CN110514704A - 新型生物传感方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新型生物传感方法。一种测定对象物质的定量方法，其包括下述步骤：使包含测定对象物质的试样与生物传感器接触的步骤，该生物传感器具备包含氧化还原酶的酶电极以及与上述酶电极成对的对电极；测定上述酶电极与上述对电极间的电位差变化的步骤，该电位差变化是由上述氧化还原酶所致的上述测定对象物质的氧化反应而引起的；以及基于该电位差变化计算出测定对象物质浓度的步骤，该方法的特征在于，在上述电位差变化测定步骤之前向上述酶电极与上述对电极间施加电位。

Description

新型生物传感方法
技术领域
本发明涉及利用电化学式酶电极的新型生物传感方法。
背景技术
在非专利文献1中公开了在阳极中使用葡萄糖脱氢酶(GDH)的生物燃料电池的构成，其中公开了，通过化学交联在电极上的酶与电解质溶液中的底物反应，阳极-阴极间的电位随着作为底物的葡萄糖浓度而升高，因而能够通过监测两电极间的电位而进行葡萄糖浓度的测定。
在非专利文献2中公开了将酶与导电性聚合物组合而成的酶电极，其中显示出，通过酶与作为底物的尿素发生反应，导电性聚合物的电子状态发生变化，能够以电极间电位的形式被检测出，因而能够测量底物浓度。
在非专利文献3中公开了一种埋入式传感器，其使用由葡萄糖氧化酶和多孔性碳构成的电极并利用了因过氧化氢的产生所致的电极间的开路电位(OCP)的变化。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Kakehi etal.Biosensors and Bioelectronics 22(2007)2250-55
非专利文献2：B.Lakard et al Biosensors and Bioelectronics 26(2011)4139-4145
非专利文献3：Y.Song et al.Anal Bioanal Chem.2017 409(1)161-168
发明内容
在非专利文献1中，开路电位(OCP)相对于阳极中的葡萄糖浓度的变化以电位升高的形式被观测到，其取决于逐渐推移的电位的状态，因此，作为传感器信号，响应时间有波动，并且在接近电极容量的极限的高浓度下达到饱和，不具有分辨力。
在非专利文献2中，以信号变化的形式观察到由酶反应产生的电子被传递至导电性聚合物的情况，因此，从原理上而言，在因酶反应以外的因素而产生导电性聚合物的状态变化(包括溶胀等物理变化)的情况下，可能会成为噪声。另外，可预料到导电性聚合物的涂布的均匀性会左右传感器性能。此外，在作为传感器的连续使用中，酶固定膜的稳定性存在问题。
在非专利文献3中，公开了以氧作为酶的电子受体的所谓第1代的葡萄糖传感器的原理，由酶反应产生的过氧化氢作为引起电位变化的分子发挥功能。但是，过氧化氢可能由于其不稳定性和氧化能力而对传感器表面材料带来不可逆的影响。
因此，本发明的课题在于提供一种能够长期稳定地以良好的精度进行物质的定量测定的方法。
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过使包含底物(测定对象物质)的试样与包含固定有氧化还原酶的酶电极以及对电极的传感器反应，在该酶电极与对电极间施加一定时间的规定电位，之后测定该酶电极与对电极间的电位差(OCP)，能够以良好的再现性稳定地测定底物浓度，从而完成了本发明。
本发明的要点如下所述。
[1]一种测定对象物质的定量方法，其包括下述步骤：
使包含测定对象物质的试样与生物传感器接触的步骤，该生物传感器具备包含配置在电极上的氧化还原酶的酶电极以及与上述酶电极成对的对电极；
测定上述酶电极与上述对电极间的电位差变化的步骤，该电位差变化是由上述氧化还原酶所致的上述测定对象物质的氧化反应而引起的；以及
基于该电位差变化计算出测定对象物质浓度的步骤，
该方法的特征在于，
在上述电位差变化测定步骤之前向上述酶电极与上述对电极间施加电位(电压)。
[2]如[1]所述的方法，其中，上述酶电极与上述对电极间的电位差变化是与施加在上述酶电极与上述对电极间的电位的值相比的变化。
[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，施加在上述酶电极与上述对电极间的电位以银/氯化银电极为基准为-100mV以上。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，向上述酶电极与上述对电极间施加电位的时间为0.1秒以上。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，上述氧化还原酶为能够与电极之间直接进行电子转移的氧化还原酶。
