CN110522535A - 用于分区骨腱界面支架的分隔装置及其分隔方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于分区骨腱界面支架的分隔装置及其方法,所述方法包括以下步骤:S1、将若干三相组织薄片从上往下放置在第一容腔底部,形成具有若干支架层的三相组织支架。S2、将隔断板压在三相组织薄片上,并通过隔断板在第一容腔中形成骨头隔断区,软骨隔断区以及肌腱隔断区,其中骨头隔断区,软骨隔断区以及肌腱隔断区与三相组织支架的骨头区、软骨区以及肌腱区相匹配。S3、在骨头隔断区中加入骨头生长因子液,在软骨隔断区中加入软骨生长因子液,在肌腱区中加入肌腱生长因子液。通过上述方法制备的得到的三相组织薄片具有仿生特性,具有较为正常的组织型态,而非简单地平齐结构,更加符合人体生理结构。
Description
技术领域
本发明主要涉及骨腱连接点缺损修复技术,尤其涉及一种用于分区骨腱界面支架的分隔装置及其分隔方法。
背景技术
以下内容仅为发明人对相关技术领域知识的认知,并不必然构成现有技术。
组织工程技术的出现与蓬勃发展,激励临床医师及研究人员试图通过组织工程策略来解决这一难题。传统组织工程骨腱界面再生策略存在以下问题:1)现有支架仅从形态结构、梯度矿化、力学性能中的一个或两个方面特性进行仿生设计,缺乏多重仿生特性;2)现有支架多由人工合成材料制备,且在支架的骨、纤维软骨和肌腱不同区域缺乏干细胞定向诱导分化的特性;3)外源性种子细胞的引入存在致瘤风险,并且体外将种子细胞负载于支架,构建组织工程移植物的操作过程繁琐、保存困难。“区域诱导活性支架”概念为组织工程骨腱界面再生策略研究提供了一种新的思维模式。该模式强调支架不同区域分别应具有成骨、成软骨、成肌腱的诱导作用,为体内原位再生提供适宜的微环境。这种设计有助于直接从体内环境诱导内源性干细胞迁入支架并定向分化,从而规避了种子细胞的引入,利于在原位修复特征性骨-纤维软骨-肌腱结构。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种用于分区骨腱界面支架的分隔装置及其方法能搭建稳固的三相组织结构。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案内容具体如下:
第一方面,提供一种用于分区骨腱界面支架的分隔装置,包括壳体,活动件以及隔断板,活动件可拆卸地安装在壳体上,所述隔断板可拆卸地安装在活动件上,所述壳体设有第一容腔,所述活动件以及隔断板都设置在第一容腔中。
在其中一种实施例,还包括缓冲件,所述缓冲件设置在第一容腔底部。
在其中一种实施例,所述缓冲件上设有密封膜。
第二方面,一种用于分区骨腱界面支架的分隔方法,结合第一方面的装置,包括以下步骤:
将若干三相组织薄片从上往下放置在第一容腔底部,形成具有若干支架层的三相组织支架;其中,每个支架层中包括一片三相组织薄片,且三相组织薄片包括骨头区、软骨区以及肌腱区。
将隔断板压在三相组织薄片上,并通过隔断板在第一容腔中形成骨头隔断区,软骨隔断区以及肌腱隔断区,其中骨头隔断区,软骨隔断区以及肌腱隔断区与三相组织支架的骨头区、软骨区以及肌腱区相匹配。
在骨头隔断区中加入骨头生长因子液,在软骨隔断区中加入软骨生长因子液,在肌腱区中加入肌腱生长因子液。
在其中一种实施例,相邻层的骨头区至少部分相互抵接,相邻层的软骨区至少部分相互抵接,相邻层的肌腱区至少部分相互抵接,其中至少两层支架层中的骨头区、软骨区和肌腱区的所占区域位置和/ 或比例不同。
在其中一种实施例,所述隔断板包括第一隔断板与第二隔断板,所述第一隔断板的形状与各层中骨头区以及软骨区的交接处组合形成的形状相匹配,所述第二隔断层的形状与各层中软骨区以及肌腱区的交接处组合形成的形状相匹配。
