3H)，6.39(t，J＝5.6Hz，1H)，7.08(d， J＝8.8Hz，2H)，7.24-7.28(m，2H)，7.80(d，J＝8.8Hz，2H)，8.02-8.06(m，2H)；¹³CNMR(100MHz，丙酮-d₆)δ23.1，34.9，42.4，55.2，114.1，115.4(d，J＝22Hz)， 128.9，130.7(d，J＝9Hz)，132.8，133.7，162.7，165.5(d，J＝250Hz)，197.3。 HRMS(ESI)：C₁₇H₁₈NO₄FS(M+Na)⁺计算值374.0838，实测值374.0843。

1.4制备化合物4，N-(4-(4-氟苯基)-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-甲基苯磺酰胺(N- (4-(4-fluorophenyl)-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-methylbenzenesulfonamide)

将多聚甲醛(0.23g，7.64mmol)溶液、胺22(1g，5.46mmol)、及甲醇钠(1.47 g，27.30mmol)的MeOH(30mL)溶液在90℃搅拌4小时，然后将该反应混合物冷却至室温。将硼氢化钠(0.41g，10.92mmol)缓慢加入该反应混合物超过5 分钟。该反应混合物以乙酸乙酯及水萃取，然后经硫酸镁干燥、真空浓缩、及藉由快速管柱层析的纯化以获得化合物23(0.67g，63％)。将4-甲氧基苯磺酰氯(1.05g，5.12mmol)溶液、三乙胺(1.43mL，10.24mmol)、及化合物23(1.0g， 5.12mmol)的THF(20mL)溶液在60℃搅拌8小时。该反应混合物以乙酸乙酯及水萃取，然后经硫酸镁干燥，并且真空浓缩。所得残余物进行快速管柱层析，然后进行正相HPLC以获得纯化合物4，其为一白色固体(1.46g，78％)：熔点 89-90℃。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ1.90-1.96(m，2H)，2.67(s，3H)，3.01-3.05 (m，4H)，3.81(s，3H)，6.91-6.94(m，2H)，7.06-7.10(m，2H)，7.64-7.67(m，2H)， 7.93-7.97(m，2H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ21.5，34.7，35.0，49.4，55.6， 114.2，115.7(d，J＝22Hz)，129.0，129.4，130.7(d，J＝9Hz)，133.3，162.8，164.7 (d，J＝254Hz)，197.9。HRMS(ESI)：C₁₈H₂₀FNO₄S(M+Na)⁺计算值388.0995，实测值388.0995。

1.5制备候选化合物5-16的一般性方法

将胺24(5mL，54.76mmol)滴加至氢化钠(2.52g，65.71mmol)及THF(100 mL)的混合物超过30分钟。该反应混合物在90℃搅拌1小时，然后滴加丁内酯(4.17mL，54.76mmol)超过10分钟。8小时后，该反应混合物以乙酸乙酯及水萃取，然后经硫酸镁干燥，并且真空浓缩。所得残余物进行快速管柱层析以获得酰胺28(8.83g，90％)，其为一白色固体。

在0℃及氩气下，将酰胺28(4.0g，22.35mmol)的THF(50mL)溶液滴加至氢化铝锂(2.12g，55.84mmol)及THF(100mL)的混合物超过30分钟。该反应混合物在90℃搅拌8小时，然后以乙酸乙酯及水萃取，经硫酸镁干燥，并且真空浓缩。由此获得二级胺32，其无需进一步纯化而直接用于下一步骤。

将4-甲氧基苯磺酰氯(4.94g，23.99mmol)、三乙胺(5.57mL，39.98mmol)、及醇32(3.30g，19.99mmol)的THF(60mL)溶液在60℃搅拌4小时。该反应混合物以乙酸乙酯和水萃取，然后经硫酸镁干燥，并且真空浓缩。所得残余物进行快速管柱层析以获得磺酰胺36(5.09g，76％)。

将分子筛(3.00g)及重铬酸吡啶盐(5.09g，13.47mmol)的混合物加入磺酰胺36(3.00g，8.98mmol)的DCM溶液。该混合物在室温下搅拌8小时，然后以乙酸乙酯及水萃取，经硫酸镁干燥，并真空浓缩。所得残余物进行快速管柱层析以获得醛43(1.95g，65％)，其为一无色固体。