[6]如[5]所述的方法，其中，上述氧化还原酶为具有电子传递亚基或电子传递结构域的氧化还原酶。
[7]如[6]所述的方法，其中，上述电子传递亚基或电子传递结构域包含血红素。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，使上述试样与上述接触生物传感器接触，接着向上述酶电极与上述对电极间施加电位后，测定上述酶电极与上述对电极间的电位差变化。
[9]如[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，反复进行下述循环：向上述酶电极与上述对电极间施加电位后，测定上述酶电极与上述对电极间的电位差变化。
[10]如[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，上述物质为葡萄糖，上述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。
[11]如[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，上述试样为生物体试样。
[12]如[11]所述的方法，其中，生物体试样为血液或尿。
[13]一种物质的测定装置，其包括：
生物传感器，具备包含配置在电极上的氧化还原酶的酶电极以及与上述酶电极成对的对电极；
控制部，控制向上述生物传感器的上述酶电极与上述对电极间的电位(电压)施加；
测定部，测量上述生物传感器的上述酶电极与上述对电极间的电位差变化；
运算部，由上述电位差变化计算出测定对象物质的浓度；以及
输出部，将上述计算出的测定对象物质的浓度输出。
发明的效果
根据本发明，通过使用包含氧化还原酶的电极并测定该电极与对电极间的电位差(OCP)，能够掌握反映了体系中的底物浓度的酶的电子状态的变化。
在本发明的方法中，不是使用导电性聚合物或电子受体间接地监测电流值、而是通过电位差直接地监测酶的电子状态，因而不容易受到外在因素所致的噪声影响。此外，与现有文献所公开的单纯地持续监测两电极间的自然电位的方法不同，通过进行在即将测定葡萄糖浓度之前施加一定时间的电位而使酶的还原状态恢复到氧化状态的作业，能够始终从相同原点的OCP开始测量，能够防止分辨力的降低，能够进行更准确的测定。
本发明的方法中，与现有方法的施加恒压下的测定不同，即使在连续测定、反复测定中也不必持续施加恒定电压，因而能够抑制酶的转换，作为电极上的酶，能够在非常温和的环境中进行监测，因此能够实现高稳定性的测定。
附图说明
图1是示出生物传感器的制造方法的一例的流程图，图1的(a)～(d)示出各步骤中的生物传感器的示意图。
图2是示出本发明的测定装置的一个方式的示意图。
图3是示出使用了本发明的测定装置的测定程序的一个方式的流程图。
图4是示出利用酶固定电极(上)和BSA固定电极(下)得到的OCP测量结果的图。
图5是示出OCP测定中的葡萄糖浓度依赖性评价的图(分别使用所固定的GDH量不同的电极进行测定)。
图6是示出使用由各种固定法制作的酶电极(分别为n＝3)对葡萄糖浓度依赖性进行评价的结果的图。
图7是示出利用结合在玻璃碳电极表面的GDH(上：非直接电子转移型、下：直接电子转移型)得到的OCP测量结果的图。
图8是示出调查+100mV的氧化电位的施加时间与OCP的葡萄糖响应速度的关系的结果的图(在葡萄糖浓度为1mM、5mM、10mM、20mM下进行测定)。
图9是示出调查有无+100mV的氧化电位施加时的OCP的葡萄糖响应的差异(上：无放电、下：放电1秒)的结果的图。
图10是示出使用酶固定电极，一边在20mM葡萄糖溶液中施加氧化电位(+100mV)一边进行5天的OCP连续测定的结果的图(分成0～20小时、20～42小时、42～66小时来示出)。
图11是示出在使用酶固定电极的OCP连续测定中中断氧化电位施加时的测定结果的图。用箭头示出氧化电位施加中断的时机。
具体实施方式
以下参照附图等对作为本发明的一个实施方式的物质的定量方法和物质的测定装置进行说明。以下举出的实施方式分别为例示，本发明并不限于以下的实施方式的构成。
本发明的测定对象物质的定量方法包括下述步骤：
使包含测定对象物质的试样与生物传感器接触的步骤，该生物传感器具备包含配置在电极上的氧化还原酶的酶电极以及与上述酶电极成对的对电极；
测定上述酶电极与上述对电极间的电位差变化的步骤，该电位差变化是由上述氧化还原酶所致的上述测定对象物质的氧化反应而引起的；以及
