TWI711448B - 抑制鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶ii之化合物及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抑制鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)的新穎苯磺醯胺化合物以及含有該苯磺醯胺化合物的醫藥組合物。本發明亦提供利用該苯磺醯胺化合物製備治療與CaMKII活性相關的疾病或狀態如黃病毒感染的醫藥組合物的用途。

Description

抑制鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II之化合物及其應用
本發明係關於一種抑制鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)的化合物及其應用。本發明特別係關於一種新穎的苯磺醯胺(benzenesulfonamide)衍生物以及將其用於製備CaMKII抑制劑的用途。
鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)是絲氨酸(serine)/蘇氨酸(threonine)專一性蛋白激酶，其活性係由鈣與鈣調蛋白的複合物調節。CaMKII普遍表現於各種組織中，其在神經元、心肌細胞、內皮細胞及免疫細胞中發揮獨特作用。CaMKII活性上升是心血管及神經疾病的關鍵致病標靶。據報導，CaMKII亦是癌症進展的原因。此外，最近一項研究指出CaMKII介導黃病毒科(Flaviviridae)一員之日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)之細胞結合及/或細胞進入(參見Simanjuntak et al.,Front Microbiol 2017,8：651)。製藥公司現今正競相開發安全且有效的CaMKII抑制劑。然而，CaMKII抑制劑對黃病毒感染的可能作用仍屬未知。
登革病毒(dengue virus，DENV)及茲卡病毒(Zika virus，ZIKV)是新興的經蚊傳播黃病毒，其對全球公共健康構成威脅。茲卡病毒對人群的感染可引起廣泛的臨床特徵，從輕度登革熱(dengue fever)到嚴重的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever)以及危及性命的登革熱休克症候群(dengue shock syndrome)。一項新近研究表示，登革病毒感染的流行率增加至每年3.9億例。儘管已成功控制死亡率，反復發生的登革熱疫情對流行病所在國家的社會經濟造 成了重大影響。同樣地，儘管茲卡病毒感染的病例死亡率低，但此感染與基蘭-巴瑞症候群(Guillain-Barré syndrome)及包括小頭畸形(microcephaly)在內的先天缺陷相關。茲卡病毒感染已然成為國際關注的公衛緊急事件。據報導，在巴西大爆發期間約有4300名嬰兒出生時患上小頭畸形。
登革病毒及茲卡病毒是有套膜的小病毒，其具有約為11kb的正鏈RNA基因組。該基因組編碼一多蛋白(polyprotein)，其被加工為三種結構性蛋白(structural proteins)，即衣殼(capsid)蛋白、前膜(premembrane，prM)蛋白、及套膜(envelope，E)蛋白，以及七種非結構蛋白(nonstructural proteins)，分別稱為NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5。病毒感染是始於主結構之套膜蛋白與細胞表面受體結合，並且利用細胞內吞作用(endocytosis)進入細胞。細胞內的病毒經歷酸誘導之構形變化及膜融合以便釋放病毒基因組。病毒RNA之轉譯係藉由RNA依賴性RNA聚合反應(RNA-dependent RNA polymerization)來產生病毒RNA複製所需的蛋白質。病毒RNA與病毒蛋白的組裝會產生成熟的病毒顆粒，其後透過細胞分泌途徑釋放。
抗病毒藥物及疫苗是控制病毒性疾病的兩種主要手段。目前尚無用於登革病毒及茲卡病毒感染的抗病毒藥物或疫苗被核准。針對這些黃病毒的疫苗開發正面臨挑戰，因為與登革病毒或茲卡病毒的E蛋白或prM蛋白結合的現有抗體已被證明會增強免疫個體中的單核細胞被後續病毒感染。在抗病毒藥物發展方面，病毒複製所需的病毒及細胞蛋白都是有潛力的標靶。如上所述，CaMKII是否是合適的抗病毒標靶仍有待釐清。
本發明係基於一項意外發現，即新設計的苯磺醯胺衍生物可當作CaMKII抑制劑，並且可用於治療與CaMKII活性相關的疾病，例如登革病毒及茲卡病毒感染。
緣此，本發明之一目的在提供一種式(I)所示的化合物：
Figure 108110137-A0101-12-0002-2
 其中，R1為氫、具有3至7個成環碳原子的環烷基、具有2至8個成環碳原子與至少1個選自由氮、氧、及硫所組成群組的雜原子的雜環基、或具有2至3個環且各環具有4至6個環原子的芳基；或R1與連接R1的苯環形成具有8至10個成環碳原子的稠合碳雙環；R2為具有4至10個成環碳原子的環烷基、或為選自由噻唑(thiazole)、咪唑(imidazole)、四唑(tetrazole)、咪唑啶(imidazolidine)、咪唑啉(imidazoline)、異噁唑(isoxazole)、及苯并咪唑(benzimidazole)所組成群組之雜環基；以及n為1、2、4或6。
在本發明之一實施例中，R1為氫以及n為1。在一較佳實施例中，該化合物如下式之一所示：
Figure 108110137-A0101-12-0003-3
在本發明之另一實施例中，R1為氫；R2為環庚烷基；以及n為2、4或6。
在本發明之另一實施例中，R2為環庚烷基以及n為1。在一較佳實施例中，該化合物如下式之一所示：
Figure 108110137-A0101-12-0003-4
本發明之另一目的在提供一種醫藥組合物，包含至少一如上定義的化合物，以及一藥學上可接受的載體。
本發明之又一目的在提供一種抑制細胞中CaMKII活性的方法，包含將該細胞接觸一有效量之式(I)化合物，或接觸一含有該有效量式(I)化合物的醫藥組合物。
本發明之又一目的在提供一種式(I)化合物的用途，係用於製備治療與CaMKII活性相關的疾病或狀態的醫藥組合物。
該與CaMKII活性相關的疾病或狀態係指相比未患病個體，與一需要治療個體的特定細胞或組織中的CaMKII活性增加有因果關係的疾病或狀態。這種疾病或狀態亦包括由CaMKII活性引起及/或加劇的症狀。在一實施例中，所述疾病或狀態係為一黃病毒感染，其中該黃病毒係選自由登革病毒、茲卡病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河病毒(West Nile virus)、黃熱病病毒(yellow fever virus)、及其任意組合所組成之群組。在另一實施例中，所述疾病或狀態係為一癌症，例如肺癌、乳癌、前列腺癌、及結腸癌。在又一實施例中，所述疾病或狀態係為一心血管疾病或狀態，例如心律不整(arrhythmia)、缺血-再灌流損傷(ischemia-reperfusion injury)、及心臟衰竭(heart failure)。在又一實施例中，所述疾病或狀態係為一神經疾病，例如阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、及癲癇(epilepsy)。
本發明之又一目的在提供一種抑制黃病毒進入細胞的方法，包含將該細胞接觸一有效量之式(I)化合物。
在本發明之一實施例中，該黃病毒係選自由登革病毒、茲卡病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河病毒、黃熱病病毒、及其任意組合所組成之群組。
本發明揭露式(I)化合物可有效抑制CaMKII促成的蛋白質磷酸化，並且改進登革病毒或茲卡病毒感染動物的存活狀況。因此，本發明提供了治療與CaMKII活性相關的疾病或狀態的新策略。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式。下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非用以限定本發明之範圍。任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾。因此，本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1A顯示先導化合物1中假定會影響抗病毒活性及細胞毒性的四個子結構，包括一苯基部分、一苯磺醯胺部分、一末端環、以及該苯磺醯胺部分與該末端環之間的一連接單元。
圖1B顯示化合物1-4的化學結構，其結構上的差異在於連接單元中的酮基以及苯基部分。
圖1C顯示化合物5-10的化學結構，其結構上的差異在於末端環。
圖1D顯示化合物11-13的化學結構，其結構上的差異在於苯磺醯胺部分。
圖1E顯示化合物14-16的化學結構，其結構上的差異在於苯基部分。
圖2A顯示不同劑量的化合物9對BE(2)C細胞的細胞毒性作用；該細胞係以指定劑量的化合物9處理，並且對其進行LDH細胞毒性試驗、XTT細胞增殖試驗、及台盼藍(Trypan blue)細胞計數；*表示基於學生T檢定、與溶劑對照相比為P<0.05。
圖2B顯示BE(2)C細胞在有或無指定劑量化合物9的情況下感染第2型登革病毒(DENV-2)，並且對其進行DENV-2 NS3蛋白與細胞核的免疫染色後的免疫螢光影像。
圖2C顯示以西方墨點法分析圖2B中細胞的DENV-2 NS3蛋白及β-肌動蛋白(β-actin；作為樣品注入對照)的蛋白質含量；NS3蛋白相對於肌動蛋白的比例係以溶劑對照進行標準化。
圖2D顯示圖2B中細胞的培養物上清液的病毒效價；*和**分別表示基於學生T檢定、與溶劑對照相比為P<0.05及P<0.01。