将甲基碘(0.42mL，6.75mmol)溶液及镁(131mg，5.40mmol)的THF(10mL) 溶液在60℃搅拌1小时，然后将该混合物冷却至室温。滴加醛43(0.45g，1.36 mmol)的THF(10mL)溶液超过10分钟。2小时后，该反应混合物以乙酸乙酯及水萃取，经硫酸镁干燥，并真空浓缩。由此获得二级醇50，其无需进一步纯化而直接用于下一步骤。

将分子筛(1.00g)及重铬酸吡啶盐(764mg，2.03mmol)的混合物加入醇50的无水DCM(30mL)溶液。该混合物在室温下搅拌8小时，然后以乙酸乙酯及水萃取，经硫酸镁干燥，并且真空浓缩。所得残余物进行快速管柱层析，然后进行正相HPLC以获得纯化合物5(0.28g，60％)。

1.5.1化合物5，4-甲氧基-N-(4-氧代戊基)-N-苯基苯磺酰胺 (4-methoxy-N-(4-oxopentyl)-N-phenylbenzenesulfonamide)

一白色固体；产率33％；熔点81-82℃。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 1.60-1.62(m，2H)，2.08(s，3H)，2.54(t，J＝7Hz，2H)，3.49(t，J＝6.5Hz，2H)， 3.807(s，3H)，6.85-6.86(m，2H)，6.99(d，J＝7Hz，2H)，7.24-7.26(m，3H)，7.44(d， J＝7Hz，2H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ21.8，30.1，39.8，49.5，55.6，113.9， 127.9，128.7，129.1，129.7，139.0，162.9，208.1。HRMS(ESI)：C₁₈H₂₁NO₄S(M+ Na)⁺计算值370.1089，实测值370.1084。

1.5.2化合物6，N-(4-环己烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺酰胺 (N-(4-cyclohexyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)

一白色固体；产率32％；熔点81-82℃。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 1.30-1.35(m，4H)，1.66-1.68(m，4H)，1.70-1.86(m，4H)，2.35(m，1H)，2.61(t，J＝ 7Hz，2H)，3.57(t，J＝7Hz，2H)，3.90(s，3H)，6.94(d，J＝8.5Hz，2H)，7.07-7.09 (m，2H)，7.32-7.35(m，3H)，7.52(d，J＝8.5Hz，2H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃) δ21.8，25.7，25.7，25.8，28.5，28.5，36.8，49.6，50.8，55.6，113.9，127.9，128.7， 129.0，129.7，129.8，139.0，162.9。HRMS(ESI)：C₂₃H₂₉NO₄S(M+Na)⁺计算值 438.1715，实测值438.1710。

1.5.3化合物7，N-(4-环丁烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺酰胺 (N-(4-cyclobutyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)

一灰色黏稠液体；产率32％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ1.61-1.67(m， 2H)，1.73-1.80(m，1H)，1.89-1.98(m，1H)，2.05-2.21(m，4H)，2.45(t，J＝6.8Hz， 2H)，3.16-3.23(m，1H)，3.51(t，J＝6.8Hz，2H)，3.83(s，3H)，6.86-6.99(m，2H)， 7.00-7.02(d，J＝8Hz，2H)，7.26-7.28(m，3H)，7.45(d，J＝8Hz，2H)；¹³C NMR (100MHz，CDCl₃)δ17.9，22.0，24.6，24.6，36.3，45.7，49.8，55.8，114.1，128.1， 128.9，129.2，130.0，130.1，139.2，163.1，211.3。HRMS(ESI)：C₂₁H₂₅NO₄S(M+ Na)⁺计算值410.1402，实测值410.1407。

1.5.4化合物8，N-(4-环戊烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺酰胺 (N-(4-cyclopentyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)

