CN110494147A - 炎症性肠病的预防或治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供一种利用iR‑29a和/或miR‑29b并对炎症性肠病显示出优异的预防或治疗效果的炎症性肠病的治疗剂。一种炎症性肠病的预防或治疗剂，包含使miR‑29a和/或miR‑29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子并被全身给药。

Description

炎症性肠病的预防或治疗剂
技术领域
本发明涉及一种炎症性肠病的预防或治疗剂。更具体而言，本发明涉及一种利用miR-29a和/或miR-29b的炎症性肠病的预防或治疗剂。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease；IBD)是胃肠道中的慢性炎症性疾病，主要大致分为溃疡性结肠炎和克罗恩病(非专利文献1～3)。特别是，在欧美国家，炎症性肠病的发病率很高(非专利文献2)，炎症性肠病的复发率高成为严峻的问题。目前，对于急性炎症性肠病，基本上进行使用抗炎药、免疫抑制药、糖皮质激素等的治疗(非专利文献4)。另外，作为炎症性肠病的新治疗法，提出了抑制以TNF-α等促炎细胞因子或其细胞表面受体为靶标的粘膜炎症通路的方式(非专利文献5及6)。
但是，目前，即使通过给药药剂来治疗炎症性肠病，仍有约30％的患者因为严重的炎症、肠管狭窄或中毒性巨结肠症而需要外科手术。
虽然炎症性肠病的病因及病理尚不明确，但可以认为其与氧化应激障碍、先天性及适应性免疫障碍、遗传因素、肠内细菌、饮食生活等多种因素复合相关。
另一方面，核酸药物作为多种疾病的新一代治疗法而备受关注。在核酸药物中，微小RNA(miRNA)为较小的非编码RNA，是主要通过与3'-UTR区的互补序列结合来调节多个靶基因的表达的RNA分子。最近的研究表明，存在参与上皮屏障功能(miRs-7,21,150)、自噬(miRs-13A，93,106,142-3p)、NF-kB信号传导通路(miRs-126,146a)、及IL23/Th17炎症轴(miRs-20,23a，29b，155)等的miRNA(非专利文献7)。因此，这些miRNA或抗miRNA有望用作炎症性肠病的治疗工具。但是，目前现状是，在使用miRNA的核酸药物中，确认有效治疗的疾病限于眼病、高脂血症及肌肉退行性疾病。
另外，在使用miRNA的核酸药物中，在体内将miRNA高效地送至靶细胞至关重要。目前，体外的miRNA向细胞内的输送中，广泛使用脂质体，但是在炎症性肠病的治疗中，尚未建立在体内高效地将miRNA输送至炎症患处的技术。
另一方面，有报告称，在敲除miR-29a及miR-29b的小鼠中，使由硫酸葡聚糖(DSS)引发的结肠炎恶化(非专利文献8)，miR-29a及miR-29b有望作为炎症性肠病的治疗药物。但是，如上所述，尚未开发在体内高效地将miRNA输送至炎症性肠疾的患处的技术，在将miR-29a及miR-29b作为症性肠病的治疗药物而实用化方面，确立在体内的输送技术必不可少(非专利文献9)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nat Rev Immunol 3：521-33,2003
非专利文献2：J Clin Invest 117：514-21,2007
非专利文献3：Gastroenterology 115:182-205,1998
非专利文献4：Drugs 65:2253-86,2005
非专利文献5：Curr Opin Gastroenterol 23:395-9,2007
非专利文献6：Surgery today 45:933-8,2015
非专利文献7：Gut 64(6):1008,2015
非专利文献8：Immunity 39:521-36,2013.
非专利文献9：Int J Nanomedicine 11:5287-5310,2016.