在其中一种实施例中,各片三相组织薄片中的骨头区、软骨区和肌腱区的所占区域比例不同。
在其中一种实施例中,相邻层的骨头区的抵接面积大于等于相邻层中横截面积较小一方的横截面积的30%,优选为50%;相邻层的软骨区的抵接面积大于等于相邻层中横截面积较小一方的横截面积的 30%,优选为50%;相邻层的肌腱区的抵接面积大于等于相邻层中横截面积较小一方的横截面积的30%,优选为50%。
在其中一种实施例中,骨头区在各个支架层中的比例从下往上逐渐增加,肌腱区在各个支架层中的比例从下往上逐渐减少。
相比起现有技术,上述方案的优点在于:
本方法通过采用整片的三相组织薄片以及采用生长因子液对各个隔断区域的骨头组织、软骨阻止以及肌腱组织进行融合,避免了需要多次缝合三相组织结构的繁琐,而且制备的得到的三相组织结构具有仿生特性,具有较为正常的组织型态,而非简单地平齐结构,更加符合人体生理结构。
附图说明
图1为实施例1中的结构示意图。
图2为实施例1中的部分结构示意图(未挤压时)。
图3为实施例1中的部分结构示意图(挤压时)。
图4为对照组、单纯支架组以及仿生支架组的CT图。
图5为对照组、单纯支架组以及仿生支架组的骨密度比较图。
图6为对照组、单纯支架组以及仿生支架组的骨小梁厚度比较图。
图7为对照组、单纯支架组以及仿生支架组的组织学H&E染色显示实验。
图8为三相组织结构植入人体后的结构示意图。
图中标识:1、壳体;11、缓冲件;12、密封膜;2、活动件;3、隔断板;4、三相组织薄片;41、骨头区;42、软骨区;43、肌腱区;5、骨头;6、肌肉。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例,对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效,详细说明如下:
一种用于分区骨腱界面支架的分隔装置,如图1所示,包括壳体 1,活动件2以及隔断板3,活动件2可拆卸地安装在壳体1上,所述隔断板3可拆卸地安装在活动件2上,所述壳体1设有第一容腔,所述活动件2以及隔断板3都设置在第一容腔中。
在本实施例中,所述壳体1上方设有开口向上的U型槽,所述U 型槽与活动件2相匹配,使得活动件2可以方便地从壳体1上拆除。同时,所述隔断板3滑动设置在活动件2。应理解所述活动件2为杆状结构。优选的,在隔断板3上设有固定结构,使得隔断板3固定在活动件2上,所述固定结构可以为螺栓、卡扣或者磁接结构。
在其中一种实施例,还包括缓冲件11,所述缓冲件11设置在第一容腔底部。
在其中一种实施例,所述缓冲件11上设有密封膜12。
应理解在制备三相组织时,需要通过隔断板3压在三相组织支架上,从而形成骨头隔断区,软骨隔断区以及肌腱隔断区,为了避免由于压力过大导致支架中的三相组织薄片4损坏,因此,设置了一个缓冲件11以便组织支架如图3所示发生变形,从而避免损坏外,同时,为了避免各个隔断区中对应的生长因子液流到其它隔断区中,影响到其它隔断区的生长因子液促进生长效果,因此在缓冲件上设置了密封膜。
实施例2
一种用于分区骨腱界面支架的分隔方法,结合实施例1的装置,包括以下步骤:
S1、将若干三相组织薄片4从上往下放置在第一容腔底部,形成具有若干支架层的三相组织支架;其中,每个支架层中包括一片三相组织薄片4,且三相组织薄片4包括沿横向依次分布的骨头区41、软骨区42以及肌腱区43。应理解正常情况下,每个支架层仅由一片三相组织薄片4构成(或者说一片三相组织薄片4构成一个支架层),但其它情况也属于本申请的保护范围内。
S2、将隔断板3压在三相组织薄片4上,并通过隔断板3在第一容腔中形成骨头隔断区,软骨隔断区以及肌腱隔断区,其中骨头隔断区,软骨隔断区以及肌腱隔断区与三相组织支架的骨头区41、软骨区42以及肌腱区43相匹配。
