CN110521848A - 南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺，以实验室索式抽提脱脂南瓜饼粕为原料，研究工艺参数对其的影响，通过单因素试验选取三个代表性水平，再通过五因素三水平正交试验选出提取浓缩蛋白的最佳组合，并通过实验对其进行验证，具体包括准备材料与器材、实验方法、单因素实验以及正交试验优化。本发明得到最佳工艺组合为乙醇体积分数65％、时间40min、料液比1:9、温度40℃、超声功率200W、超声半小时，浸提两次；在该参数条件下得到的产品粗蛋白含量为77.04％；通过本发明的工艺参数，醇洗得到的南瓜籽浓缩蛋白含量较高，外观好，具有很好的实用价值。

Description

南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺

技术领域

本发明涉及一种提取工艺，具体是一种南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺。

背景技术

蛋白质是人类生命基础，是一类构成十分复杂的聚合体，维持着细胞和生物体的生命。蛋白质是对人体很重要的物质，其以不同的方式在人体中发挥着特定功能。蛋白质也是食品组成成分之一，对食品影响巨大，食品的质构、风味、都与之关联。研究、改造它的功能性质将其合理的应用于食品工业是目前科学研究热门。它的组成单元多肽链的链长，构成，折叠方式等都会影响它的功能性质。食品蛋白不仅是人体生长发育的基础物质，对食品形成良好的色、香、味也有很大的作用。一直以来，人们对蛋白的研究也源源不断，新型产品也越来越多，但随着我国人口的不断增长，为了满足我们机体营养的需要，人们需要开发更多能与传统蛋白相竞争的非传统蛋白资源。同时，现代人比较注重营养搭配，对蛋白的质量要求也越来越高。缺少任何一种必需氨基酸都会对人体产生很大的影响，合理搭配食物，摄入多元化食物可以达到互补作用，既能提高蛋白的营养价值，还能减少人们对氨基酸种类摄入的不平衡。但现在含有过多脂肪的动物蛋白已经不太受到人们的关注了，因为动物蛋白对引起人们的心血管疾病有很大的关系，且随着肉制品和乳制品的价格上涨，近年来人们已经把目光转向了比较健康，价格低廉的植物蛋白，植物蛋白的开发得到更多的关注。将植物蛋白运用到食品工业中，代替传统蛋白，开发新型产品，将对我们蛋白产业链开发有着重大意义。

南瓜，一种世界各地广泛种植的农作物，别名番瓜、窝瓜等。南瓜因其栽培性强和产量高等优点，在全国各地均有种植，全国各地的南瓜种植品种、周期不同，形状、口感和营养也不一样，人们对其选择也不同。南瓜果实一般呈黄、橘色，色泽鲜艳，人们常常将其加工为菜肴食用，也可以代替粮食，有时还可以研磨成粉状作为饲料使用。南瓜籽也可以食用，全株各部又可供药用，是一种优良的农作物。不仅如此，南瓜籽还具有很大的开发潜力。南瓜籽精油的活性物质，其不饱和脂肪酸成分对前列腺增生有着良好的预防效果，叶绿醌等物质能够预防缓解糖尿病。亚麻酸、亚油酸能调节胆固醇，多种类的矿物质、维生素易于被人体吸收，能抗氧化，可以达到美容养颜效果，是一种多功能物质。从南瓜籽中提取出的甲醇梯度洗脱物能明显抑制小鼠的前列腺增生。

近几年，欧美掀起了南瓜籽开发热潮，我国也越来越重视南瓜产业的发展。随着种植技术的发展，我国南瓜产量与质量得到了提升，同时南瓜籽的产量也在增多，南瓜籽脱脂后产生的大量饼粕也待解决。饼粕的合理利用能提高南瓜籽的经济价值，而现在脱脂饼粕蛋白多用于饲料、化肥中或直接被丢弃，这将会造成优质蛋白的浪费。所以加大对脱脂饼粕蛋白的开发力度，提高其附加价值，对解决我国蛋白资源有深远意义。

南瓜籽浓缩蛋白，是南瓜籽先脱脂后脱除饼粕中的色素、可溶性灰分、糖分等非蛋白成分后的物质，蛋白含量一般在65％以上，我们日常常见的蛋白产品系列有普通、浓缩、分离蛋白粉三种。普通蛋白粉制作简单，价格低廉，但因蛋白含量低和蛋白功能性较差，使用量与范围有限。分离蛋白粉，采用碱溶酸沉的方法制备，蛋白含量较高，一般在90％以上，但价格较贵。浓缩蛋白介于两者之间，功能性较好，营养价值高，蛋白也易制取。是一种利用性和可塑性较强的蛋白制品。