圖2E顯示BE(2)C細胞在有或無指定劑量化合物9的情況下感染茲卡病毒(ZIKV)48小時，並且對其進行ZIKV E蛋白與細胞核的免疫染色後的免疫螢光影像。
圖2F顯示圖2E中細胞的ZIKV E蛋白及β-肌動蛋白(作為樣品注入對照)的蛋白質含量；E蛋白相對於肌動蛋白的比例係以溶劑對照進行標準化。
圖2G顯示圖2E中細胞的培養物上清液的病毒效價；*和**分別表示基於學生T檢定、與溶劑對照相比為P<0.05及P<0.01。
圖3A顯示BE(2)C細胞在病毒吸附期間(感染後0至3小時，標示為0-3hpi)或病毒吸附後(感染後3至24小時，標示為3-24hpi)有或無指定劑量化合物9的情況下感染DENV-2，並以西方墨點法分析該細胞的DENV-2 NS3蛋白及β-肌動蛋白(作為樣品注入對照)的蛋白質含量；NS3蛋白相對於肌動蛋白的比例係以溶劑對照進行標準化。
圖3B顯示在有或無指定劑量化合物9的情況下，ZIKV結合及進入BE(2)C細胞的數量；*及**分別表示基於學生T檢定、與溶劑對照相比為P<0.05及P<0.01。
圖3C顯示在有或無指定劑量化合物9的情況下，DENV-2或ZIKV結合BE(2)C細胞的數量。
圖3D顯示在有或無指定劑量化合物9的情況下，ZIKV進入BE(2)C細胞的數量；虛線表示偵測極限(DL)。
圖4A顯示化合物9(標示為C9)的即時治療對感染DENV-2的Stat1-/-小鼠的存活狀況的保護作用；治療日以箭頭標記。
圖4B顯示化合物9(C9)的即時治療對感染ZIKV的Stat1-/-小鼠的存活狀況的保護作用；治療日以箭頭標記。
圖4C顯示由圖4A-4B中經過不同處理的小鼠採集得血清樣品的病毒效價；*及**分別表示基於學生T檢定、與溶劑對照相比為P<0.05及P<0.01。
圖4D顯示化合物9(C9)的8小時延遲治療對感染DENV-2的Stat1-/-小鼠的存活狀況的保護作用；治療日以箭頭標記。
圖4E顯示化合物9(C9)的8小時延遲治療對感染ZIKV的Stat1-/-小鼠的存活狀況的保護作用；治療日以箭頭標記。
圖5A顯示化合物9在CaMKII中的嵌合構形。
圖5B顯示化合物9與CaMKII的指定胺基酸殘基間的氫鍵(虛線)及疏水交互作用(實線)。
圖6A顯示化合物9及KN-62對CaMKII活性的抑制作用；*和**分別表示基於學生T檢定、與溶劑對照相比為P<0.05及P<0.01。
圖6B顯示化合物7、8、及16對CaMKII活性的抑制作用；*和**分別表示基於學生T檢定、與溶劑對照相比為P<0.05及P<0.01。
除非另有定義，本文中使用的所有技術與科學術語及縮寫的含義與本發明所屬領域熟習技藝人士的一般理解相同。
定義
本文給出的數值為近似值，並且實驗數據可在20%的範圍內變化，較佳為在10%的範圍內變化，最佳為在5%的範圍內變化。因此，「約」及「近似」等用語係指在一給定數值或範圍的20%範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
除非另有定義，術語「環烷基(cycloalkyl)」係指一具有3至10個成環碳原子的非芳香族碳環，而所謂成環碳原子係為彼此鍵結以形成環的碳原子。該環可以是飽和的(saturated)或具有一個或多個碳-碳雙鍵。環烷基的例子包括但不限於環丙烷基、環丁烷基、環戊烷基、環戊烯基、環己烷基、環己烯基、及環庚烷基，以及橋聯(bridged)與籠形(caged)的飽和環基團，例如降冰片烷基(norbornyl)及金剛烷基(adamantyl)。
術語「碳環(carbocycle)」係指一含有3至14個成環碳原子的飽和碳環、部分飽和碳環、或芳香環系統。碳環通常含有3至10個成環碳原子，例如環丙烷基、環丁烷基、環戊烷基、環戊烯基、環戊二烯基、環己烷基、環己烯基、環己二烯基、及苯基。或者，碳環可以是稠合的二個或三個碳環，例如萘基(naphthalenyl)、四氫萘基(tetrahydronaphthalenyl)、茚基(indenyl)、異茚基(isoindenyl)、雙環癸烷基(bicyclodecanyl)、蒽基(anthracenyl)、菲(phenanthrenyl)、苯并萘基(benzonaphthenyl，亦稱萉基(phenalenyl))、芴基(fluorenyl)、及十氫萘基(decalinyl)。
術語「雜環(heterocycle)」係指一含有3至14個成環原子的飽和環狀、部分飽和環狀、或芳香環系統，其中至少一個成環原子是雜原子，即氧、氮、或硫。雜環可以是單環、雙環、或三環系統，其可包括稠合環。雜環的例子包括但不限於氮呯(azepine)、吡咯(pyrroles)、噻吩(thiophene)、咪唑(imidazole)、呋喃(furan)、噻唑(thiazole)、異噻唑(isothiazole)、異噁唑(isoxazole)、吲哚(indole)、吡啶(pyridine)、噠嗪(pyridazine)、吡嗪(pyrazine)、哌啶(piperidine)、哌嗪(piperazine)、四氫呋喃(tetrahydrofuran)、四氫哌喃(tetrahydropyran)、1,4-二噁烷(1,4-dioxane)、三唑(triazoles)、四唑(tetrazole)、苯并咪唑(benzimidazole)、苯并 噻唑(benzothiazole)、苯并嘧啶(benzopyrimidine)、噻二唑(thiadiazole)、嘌呤(purine)、及喹啉酮(quinolone)。
除非另有定義，術語「芳基(aryl)」係指一含有一個或二至三個分離或稠合環的取代基，其中至少一個環是五元或六元的碳芳香環，例如苯。芳基取代基可具有6至18個碳原子。芳基取代基的例子包括苯基、萘基、及蒽基。芳基取代基的例子還包括一C4-C6碳環或一與苯基、萘基、或蒽基稠合的四至六元雜環，例如四氫萘基、茚基、異茚基、二氫茚基(indanyl)、菲基、苯并萘基、及芴基。芳基取代基可以是取代的(substituted)或未取代的(unsubstituted)。「取代的」係指一基團中的一個或多個氫原子各自獨立地被相同或不同的取代基所取代。典型的取代基包括但不限於-X、-R1a、-O-、=O、-OR1a、-SR1a、-S-、=S、-NR1aR1b、=NR1a、-CX3、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、=N2、-N3、-S(O)2O-、-S(O)2OH、-S(O)2R1a、-OS(O2)O-、-OS(O)2R1a、-P(O)(O-)2、-P(O)(OR1a)(O-)、-OP(O)(OR1a)(OR1b)、-C(O)R1a、-C(S)R1a、-C(O)OR1a、-C(O)NR1aR1b、-C(O)O-、-C(S)OR1a、-NR2aC(O)NR1aR1b、-NR2aC(S)NR1aR1b、—NR2aC(NR1a)NR1aR1b、-C(NR1a)NR1aR1b、-S(O)2NR1aR1b、-NR2aS(O)2R1a、-NR2aC(O)R1a、及-S(O)R1a，其中各X獨立地為鹵素；各R1a及R1b獨立地為氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基(arylalkyl)、取代的芳基烷基、環烷基、取代的環烷基、雜環烷基(cycloheteroalkyl)、取代的雜環烷基、雜芳基、取代的雜芳基、雜芳基烷基、取代的雜芳基烷基、-NR2aR2b、-C(O)R2a、或-S(O)2R2a；任選地，R1a及R1b與連接該二者的原子一起形成一個或多個雜環烷基、取代的雜環烷基、雜芳基、或取代的雜芳基環；R2a及R2b獨立地為氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、環烷基、取代的環烷基，雜環烷基、取代的雜環烷基、雜芳基、取代的雜芳基、雜芳基烷基、或取代的雜芳基烷基；或任選地，R2a及R2b與連接該二者的氮原子一起形成一個或多個雜環烷基、取代的雜環烷基、雜芳基、或取代的雜芳基環。在某些實施例中，一三級胺或芳香族氮可以被一個或多個氧原子取代以形成相應的氮氧化物。
本文揭露的化合物可經由任何適合的途徑給予有需要的個體，較佳的給藥方式是適應這類途徑的醫藥組合物。舉例而言，給藥方式可以是口服、 經黏膜、或腸內給藥，或者腸外給藥，包括肌肉內、皮下、鞘內、心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內及眼內注射。
本文中所用術語「有效量」係指賦予接受治療個體治療效果所需的活性成分的量。如本領域熟習技藝人士所知，有效劑量將依據給藥途徑、使用賦形劑、及可能與其他治療性處置共同使用而變化。
本文中所用術語「藥學上可接受的載體」係指與組合物的活性成分相容(較佳地，能夠穩定活性成分)並且對有待治療的個體無害的任何載體。藥學上可接受的載體或賦形劑可包括緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸(methionine)；防腐劑，例如十八烷基二甲基芐基氯化銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、六甲基氯化銨(hexamethonium chloride)、苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、芐索氯銨(benzethonium chloride)、苯酚、苯甲醇、如對羥基苯甲酸甲酯之對羥基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇、及間甲酚；低分子量(少於約10個殘基)的多肽；胺基酸，例如甘胺酸(glycine)、麩醯胺酸(glutamine)、天冬醯胺酸(asparagine)、組胺酸(histidine)、精胺酸(arginine)或離胺酸(lysine)；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；單醣、雙醣、及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖(mannose)、葡聚醣(dextran)、蔗糖、甘露醇(mannitol)、海藻糖(trehalose)、及山梨醇(sorbitol)；螯合劑如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)；成鹽相對離子，例如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白質複合物)；及非離子性界面活性劑，例如TWEENTM(聚山梨醇酯)、PLURONICSTM(泊洛沙姆(poloxamer))、或聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。