S3、在骨头隔断区中加入骨头5生长因子液,在软骨隔断区中加入软骨生长因子液,在肌腱区43中加入肌腱生长因子液。应理解在步骤S3后,需要静置一段时间让隔断区中的各层中对应的物质结合在一起。
需要说明的是,由于在现有的技术中三相组织支架通过分别得到骨头区41的组织薄片,软骨区42的组织薄片以及肌腱区43的组织薄片再将多片组织薄片缝合得到三相组织支架,但是原有的方式如果想得到如本申请的设计(支架上若干三相组织薄片4从上往下分布,三相组织薄片4中骨头区41、软骨区42以及肌腱区43横向分布的设计),需要多次缝合超级麻烦。而本申请则通过设置一个隔断板3,通过隔断板3在三相组织薄片4的骨头区41与软骨区42连接处或软骨区42与肌腱区43的连接处的位置上挤压三相组织支架,实现相对的密封,避免生长因子液从一个隔断区去到另外一个隔断区造成污染。加之,由于三相组织薄片4为一体成型的结构,因此在横向上具有较强的刚度,不容易被撕裂。而在纵向上,首先由于三相组织支架为薄片纵向上下叠加的结构,薄片明显地不容易发生纵向分离的情况,加之骨头区41、软骨区42以及肌腱区 43中的骨头5、软骨以及肌腱分别在独特的生长因子液的环境中培养一段时间后骨头5、软骨以及肌腱能更好地结合在一起,更难从纵向中将其分离。需要说明的是大部分的生长因子液只能对对应的组织产生作用,如果与其它生长因子液混合使其失效或者流到不对应的组织中可能会导致组织的损害。
在其中一种实施例,相邻层的骨头区41至少部分相互抵接,相邻层的软骨区42至少部分相互抵接,相邻层的肌腱区43至少部分相互抵接,其中至少两层支架层中的骨头区41、软骨区42和肌腱区43 的所占区域位置和/或比例不同。由于现有的组织工程支架没有考虑到如何模拟正常的骨腱界面骨-软骨-肌腱三相结构,导致现有支架缺乏正常地组织形态及抗牵拉力学性能双重仿生特性。所以本申请中制备了一种各层支架层中的骨头区41、软骨区42和肌腱区43的所占区域位置和/或比例不同的三相支架,以模仿正常的肌腱组织。
在其中一种实施例,为了方便制备得到具有仿生特性的三相组织结构,所述隔断板3包括第一隔断板3与第二隔断板3,所述第一隔断板3的形状与各层中骨头区41以及软骨区42的交接处组合形成的形状相匹配,所述第二隔断层的形状与各层中软骨区42以及肌腱区 43的交接处组合形成的形状相匹配。使得通过隔断板3分离得到隔断区能更加符合人体生理结构,得到具有仿生特性的三相组织结构。
在其中一种实施例中,各片三相组织薄片4中的骨头区41、软骨区42和肌腱区43的所占区域比例不同。起码有部分层的骨头区41、软骨区42和肌腱区43的所占区域比例不同,必然导致某层中的骨头区41与相邻层的软骨区42部分抵接,同理相邻层的软骨区42 与肌腱区43也会出现相同的情况,使得骨头区41、软骨区42以及肌腱区43除了横向的连接外,还有纵向的连接,进而加强了骨头区 41、软骨区2以及肌腱区43之间的联系,提高了整个三相组织工程支架的稳固度。
在其中一种实施例中,相邻层的骨头区41的抵接面积大于等于相邻层中横截面积较小一方的横截面积的30%,优选为50%;相邻层的软骨区42的抵接面积大于等于相邻层中横截面积较小一方的横截面积的30%,优选为50%;相邻层的肌腱区43的抵接面积大于等于相邻层中横截面积较小一方的横截面积的30%,优选为50%。
在其中一种实施例中,所述骨头区在各个支架层中的比例从下往上逐渐增加,所述肌腱区在各个支架层中的比例从下往上逐渐减少。上述方案中的三相组织支架设计更加符合生物实际的组织结构,使得其具有更好的抗牵引力。使得各层中骨支架与软骨支架的交接处形成一条偏向一侧的曲线;同时将肌腱支架的比例逐渐沿纵向减少或者增大,使得各层中肌腱支架与软骨支架的交接处形成一条偏向同侧的曲线。
应理解三相组织结构即为本方法得到的最终产物,而且上述三相组织具有一定的仿生特性。