一白色固体；产率35％；熔点89-90℃。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 1.57-1.78(m，10H)，2.53(t，J＝7Hz，2H)，2.75-2.83(m，1H)，3.50(t，J＝6.4Hz， 2H)，3.80(s，3H)，6.84-6.87(m，2H)，6.98-7.01(m，2H)，7.22-7.26(m，3H)，7.43(d， J＝8.8Hz，2H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ22.2，26.1，26.1，29.1，29.1，38.1， 49.8，51.7，55.7，114.1，128.1，128.9，129.0，129.2，129.9，139.2，163.0，212.7。 HRMS(ESI)：C₂₂H₂₇NO₄S(M+Na)⁺计算值424.1559，实测值424.1552。

1.5.5化合物9，N-(4-环庚烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺酰胺 (N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)

一白色固体；产率34％；熔点75-76℃。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 1.62-1.71(m，6H)，1.75-1.80(m，8H)，2.44-2.50(m，1H)，2.55(t，J＝7.2Hz，2H)， 3.51(m，J＝6.4Hz，2H)，3.83(s，3H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，7.01-7.03(m，2H)， 7.27-7.28(m，3H)，7.45(d，J＝8.8Hz，2H)；¹³C NMR(100Hz，CDCl₃)δ22.2，26.9， 26.9，28.5，28.5，30.1，30.1，37.2，49.8，52.6，55.8，114.1，128.1，128.9，129.2， 130.0，139.3，163.1，213.9。HRMS(ESI)：C₂₄H₃₁NO₄S(M+Na)⁺计算值452.1872，实测值452.1866。

1.5.6化合物10，N-(4-(金刚烷-2-基)-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺酰胺(N-(4-(adamantan-2-yl)-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)

一白色固体；产率35％；熔点117-118℃。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 1.54-1.88(m，14H)，2.29-2.31(m，2H)，2.41-2.42(m，1H)，2.53(t，J＝7.2Hz， 2H)，3.52(t，J＝6.4Hz，2H)，3.83(s，3H)，6.89(d，J＝7.2Hz，2H)，7.00-7.02(m， 2H)，7.26-7.28(m，3H)，7.45(d，J＝9.2Hz，2H)；¹³C NMR(100Hz，CDCl₃)δ22.2， 27.7，27.8，29.4，29.4，33.5，33.5，36.2，37.5，38.5，38.5，49.8，55.8，57.3，114.1， 128.1，128.9，129.2，129.9，139.2，163.0，212.3。HRMS(ESI)：C₂₇H₃₃NO₄S(M+ Na)⁺计算值490.2028，实测值490.2033。

1.5.7化合物11，N-(4-环戊烷基-4-氧代丁基)-N-苯基-4-(三氟甲氧基)苯磺酰胺

(N-(4-cyclopentyl-4-oxobutyl)-N-phenyl-4-(trifluoromethoxy)benzenesulfonamide)

一白色固体；产率32％；熔点69-70℃。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 1.56-1.77(m，8H)，1.79-1.82(m，2H)，2.56(t，J＝7.2Hz，2H)，2.78-2.86(m，1H)， 3.56(t，J＝6.4Hz，2H)，7.00-7.03(m，2H)，7.23-7.25(m，2H)，7.29-7.31(m，3H)， 7.57-7.59(m，2H)；¹³C NMR(100Hz，CDCl₃)δ22.1，26.2，26.2，28.1，28.1，39.0， 50.0，51.7，120.7，128.2，128.8，129.5，130.0，136.6，138.6，152.3，212.6。HRMS (ESI)：C₂₂H₂₅NO₄SF₃(M+H)⁺计算值456.1456，实测值456.1458。

1.5.8化合物12，N-(4-环庚烷基-4-氧代丁基)-4-苯氧基-N-苯基苯磺酰胺 (N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-4-phenoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)

一白色固体；产率35％；熔点127-128℃。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 1.40-1.80(m，14H)，2.45-2.49(m，1H)，2.55(t，J＝7.2Hz，2H)，3.53(t，J＝6.4Hz， 2H)，6.93-6.95(m，2H)，7.03-7.05(m，4H)，7.18-7.30(m，4H)，7.37-7.41(m，2H)， 7.46-7.48(m，2H)；¹³C NMR(100Hz，CDCl₃)δ22.3，26.9，26.9，28.5，28.5，30.2， 30.2，37.2，49.9，52.7，117.5，120.5，125.1，128.2，128.9，129.3，130.1，130.4，132.0， 139.1，155.4，161.7，213.9。HRMS(ESI)：C₂₉H₃₃NO₄S(M+Na)⁺计算值514.2028，实测值514.2023。