術語「個體」係指需要治療與CaMKII活性相關的疾病或狀態(例如黃病毒感染)的哺乳動物。該個體是人類或非人類，例如靈長類、小鼠、狗、貓、牛、馬、兔、豬等。
方法及材料 化學物鑑定
除非另有說明，所有試劑及溶劑均從商業來源獲得並按購買時形式使用。四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)係在惰性氮氣下從鈉/二苯甲酮羰基中 新蒸餾出。1H核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)及13C NMR光譜係以Bruker AVIII-400、AV-400、或AV-500記錄。質子化學位移以百萬分率(ppm)為單位，其係相對於氘代氯仿(deuteriochloroform)中殘留的CHCl3在7.24ppm的單峰。碳化學位移以百萬分率為單位，其係相對於CDCl3(77.0ppm)及丙酮-d6(29.1ppm)的內部13C訊號。高解析度質譜(high resolution mass spectra，HRMS)係使用Waters LCT Premier XE(Waters公司，Manchester，英國)及Bruker New ultrafleXtreme(Bruker，Bremen，德國)而獲得。分析型薄層層析(thin layer chromatography，TLC)係在矽膠60 F254(Merck)上進行。管柱層析(column chromatography)係在矽膠60(230-400目)(Merck)上進行。藉由正相高效液相層析(high-performance liquid chromatography，HPLC)確定化合物的純度高於95%，HPLC係使用Waters 1525二元系統，配合Waters 2489雙λ吸光偵測器以及Purospher STAR Si(5μm)(Merck)與Venusil XBP Silica(Agela Technologies)管柱。沖提液為乙酸乙酯及己烷。所有化合物之偵測係在254nm。
細胞株
實施例中使用的所有細胞均購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)，包括幼倉鼠腎BHK-21細胞(ATCC CCL-10)、蚊C6/36細胞(ATCC CRL-1660)、非洲綠猴腎上皮細胞(Vero；ATCC CRL-1587)、及人神經母細胞瘤BE(2)C細胞(ATCC CRL-2268)。
構建DENV-2-eGFP報導病毒
為評估候選化合物的抗病毒活性，建構一具有SP6啟動子的DENV-2感染性選殖株(SP6-Den2)。簡言之，自DENV-2 PL046病毒株(GenBank登錄號：AJ968413.1)萃取基因組RNA並用於反轉錄聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)以產生五個cDNA片段，其分別含有第1-1512、1342-4250、4132-6375、4522-9368、及6838-10723個核苷酸。將這些cDNA片段選殖至pJET1.2載體的多接頭(polylinker)位點，而後憑藉限制酶與接合(ligation)的標準策略，利用pBR322載體產出病毒全長cDNA選殖株。為建構一DENV-2-eGFP報導病毒，將一包含eGFP cDNA及豬鐵士古病毒(Tescho virus，PTV1)2A序列的DNA片段插入該SP6-Den2的5' UTR及DENV-2的ATG起始密碼子之間。以單引子PCR突變對該SP6-Den2的環化序列(cyclization sequence，CS)進行沉默突變。將編碼DENV-2衣殼蛋白的前34個胺基酸及含有該環化序列 的DNA序列藉由PCR及鈍端連合(blunt end ligation)插入該SP6-Den2感染性選殖株。該選殖株最終含有重複的衣殼蛋白單元，其後接著eGFP-PTV2A及DENV-2基因組的5'端，而該DENV-2基因組具有保守突變的環化序列(SP6-Den2 C34-eGFP-2A 5'CS mut)。將該DENV-2報導病毒的病毒RNA自SP6啟動子在體外轉錄。利用微脂體Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)將病毒RNA轉染至BHK-21細胞中以產生DENV-2報導病毒。該報導病毒係在蚊C6/36細胞中完成擴增。
以細胞為基礎的抗DENV-2篩選
人類神經母細胞瘤BE(2)C細胞係培養於添加10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI 1640培養基(Gibco)。進行篩選前，將BE(2)C細胞接種於一具有透明平底的黑色96孔盤(Corning Costar 3603)。該細胞係在有或無不同劑量指定化合物的情況下，以感染倍率(MOI)為1的DENV-2-eGFP報導病毒感染24小時。使用二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)作為溶劑對照。經過處理的細胞以4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定，並以Hoechst染色細胞核。評估候選化合物的抗病毒活性時，利用ImageXpress Micro XLS高含量分析系統(Molecular Devices)測量細胞培養物的eGFP表現。指示病毒感染的eGFP相對螢光強度以溶劑對照的百分比表示。
細胞毒性試驗
使用細胞毒性檢測試劑組(LDH)(Roche)、細胞增殖試劑組(XTT)(Roche)、及台盼藍(Trypan blue)細胞計數試驗來評估候選化合物對BE(2)C細胞的細胞毒性。簡言之，細胞以指定劑量的候選化合物處理過夜後用於該三種試驗。進行LDH和XTT試驗時，使用酵素連結免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)讀取儀(Molecular Devices)測定樣品在490nm的吸光值。進行台盼藍細胞計數試驗時，使用血球計數器測定活細胞的數目。實驗數據以溶劑對照標準化並且表示為百分比。
抗病毒試驗
體外試驗中使用分離自台灣登革熱患者的DENV-2 PL046病毒株(GenBank登錄號：AJ968413.1)及台灣疾病控制中心提供的ZIKV PRVABC59病毒株(GenBank登錄號：KU501215)。BE(2)C細胞在有或無不同劑量化合物9的情況下以MOI為0.1的DENV-2或ZIKV感染48小時。化合物9的抗病毒活性之評估係 利用免疫螢光試驗(immunofluorescence assay，IFA)、西方墨點法(Western blotting)、及病毒蝕斑形成試驗(plaque-forming assay，PFA)。檢測DENV-2 NS3蛋白或ZIKV E蛋白的表現時，係分別將細胞與抗DENV NS3蛋白抗體或抗黃病毒E蛋白抗體共培養。免疫螢光試驗中使用連結Alexa Fluor-488的抗小鼠二級抗體(Molecular Probes)及用於細胞核染色的Hoechst(Molecular Probes)。經染色的細胞以倒立螢光顯微鏡(Olympus 1X71)觀察。西方墨點法係使用抗β蛋白抗體(Chemicon)及連結山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗小鼠二級抗體(Jackson ImmunoResearch)，並藉由增強型化學發光試劑(ECL；Pierce)偵測訊號。感染性DENV-2及ZIKV顆粒的數量係分別利用BHK-21及Vero細胞的病毒蝕斑形成試驗來測量。病毒效價表示為Log蝕斑形成單位(plaque-forming unit，PFU)/mL，並用於確定半數最大有效濃度(EC50)。EC50之計算係使用本技術領域已知的方法，參見例如Alexander,B.et al.A simple and accurate mathematical method for calculation of the EC50.J Pharmacol Toxicol 1999,41,55-58。
病毒結合/進入試驗
進行病毒結合/進入試驗時，在有或無指定劑量化合物9的情況下，使DENV-2(MOI，5)或ZIKV(MOI，10)在室溫震盪下吸附BE(2)C細胞90分鐘。進行病毒結合試驗時，在有或無化合物9的情況下，使DENV-2或ZIKV在4℃震盪下吸附BE(2)C細胞90分鐘。進行病毒進入試驗時，首先使DENV-2或ZIKV在4℃吸附BE(2)C細胞90分鐘。以冷培養基溫和清洗細胞後，在有或無化合物9的情況下於37℃培養細胞60分鐘以允許病毒進入。其後，用酸性甘胺酸溶液(0.1M，pH=3)處理細胞5分鐘以便使未進入細胞的病毒失去活性，並用冷的漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)清洗細胞。利用細胞刮刀收集細胞，並使細胞通過27-G針頭7次以釋放吸附的病毒。細胞裂解物在12,000rpm離心1分鐘，其上清液用於病毒蝕斑形成試驗以測定病毒結合及/或進入的數量。