目前国内外对南瓜籽浓缩蛋白工艺研究较少，专门的提取设备也还没完善。但近年人们对南瓜籽的功能性越来越重视，对其的提取利用也在进一步加深。其它植物油料的研究进程会对醇洗南瓜籽浓缩蛋白有着很好的借鉴作用。目前提取浓缩蛋白主要采用的是稀酸沉淀和乙醇浸提、湿热水洗等方法。

稀酸沉淀法：脱脂饼粕料液体系在等电点时，疏水相互作用使蛋白质溶解度降低，利用这一特点，采用酸化的溶液提取，用离心原理，将可溶性蛋白质，灰分，色素、可溶性碳水化合物等物质与低分子蛋白分离，将所得沉淀物进行干燥可得浓缩蛋白粉。稀酸沉淀法提取浓缩蛋白，得到的浓缩蛋白溶解度好，但得率低，而且酸碱液耗费大，提取后的废液也容易污染环境，综合效益差。

湿热水洗法：蛋白质的功能性质受温度影响，当温度达到临界温度时，蛋白质的结构会发生改变。利用蛋白质对热的敏感程度，将南瓜籽粕同水一起加热，当加热到一定程度时，蛋白质对水的溶解度很小，这时水可将脱脂饼粕中的水溶性糖分、灰分、色素脱去。但温度引起的蛋白质变性非常复杂且难于控制，因为它涉及蛋白分子间与水分子内部的相互作用的影响，得到的蛋白制品风味差，色泽不好，功能性也差，不利于产品的后续利用，这种方法已经基本被淘汰了。

醇洗法：因为脱脂后的南瓜籽饼粕结构疏松，蛋白质能溶于水,而难溶于酒精,所以用乙醇溶液进行浸提，将蛋白质组分固定化，将能溶于乙醇溶液的杂质除去，然后离心干燥，得到浓缩蛋白粉。乙醇溶液对蛋白质有很强的蛋白质变性和沉淀能力，这种方法提取的浓缩蛋白粉溶解性会降低，但得率较高，风味、色泽也比较好，且生产过程几乎不产生污染环境的物质，可溶性多糖等副产物也可以进一步利用，综合效益比较高。是目前比较常用的方法之一。

蛋白质营养价值高、功能特性多，常常被运用到食品体系中时。正因如此，人们也会特别考虑它的功能性质。传统醇洗法提取的蛋白质因为受乙醇作用，大量疏水基暴露，导致溶解性下降，而蛋白质的功能性质通常会受到溶解度的影响，所以借用物理法中的超声波方式辅助提取。超声波具有成本低，使用方便、可以缩短提取时间等优点，是人们常用的辅助提取方式。达到一定能量的超声波会使蛋白质分子在强烈的震荡下，变形、破碎。使溶剂更容易渗入物料细胞中。从而加速有效成分的提取，提高产品蛋白含量、缩短提取时间。在超声波强烈的空化作用下，蛋白溶解性也会提高。因此，本发明提供了一种南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺，以实验室索式抽提脱脂南瓜饼粕为原料，研究工艺参数对其的影响，通过单因素试验选取三个代表性水平，再通过五因素三水平正交试验选出提取浓缩蛋白的最佳组合，并通过实验对其进行验证，具体步骤如下：

(1)材料与器材

a.试验原料与试剂：试验原料采用超市购买的袋装南瓜籽仁；石油醚、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、硼酸、硫酸铜、氢氧化钠等试剂均为分析纯；

b.试验仪器与设备：高脂肪样品磨；自动脂肪检测仪；KJELTEC 2300凯氏定氮仪；KQ-500DE型数控超声波清洗器；JY5002电子天平；DKZ-2电热恒温振荡水槽；101型电热鼓风干燥箱；

(2)实验方法

a.原料预处理：将市面上购买的袋装南瓜子仁用高脂肪样品磨磨碎后，干燥箱中干燥后取出，用滤纸棉线包扎好放入抽提管内，倒入适量的石油醚，安上冷凝器，打开进水管在55℃的水浴锅上加热回流；控制回流速度12-16次/h，提取6至10小时后结束，将脱脂试样包取出，蒸发溶剂后，放入干燥箱里干燥后取出，用样品磨磨碎，过80目筛后备用；

b.醇洗南瓜籽浓缩蛋白提取工艺流程：取2g过80目筛的脱脂南瓜籽粕于浸提瓶中，加入浸提溶液混合均匀后，用保鲜膜封住瓶口以防止乙醇挥发，在超声水浴锅上超声半小时后，将其取出放入恒温振荡水槽中继续提取；