基于该电位差变化计算出测定对象物质浓度的步骤，
该方法的特征在于，
在上述电位差变化测定步骤之前向上述酶电极与上述对电极间施加电位。
作为测定对象物质，只要是可作为氧化还原酶的底物的物质即可，可以例示例如葡萄糖、果糖、山梨糖醇、胆固醇、纤维素二糖、乙醇、乳酸、尿酸等，但并不限于这些。
试样只要是包含测定对象物质的试样就没有特别限制，优选生物体试样，可以举出血液、尿等。
(生物传感器)
本发明的方法中使用的生物传感器具备：包含配置在电极上的氧化还原酶的酶电极(工作电极)以及与上述酶电极成对的对电极。为了对酶电极、对电极施加一定的电位、并进一步测定酶电极中的电位差变化，优选除了酶电极和对电极以外还具备参比电极。其中，对电极可以使用银/氯化银电极或甘汞电极，使其也作为参比电极发挥功能。
作为对电极，只要是通常能作为生物传感器的对电极使用的电极即可，例如可以使用通过丝网印刷进行成膜的碳电极、通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)进行成膜的金属电极、通过丝网印刷进行成膜的银/氯化银电极。另外，对于参比电极，可以使用银/氯化银电极、甘汞电极等。
(酶电极)
酶电极包含配置在电极上的氧化还原酶。
电极例如使用金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)和钯(Pd)之类的金属材料或以石墨、碳纳米管、石墨烯、介孔碳等碳为代表的碳材料来形成。电极可以设置在由聚醚酰亚胺(PEI)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯(PE)之类的热塑性树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂之类的各种树脂(塑料)、玻璃、陶瓷、纸等绝缘性材料形成的绝缘性基板上。
(氧化还原酶)
作为能够应用于本发明的氧化还原酶，根据测定对象物质的种类来选择即可，例如可以举出葡萄糖氧化酶(GOD)、半乳糖氧化酶、胆红素氧化酶、丙酮酸氧化酶、D-或L-氨基酸氧化酶、胺氧化酶、胆固醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、肌氨酸氧化酶、L-乳酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)、果糖脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、甘油脱氢酶、17B羟基类固醇脱氢酶、雌二醇17B脱氢酶、氨基酸脱氢酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、3-羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、细胞色素氧化还原酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶等。其中优选为糖类的氧化还原酶，作为糖类的氧化还原酶的示例，例如可以举出葡萄糖氧化酶(GOD)、半乳糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)、果糖脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶。因此，本发明的生物传感器可以根据酶的种类作为葡萄糖传感器、胆固醇传感器、乙醇传感器、山梨糖醇传感器、果糖传感器、纤维素二糖传感器、乳酸传感器、尿酸传感器等来使用。
这些之中，优选使用能够与电极之间直接进行电子转移的氧化还原酶、即能够在不利用电子受体之类的氧化还原物质的情况下将由酶反应产生的电子直接传递至电极的氧化还原酶(也称为直接电子转移型氧化还原酶)。作为能够与电极之间直接进行电子转移的氧化还原酶，可以举出生理性地包含参与与电极的电子转移的氧化还原分子的氧化还原酶，例如可以使用包含电子传递亚基或电子传递结构域作为该氧化还原分子的氧化还原酶。作为电子传递亚基，例如可以举出含有血红素的亚基，作为电子传递结构域，可以举出含有血红素的结构域。作为该含有血红素的亚基或结构域，可以举出包含血红素C或血红素b的亚基或结构域，更具体地说，可以举出包含细胞色素C或细胞色素b等细胞色素的亚基或结构域。