動物研究
小鼠實驗係經中央研究院實驗動物照護及使用委員會批准並依據相關規定進行。小鼠在異氟醚(isoflurane)麻醉下接受感染以使動物痛苦最小化。動物研究中使用由Ching-Juh Lai博士(美國國家衛生研究院)提供的小鼠腦中連續繼代的DENV-2新幾內亞C株(NGC-N)及ZIKV PRVABC59病毒株。數組6週齡Stat1-/-小鼠在尾部個別經靜脈感染1×105PFU的DENV-2，或者在腳掌個別經皮 下感染5×104PFU的ZIKV。為研究經口服途徑給藥的化合物9的抗病毒功效，將小鼠分成數組以接受不同治療：磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；載體對照)；在感染時施予2、4、或8mg化合物9/kg體重/天(即時治療)；或在感染後8小時施予2、4、或8mg化合物9/kg體重/天(8小時延遲治療)。其後，在感染後直至第6天每天對小鼠施用PBS或相同劑量的化合物9。每天檢查小鼠的嚴重症狀，包括肢體麻痺。患有嚴重肢體麻痺的小鼠予以安樂死，其作為動物存活的終點。小鼠存活率以存活百分比表示。在感染後第3天以放血法(phlebotomy)自小鼠臉部靜脈採集血清樣品，並藉由病毒蝕斑形成試驗測定病毒載量。
嵌合(docking)運算分析
分子嵌合係使用線上嵌合網路伺服器SwissDock進行，並使用UCSF chimera程式將其視覺化以預測配體分子與整個標靶蛋白之間的交互作用。人類CaMKII的X-射線晶體結構係自蛋白質資料庫(PDB編號：2VZ6)下載，並經過去除靛玉紅E804(Indirubin E408)與非極性氫原子及添加極性氫原子之修飾，以模擬藥物標靶蛋白。作為配體分子的化合物9的結構係以ChemSketch軟體(ACD Inc)製作。
CaMKII生化試驗
化合物7、8、9、或16對純化的人類CaMKII(具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列)活性的抑制作用係利用免疫試驗測量，該試驗係依據製造商使用說明書(CycLex CaM kinase II Assay Kit，MBL Internationl Corp)進行。該免疫試驗足夠靈敏以半定量測量CaMKII的活性，其涉及在Ca2+、鈣調蛋白、Mg2+、及ATP存在下使純化的人類CaMKII與激酶受質(syntide-2，以下稱合成肽2)反應。簡言之，將含有或不含指定劑量化合物7、8、9、或16的激酶反應緩衝液添加至一微量多孔盤。一市售的CaMKII抑制劑KN-62(Selleckchem，S7422)被用作陽性對照。不含Ca2+的激酶反應緩衝液被用作陰性對照。其後，該微量多孔盤的試驗孔洞與連結HRP的抗磷酸化合成肽2抗體共培養，然後加入合成肽2。在室溫下培養15分鐘後停止磷酸化反應。使用ELISA讀取儀(Molecular Devices)測定樣品在450nm的吸光值。實驗數據以溶劑對照標準化並且表示為百分比。
統計分析
除非另有說明，數據表示為平均值±標準偏差，並藉由變異數分析(ANOVA)及Bonferroni事後檢定(Bonferroni post-hoc test)互為比較。統計上顯 著性設定為P值<0.05或<0.01。利用SigmaPlot v10.0(Systat軟體)描述性分析存活曲線。利用Prism v5.0(GraphPad軟體)測定基於對數秩檢定(log-rank test)的存活時間中位數(T50)及P值。對於西方墨點法，利用ImageJ軟體(美國國家衛生研究院)定量條帶強度。
實施例1 候選化合物1-16之合成
以下及顯示於下方流程圖1-3的方法係舉例說明本發明之一些化合物的合成方法。先導化合物1包含四個子結構，包括一苯基部分、一苯磺醯胺主體部分、一末端環、及一連接單元(圖1A)。從先導化合物1開始，製備四個系列的衍生化合物2-16(圖1B-1E)以探討結構-抗病毒活性關係。
Figure 108110137-A0101-12-0014-5
如流程圖1所示，首先，為製得具有磺醯胺及氟苯單元的先導化合物1及類似物2，藉由作為起始材料之酸17及苯胺(aniline)的縮合反應及透過偶合劑O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(O-benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate，HBTU)及二異丙基乙胺(diisopropylethylamine，DIPEA)形成醯胺18。當以氫化鋁鋰完全還原後，使用胺19與4-甲氧基苯磺醯氯(4-methoxybenzenesulfonyl chloride)反應以形成磺醯胺2。最終，在可提高反應效率的4Å分子篩存在下，使用重鉻酸吡啶鹽(pyridinium dichromate，PDC)將類似物2的羥基氧化成酮1。流程圖1所指反應試劑及條件簡述如下：(a)HBTU，DIPEA，THF，8小時，室溫，92%；(b)LiAlH4，THF，4 小時，90℃，90%；(c)4-甲氧基苯磺醯氯，Et3N，THF，60℃，4小時，75%；(d)PDC，二氯甲烷(dichloromethane，DCM)，8小時，室溫，70%。
Figure 108110137-A0101-12-0015-6
如流程圖2所示，藉由在4-甲氧基苯磺醯胺的N-取代基位置引入質子(H)及甲基(CH3)基團來代替原始苯環，可產生不同取代的磺醯胺3及4。氯化物20在過量疊氮化鈉及催化量的碘化鉀存在下，再藉由活性炭上的鈀及氫氣將其選擇性還原，可轉化為相應的胺22。胺22及4-甲氧基苯磺醯氯的縮合反應會得到磺醯胺3。磺醯胺4的製備始於使用多聚甲醛令胺22形成亞胺，而後以硼氫化鈉選擇性還原，接著在相同條件下形成磺醯胺。流程圖2所指反應試劑及條件簡述如下：(a)KI，NaN3，二甲基甲醯胺(dimethylformamide，DMF)，4小時，90℃；(b)Pd/C，H2，MeOH，8小時，室溫；(c)4-甲氧基苯磺醯氯，Et3N，THF，60℃，4小時，48%；(d)(1)HCHO，NaOMe，MeOH，90℃，4小時，(2)NaBH4，MeOH，室溫，4小時，63%；(e)4-甲氧基苯磺醯氯，Et3N，THF，60℃，4小時，78%。
Figure 108110137-A0101-12-0016-7
如流程圖3所示合成苯磺醯胺類似物5-16，其係衍生自對先導化合物的苯基、末端環、連接單元、及苯磺醯胺部分予以修飾。在90℃及氫化鈉存在下藉由相應的胺24-27氨解γ-丁內酯(γ-butyrolactone)可得到羧醯胺28-31，其被LiAlH4還原會產出二級胺32-35。此外，不同取代的苯磺醯氯與胺32-35縮合，然後在重鉻酸吡啶鹽存在下進行溫和氧化，會分別得到醛43-49。將過量的格林納試劑(Grignard reagent)加入相應的醛43-49會得到二級醇50-56，其被重鉻酸吡啶鹽溶液進一步氧化以獲得各別目標化合物5-16，其R1'、R2'、及R3'基團顯示於表1。流程圖3所指反應試劑及條件簡述如下：(a)(1)NaH，THF，30分鐘，90℃，(2)丁內酯，THF，8小時，90℃，90%；(b)LiAlH4，THF，8小時，90℃；(c)取代的苯磺醯氯，Et3N，THF，60℃，4小時，76%；(d)PDC，DCM，8小時，室溫，65%；(e)(1)R2Br，Mg，THF，2小時，室溫，(2)醛，THF，60℃，2小時，60%；(f)PDC，DCM，8小時，室溫。
Figure 108110137-A0101-12-0017-8
候選化合物1-16的製備方法詳述如下。
1.1 製備化合物2，N-(4-(4-氟苯基)-4-羥基丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺醯胺(N-(4-(4-fluorophenyl)-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0017-9
將苯胺(2mL，21.93mmol)溶液、酸17(4.30g，21.93mmol)、HBTU(9.15g，24.12mmol)及DIPEA(7.64mL，43.86mmol)的THF(60mL)溶液在室溫下攪拌8小時。減壓乾燥該反應混合物，並藉由管柱層析純化得醯胺18，其為白色固體(5.47g，92%)。在室溫及氬氣下將氫化鋁鋰(696mg，18.40mmol)懸浮於THF(100mL)。在0℃及氬氣下滴加醯胺18(2g，7.36mmol)的THF(10mL)溶液超過30分鐘。接著，該反應混合物在90℃攪拌8小時，然後以乙酸乙酯及水萃取，經硫酸鎂乾燥，並且真空濃縮。由此得到胺19，其為灰色油狀物(1.72g，90%)， 無需進一步純化而直接用於下一步驟。將4-甲氧基苯磺醯氯(1.59g，7.71mmol)、三乙胺(triethylamine；2.15mL，15.42mmol)、及胺19(2g，7.71mmol)的THF(60mL)溶液在60℃攪拌8小時。該反應混合物以乙酸乙酯及水萃取。將合併的有機層用硫酸鎂乾燥並且真空濃縮。所得殘餘物進行快速管柱層析，然後進行正相HPLC以獲得純產物2，其為一無色油狀物(2.48g，75%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 1.42-1.54(m,2H),1.78-1.84(m,2H),3.55-3.60(m,2H),3.88(s,3H),4.68(t,J=6.4Hz,2H),6.91(d,J=8.4Hz,2H),7.01-7.04(m,4H),7.26-7.31(m,5H),7.50(d,J=8.4Hz,2H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ 24.3,36.3,50.0,55.3,71.9,114.0,114.5,114.7,127.6,127.6,128.8,128.8,129.7,130.3,139.5,142.1,161.8(d,J=251Hz)。HRMS(ESI)：C23H24NO4FS(M+Na)+計算值452.1308，實測值452.1301。