1.5.9化合物13，N-(4-环庚烷基-4-氧代丁基)-4-甲基-N-苯基苯磺酰胺 (N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-4-methyl-N-phenylbenzenesulfonamide)

一灰色黏稠液体；产率23％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ1.46-1.91(m， 16H)，2.46(s，3H)，2.50-2.57(m，1H)，2.62(t，J＝7.2Hz，2H)，3.58(t，J＝6.6Hz， 2H)，7.06-7.09(m，2H)，7.26-7.35(m，5H)，7.47(d，J＝8.4Hz，2H)；¹³C NMR(75 Hz，CDCl₃)δ21.7，22.2，26.7，26.7，28.5，28.5，30.2，30.2，37.2，49.9，52.7，127.9， 128.1，129.0，129.3，129.6，135.4，139.2，143.6，214.0。HRMS(ESI)：C₂₄H₃₁NO₃S (M+Na)⁺计算值436.1922，实测值436.1917。

1.5.10化合物14，N-(4-环庚烷基-4-氧代丁基)-N-环己烷基-4-甲氧基苯磺酰胺(N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-N-cyclohexyl-4-methoxybenzenesulfonamide)

一灰色黏稠液体；产率32％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ1.28-1.86(m， 23H)，2.49(t，J＝7.2Hz，2H)，3.07-3.11(m，2H)，3.50-3.56(m，1H)，3.82(s，3H)， 6.96(d，J＝8，2H)，7.69-7.71(m，2H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ25.5，26.0， 26.3，26.3，26.9，26.9，28.5，28.5，30.2，30.2，31.9，31.9，37.9，43.3，52.5，55.7，58.2， 114.3，129.1，162.7，214.2。HRMS(ESI)：C₂₄H₂₅NO₄S(M+Na)⁺计算值446.1402，实测值446.1402。

1.5.11化合物15，N-(4-环庚烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-(5，6，7，8-四氢萘-2- 基)-苯磺酰胺

(N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-(5，6，7，8-tetrahydronaphthalen-2-yl)-benzenesulfonamide)

一白色固体；产率32％；熔点111-112℃。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ 1.47-1.78(m，18H)，2.50-2.55(m，3H)，2.76-2.79(m，3H)，2.95-3.08(m，1H)， 3.17-3.24(m，1H)，3.60-3.70(m，1H)，3.87(s，3H)，6.38-6.41(m，1H)，6.92-7.04 (m，4H)，7.60(d，J＝9Hz，2H)；¹³CNMR(75MHz，CDCl₃)δ22.5，22.8，22.9， 26.0，26.0，26.9，26.9，28.5，29.9，30.1，30.2，37.8，51.5，52.6，55.8，114.1，125.2， 125.6，129.5，130.3，130.8，138.4，139.5，139.6，163.1，213.7。HRMS(ESI)： C₂₈H₃₇NO₄S(M+Na)⁺计算值506.2341，实测值506.2322。

1.5.12化合物16，N-(4-环庚烷基-4-氧代丁基)-N-(4-环己烷基苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺

(N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-N-(4-cyclohexylphenyl)-4-methoxybenzenesulfonamide)

一白色固体；产率35％；熔点103-104℃。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ 1.32-1.82(m，24H)，2.47-2.48(m，2H)，2.55(t，J＝7.2Hz，2H)，3.47(t，J＝6.6Hz， 2H)，3.83(s，3H)，6.86-6.92(m，4H)，7.09(d，J＝8.4Hz，2H)，7.47(d，J＝8.7Hz， 2H)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)22.2，26.2，26.8，26.8，26.9，26.9，28.4，28.4，30.1， 30.1，34.5，34.5，37.2，44.2，49.9，52.5，55.7，114.0，127.5，128.3，129.9，130.2， 136.7，148.0，162.9，214.0。HRMS(ESI)：C₃₀H₄₁NO₄S(M+Na)⁺计算值534.2654，实测值534.2648。