提取完毕后将料液转至离心管中离心5min，分离固形物与上清液，再加入浸提溶液进行2次浸提；

最后取分离完毕的固形物干燥后磨成粉，取0.1g浓缩蛋白粉420℃消化处理20-40min，并测定南瓜籽浓缩蛋白粉的蛋白质含量；

(3)单因素实验

a.产品蛋白含量随乙醇体积分数变化的影响

在料液体系1:9g/mL，时间70min，浸提温度50℃，超声功率250W,超声0.5h,浸提次数2次的条件下，考察乙醇溶液体积分数45％-85％对南瓜籽粕蛋白提取的影响；

b.产品蛋白含量随浸提时间变化的影响

在料液体系1:9g/mL,乙醇体积分数65％,温度50℃,超声功率250W,超声0.5h，提取2次的条件下，考察浸提时间40-80min对提取产品粗蛋白含量的影响；

c.产品蛋白含量随料液比变化的影响

在乙醇体积分数65％，时间50min，浸提温度50℃，超声功率250W,超声时间0.5h,提取次数2次的条件下，考察料液比1：7-1:13g/mL对产品粗蛋白含量的影响；

d.产品蛋白含量随浸提温度变化的影响

在料液比1:9g/mL，时间50min，乙醇体积分数65％，超声功率250W，超声时间0.5h,提取次数为两次的条件下，考察浸提温度30℃-70℃对产品粗蛋白含量的影响；

e.产品蛋白含量随超声功率变化的影响

在料液比1：9g/mL，时间50min,乙醇体积分数为65％，温度50℃，超声时间0.5h，提取次数为2次的条件下，考察超声功率200-400W对产品粗蛋白含量的影响；

(4)正交试验优化

单因素试验数据采用SAS9.2程序计算，用多重比较字母标记法分析各因素跨度间的显著性差异，分析结果后，将五个因素进行编码和选取代表性三水平做正交试验，考察五因素对产品粗蛋白含量的影响，最后方差分析影响因素的显著性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明研究了超声辅助醇洗南瓜籽浓缩蛋白的提取工艺参数，最后得到最佳工艺组合为乙醇体积分数65％、时间40min、料液比1:9、温度40℃、超声功率200W、超声半小时，浸提两次；在该参数条件下对脱脂南瓜籽粕蛋白进行醇洗得到的产品粗蛋白含量为77.04％；综合数据分析可知，各因素对醇洗南瓜籽浓缩蛋白的粗蛋白含量有很大的影响，合适的取值能提高产品粗蛋白含量，醇洗得到的南瓜籽浓缩蛋白含量较高，外观好，具有很好的实用价值。

附图说明

图1为南瓜籽成分表。

图2为本发明中蛋白含量随乙醇体积的变化示意图。

图3为本发明中蛋白含量随浸提时间的变化示意图。

图4为本发明中蛋白含量随料液比的变化示意图。

图5为本发明中蛋白含量随浸提温度的变化示意图。

图6为本发明中蛋白含量随超声功率的变化示意图。

图7为本发明中因素和水平编码表。

图8为本发明中正交试验优化表。

图9为本发明中方差分析表。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，一种南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺，以实验室索式抽提脱脂南瓜饼粕为原料，研究工艺参数对其的影响，通过单因素试验选取三个代表性水平，再通过五因素三水平正交试验选出提取浓缩蛋白的最佳组合，并通过实验对其进行验证，具体步骤如下：

(1)材料与器材

a.试验原料与试剂：试验原料采用超市购买的袋装南瓜籽仁；石油醚、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、硼酸、硫酸铜、氢氧化钠等试剂均为分析纯；

b.试验仪器与设备：高脂肪样品磨；自动脂肪检测仪；KJELTEC 2300凯氏定氮仪；KQ-500DE型数控超声波清洗器；JY5002电子天平；DKZ-2电热恒温振荡水槽；101型电热鼓风干燥箱；