作为包含含有细胞色素的亚基作为电子传递亚基的酶，例如可以举出葡萄糖脱氢酶(GDH)、山梨糖醇脱氢酶(Sorbitol DH)、D-果糖脱氢酶(Fructose DH)、D-葡糖苷-3-脱氢酶(Glucoside-3-Dehydrogenase)、纤维素二糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、尿酸氧化酶等。
作为包含细胞色素的葡萄糖脱氢酶，更具体地可以举出具有含有FAD的催化亚基(α亚基)和细胞色素亚基(β亚基)的细胞色素葡萄糖脱氢酶(FADGDH)，FADGDH优选进一步具有调节亚基(γ亚基)(FADGDHγαβ)。作为FADGDH，可以举出洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)来源的FAD依赖性葡萄糖脱氢酶或其突变体。作为洋葱伯克霍尔德菌来源的FADGDH的突变体，可以举出包括下述突变体的FADGDH突变体：472位和475位的氨基酸残基被置换的α亚基突变体(WO 2005/103248)；326位、365位和472位的氨基酸残基被置换的α亚基突变体(QYY：日本特开2012-090563)；365位和326位、472位、475位以及529位等被置换的α亚基突变体(WO 2006/137283)；等等。
另外，作为包含电子传递结构域的酶，可以例示包含血红素结构域或细胞色素结构域的酶，具体地说，例如可以举出醌血红素乙醇脱氢酶(QHEDH；PQQ Ethanol dh)。此外，作为包含含有细胞色素的结构域作为电子传递结构域的酶，例如可以举出“QHGDH”(融合酶；带有QHGDH血红素结构域的GDH)、纤维素二糖脱氢酶。另外，还可以使用国际公开WO2005/030807号公报中公开的PQQ葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)与细胞色素的融合蛋白。
需要说明的是，代替直接电子转移型氧化还原酶，也可以使用导电性聚合物、氧化还原聚合物等将氧化还原酶以可直接与电极进行电子转移的状态配置在电极上。为此，重要的是使氧化还原酶配置在电极的附近，在生理学反应体系中发生直接电子转移的极限距离据称为因而为了无损于从酶向电极的电子转移，重要的是将酶配置在比该极限距离更靠近电极的距离。
另外，通过对氧化还原酶进行电子受体或纳米材料的修饰、或者将它们用于电极材料而能够进行与电极的电子转移的氧化还原酶也可以适用于本发明中。
此处，电子受体只要是从氧化还原酶接受电子而被还原、在电极上再次被氧化、且不具有催化剂作用的化合物即可，例如可以举出醌化合物(例如1,4-萘醌、VK3、9,10-菲醌、1,2-萘醌、2,5-二甲基对苯醌、甲基苯醌、2,6-二甲基苯醌、1,2-萘醌-4-磺酸钠、1,4-蒽醌、四甲基苯醌、百里醌)、苯二胺化合物(例如N,N-二甲基-1,4-苯二胺、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-苯二胺)、1-甲氧基-PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐)、PES(吩嗪乙基硫酸盐)、辅酶Q0、AZURE A氯化物、酚藏花红、6-氨基喹喔啉、四硫富瓦烯等。
为了用电子受体修饰氧化还原酶，可以举出使电子受体与酶化学结合的方法。例如可以例示在电子受体中导入琥珀酰亚胺等官能团并使其与酶的氨基反应而导入的方法。
另外，在纳米材料中，可以例示能够配置到可与酶的活性中心进行直接电子转移的距离的导电性材料，例如碳纳米管(Analytical Biochemistry,Volume 332,Issue 1,1September 2004,Pages 75-83)或金属纳米颗粒(Analytical Biochemistry Volume331,Issue 1,1August 2004,Pages 89-97)等，但只要是可观测到直接电子传递的材料，则并不限定于此。
作为用于将氧化还原酶配置在电极表面的方法没有特别限制，例如可以举出将氧化还原酶化学固定在电极上的方法、使用导电性聚合物或交联剂等将氧化还原酶间接固定在电极上的方法(例如WO2014/002999或日本特开2016-121989等)、藉由单分子膜形成分子将酶固定在电极上的方法等。作为藉由单分子膜形成分子将酶固定在电极上的方法，可以举出日本特开2017-211383所公开的藉由单分子膜形成分子(SAM)将酶固定在电极上的方法。
(酶电极的制作方法)
酶电极例如如下进行制作。