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供一种利用miR-29a和/或miR-29b并对炎症性肠病显示出优异的预防或治疗效果的炎症性肠病的预防或治疗剂。
用于解决问题的技术方案
已知碳酸磷灰石粒子具有将核酸输送至细胞内的作用(日本特开2007-63194号公报)。由于不知道碳酸磷灰石粒子具有向炎症组织聚集的作用，因此，现有技术中一般认为，即使全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子，也不能有效果地向炎症性肠病的患处输送miR-29a和/或miR-29b。因此，本发明人等尝试了将使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子对炎症性肠病的患处进行局部给药，结果几乎未见炎症性肠病的改善(参见下述参考试验例5)。
在这样的状况下，本发明人等进行了潜心研究，结果发现，如全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子，不仅该miRNA的一部分被吸收至炎症性肠病的患处，该miRNA的一部分还会被吸收至定位于患处的粘膜上的树突状细胞，通过患处直接吸收的该miRNA的作用和吸收了该miRNA的树突状细胞的作用能够有效地改善炎症性肠病。即，通过全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子，该miRNA不仅作用于炎症性肠病的患处，还能够作用于参与炎症的初期免疫反应的树突状细胞，从而使炎症性肠病的治疗效果大幅提高。本发明是基于这样的知识进一步重复探讨而完成的。
即，本发明提供下述所公开的方式的发明。
项1.一种炎症性肠病的预防或治疗剂，其包含使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子，
所述预防或治疗剂被全身给药。
项2.根据项1所述的炎症性肠病的预防或治疗剂，其中，所述预防或治疗剂通过血管内给药或皮下给药而给药。
项3.根据项1或2所述的炎症性肠病的预防或治疗剂，其中，碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径为400～3000nm。
项4.使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子在用于制造全身给药的炎症性肠病的预防或治疗剂中的用途。
项5.根据项4所述的用途，其中，所述全身给药为血管内给药或皮下给药。
项6.根据项4或5所述的用途，其中，所述碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径为400～3000nm。
项7.一种炎症性肠病的预防或治疗方法，其将使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子向需要预防或治疗炎症性肠病的患者全身给药。
项8.根据项7所述的方法，其中，所述全身给药为血管内给药或皮下给药。
项9.根据项7或8所述的方法，其中，所述碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径为400～3000nm。
发明效果
根据本发明的炎症性肠病的预防或治疗剂，通过全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子，该miRNA不仅吸收至炎症性肠病的患处，还吸收至树突状细胞，由此能够起到更优异的治疗效果。
直接吸收至炎症性肠病的患处的miR-29a和/或miR-29b有助于该患处的症状的缓和或治愈。另外，吸收了miR-29a和/或miR-29b的树突状细胞降低参与幼稚T细胞向Th-17细胞分化的细胞因子(IL-6及TGF-β)和激活Th-17细胞从而导向病原性Th-17细胞(pathogenic Th17 cells)的细胞因子(IL12 p40及IL23 p19)的表达量，从而有助于炎症性肠病的治疗效果。即，在本发明的炎症性肠病的预防或治疗剂中，通过全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子，不仅能够直接作用于患处，还能够作用于树突状细胞，由此能够起到更加优异的治疗效果。树突状细胞为与炎症性肠炎的初期免疫反应相关的重要的因子，在本发明的炎症性肠病的预防或治疗剂中，能够通过抑制树突状细胞而有效地抑制干扰素信号介导的肠管整体的炎症扩散。
附图说明
图1为表示参考试验例1的结果的图。a为表示向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药MIRTX(miR-29b衍生物(人工miRNA))/sCA复合体之后，测定直肠、横结肠、盲肠及回肠中的MIRTX的吸收量而得到的结果的图。b为表示向DSS引发的小鼠肠炎模型静脉给药Alexa647-miRNA/sCA复合体之后，对肠进行核染色并通过荧光显微镜观察而得到的结果的图像。
图2为表示试验例1的结果的图。a为表示测定从静脉给药DSS和miR-29b/sCA复合体的小鼠中取出的大肠粘膜中的miR-29b-3p表达量而得到的结果的图。b为表示对从静脉给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠中摘除的直肠进行HE染色并进行显微镜观察而得到的结果的图。c为表示随着时间的经过测定所述小鼠的体重而得到的结果的图。d为表示随着时间的经过测定试验开始7天后的所述小鼠的体重而得到的结果的图。