本项目拟改变切割方向,将正常骨腱界面组织块沿着力学牵拉方向由肌腱向骨方向进行切割,获取骨腱界面组织(即三相组织薄片,应理解三相组织薄片具有骨头组织、软骨组织以及肌腱组织),经去细胞处理,制备去细胞骨腱界面支架。这种方法不但有利于加速骨腱界面组织去细胞,保留组织原有形态结构,避免胞外基质成份丢失,特别是生物活性成份的丢失;而且还能保障去细胞支架具有优良的牵拉力学性能;从而为骨腱界面损伤修复提供了一种形态结构与力学性能双重仿生的组织工程支架。
2.1、骨腱界面组织脱钙:骨腱界面组织置于广口瓶中,有机酸脱钙液完全浸泡样本,37℃,每周取出样本,更换新脱钙液,直至完成脱钙。用物理检测方法判定是否脱钙完全,当骨腱界面组织块外观趋于透明,易弯曲,用1mL注射器针头可轻松插入样本,表明脱钙已完全。
2.2、多层组织薄片技术制备支架:将完全脱钙的骨腱界面组织,用5%NaHCO3漂洗3次,每次5min,PBS液漂洗3次,每次5min。设置冰冻温度-22℃。将组织块切割成长方体,将组织块平放在冰冻切片机组织支承器上,滴加少量OCT冰冻切片包埋剂,并将骨片压平,滴加OCT包埋剂将组织块完全包埋,迅速将样本置入冰冻切片机冰冻固定。将组织支承器固定在切片机持承器上,样本长轴延长线与刀片垂直。将切片厚度设置为100μm,按微调按钮将标本调整到接近刀片的位置,缓慢顺时针方向旋转手动旋钮,听到“嘀”的一声后立即逆时针旋转旋钮至原始位置,如此再反复进行2次,可获得300μm 骨腱界面组织工程支架。支架每页厚度300μm,不少于10页。将切好的组织工程支架置于去离子水中漂洗3次,每次5min,去除OCT 包埋剂。
2.3、骨腱界面组织去细胞处理:样本以4℃PBS冲洗3次,每次 10min,滤纸吸除样本表面水分;将样本用纱布包裹,置入液氮冰冻, 10min,取出后立即行37℃水浴,10min,反复交替3个循环;冻融循环后的支架置于含2%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中,置于摇床上,振荡4h,37℃;样本取出后PBS振荡漂洗,12h,4℃;将样本置于0.1%TritonX-100-1.5MKCL溶液中,12小时,4℃;将样本置于10mMTris漂洗3h,PBS漂洗,3h,4℃;标本置于0.25%胰蛋白酶,24h,PBS漂洗24h,37℃;标本置于核酸酶液(含DNA酶 deoxyribonucleaseI,500U/mL,RNA酶ribonuclease A,1mg/mL), 12h,37℃;样本取出后PBS漂洗24h,样本放-80℃冰箱保存。
2.4、在其中一种实施例中,生长因子涂层可以由生长因子、活性酶、小分子药物和无机活性材料等材料或其组合制备得到。在一些实施例中,骨类的生长因子涂层由2型骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)制备得到,软骨的生长因子涂层由β3型转化生长因子(Transforming growth factor-β3,TGF-β 3)制备得到,肌腱的生长因子涂层由7型生长分化因子(Growth differentiation factor-7,GDF-7)制备得到。
为了测试本申请制备得到的三相组织结构是否比较符合人体生理需要,具有更强的抗牵引力,申请人还将3种三相组织结构植入人体一段时间进行比较,如图4所示,对照组为不植入三相组织结构的空白组,单纯支架组即为不具有仿生形态,平齐的三相组织结构,而仿生支架组为具有仿生形态的三相组织结构(即本申请制备得到的三相组织结构)。从图4的CT扫描图中,可以看出仿生支架组中其横截面可见骨体积明显增加,证明有大量新生骨生成,具有更加良好的效果。从图5和图6可以看出,植入后的仿生学支架经过一段时间生长后具有比较高的骨密度以及骨小梁厚度,说明其骨质比较紧密。同时,申请人也对三种组织结构进行了组织学H&E染色显示实验:如图 7所示,术后8周和16周中仿生三相组织结构具有再生纤维软骨层连接新骨和残余髌腱。仿生学三相组织工程支架组有较多的编织骨和较为致密的纤维软骨连接。应理解在本申请中染色剂为苏木素和伊红,具体染色显示实验的步骤为:
脱蜡及湿化:二甲苯(I)15min;二甲苯(II)15min;无水乙醇、90%酒精、80%酒精、70%酒精、30%酒精、自来水分别浸没 2min。
b.核染:苏木素染色5min,自来水冲洗5min。
c.浆染:伊红染色30s,增色液冲洗30s,显微镜观察控制染色效果,并对时间做出适当调整。
d.脱水、透明:快速通过70%、80%、90%酒精、无水乙醇脱水各1min;二甲苯(I),二甲苯(II)透明各2min;
e.封片:DPX封固剂封片。
应理解正常的三相组织结构是指具有骨头组织结构、软骨组织结构以及肌腱组织结构的结构。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于分区骨腱界面支架的分隔装置,包括壳体,活动件以及隔断板,活动件可拆卸地安装在壳体上,所述隔断板可拆卸地安装在活动件上,所述壳体设有第一容腔,所述活动件以及隔断板都设置在第一容腔中。
2.根据权利要求1所述的一种用于分区骨腱界面支架的分隔装置,其特征在于,还包括缓冲件,所述缓冲件设置在第一容腔底部。
3.根据权利要求2所述的一种用于分区骨腱界面支架的分隔装置,其特征在于,所述缓冲件上设有密封膜。
4.一种采用权利要求1-3任一项所述的分隔装置的用于分区骨腱界面支架的分隔方法,其特征在于,包括以下步骤:
将若干三相组织薄片从上往下放置在第一容腔底部,形成具有若干支架层的三相组织支架;其中,每个支架层中包括一个三相组织薄片,且三相组织薄片包括骨头区、软骨区以及肌腱区;
将隔断板压在三相组织薄片上,并通过隔断板在第一容腔中形成骨头隔断区,软骨隔断区以及肌腱隔断区,其中骨头隔断区,软骨隔断区以及肌腱隔断区与三相组织支架的骨头区、软骨区以及肌腱区相匹配;
在骨头隔断区中加入骨头生长因子液,在软骨隔断区中加入软骨生长因子液,在肌腱区中加入肌腱生长因子液。
5.根据权利要求4所述的一种用于分区骨腱界面支架的分隔方法,其特征在于,相邻层的骨头区至少部分相互抵接,相邻层的软骨区至少部分相互抵接,相邻层的肌腱区至少部分相互抵接,其中至少两层支架层中的骨头区、软骨区和肌腱区的所占区域位置和/或比例不同。
6.根据权利要求5所述的一种用于分区骨腱界面支架的分隔方法,其特征在于,所述隔断板包括第一隔断板与第二隔断板,所述第一隔断板的形状与各层中骨头区以及软骨区的交接处组合形成的形状相匹配,所述第二隔断层的形状与各层中软骨区以及肌腱区的交接处组合形成的形状相匹配。
7.根据权利要求4所述的一种用于分区骨腱界面支架的分隔方法,其特征在于,三相组织薄片的厚度相等,且厚度为100-1000μm,优选为300μm。
8.根据权利要求4所述的一种用于分区骨腱界面支架的分隔方法,其特征在于,各片三相组织薄片中的骨头区、软骨区和肌腱区的所占区域比例不同。
9.根据权利要求4所述的一种用于分区骨腱界面支架的分隔方法,其特征在于,相邻层的骨头区的抵接面积大于等于相邻层中横截面积较小一方的横截面积的30%,优选为50%;相邻层的软骨区的抵接面积大于等于相邻层中横截面积较小一方的横截面积的30%,优选为50%;相邻层的肌腱区的抵接面积大于等于相邻层中横截面积较小一方的横截面积的30%,优选为50%。
10.根据权利要求4所述的一种用于分区骨腱界面支架的分隔方法,其特征在于,骨头区在各个支架层中的比例从下往上逐渐增加,肌腱区在各个支架层中的比例从下往上逐渐减少。
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