1.2 製備化合物1，N-(4-(4-氟苯基)-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺醯胺(N-(4-(4-fluorophenyl)-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0018-10
將重鉻酸吡啶鹽(0.91g，2.43mmol)溶液及含4Å分子篩(1.0g)的化合物2(0.8g，1.87mmol)的二氯甲烷(DCM；30mL)溶液在室溫下攪拌8小時。該反應混合物以乙酸乙酯及水萃取。將合併的有機層用硫酸鎂乾燥並且真空濃縮。所得殘餘物進行快速管柱層析，然後進行正相HPLC以獲得純化合物1，其為一白色固體(70%)：熔點93-94℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.82-1.89(m,2H),3.09-3.12(t,J=7.0Hz,2H),3.66-3.69(t,J=6.2Hz,2H),3.87(s,3H),6.91(d,J=8.4Hz,2H),7.08-7.15(m,4H),7.31-7.33(m,3H),7.51(d,J=8.0Hz,2H),7.96-7.99(m,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ22.3,35.0,49.6,55.6,55.75,114.0,115.6(d,J=22Hz),128.0,128.7,129.1,129.7,130.6,130.7,133.3,139.0,162.9,165.7(d,J=253Hz),197.7。HRMS(ESI)：C23H22NO4FS(M+Na)+計算值450.1151，實測值450.1146。
1.3 製備化合物3，N-(4-(4-氟苯基)-4-氧代丁基)苯磺醯胺(N-(4-(4-fluorophenyl)-4-oxobutyl)benzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0019-11
將疊氮化鈉(1.06g，16.24mmol)、氯化物20(1.3mL，8.12mmol)、及碘化鉀(134mg，0.81mmol)的DMF(30mL)溶液在90℃攪拌8小時。該反應混合物以乙酸乙酯及水萃取。將合併的有機層用硫酸鎂乾燥並且真空濃縮。所得粗殘餘物21無需進一步純化即可使用。將殘餘物21(2g，9.65mmol)及鈀/活性炭(0.21g，0.97mmol)的MeOH(10mL)溶液在室溫及氫氣(1bar)下攪拌8小時。過濾該反應混合物可得到胺22。將4-甲氧基苯磺醯氯(2.19g，10.62mmol)與三乙胺(2.94mL，21.12mmol)的混合物加入胺22(在前一步驟係溶解於MeOH中)的無水THF(50mL)溶液，且該混合物在60℃攪拌8小時。該反應混合物以乙酸乙酯及水萃取，然後經硫酸鎂乾燥，並且真空濃縮。所得殘餘物進行快速管柱層析，然後進行正相HPLC以獲得純化合物3，其為一白色固體(48%)：熔點84-85℃。1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ 1.85-1.92(m,2H),3.00-3.03(m,2H),3.05-3.10(m,2H),3.88(s,3H),6.39(t,J=5.6Hz,1H),7.08(d,J=8.8Hz,2H),7.24-7.28(m,2H),7.80(d,J=8.8Hz,2H),8.02-8.06(m,2H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ 23.1,34.9,42.4,55.2,114.1,115.4(d,J=22Hz),128.9,130.7(d,J=9Hz),132.8,133.7,162.7,165.5(d,J=250Hz),197.3。HRMS(ESI)：C17H18NO4FS(M+Na)+計算值374.0838，實測值374.0843。
1.4 製備化合物4，N-(4-(4-氟苯基)-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-甲基苯磺醯胺(N-(4-(4-fluorophenyl)-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-methylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0019-12
將多聚甲醛(0.23g，7.64mmol)溶液、胺22(1g，5.46mmol)、及甲醇鈉(1.47g，27.30mmol)的MeOH(30mL)溶液在90℃攪拌4小時，然後將該反應混合物冷卻至室溫。將硼氫化鈉(0.41g，10.92mmol)緩慢加入該反應混合物超過5分鐘。該反應混合物以乙酸乙酯及水萃取，然後經硫酸鎂乾燥、真空濃縮、及藉由快速管柱層析之純化以獲得化合物23(0.67g，63%)。將4-甲氧基苯磺醯氯(1.05g，5.12mmol)溶液、三乙胺(1.43mL，10.24mmol)、及化合物23(1.0g，5.12mmol)的THF(20mL)溶液在60℃攪拌8小時。該反應混合物以乙酸乙酯及水萃取，然後經硫酸鎂乾燥，並且真空濃縮。所得殘餘物進行快速管柱層析，然後進行正相HPLC以獲得純化合物4，其為一白色固體(1.46g，78%)：熔點89-90℃。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ 1.90-1.96(m,2H),2.67(s,3H),3.01-3.05(m,4H),3.81(s,3H),6.91-6.94(m,2H),7.06-7.10(m,2H),7.64-7.67(m,2H),7.93-7.97(m,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ 21.5,34.7,35.0,49.4,55.6,114.2,115.7(d,J=22Hz),129.0,129.4,130.7(d,J=9Hz),133.3,162.8,164.7(d,J=254Hz),197.9。HRMS(ESI)：C18H20FNO4S(M+Na)+計算值388.0995，實測值388.0995。
1.5 製備候選化合物5-16的一般性方法
將胺24(5mL，54.76mmol)滴加至氫化鈉(2.52g，65.71mmol)及THF(100mL)的混合物超過30分鐘。該反應混合物在90℃攪拌1小時，然後滴加丁內酯(4.17mL，54.76mmol)超過10分鐘。8小時後，該反應混合物以乙酸乙酯及水萃取，然後經硫酸鎂乾燥，並且真空濃縮。所得殘餘物進行快速管柱層析以獲得醯胺28(8.83g，90%)，其為一白色固體。
在0℃及氬氣下，將醯胺28(4.0g，22.35mmol)的THF(50mL)溶液滴加至氫化鋁鋰(2.12g，55.84mmol)及THF(100mL)的混合物超過30分鐘。該反應混合物在90℃攪拌8小時，然後以乙酸乙酯及水萃取，經硫酸鎂乾燥，並且真空濃縮。由此獲得二級胺32，其無需進一步純化而直接用於下一步驟。
將4-甲氧基苯磺醯氯(4.94g，23.99mmol)、三乙胺(5.57mL，39.98mmol)、及醇32(3.30g，19.99mmol)的THF(60mL)溶液在60℃攪拌4小時。該反應混合物以乙酸乙酯和水萃取，然後經硫酸鎂乾燥，並且真空濃縮。所得殘餘物進行快速管柱層析以獲得磺醯胺36(5.09g，76%)。
將4Å分子篩(3.00g)及重鉻酸吡啶鹽(5.09g，13.47mmol)的混合物加入磺醯胺36(3.00g，8.98mmol)的DCM溶液。該混合物在室溫下攪拌8小時，然後以乙酸乙酯及水萃取，經硫酸鎂乾燥，並真空濃縮。所得殘餘物進行快速管柱層析以獲得醛43(1.95g，65%)，其為一無色固體。
將甲基碘(0.42mL，6.75mmol)溶液及鎂(131mg，5.40mmol)的THF(10mL)溶液在60℃攪拌1小時，然後將該混合物冷卻至室溫。滴加醛43(0.45g，1.36mmol)的THF(10mL)溶液超過10分鐘。2小時後，該反應混合物以乙酸乙酯及水萃取，經硫酸鎂乾燥，並真空濃縮。由此獲得二級醇50，其無需進一步純化而直接用於下一步驟。
將4Å分子篩(1.00g)及重鉻酸吡啶鹽(764mg，2.03mmol)的混合物加入醇50的無水DCM(30mL)溶液。該混合物在室溫下攪拌8小時，然後以乙酸乙酯及水萃取，經硫酸鎂乾燥，並且真空濃縮。所得殘餘物進行快速管柱層析，然後進行正相HPLC以獲得純化合物5(0.28g，60%)。
1.5.1 化合物5，4-甲氧基-N-(4-氧代戊基)-N-苯基苯磺醯胺(4-methoxy-N-(4-oxopentyl)-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0021-13