首先，在绝缘性基板的单面上形成作为电极发挥功能的金属层。例如，在规定厚度(例如100μm左右)的膜状的绝缘性基板的单面上，通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)将金属材料成膜，由此形成具有所期望的厚度(例如30nm左右)的金属层。也可以形成由碳材料形成的电极层来代替金属层。
使酶结合在这样得到的电极层的表面。
例如，在使用单分子膜形成分子的情况下，首先，在电极上结合单分子膜形成分子。之后，使单分子膜形成分子的反应性官能团与氧化还原酶的氨基或羧基反应，从而能够藉由单分子膜形成分子将氧化还原酶固定在电极上。
需要说明的是，在利用导电性聚合物或交联剂将酶固定在电极上的情况下，可以通过在电极上添加酶以及导电性聚合物或交联剂等试剂来制作酶电极。
(生物传感器的制作方法)
以下基于图1对可在本发明中使用的生物传感器的一例进行说明。
图1(a)～(d)是示出制造生物传感器的一系列步骤的立体图。需要说明的是，可在本发明中使用的生物传感器并不限于以下的方式，可以为体内埋入式传感器，也可以为间歇式传感器。
如图1(d)所示，该生物传感器A具备：基板10、由具有引线部11a的对电极11以及具有引线部12a的工作电极12构成的电极系统(图1(a))、绝缘层14、具有开口部的间隔物15、以及具有贯通孔18的盖体16。如图1(b)所示，在基板10上设有检测部13，在检测部13，与基板10的宽度方向平行地配置有工作电极12和对电极11。另外，工作电极12与对电极11之间成为绝缘部。在具备这样的电极系统的基板10上，如图1(b)所示，除了引线部11a、12a和检测部13以外，还层积有绝缘层14，在未层积绝缘层14的上述检测部13的工作电极12上固定有氧化还原酶。并且，如图1(c)所示，在绝缘层14上配置有间隔物15，该间隔物15的与检测部13对应的位置成为开口部。进一步在间隔物15上配置有盖体16，该盖体16在与上述开口部对应的一部分具有贯通孔18(图1(d))。在该生物传感器中，作为上述开口部的空间部分且被夹在上述工作电极、对电极和绝缘层14与盖体16之间的空间部分形成毛细管结构的样本供给部17。并且，上述贯通孔18形成用于通过毛细管现象吸入样本的空气孔。
(物质的定量方法)
本发明的定量方法包括下述步骤：
使包含测定对象物质的试样与生物传感器接触的步骤；
测定电极间的电位差变化的步骤，该电位差变化是由上述氧化还原酶所致的上述测定对象物质的氧化反应而引起的；
基于该电位差变化计算出测定对象物质浓度的步骤。
使包含测定对象物质的试样与生物传感器接触的步骤可以为将试样滴加至生物传感器的步骤，也可以为将生物传感器浸渍在试样中的步骤。另外，在体内埋入式传感器的情况下，还包括将传感器埋入到体内而使其处于与血液等试样接触的状态的步骤。
通过使包含测定对象物质的试样与生物传感器接触，由氧化还原酶引起物质的氧化反应，还原体的酶与底物浓度相应地增加。即，由于该酶被固定在电极附近、酶的活性中心(严格地说为电子传递单元)靠近电极，因此它们从氧化体变成还原体，由此电极的电荷分布发生变化、表面电位发生变化。此时成为还原体的酶分子的数目依赖于测定对象物质的浓度，因此可以获取与基准电位相比的电位变化量作为表示对象物的浓度的参数。
并且，在本发明中，在OCP测定前对酶电极施加规定时间的电位。
由此，能够使酶电极的电子的状态复位，在测定中，能够以与通过施加电位而被复位的状态相比的变化的形式来测量酶反应后的OCP的值，因此能够更准确地以高再现性得到稳定的测定结果。即，可以将所测量的电位差变化设定为与所施加的电位相比的变化值(OCP－施加电位)。
所施加的电位只要是比传感器中使用的氧化还原酶的氧化还原电位高的电位即可，例如，在葡萄糖脱氢酶的情况下，以银/氯化银电极为基准，可以设定为-100mV以上、+10mV以上或+100mV以上。上限没有特别限制，例如，以银/氯化银电极为基准，为+10000mV、+5000mV或+1000mV。
对酶电极施加电位的时间只要是能够将氧化还原酶中的电子的状态复位的时间即可，可以设定为0.01秒以上、0.1秒以上或1秒以上。施加时间没有特别的上限，例如为20秒以下或10秒以下。
电位施加的时机优选为即将对试样中的测定对象物质进行测定之前，在连续测定的情况下，可以在多次OCP测定前每次事先进行电位施加。
用于进行物质浓度测定的OCP测定的时机优选为在电位施加结束后与物质浓度相应的电位差变化稳定而显示出恒定值的时机，尽管还取决于物质浓度的范围，但例如优选为自电位施加结束时起10～20秒后或在此以后。
本发明的方法可适用于单次测定也可以适用于连续测定。
在单次测定的情况下，例如，使试样与传感器接触，在电位施加后测定OCP变化即可。另一方面，在连续测定的情况下，例如，使试样与传感器接触后，在所期望的时机反复进行电位施加、OCP变化测定的循环即可。