(2)实验方法

a.原料预处理：(南瓜籽成分见图1)粗脂肪提取参照GB 5009.6-2016，根据相似相溶、脂类物质不挥发原理，用有机试剂石油醚对南瓜籽试样进行萃取，萃取完后，取出试样包，蒸发试剂，干燥后得到脱脂南瓜籽饼粕；石油醚沸点为(30℃-60℃)，萃取出的脂类物质接近简单脂类成分且对试样要求不高，可以带有微量水分，索式抽提脂肪装置简单，易于操作，适用于实验室提取粗脂肪。

具体预处理步骤如下：将市面上购买的袋装南瓜子仁用高脂肪样品磨磨碎后，干燥箱中干燥后取出，用滤纸棉线包扎好放入抽提管内，倒入适量的石油醚，安上冷凝器，打开进水管在约55℃的水浴锅上加热回流。控制回流速度12-16次/h，提取6至10小时后结束，将脱脂试样包取出，蒸发溶剂后，放入干燥箱里干燥后取出，用样品磨磨碎，过80目筛后备用。脱脂南瓜籽粕的外观呈白绿色粉状，色泽较浅，有很淡的南瓜籽香味。

b.醇洗南瓜籽浓缩蛋白提取工艺流程：取2g过80目筛的脱脂南瓜籽粕于浸提瓶中，加入浸提溶液混合均匀后，用保鲜膜封住瓶口以防止乙醇挥发，在超声水浴锅上超声半小时后，将其取出放入恒温振荡水槽中继续提取；提取完毕后将料液转至离心管中离心5min，分离固形物与上清液，再加入浸提溶液进行2次浸提；最后取分离完毕的固形物干燥后磨成粉。因提取条件不同，提取出的产品蛋白粉大致呈青绿色，但色泽深浅不一。取0.1g浓缩蛋白粉420℃消化处理20-40min，并测定南瓜籽浓缩蛋白粉的蛋白质含量。

粗蛋白质测定参照GB 5009.5 2016。凯氏定氮法是实验室最常用的测量粗蛋白含量的方法之一，其测定结果的重复性和重现性较好。取干燥的南瓜籽浓缩蛋白粉消化后用全自动凯式定氮仪定氮，定氮、计算过程由机器完成(N×6.25)。

(3)单因素实验

a.产品蛋白含量随乙醇体积分数变化的影响

在料液体系1:9g/mL，时间70min，浸提温度50℃，超声功率250W,超声0.5h,浸提次数2次的条件下，考察乙醇溶液体积分数45％-85％对南瓜籽粕蛋白提取的影响，影响效果如图2所示。

由图2分析可知，在乙醇体积分数从45％到65％时，随着乙醇浓度的增加，目标产物粗蛋白含量呈上升趋势，可能是随着乙醇浓度的增加，加大了南瓜籽粕中的可溶性成分在提取液的溶解度，在分离料液后，产品蛋白增加。在乙醇体积为65％时目标产物粗蛋白含量达到最大值，当乙醇浓度继续增加时，产物粗蛋白含量开始下降，下降幅度较大，原因可能是高浓度的乙醇溶液打乱了稳定蛋白质结构的静电力，导致蛋白质发生醇变性，醇变性的小蛋白聚集体会被醇溶液洗脱出去，且醇变性蛋白的功能性会受到一定影响，最终影响产物粗蛋白质含量和质量的下降。由此得出，乙醇体积分数对提取蛋白质有影响，过高的乙醇体积分数会降低蛋白含量与质量，同时也造成乙醇的浪费。因此，选择合适的乙醇体积分数为65％。

b.产品蛋白含量随浸提时间变化的影响

在料液体系1:9g/mL,乙醇体积分数65％,温度50℃,超声功率250W,超声0.5h，提取2次的条件下，考察浸提时间40-80min对提取产品粗蛋白含量的影响，影响效果如图3所示。

由图3分析可知，醇洗蛋白时间从40min到50min时，目标产物粗蛋白含量呈上升趋势，在50min时达到最大值74.71％，但随着浸提时间的延长，产物粗蛋白开始呈下降趋势，然后趋于平缓。原因可能是较短的时间内，南瓜籽粕与与溶剂接触不够充分，不能将南瓜籽粕中的杂质洗脱出来，时间过长时又会增加醇溶蛋白的溶解，使产品粗蛋白含量下降。超过一定时间后蛋白溶出率趋于平衡。此时浸提时间对产品粗蛋白含量影响不大。浸提时间过长，耗能将增大，不利于工业生产，且时间越长，产品蛋白反而会下降，蛋白提取率不高，综合考虑本次实验合适的浸提时间为50min。

c.产品蛋白含量随料液比变化的影响

在乙醇体积分数65％，时间50min，浸提温度50℃，超声功率250W,超声时间0.5h,提取次数2次的条件下，考察料液比1：7-1:13g/mL对产品粗蛋白含量的影响，影响效果如图4所示。