实施例2

结构-活性关系(structure-activity relationship，SAR)筛选

为对实施例1中描述的候选化合物1-16进行初步抗病毒筛选，在有或无指定化合物的情况下使用一表现增强型绿色荧光蛋白的DENV-2报导病毒(称为DENV-2-eGFP)感染人类神经元BE(2)C细胞。表2显示以3.125μM的指定化合物处理的细胞的eGFP相对荧光强度。此外，利用XTT试验评估6.25μM 的指定化合物对细胞增殖的影响。

表2

依据表2，相比溶剂对照，先导化合物1的处理致使39.3％BE(2)C细胞感染DENV-2，并且减少细胞增殖至56.1％。第一系列化合物在结构上的差异在于连接单元中的酮基以及苯基部分(化合物1-4)。将化合物1的酮基还原为化合物2的羟基会造成48.5％的感染，并且改善细胞增殖至76.3％。当化合物 1的苯基分别在化合物3及4中被氢或甲基取代时，未观察到化合物的细胞毒性，然而，该些取代导致对DENV-2的抗病毒效力丧失，造成122.6％(化合物 3)或100.9％(化合物4)的感染。这些数据显示苯环是该些苯环磺酰胺衍生物的抗登革病毒活性所需。

基于这些发现，产出在连接单元的末端环有结构上差异的第二系列化合物 (化合物5-10)。具有甲基取代的化合物5的处理未显示可观察到的抗登革病毒功效(100.8％的感染)。化合物6的环己烷基取代使其重新获得抗病毒活性 (63.3％的感染)，尽管此抗病毒效力低于化合物1。化合物7及8的末端环的环丁烷基或环戊烷基取代分别导致33％及25.1％的感染，显示出与化合物1相当的抗病毒活性。值得注意的是，相比化合物1，化合物7或8的细胞毒性明显降低。化合物9中的环庚烷基取代致使DENV-2感染显著降低至9.6％，且对细胞增殖仅有少许影响。具金刚烷基取代的化合物10造成51.1％的DENV-2 感染以及对细胞增殖的少许影响。

在第三系列化合物中(化合物11-13)，苯磺酰胺的甲氧基被修改为三氟甲基(化合物11)、苯氧基(化合物12)、或甲基(化合物13)。化合物11、12、或 13的处理分别导致118.2％、73.4％、及76.9％的DENV-2感染。在以该些化合物处理的细胞中观察到对细胞增殖的少许影响。此结果显示取代的苯磺酰胺的甲氧基对抗病毒活性是重要的。

此外，将化合物9的苯基改变为脂肪环(化合物14)。我们在以化合物14 处理的细胞中观察到轻微的细胞毒性及65.7％的DENV-2感染。此外，为增加化合物的溶解度，将苯基延伸成四氢萘基(化合物15)或4-环己烷基苯基(化合物16)。化合物15或16的处理分别导致21.5％及13.8％的DENV-2感染，且对BE(2)C细胞的增殖没有影响。

综上，先导化合物1的抗登革病毒活性需要包括一苯基部分、一连接单元中的酮基、及一甲氧基苯磺酰胺等子结构。此外，末端环的脂肪族取代使抗病毒效力大为增加，并且降低先导化合物1的细胞毒性，又与苯基部分相连的额外环可以增加溶解度。

实施例3

化合物9抑制DENV-2及ZIKV的体外感染

依据实施例2，化合物9相比其他苯磺酰胺衍生物表现出最佳抗病毒活性，而且具有可容忍的细胞毒性。因此，进一步研究化合物9对野生型DENV-2 及ZIKV感染的抗病毒效力。首先，使用三种不同的试验方法全面性测定化合物9的非细胞毒性剂量(non-cytotoxic dose)：LDH细胞毒性试验、XTT细胞增殖试验、及台盼蓝细胞计数试验。其后，在有或无非细胞毒性的化合物9的情况下，用DENV-2(MOI，0.1)或ZIKV(MOI，0.1)感染BE(2)C细胞以进行抗病毒试验，并且测定病毒蛋白表现及病毒子代产生。