基于电位差变化计算出测定对象物质浓度的步骤中，例如，对于该传感器，可以预先求出电位差变化的值与物质浓度的关系并制作校准曲线，通过将测定值与该校准曲线对照而求出物质浓度。
(装置)
接着，使用附图对本发明的测定装置进行说明。此处例示了葡萄糖测定装置的一个方式，但本发明的测定装置并不限于以下的方式。
图2示出容纳在测定装置B内的主要电子部件的构成例。控制计算机28、恒电位仪24、电位差计29、电力供给装置21设置在容纳于壳体内的基板30上。
控制计算机28在硬件上包含CPU(中央运算处理装置)之类的处理器、存储器(RAM(Random Access Memory，随机存取存储器)、ROM(Read Only Memory，只读存储器))之类的记录介质、以及通信单元，处理器将储存在记录介质(例如ROM)中的程序加载至RAM并执行，由此作为具备输出部20、控制部22、运算部23、测定部(恒电位仪24和电位差计29)的装置发挥功能。需要说明的是，控制计算机28也可以包含半导体存储器(EEPROM，闪存)或硬盘之类的辅助存储装置。
控制部22对电位施加的时机、施加电位值等进行控制。
电力供给装置21具有电池26，向控制部计算机28、恒电位仪24供给工作用的电力。需要说明的是，电力供给装置21也可以设置在壳体的外部。
恒电位仪24是使工作电极的电位相对于参比电极恒定的装置，由控制部22进行控制，使用端子CR、W在葡萄糖传感器27的对电极与工作电极之间施加规定的电位。
电位差计29测量从电位施加起经过一定时间后的电极间的电位差变化(OCP)。
运算部23由所测量的OCP进行测定对象物质的浓度的运算并进行存储。输出部20与显示部单元25之间进行数据通信，将由运算部23得到的测定对象物质的浓度的运算结果发送到显示部单元25。显示部单元25例如可以将由测定装置B接收的葡萄糖浓度的运算结果以规定的格式显示在显示画面中。
图3是示出利用控制计算机28进行的葡萄糖浓度测定处理的示例的流程图。
控制计算机28的CPU(控制部22)接收到葡萄糖浓度测定的开始指示时，控制部22控制恒电位仪24，对工作电极施加规定的电位，开始测定。例如，对工作电极施加10秒相对于参比电极为+100mV的电位(步骤S01)。
之后，控制部22控制恒电位仪24，将工作电极切换至开路状态，电位差计29对工作电极11与对电极12间的电位差进行规定时间(例如5分钟)的测定(步骤S02)。之后，将电位差的测定结果例如每秒1次向运算部23发送。
运算部23例如在即将进行下一电位施加之前的10秒内计算出每秒1次、合计10次OCP的平均值(步骤S03)，基于电位差的变化值进行运算处理，计算出葡萄糖浓度(步骤S04)。
例如，控制计算机28的运算部23预先保持有与配置在电极上的葡萄糖脱氢酶相对应的电位差变化值和葡萄糖浓度的校准曲线数据，使用这些计算式或校准曲线计算出葡萄糖浓度。
输出部20将葡萄糖浓度的计算结果通过其与显示部单元25之间形成的通信链路发送到显示部单元25，显示出葡萄糖浓度(步骤S05、S06)。
在多次测定或连续测定的情况下，在显示葡萄糖浓度后，控制部22控制恒电位仪24，对工作电极施加电位，再次开始测定。
[实施例]
接着，举出实施例进一步对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
[实施例1]
传感器制作
1.将介孔碳分散液(产品名CNovel P(4)050、1％浓度10μl)涂布在Au电极(表面积7mm2)上
2.涂布洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)葡萄糖脱氢酶(FADGDHγαβ)(α亚基具有QYY突变)水溶液(0.013mg/ml，7μl)并进行干燥(对照中涂布BSA水溶液(0.0128mg/ml，7μl))
3.通过利用25％戊二醛(GA)蒸气进行1小时处理而将FADGDHγαβ交联在电极上
表面电位测定
将上述制作的酶电极与对电极和参比电极(均为Ag/AgCl)组合，制成生物传感器，对酶电极施加+100mV(vs Ag/AgCl)的电位(10秒，3次)，之后浸渍在规定浓度(0.1mM、1mM、3mM、5mM、10mM、15mM、20mM)的葡萄糖溶液(100mMPPB pH7.0、37℃)中，使其发生酶反应，测定开路电位，重复进行该步骤。
作为对照，使用包含BSA电极以及对电极和参比电极(均为Ag/AgCl)的生物传感器，对BSA电极施加+100mV的电位(10秒，1次)，之后浸渍在相同条件的葡萄糖溶液中，使其发生酶反应，测定开路电位，重复进行该步骤。