由图4分析可知，在料液比1:9g/mL之前，产品粗蛋白含量随着料液比的增加而呈上升趋势，在1:9时达到最高，粗蛋白含量为72.40％。之后，随着料液比的增加，产品粗蛋白呈下降趋势。这可能是因为较低的料液比不能很好的溶解试样中的多糖物质,这些多糖物质不能被很好的洗脱出来。超过最佳值后，固液比过高又会使蛋白质中的醇溶蛋白被洗脱出来而导致产品粗蛋白含量降低。料液比越大，相应的乙醇用量会增大，达到相同条件的能耗需要增加，综合效益不高。因此，本次实验合适料液比为1:9g/mL。

d.产品蛋白含量随浸提温度变化的影响

在料液比1:9g/mL，时间50min，乙醇体积分数65％，超声功率250W，超声时间0.5h,提取次数为两次的条件下，考察浸提温度30℃-70℃对产品粗蛋白含量的影响，影响效果如图5所示。

由图5分析可知，温度从30℃到40℃时，产品粗蛋白含量随着温度的增加而呈上升趋势，40℃时产品粗蛋白含量达最大值。当超过最高点40℃后，产品粗蛋白含量呈下降趋势。原因可能是温度越高，分子运动越快，更有利于非蛋白成分从南瓜籽粕中溶出，产品粗蛋白含量增加，当温度超过合适值后，温度的上升会使蛋白质天然结构发生改变，蛋白热变性程度增加，引起蛋白聚集体溶出，最终导致粗蛋白含量下降，温度超过一定值时，还可能导致蛋白质热变性，影响蛋白功能性质。温度过高还会导致水分、乙醇挥发程度增大，料液比失去平衡，粗蛋白含量下降，工艺条件难以控制。因此，可选取40℃作为合适的浸提温度值。

e.产品蛋白含量随超声功率变化的影响

在料液比1：9g/mL，时间50min,乙醇体积分数为65％，温度50℃，超声时间0.5h，提取次数为2次的条件下，考察超声功率200-400W对产品粗蛋白含量的影响，影响效果如图6所示。

由图6分析可知，在超声功率250W到300W阶段，产品粗蛋白含量随着超声功率的增加而呈上升趋势，300W时产品粗蛋白含量达最大值。之后产品粗蛋白随着超声功率的增大而呈下降，原因可能是超声产生的声波破坏了南瓜籽饼粕细胞结构，加大了溶剂与试样的接触面积，同时超声产生的热效应也会加速分子运动，加速了溶剂渗透到南瓜籽粕内部，更好的将非蛋白成分溶出，提高产品蛋白含量，但当超声功率过大时，各种因素综合起来又会加速醇溶蛋白分子的溶出，使料液体系中产生大量气泡削弱空化作用，从而影响超声波的震荡效果。最终产品蛋白下降。超声功率越大，耗能越大，经济效益也不高，综合考虑，可选取200W作为合适的功率值。

(4)正交试验优化

单因素试验数据采用SAS9.2程序计算，用多重比较字母标记法分析各因素跨度间的显著性差异。分析结果后，将五个因素进行编码和选取代表性三水平做正交试验。考察五因素对产品粗蛋白含量的影响，最后方差分析影响因素的显著性。各因素编码和水平选取范围如图7所示。正交试验结果如图8所示，方差分析如图9所示。

见图8正交试验结果可知，极差R_D>R_A>R_E>R_C>R_B，说明了五个因素对提取南瓜籽浓缩蛋白的影响大小，浸提温度>乙醇体积分数>超声功率>料液比>浸提时间。据图9方差分析可以看出本次实验中温度对提取浓缩蛋白工艺研究影响极显著，乙醇体积分数、超声功率、料液比影响显著，浸提时间影响不显著。