如图2A所示，高达12.5μM的化合物9没有显著细胞毒性，并且对BE(2)C 细胞的增殖与活力没有显著影响。

依据图2B-2D，非细胞毒性的化合物9的处理以剂量依赖方式显著降低 DENV-2NS3蛋白表现及病毒子代产生，其EC₅₀为1.52μM。类似地，如图 2E-2G所示，非细胞毒性的化合物9的处理显著抑制ZIKV E蛋白表现及病毒子代产生，其EC₅₀为1.91μM。因此，在非细胞毒性浓度下，化合物9展现对野生型DENV-2及ZIKV感染的抗病毒作用。

实施例4

化合物9阻止DENV-2及ZIKV的病毒进入

为了探讨化合物9是否在病毒感染的早期或晚期表现出抗病毒作用， BE(2)C细胞在病毒吸附期间(0-3hpi)或病毒吸附后(3-24hpi)有或无指定剂量化合物9的情况下感染DENV-2(MOI，1)。如图3A所示，在病毒吸附期间以化合物9处理3小时会剂量依赖地降低病毒NS3蛋白的表现，显示化合物9 可以对付病毒感染的早期步骤。并且如图3B所示，化合物9的处理显著降低 ZIKV结合/进入的数量。

为了进一步剖析化合物9对病毒结合与进入的影响，在有或无不同剂量的该化合物的情况下，对BE(2)C细胞分别进行病毒结合试验及病毒进入试验。如图3C所示，化合物9的处理不影响DENV-2或ZIKV结合至细胞。然而，如图3D所示，化合物9的处理以剂量依赖方式显著降低DENV-2及ZIKV进入细胞的数量。因此，化合物9对DENV-2及ZIKV感染的抗病毒作用是有关于病毒进入。

实施例5

化合物9改善DENV-2及ZIKA感染小鼠的存活状况

接受小鼠适应性DENV-2NGC-N病毒株或ZIKV刺激的Stat1缺陷小鼠被当作一种感染性疾病模型，用于测试化合物9在体内是否具有抗病毒作用。简言之，在感染时(实时治疗)或感染后8小时(8小时延迟治疗)对小鼠单独施予 PBS(n＝5)或化合物9(2、4、或8mg/kg体重/天；n＝5)的PBS溶液，其后使该小鼠接受相同剂量的治疗直至感染后第6天。

如图4A所示，在6天治疗期间经由口服给予8或4mg化合物9/kg体重/ 天的实时治疗将DENV-2感染小鼠的总体存活率显著提升至60％。值得注意的是，较低剂量化合物92mg/kg体重/天)的实时治疗显著降低动物的死亡率 (T₅₀为15天，对比载体对照的T₅₀为9天)，但对动物的总体存活率有较小影响。

如图4B所示，8mg化合物9/kg体重/天的实时治疗亦显著延迟ZIKV诱导的致死率(T₅₀为11天，对比载体对照的T₅₀为7天)，但较低剂量的化合物 9(4mg/kg体重/天)并未改善总体存活率。此外，如图4C所示，化合物9的处理以剂量依赖方式显著降低DENV-2或ZIKV感染小鼠的病毒载量。因此，与小鼠存活的结果一致，病毒载量数据证明了化合物9对DENV-2及ZIKV感染的抗病毒活性。

自感染后8小时(8小时延迟)开始到感染后第6天结束所进行的治疗，其目的是监测化合物9在治疗模式中的抗病毒作用。如图4D所示，2mg化合物 9/kg体重/天的治疗足以显著改善DENV-2感染小鼠的存活时间中位数(T₅₀为 14天，对比载体对照的T₅₀为10天)。此外，较高剂量化合物9(4mg/kg体重/ 天)的治疗可保护40％的DENV-2感染小鼠免于死亡，并且进一步增加动物的存活时间(T₅₀为22天，对比载体对照的T₅₀为10天)。然而，如图4E所示，化合物9的8小时延迟治疗对ZIKV感染小鼠的总体存活率有较小影响。8mg 化合物9/kg体重/天的治疗仅将T₅₀提升至10天。DENV-2及ZIKV在Stat1缺陷小鼠的不同毒力及/或病毒致病机制可能促成化合物9改善动物存活效力的差异。有趣的是，化合物9对DENV-2及ZIKV感染的进入步骤的抑制作用或可解释化合物9的实时给药相比感染后8小时给药有更好效果。总之，这些数据显示化合物9在哺乳动物中具有对DENV-2及ZIKV感染的抗病毒效力。