一白色固體；產率33%；熔點81-82℃。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ 1.60-1.62(m,2H),2.08(s,3H),2.54(t,J=7Hz,2H),3.49(t,J=6.5Hz,2H),3.807(s,3H),6.85-6.86(m,2H),6.99(d,J=7Hz,2H),7.24-7.26(m,3H),7.44(d,J=7Hz,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ 21.8,30.1,39.8,49.5,55.6,113.9,127.9,128.7,129.1,129.7,139.0,162.9,208.1。HRMS(ESI)：C18H21NO4S(M+Na)+計算值370.1089，實測值370.1084。
1.5.2 化合物6，N-(4-環己烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺醯胺(N-(4-cyclohexyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0022-14
一白色固體；產率32%；熔點81-82℃。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ 1.30-1.35(m,4H),1.66-1.68(m,4H),1.70-1.86(m,4H),2.35(m,1H),2.61(t,J=7Hz,2H),3.57(t,J=7Hz,2H),3.90(s,3H),6.94(d,J=8.5Hz,2H),7.07-7.09(m,2H),7.32-7.35(m,3H),7.52(d,J=8.5Hz,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ 21.8,25.7,25.7,25.8,28.5,28.5,36.8,49.6,50.8,55.6,113.9,127.9,128.7,129.0,129.7,129.8,139.0,162.9。HRMS(ESI)：C23H29NO4S(M+Na)+計算值438.1715，實測值438.1710。
1.5.3 化合物7，N-(4-環丁烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺醯胺(N-(4-cyclobutyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0022-15
一灰色黏稠液體；產率32%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 1.61-1.67(m,2H),1.73-1.80(m,1H),1.89-1.98(m,1H),2.05-2.21(m,4H),2.45(t,J=6.8Hz,2H),3.16-3.23(m,1H),3.51(t,J=6.8Hz,2H),3.83(s,3H),6.86-6.99(m,2H),7.00-7.02(d,J=8Hz,2H),7.26-7.28(m,3H),7.45(d,J=8Hz,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ 17.9,22.0,24.6,24.6,36.3,45.7,49.8,55.8,114.1,128.1,128.9,129.2,130.0,130.1,139.2,163.1,211.3。HRMS(ESI)：C21H25NO4S(M+Na)+計算值410.1402，實測值410.1407。
1.5.4 化合物8，N-(4-環戊烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺醯胺(N-(4-cyclopentyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0023-16
一白色固體；產率35%；熔點89-90℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 1.57-1.78(m,10H),2.53(t,J=7Hz,2H),2.75-2.83(m,1H),3.50(t,J=6.4Hz,2H),3.80(s,3H),6.84-6.87(m,2H),6.98-7.01(m,2H),7.22-7.26(m,3H),7.43(d,J=8.8Hz,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ 22.2,26.1,26.1,29.1,29.1,38.1,49.8,51.7,55.7,114.1,128.1,128.9,129.0,129.2,129.9,139.2,163.0,212.7。HRMS(ESI)：C22H27NO4S(M+Na)+計算值424.1559，實測值424.1552。
1.5.5 化合物9，N-(4-環庚烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺醯胺(N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0023-17
一白色固體；產率34%；熔點75-76℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 1.62-1.71(m,6H),1.75-1.80(m,8H),2.44-2.50(m,1H),2.55(t,J=7.2Hz,2H),3.51(m,J=6.4Hz,2H),3.83(s,3H),6.87(d,J=8.8Hz,2H),7.01-7.03(m,2H),7.27-7.28(m,3H),7.45(d,J=8.8Hz,2H)；13C NMR(100Hz,CDCl3)δ 22.2,26.9,26.9,28.5,28.5,30.1,30.1,37.2,49.8,52.6,55.8,114.1,128.1,128.9,129.2,130.0,139.3,163.1,213.9。HRMS(ESI)：C24H31NO4S(M+Na)+計算值452.1872，實測值452.1866。
1.5.6 化合物10，N-(4-(金剛烷-2-基)-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-苯基苯磺醯胺(N-(4-(adamantan-2-yl)-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0024-18
一白色固體；產率35%；熔點117-118℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 1.54-1.88(m,14H),2.29-2.31(m,2H),2.41-2.42(m,1H),2.53(t,J=7.2Hz,2H),3.52(t,J=6.4Hz,2H),3.83(s,3H),6.89(d,J=7.2Hz,2H),7.00-7.02(m,2H),7.26-7.28(m,3H),7.45(d,J=9.2Hz,2H)；13C NMR(100Hz,CDCl3)δ 22.2,27.7,27.8,29.4,29.4,33.5,33.5,36.2,37.5,38.5,38.5,49.8,55.8,57.3,114.1,128.1,128.9,129.2,129.9,139.2,163.0,212.3。HRMS(ESI)：C27H33NO4S(M+Na)+計算值490.2028，實測值490.2033。
1.5.7 化合物11，N-(4-環戊烷基-4-氧代丁基)-N-苯基-4-(三氟甲氧基)苯磺醯胺(N-(4-cyclopentyl-4-oxobutyl)-N-phenyl-4-(trifluoromethoxy)benzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0024-19
一白色固體；產率32%；熔點69-70℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 1.56-1.77(m,8H),1.79-1.82(m,2H),2.56(t,J=7.2Hz,2H),2.78-2.86(m,1H),3.56(t,J=6.4Hz,2H),7.00-7.03(m,2H),7.23-7.25(m,2H),7.29-7.31(m,3H),7.57-7.59(m,2H)；13C NMR(100Hz,CDCl3)δ 22.1,26.2,26.2,28.1,28.1,39.0,50.0,51.7,120.7,128.2,128.8,129.5,130.0,136.6,138.6,152.3,212.6。HRMS(ESI)：C22H25NO4SF3(M+H)+計算值456.1456，實測值456.1458。
1.5.8 化合物12，N-(4-環庚烷基-4-氧代丁基)-4-苯氧基-N-苯基苯磺醯胺(N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-4-phenoxy-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0025-20
一白色固體；產率35%；熔點127-128℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 1.40-1.80(m,14H),2.45-2.49(m,1H),2.55(t,J=7.2Hz,2H),3.53(t,J=6.4Hz,2H),6.93-6.95(m,2H),7.03-7.05(m,4H),7.18-7.30(m,4H),7.37-7.41(m,2H),7.46-7.48(m,2H)；13C NMR(100Hz,CDCl3)δ 22.3,26.9,26.9,28.5,28.5,30.2,30.2,37.2,49.9,52.7,117.5,120.5,125.1,128.2,128.9,129.3,130.1,130.4,132.0,139.1,155.4,161.7,213.9。HRMS(ESI)：C29H33NO4S(M+Na)+計算值514.2028，實測值514.2023。