图3为表示试验例1的结果的图。a为表示针对静脉给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠测定试验开始后7天后的大肠的长度而得到的结果的图。b为表示针对所述小鼠对试验开始7天后的结直肠的炎症的程度进行评分的结果的图。c为表示针对试验开始时的正常组、试验开始4天后及6天后的DSS组测定大肠中的miR-29b的表达量而得到的结果的图。
图4为表示参考试验例2的结果的图。a为表示向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药Alexa647-miRNA/sCA复合体之后，通过抗CD11c抗体及DAPI对直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。b为表示利用共聚焦显微镜观察所述免疫染色后的直肠而得到的结果的图像。
图5为表示在试验例2中，向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药sCA-miR-29a/sCA复合体或sCA-miR-29b/sCA复合体之后，回收大肠，并测定从其的粘膜中所分离的树突状细胞中的各种细胞因子(IL12 p40、IL23p19、IL-6及TGF-β)的信使RNA的表达量而得到的结果的图。
图6为表示在试验例3中，使用从静脉给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠中摘除的大肠，通过IPA进行基因表达量分析而得到的结果的图。
图7为与由Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)产生IFN及炎症性细胞因子相关的细胞内信号通路图。图7中，在带有＊的分子中，通过DSS的静脉给药确认到激活。
图8为IFN信号通路。图8中，带有＊的分子通过IPA预测到了基因的激活，带有○的分子为通过mRNA阵列确认到了上调的分子。
图9为表示试验例4的结果的图。a为表示随着时间的经过测定皮下给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠的体重而得到的结果的图。b为表示测定所述小鼠的试验结束时的体重而得到的结果的图。c为表示测定所述小鼠的大肠的长度而得到的结果的图。d为表示对所述小鼠的直肠的炎症的程度进行评分而得到的结果的图。e为表示针对DSS+sCA-miR-29b组对摘除的直肠进行HE染色并利用显微镜进行观察而得到的结果的图。
图10为表示试验例5的结果的图。a为表示向DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药Alexa647-miR-29b/sCA复合体之后，利用抗CD11c抗体及DAPI对直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。b为表示针对从所述小鼠的大肠分离出的CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞测定miR-29b量而得到的结果的图。c为表示利用抗Ly-6G抗体、抗F4/80抗体、抗CD4抗体、抗CD45R抗体及DAPI对所述小鼠的直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。
图11为表示在试验例5中，向DSS诱导小鼠肠炎模型中皮下给药Alexa647-miR-29b/sCA复合体之后，利用抗Ly-6G抗体、抗F4/80抗体、抗CD4抗体、抗CD45R抗体及DAPI对直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。
图12为表示试验例6的结果的图。a为表示向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药miR-29b/sCA复合体(>50nm)或miR-29b/sCA复合体(≤50nm)之后，对直肠进行HE染色并利用显微镜进行观察而得到的结果的图。b为表示针对所述小鼠的大肠利用组织学方式评价炎症度而得到的结果的图。
图13为表示在参考试验例3中，向DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药Alexa647-miRNA/sCA复合体之后，利用抗CD11c抗体及DAPI对直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。
图14为表示在参考试验例4中，向DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药MIRTX/sCA复合体之后，回收大肠，并测定从其的粘膜分离的CD11c阳性细胞(树突状细胞)和CD11c阴性细胞中的MIRTX的吸收量而得到的结果的图。
图15为表示参考试验例5的结果的图。a为表示随时间的经过测定局部给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠的体重而得到的结果的图。b为表示测定所述小鼠的试验结束时的体重而得到的结果的图。c为表示测定所述小鼠的大肠的长度而得到的结果的图。d为表示对所述小鼠的直肠的炎症的程度进行评分而得到的结果的图。e为表示针对DSS+sCA-miR-29b组对摘除的直肠进行HE染色并进行显微镜观察而得到的结果的图。
具体实施方式
本发明的预防或治疗剂，其特征在于，是用于预防或治疗炎症性肠病的药剂，包含使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子，且被全身给药。下面，对本发明的预防或治疗剂进行详细叙述。