将结果示于图4。
可知：在具有BSA电极的非酶传感器中，即使添加底物(葡萄糖)，也没有OCP的变化；而在具有GDH电极的酶传感器中，在短时间施加外部电位后，当发生酶反应时，恢复到与葡萄糖浓度相应的电位(OCP)。
接着，使用包含改变了FADGDHγαβ的固定量的GDH电极的生物传感器，对GDH电极施加+100mV(vs Ag/AgCl)的电位(10秒，1次)，之后添加葡萄糖使其发生酶反应，测定开路电位，改变葡萄糖浓度而重复进行该步骤，调查OCP与葡萄糖浓度的关系。
将结果示于图5。
可知：对具有GDH电极的酶传感器施加外部电位后使其进行酶反应而测量到的OCP的值依赖于葡萄糖浓度。
[实施例2]
2-1.GDH-SAM传感器制作
1.对Au电极表面(表面积7mm2)进行一夜食人鱼洗液(Piranha)处理后，用丙酮清洗
2.将电极在10μM DSH溶液中浸渍一夜，进行DSH修饰
[化1]
3.在葡萄糖脱氢酶溶液(26.3mg/ml FADGDHγαβ/100mM PPB(pH 7.0))中浸渍一夜，将GDH藉由SAM固定在电极上
2-2.GDH-MWCNT传感器制作
1.将多层碳纳米管(MWCNT)分散液(产品名：名城纳米碳MWNT INK(MW-I)浓度2％，2μl)涂布在Au电极(表面积7mm2)上
2.涂布洋葱伯克霍尔德菌葡萄糖脱氢酶(FADGDHγαβ)水溶液(0.013mg/ml，7μl)并进行干燥(对照中涂布BSA溶液)
3.通过利用25％戊二醛(GA)蒸气进行1小时处理而将GDH交联在电极上
2-3.电位测定
将上述制作的酶电极(实施例1的GDH-介孔碳(MesoPC)、实施例2-1的GDH-SAM和实施例2-2的GDH-MWCNT)分别与对电极和参比电极(均为Ag/AgCl)组合，制成生物传感器，对酶电极施加+100mV(vs Ag/AgCl)的电位(10秒，1次)，之后添加各种浓度的葡萄糖使其发生酶反应，测定开路电位。
针对各电极，绘制葡萄糖浓度与OCP值的关系的图。
将结果示于图6。在任一电极中均可确认到OCP的葡萄糖浓度依赖性。
[实施例3]
GDH-GC传感器制作
1.对玻璃碳(GC)电极表面进行研磨清洗
2.在葡萄糖脱氢酶溶液(26.3mg/ml FADGDHγαβ/100mM PPB(pH 7.0))中浸渍一夜，将GDH固定在电极上(对照使用不含Cy的非直接电子传递型GDH)
3.通过利用25％戊二醛(GA)蒸气进行1小时处理而将GDH交联在电极上
表面电位测定
将上述制作的酶电极与对电极和参比电极(均为Ag/AgCl)组合，制成生物传感器，对酶电极施加+100mV(vs Ag/AgCl)的电位(10秒，1次)，之后添加规定浓度的葡萄糖，使其发生酶反应，测定开路电位，重复进行该步骤。
作为对照，使用包含固定有非直接电子传递型GDH的酶电极以及对电极和参比电极的生物传感器，对该电极施加+100mV的电位(10秒，1次)，之后添加规定浓度的葡萄糖，使其发生酶反应，测定开路电位，重复进行该步骤。
将结果示于图7。
其结果，即使同样为FAD-GDH但不是直接电子转移型时，也没有与葡萄糖相伴的OCP变化(图7上)，由此可认为，本发明中的葡萄糖响应(图7下)依赖于在酶将葡萄糖氧化而成为还原体时的电子传递单元的状态变化。
[实施例4]
4-1.OCP的响应时间的测定
使用实施例1中制作的包含FADGDHγαβ的传感器，改变电位(+100mV vs Ag/AgCl)的施加时间来进行测定，调查各葡萄糖浓度下的响应时间(OCP显示出与葡萄糖浓度相应的恒定值为止所需的时间)。
将结果示于图8。
可知：对于低浓度葡萄糖，OCP的响应时间长，但电位施加时间越短则响应时间越短，可以利用电位施加时间来调节OCP的响应时间。
4-2.有无电位施加时的测定结果的比较
使用实施例1中制作的包含FADGDHγαβ的传感器，在施加电位(+100mV vs Ag/AgCl)(1秒)后、或在未施加电位下，添加规定浓度的葡萄糖使其发生酶反应，测定开路电位(分别3次)。
将结果示于图9。
其结果暗示出：在未进行电位施加的情况下，测定批次间的偏差大，通过在电位施加下使其放电，传感器间差异显著减轻，能够更准确地进行葡萄糖测定。
另外，改变电位施加时间和葡萄糖浓度进行了同样的实验，结果如表1中3次测定结果的标准偏差所示，通过0.1～10秒的电位施加，与不施加电位的情况相比，可抑制电位变化量的波动。
[表1]
3mM 5mM 10mM 20mM
0秒 5.08 6.91 10.04 12.58