1.5.9 化合物13，N-(4-環庚烷基-4-氧代丁基)-4-甲基-N-苯基苯磺醯胺(N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-4-methyl-N-phenylbenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0025-21
一灰色黏稠液體；產率23%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 1.46-1.91(m,16H),2.46(s,3H),2.50-2.57(m,1H),2.62(t,J=7.2Hz,2H),3.58(t,J=6.6Hz,2H),7.06-7.09(m,2H),7.26-7.35(m,5H),7.47(d,J=8.4Hz,2H)；13C NMR(75Hz,CDCl3)δ 21.7,22.2,26.7,26.7,28.5,28.5,30.2,30.2,37.2,49.9,52.7,127.9,128.1,129.0,129.3,129.6,135.4,139.2,143.6,214.0。HRMS(ESI)：C24H31NO3S(M+Na)+計算值436.1922，實測值436.1917。
1.5.10 化合物14，N-(4-環庚烷基-4-氧代丁基)-N-環己烷基-4-甲氧基苯磺醯胺(N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-N-cyclohexyl-4-methoxybenzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0026-22
一灰色黏稠液體；產率32%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 1.28-1.86(m,23H),2.49(t,J=7.2Hz,2H),3.07-3.11(m,2H),3.50-3.56(m,1H),3.82(s,3H),6.96(d,J=8,2H),7.69-7.71(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ 25.5,26.0,26.3,26.3,26.9,26.9,28.5,28.5,30.2,30.2,31.9,31.9,37.9,43.3,52.5,55.7,58.2,114.3,129.1,162.7,214.2。HRMS(ESI)：C24H25NO4S(M+Na)+計算值446.1402，實測值446.1402。
1.5.11 化合物15，N-(4-環庚烷基-4-氧代丁基)-4-甲氧基-N-(5,6,7,8-四氫萘-2-基)-苯磺醯胺(N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-4-methoxy-N-(5,6,7,8-tetrahydro naphthalen-2-yl)-benzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0026-23
一白色固體；產率32%；熔點111-112℃。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 1.47-1.78(m,18H),2.50-2.55(m,3H),2.76-2.79(m,3H),2.95-3.08(m,1H),3.17-3.24(m,1H),3.60-3.70(m,1H),3.87(s,3H),6.38-6.41(m,1H),6.92-7.04(m,4H),7.60(d,J=9Hz,2H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ 22.5,22.8,22.9,26.0,26.0,26.9,26.9,28.5,29.9,30.1,30.2,37.8,51.5,52.6,55.8,114.1,125.2,125.6,129.5,130.3,130.8,138.4,139.5,139.6,163.1,213.7。HRMS(ESI)：C28H37NO4S(M+Na)+計算值506.2341，實測值506.2322。
1.5.12 化合物16，N-(4-環庚烷基-4-氧代丁基)-N-(4-環己烷基苯基)-4-甲氧基苯磺醯胺(N-(4-cycloheptyl-4-oxobutyl)-N-(4-cyclohexylphenyl)-4-methoxy benzenesulfonamide)
Figure 108110137-A0101-12-0027-24
一白色固體；產率35%；熔點103-104℃。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 1.32-1.82(m,24H),2.47-2.48(m,2H),2.55(t,J=7.2Hz,2H),3.47(t,J=6.6Hz,2H),3.83(s,3H),6.86-6.92(m,4H),7.09(d,J=8.4Hz,2H),7.47(d,J=8.7Hz,2H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)22.2,26.2,26.8,26.8,26.9,26.9,28.4,28.4,30.1,30.1,34.5,34.5,37.2,44.2,49.9,52.5,55.7,114.0,127.5,128.3,129.9,130.2,136.7,148.0,162.9,214.0。HRMS(ESI)：C30H41NO4S(M+Na)+計算值534.2654，實測值534.2648。
實施例2 結構-活性關係(structure-activity relationship，SAR)篩選
為對實施例1中描述的候選化合物1-16進行初步抗病毒篩選，在有或無指定化合物的情況下使用一表現增強型綠色螢光蛋白的DENV-2報導病毒(稱為DENV-2-eGFP)感染人類神經元BE(2)C細胞。表2顯示以3.125μM之指定化合物處理的細胞的eGFP相對螢光強度。此外，利用XTT試驗評估6.25μM之指定化合物對細胞增殖的影響。
Figure 108110137-A0101-12-0027-25
Figure 108110137-A0101-12-0028-26
依據表2，相比溶劑對照，先導化合物1之處理致使39.3% BE(2)C細胞感染DENV-2，並且減少細胞增殖至56.1%。第一系列化合物在結構上的差異在於連接單元中的酮基以及苯基部分(圖1B)。將化合物1的酮基還原為化合物2的羥基會造成48.5%的感染，並且改善細胞增殖至76.3%。當化合物1的苯基分別在化合物3及4中被氫或甲基取代時，未觀察到化合物的細胞毒性，然而，該些取代導致對DENV-2的抗病毒效力喪失，造成122.6%(化合物3)或100.9%(化合物4)的感染。這些數據顯示苯環是該些苯環磺醯胺衍生物的抗登革病毒活性所需。
基於這些發現，產出在連接單元的末端環有結構上差異的第二系列化合物(圖1C)。具有甲基取代的化合物5之處理未顯示可觀察到的抗登革病毒功效(100.8%的感染)。化合物6的環己烷基取代使其重新獲得抗病毒活性(63.3%的感染)，儘管此抗病毒效力低於化合物1。化合物7及8的末端環的環丁烷基或環戊烷基取代分別導致33%及25.1%的感染，顯示出與化合物1相當的抗病毒活性。值得注意的是，相比化合物1，化合物7或8的細胞毒性明顯降低。化合物9中的環庚烷基取代致使DENV-2感染顯著降低至9.6%，且對細胞增殖僅有少許影響。具金剛烷基取代的化合物10造成51.1%的DENV-2感染以及對細胞增殖的少許影響。
在第三系列化合物中(圖1D)，苯磺醯胺的甲氧基被修改為三氟甲基(化合物11)、苯氧基(化合物12)、或甲基(化合物13)。化合物11、12、或13之處理分別導致118.2%、73.4%、及76.9%的DENV-2感染。在以該些化合物處理的細胞中觀察到對細胞增殖的少許影響。此結果顯示取代的苯磺醯胺的甲氧基對抗病毒活性是重要的。
此外，將化合物9的苯基改變為脂肪環(化合物14)。我們在以化合物14處理的細胞中觀察到輕微的細胞毒性及65.7%的DENV-2感染。此外，為增加化合物的溶解度，將苯基延伸成四氫萘基(化合物15)或4-環己烷基苯基(化合 物16)(圖1E)。化合物15或16之處理分別導致21.5%及13.8%的DENV-2感染，且對BE(2)C細胞的增殖沒有影響。
綜上，先導化合物1的抗登革病毒活性需要包括一苯基部分、一連接單元中的酮基、及一甲氧基苯磺醯胺等子結構。此外，末端環的脂肪族取代使抗病毒效力大為增加，並且降低先導化合物1的細胞毒性，又與苯基部分相連的額外環可以增加溶解度。
實施例3 化合物9抑制DENV-2及ZIKV的體外感染
依據實施例2，化合物9相比其他苯磺醯胺衍生物表現出最佳抗病毒活性，而且具有可容忍的細胞毒性。因此，進一步研究化合物9對野生型DENV-2及ZIKV感染的抗病毒效力。首先，使用三種不同的試驗方法全面性測定化合物9的非細胞毒性劑量(non-cytotoxic dose)：LDH細胞毒性試驗、XTT細胞增殖試驗、及台盼藍細胞計數試驗。其後，在有或無非細胞毒性的化合物9的情況下，用DENV-2(MOI，0.1)或ZIKV(MOI，0.1)感染BE(2)C細胞以進行抗病毒試驗，並且測定病毒蛋白表現及病毒子代產生。
如圖2A所示，高達12.5μM之化合物9沒有顯著細胞毒性，並且對BE(2)C細胞的增殖與活力沒有顯著影響。
依據圖2B-2D，非細胞毒性的化合物9之處理以劑量依賴方式顯著降低DENV-2 NS3蛋白表現及病毒子代產生，其EC50為1.52μM。類似地，如圖2E-2G所示，非細胞毒性的化合物9之處理顯著抑制ZIKV E蛋白表現及病毒子代產生，其EC50為1.91μM。因此，在非細胞毒性濃度下，化合物9展現對野生型DENV-2及ZIKV感染的抗病毒作用。