综合极差和方差分析，A₂B₁C₂D₂E₁工艺组合为本次实验最佳提取工艺组合，在最优工艺下进行重复性试验，得出的产品粗蛋白含量达到77.04％。

本次实验研究了超声辅助醇洗南瓜籽浓缩蛋白的提取工艺参数，最后得到最佳工艺组合为乙醇体积分数65％，时间40min，料液比1:9，温度40℃，超声功率200W，超声半小时，浸提两次。在这个条件下对脱脂南瓜籽粕蛋白进行醇洗得到的产品粗蛋白含量为77.04％。综合实验数据分析可知，各因素对醇洗南瓜籽浓缩蛋白的粗蛋白含量有很大的影响，合适的取值能提高产品粗蛋白含量。醇洗得到的南瓜籽浓缩蛋白含量较高，外观也比较好，参考以及应用价值很大。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺，其特征在于，以实验室索式抽提脱脂南瓜饼粕为原料，研究工艺参数对其的影响，通过单因素试验选取三个代表性水平，再通过五因素三水平正交试验选出提取浓缩蛋白的最佳组合，并通过实验对其进行验证，具体步骤如下：

(1)材料与器材

a.试验原料与试剂：试验原料采用超市购买的袋装南瓜籽仁、石油醚、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、硼酸、硫酸铜、氢氧化钠；

b.试验仪器与设备：高脂肪样品磨；自动脂肪检测仪；KJELTEC 2300凯氏定氮仪；KQ-500DE型数控超声波清洗器；JY5002电子天平；DKZ-2电热恒温振荡水槽；101型电热鼓风干燥箱；

(2)实验方法

a.原料预处理：将市面上购买的袋装南瓜子仁用高脂肪样品磨磨碎后，干燥箱中干燥后取出，用滤纸棉线包扎好放入抽提管内，倒入适量的石油醚，安上冷凝器，打开进水管在55℃的水浴锅上加热回流；控制回流速度12-16次/h，提取6至10小时后结束，将脱脂试样包取出，蒸发溶剂后，放入干燥箱里干燥后取出，用样品磨磨碎，过80目筛后备用；

b.醇洗南瓜籽浓缩蛋白提取工艺流程：取2g过80目筛的脱脂南瓜籽粕于浸提瓶中，加入浸提溶液混合均匀后，用保鲜膜封住瓶口以防止乙醇挥发，在超声水浴锅上超声半小时后，将其取出放入恒温振荡水槽中继续提取；

提取完毕后将料液转至离心管中离心5min，分离固形物与上清液，再加入浸提溶液进行2次浸提；

最后取分离完毕的固形物干燥后磨成粉，取0.1g浓缩蛋白粉420℃消化处理20-40min，并测定南瓜籽浓缩蛋白粉的蛋白质含量；

(3)单因素实验

a.产品蛋白含量随乙醇体积分数变化的影响

在料液体系1:9g/mL，时间70min，浸提温度50℃，超声功率250W,超声0.5h,浸提次数2次的条件下，考察乙醇溶液体积分数45％-85％对南瓜籽粕蛋白提取的影响；

b.产品蛋白含量随浸提时间变化的影响

在料液体系1:9g/mL,乙醇体积分数65％,温度50℃,超声功率250W,超声0.5h，提取2次的条件下，考察浸提时间40-80min对提取产品粗蛋白含量的影响；

c.产品蛋白含量随料液比变化的影响

在乙醇体积分数65％，时间50min，浸提温度50℃，超声功率250W,超声时间0.5h,提取次数2次的条件下，考察料液比1：7-1:13g/mL对产品粗蛋白含量的影响；

d.产品蛋白含量随浸提温度变化的影响

在料液比1:9g/mL，时间50min，乙醇体积分数65％，超声功率250W，超声时间0.5h,提取次数为两次的条件下，考察浸提温度30℃-70℃对产品粗蛋白含量的影响；

e.产品蛋白含量随超声功率变化的影响

在料液比1：9g/mL，时间50min,乙醇体积分数为65％，温度50℃，超声时间0.5h，提取次数为2次的条件下，考察超声功率200-400W对产品粗蛋白含量的影响；

(4)正交试验优化

单因素试验数据采用SAS9.2程序计算，用多重比较字母标记法分析各因素跨度间的显著性差异，分析结果后，将五个因素进行编码和选取代表性三水平做正交试验，考察五因素对产品粗蛋白含量的影响，最后方差分析影响因素的显著性。

2.根据权利要求1所述的一种南瓜籽浓缩蛋白超声辅助提取工艺，其特征在于，所述的石油醚、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、硼酸、硫酸铜、氢氧化钠试剂均为分析纯。