0.1秒 1.24 0.91 3.33 3.43
1秒 1.14 1.30 0.73 0.62
10秒 1.88 2.60 1.59 1.61
[实施例5]
葡萄糖连续测定
将实施例2-1中制作的包含FADGDHγαβ的传感器浸渍在20mM葡萄糖溶液(100mMPPB(pH7.0))中，一边在37℃下以250rpm进行搅拌一边通过下述程序进行OCP的连续测定。
1.+100mV(vs Ag/AgCl)10秒
2.OCP测定5分钟(每1秒进行采样)
3.重复上述步骤
将结果示于图10。
由该结果可知，在一般的计时安培分析法中，即使在观察到信号衰减这样的长时间测定中，利用施加电位来测定OCP的本发明的方法也可稳定地得到恒定的信号。
需要说明的是，若在连续测定中途停止氧化电位的施加，即使葡萄糖浓度相同，也可观察到OCP增加的倾向，可知为了准确测定需要施加电位(图11)。
符号的说明
A···生物传感器
10···基板
11···对电极
11a···引线部
12···工作电极
12a···引线部
13···检测部
14···绝缘层
15···间隔物
16···盖体
17···样本供给部
18···空气孔
B···测定装置
20···输出部
21···电力供给装置
22···控制部
23···运算部
24···恒电位仪
25···显示部单元
26···电池
27···葡萄糖传感器
28···控制计算机
29···电位差计
30···基板
CR、W···端子

Claims (13)

1.一种测定对象物质的定量方法，其包括下述步骤：
使包含测定对象物质的试样与生物传感器接触的步骤，该生物传感器具备包含氧化还原酶的酶电极以及与所述酶电极成对的对电极；
测定所述酶电极与所述对电极间的电位差变化的步骤，该电位差变化是由所述氧化还原酶所致的所述测定对象物质的氧化反应而引起的；以及
基于该电位差变化计算出测定对象物质浓度的步骤，
该方法的特征在于，
在所述电位差变化测定步骤之前向所述酶电极与所述对电极间施加电位。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述酶电极与所述对电极间的电位差变化是与施加在所述酶电极与所述对电极间的电位的值相比的变化。
3.如权利要求1所述的方法，其中，施加在所述酶电极与所述对电极间的电位以银/氯化银电极为基准为-100mV以上。
4.如权利要求1所述的方法，其中，向所述酶电极与所述对电极间施加电位的时间为0.1秒以上。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述氧化还原酶为能够与电极之间直接进行电子转移的氧化还原酶。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述氧化还原酶为具有电子传递亚基或电子传递结构域的氧化还原酶。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述电子传递亚基或电子传递结构域包含血红素。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，使所述试样与所述生物传感器接触，接着向所述酶电极与所述对电极间施加电位后，测定所述酶电极与所述对电极间的电位差变化。
9.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，反复进行下述循环：向所述酶电极与所述对电极间施加电位后，测定所述酶电极与所述对电极间的电位差变化。
10.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述物质为葡萄糖，所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。
11.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述试样为生物体试样。
12.如权利要求11所述的方法，其中，生物体试样为血液或尿。
13.一种物质的测定装置，其包括：
生物传感器，具备包含氧化还原酶的酶电极以及与所述酶电极成对的对电极；控制部，控制向所述生物传感器的酶电极进行的电位施加；
测定部，测量所述生物传感器的所述酶电极与所述对电极间的电位差变化；运算部，由所述电位差变化计算出测定对象物质的浓度；以及
输出部，将所述计算出的测定对象物质的浓度输出。
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