實施例4 化合物9阻止DENV-2及ZIKV的病毒進入
為了探討化合物9是否在病毒感染的早期或晚期表現出抗病毒作用，BE(2)C細胞在病毒吸附期間(0-3hpi)或病毒吸附後(3-24hpi)有或無指定劑量化合物9的情況下感染DENV-2(MOI，1)。如圖3A所示，在病毒吸附期間以化合物9處理3小時會劑量依賴地降低病毒NS3蛋白的表現，顯示化合物9可以對付病 毒感染的早期步驟。並且如圖3B所示，化合物9之處理顯著降低ZIKV結合/進入的數量。
為了進一步剖析化合物9對病毒結合與進入的影響，在有或無不同劑量的該化合物的情況下，對BE(2)C細胞分別進行病毒結合試驗及病毒進入試驗。如圖3C所示，化合物9之處理不影響DENV-2或ZIKV結合至細胞。然而，如圖3D所示，化合物9之處理以劑量依賴方式顯著降低DENV-2及ZIKV進入細胞的數量。因此，化合物9對DENV-2及ZIKV感染的抗病毒作用係有關於病毒進入。
實施例5 化合物9改善DENV-2及ZIKA感染小鼠的存活狀況
接受小鼠適應性DENV-2 NGC-N病毒株或ZIKV刺激的Stat1缺陷小鼠被當作一種感染性疾病模型，用於測試化合物9在體內是否具有抗病毒作用。簡言之，在感染時(即時治療)或感染後8小時(8小時延遲治療)對小鼠單獨施予PBS(n=5)或化合物9(2、4、或8mg/kg體重/天；n=5)的PBS溶液，其後使該小鼠接受相同劑量的治療直至感染後第6天。
如圖4A所示，在6天治療期間經由口服給予8或4mg化合物9/kg體重/天的即時治療將DENV-2感染小鼠的總體存活率顯著提升至60%。值得注意的是，較低劑量化合物9 2mg/kg體重/天)的即時治療顯著降低動物的死亡率(T50為15天，對比載體對照的T50為9天)，但對動物的總體存活率有較小影響。
如圖4B所示，8mg化合物9/kg體重/天的即時治療亦顯著延遲ZIKV誘導的致死率(T50為11天，對比載體對照的T50為7天)，但較低劑量的化合物9(4mg/kg體重/天)並未改善總體存活率。此外，如圖4C所示，化合物9之處理以劑量依賴方式顯著降低DENV-2或ZIKV感染小鼠的病毒載量。因此，與小鼠存活的結果一致，病毒載量數據證明了化合物9對DENV-2及ZIKV感染的抗病毒活性。
自感染後8小時(8小時延遲)開始到感染後第6天結束所進行的治療，其目的是監測化合物9在治療模式中的抗病毒作用。如圖4D所示，2mg化合物9/kg體重/天的治療足以顯著改善DENV-2感染小鼠的存活時間中位數(T50為14天，對比載體對照的T50為10天)。此外，較高劑量化合物9(4mg/kg體重/天)的治療可保護40%的DENV-2感染小鼠免於死亡，並且進一步增加動物的存活時間(T50為22天，對比載體對照的T50為10天)。然而，如圖4E所示，化合物9的8小時 延遲治療對ZIKV感染小鼠的總體存活率有較小影響。8mg化合物9/kg體重/天的治療僅將T50提升至10天。DENV-2及ZIKV在Stat1缺陷小鼠的不同毒力及/或病毒致病機制可能促成化合物9改善動物存活效力的差異。有趣的是，化合物9對DENV-2及ZIKV感染的進入步驟的抑制作用或可解釋化合物9的即時給藥相比感染後8小時給藥有更好效果。總之，這些數據顯示化合物9在哺乳動物中具有對DENV-2及ZIKV感染的抗病毒效力。
實施例6 化合物9及其類似物對CaMKII活性的抑制作用
為預測化合物9及CaMKII之間的交互作用進行了分子嵌合。如圖5A所示，化合物9結合至CaMKII激酶結構域(domain)的N-環(N-loop)及C-環(C-loop)之間的界面。如圖5B所示，結合分析揭示化合物9與CaMKII的Ala23(2.21Å)及Phe24(2.31Å)之間有氫鍵交互作用。此外，化合物9與Lys21、Gly22、Glu139、Gly175、及Gly158間可能有交互作用。值得注意的是，Lys21、Gly22及Phe24是位於CaMKII的ATP結合位置內的殘基。此外，CaMKII的Glu139突變使其受質親和力變差，因為該殘基是位於受質結合位置。這些數據說明化合物9可能干擾ATP及受質與CaMKII結合。
為了驗證化合物9及其類似物，例如化合物7、8、及16，是否抑制CaMKII活性，進行生化試驗以測量純化的人類CaMKII在有或無該些化合物的情況下的活性。如圖6A所示，當鈣離子欠缺時(表示為Ca(-))難以觀察到CaMKII的活性。化合物9及市售CaMKII抑制劑KN-62以劑量依賴方式顯著降低CaMKII的活性，其IC50分別為約0.79μM及1.03μM。如圖6B所示，化合物7、8、及16亦顯著降低CaMKII的活性，其IC50分別為約0.6μM、0.8μM及、0.7μM。
基於以上說明，本領域熟習技藝人士可以輕易確定本揭露的重要特徵，並且在不脫離其精神及範圍的情況下，可以對本揭露進行各種變化及修飾，以使其適用於各種用途與狀況。因此，其他實施方式亦在申請專利範圍內。
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Figure 108110137-A0101-12-0032-27
Figure 108110137-A0101-12-0033-28
Figure 108110137-A0101-11-0002-1

Claims (19)

  1. 一種式(I)所示的化合物：
    Figure 108110137-A0305-02-0036-1
     其中，R1為氫、具有3至7個成環碳原子的環烷基、或具有2至3個環且各環具有4至6個環原子的芳基；或R1與連接R1的苯環形成具有8至10個成環碳原子的稠合碳雙環；R2為具有4至10個成環碳原子的環烷基；以及n為1、2、4或6。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R1為氫以及n為1。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之化合物，係以下式之一所示：
    Figure 108110137-A0305-02-0036-2
  4. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R1為氫；R2為環庚烷基；以及n為2、4或6。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R2為環庚烷基以及n為1。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之化合物，係以下式之一所示：
    Figure 108110137-A0305-02-0037-3
  7. 一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項所述之化合物，以及一藥學上可接受的載體。
  8. 一種抑制細胞中鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)活性的方法，包含將該細胞接觸一有效量之如申請專利範圍第1項所述之化合物。
  9. 一種如申請專利範圍第1項所述之化合物的用途，係用於製備治療與鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)活性相關的疾病或狀態的醫藥組合物。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該與CaMKII活性相關的疾病或狀態係為一黃病毒感染。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該黃病毒係選自由登革病毒、茲卡病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河病毒、黃熱病病毒、及其任意組合所組成之群組。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該與CaMKII活性相關的疾病或狀態係為一癌症。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中該癌症係選自由肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、及其任意組合所組成之群組。
  14. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該與CaMKII活性相關的疾病或狀態係為一心血管疾病或狀態。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該心血管疾病或狀態係選自由心律不整、缺血-再灌流損傷、心臟衰竭、及其任意組合所組成之群組。
  16. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該與CaMKII活性相關的疾病或狀態係為一神經疾病。
  17. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該神經疾病係選自由阿茲海默症、帕金森氏症、癲癇、及其任意組合所組成之群組。
  18. 一種抑制黃病毒進入體外細胞的方法，包含將該體外細胞接觸一有效量之如申請專利範圍第1項所述之化合物。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該黃病毒係選自由登革病毒、茲卡病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河病毒、黃熱病病毒、及其任意組合所組成之群組。
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