实施例6

化合物9及其类似物对CaMKII活性的抑制作用

为预测化合物9及CaMKII之间的交互作用进行了分子嵌合。如图5A所示，化合物9结合至CaMKII激酶结构域(domain)的N-环(N-loop)及C-环(C-loop) 之间的界面。如图5B所示，结合分析揭示化合物9与CaMKII的Ala23及Phe24之间有氢键交互作用。此外，化合物9与Lys21、Gly22、Glu139、 Gly175、及Gly158间可能有交互作用。值得注意的是，Lys21、Gly22及Phe24 是位于CaMKII的ATP结合位置内的残基。此外，CaMKII的Glu139突变使其受质亲和力变差，因为该残基是位于受质结合位置。这些数据说明化合物9 可能干扰ATP及受质与CaMKII结合。

为了验证化合物9及其类似物，例如化合物7、8、及16，是否抑制CaMKII 活性，进行生化试验以测量纯化的人类CaMKII在有或无该些化合物的情况下的活性。如图6A所示，当钙离子欠缺时(表示为Ca(-))难以观察到CaMKII的活性。化合物9及市售CaMKII抑制剂KN-62以剂量依赖方式显著降低CaMKII 的活性，其IC₅₀分别为约0.79μM及1.03μM。如图6B所示，化合物7、8、及16亦显著降低CaMKII的活性，其IC₅₀分别为约0.6μM、0.8μM及、0.7μM。

基于以上说明，本领域熟习技艺人士可以轻易确定本揭露的重要特征，并且在不脱离其精神及范围的情况下，可以对本揭露进行各种变化及修饰，以使其适用于各种用途与状况。因此，其他实施方式亦在申请专利范围内。

Claims

1.一种式(I)所示的化合物：

其中，R₁为氢、具有3至7个成环碳原子的环烷基、具有2至8个成环碳原子与至少1个选自由氮、氧、及硫所组成群组的杂原子的杂环基、或具有2至3个环且各环具有4至6个环原子的芳基；或R₁与连接R₁的苯环形成具有8至10个成环碳原子的稠合碳双环；

R₂为具有4至10个成环碳原子的环烷基、或为选自由噻唑、咪唑、四唑、咪唑啶、咪唑啉、异恶唑、及苯并咪唑所组成群组的杂环基；以及

n为1、2、4或6。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R₁为氢以及n为1。

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，是以下式之一所示：

及

4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R₁为氢；R₂为环庚烷基；以及n为2、4或6。

5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R₂为环庚烷基以及n为1。

6.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于，是以下式之一所示：

及

7.一种医药组合物，包含权利要求1所述的化合物，以及一药学上可接受的载体。

8.一种抑制细胞中钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)活性的方法，包含将该细胞接触一有效量的权利要求1所述的化合物。

9.一种权利要求1所述的化合物的用途，是用于制备治疗与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)活性相关的疾病或状态的医药组合物。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II活性相关的疾病或状态是一黄病毒感染。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述黄病毒是选自由登革病毒、兹卡病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、及其任意组合所组成的群组。

12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II活性相关的疾病或状态是一癌症。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述癌症是选自由肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、及其任意组合所组成的群组。

14.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II活性相关的疾病或状态是一心血管疾病或状态。

15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病或状态是选自由心律不整、缺血-再灌流损伤、心脏衰竭、及其任意组合所组成的群组。

16.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II活性相关的疾病或状态是一神经疾病。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述神经疾病是选自由阿兹海默症、帕金森氏症、癫痫、及其任意组合所组成的群组。

18.一种抑制黄病毒进入细胞的方法，包含将该细胞接触一有效量的权利要求1所述的化合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述黄病毒是选自由登革病毒、兹卡病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、及其任意组合所组成的群组。