miRNA
本发明的预防或治疗剂包含miR-29a和/或miR-29b作为miRNA。有报告称，在敲除了miR-29a及miR-29b的小鼠中，会使由硫酸葡聚糖(DSS)诱发的结肠炎恶化(非专利文献8)，但目前并不知道，这些miRNA在树突状细胞中具有降低IL-6、TGF-β、IL12 p40及IL23 p19等细胞因子的表达量的作用。
本发明中所使用的miR-29a可以为成熟型miRNA，另外，也可以为发夹型前体miRNA(pri-miRNA)或pri-miRNA的一部分被切断的pre-miRNA。该pri-miRNA或pre-miRNA在细胞内受到加工而变为成熟型miR-29a。也可以形成与具有互补碱基序列的RNA构成的双链的前体。该双链RNA在细胞内解开双链而使成熟型miR-29a游离出来。另外，关于发夹型前体的miR-29a的碱基序列，设置为在生物体内受到加工而产生成熟型miR-29a即可，这样的碱基序列可以由本领域技术人员适当设置。
关于本发明中所使用的miR-29a的来源，根据作为应用对象的动物的种类适当设置即可。例如，如果用于人的炎症性肠病的治疗，则使用来自人的miR-29a即可。作为本发明中所使用的来自人的miR-29a，具体而言，可举出下面所示的成熟型miR-29a。需要指出，来自小鼠的miR-29a的碱基序列与来自人的miR-29a相同。
成熟型has-miR-29a(sense)：5'-UAG CAC CAU CUG AAA UCG GUU A-3'(序列号1)
成熟型has-miR-29a(antisense)：5'-UAA CCG AUU UCA GAU GGU GCU A-3'(序列号2)
另外，本发明中所使用的miR-29b可以为成熟型miRNA，另外，也可以为发夹型前体miRNA(pri-miRNA)或pri-miRNA的一部分被切断的pre-miRNA。该pri-miRNA或pre-miRNA在细胞内受到加工而形成成熟型miR-29b。可以形成与具有互补碱基序列的RNA构成的双链的前体。该双链RNA在细胞内解开双链从而使成熟型miR-29b游离出来。另外，关于发夹型前体的miR-29b的碱基序列，设置为在生物体内受到加工而产生成熟型miR-29b即可，这样的碱基序列可以由本领域技术人员适当设置。
关于本发明中所使用的miR-29b的来源，根据作为应用对象的动物的种类适当设置即可。例如，如果用于人的炎症性肠病的治疗，则使用来自人的miR-29b即可。作为本发明中所使用的来自人的miR-29b，具体而言，可举出下面所示的成熟型miR-29b。需要指出，来自小鼠的miR-29b的碱基序列与来自人的miR-29b相同。
成熟型has-miR-29b(sense)：5'-UAG CAC CAU UUG AAA UCA GUG UU-3'(序列号3)
成熟型has-miR-29b(antisense)：5'-AAC ACU GAU UUC AAA UGG UGC UA-3'(序列号4)
为了赋予耐受酶降解的性质等，miR-29a和/或miR-29b可以根据需要而被实施通常对核酸施加的各种修饰。作为这样的修饰，例如，可举出：2'-O甲基化等糖链部分的修饰；碱基部分的修饰；氨基化，低级烷基氨基化、乙酰基化等磷酸部分的修饰等。
在本发明的预防或治疗剂中，作为miRNA，可以仅使用miR-29a或miR-29b中的一种，另外，也可以将它们组合使用。
碳酸羟基磷灰石粒子
碳酸羟基磷灰石为具有羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)的羟基的一部分被CO3取代而成的结构并由通式Ca10-mXm(PO4)6(CO3)1-nYn所表示的化合物。在此，X为能够部分取代碳酸羟基磷灰石中的Ca的元素，例如，可举出Sr、Mn、稀土元素等。m通常为0以上且1以下的正数，优选为0以上且0.1以下，更优选为0以上且0.01以下，进一步优选为0以上且0.001以下。Y为能够部分取代碳酸羟基磷灰石中的CO3的基团或元素，可举出OH、F、Cl等。n通常为0以上且0.1以下的正数，优选为0以上且0.01以下，更优选为0以上且0.001以下，进一步优选为0以上且0.0001以下。
关于本发明中所使用的碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径，只要为能够被给药至生物体内并向细胞内转移程度的大小，则没有特别限制，但在树突状细胞中的吸收主要通过吞噬作用(日语：ファゴトーシス)来进行，因此，与用作血液给药的核酸载体的现有的碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径(50nm以下)相比，更优选使用较大的平均粒径。具体而言，作为本发明中所使用的碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径，可举出：通常为超过50nm(例如，超过50nm且3000nm以下)，优选为100～3000nm，进一步优选为100～2000nm，更优选为200～2000nm或400～3000nm，特别优选为400～2000nm。
需要指出，所述碳酸羟基磷灰石的平均粒径为通过动态光散射法粒子测量(DLS)所测定的值。在存在不适合使用DLS的测定的巨大粒子(例如，粒径5μm以上)的情况下，将它们从待测定范围中除去。另外，在本说明书中，粒径表示在利用扫描型探针显微镜进行测定时，能够作为单独的粒子所识别的独立粒子的粒径。由此，在多个粒子聚集的情况下，将这些集合体判断为一个粒子。
碳酸羟基磷灰石粒子能够根据公知的方法来获得。例如，能够通过在水溶液中使钙离子、磷酸根离子及碳酸氢根离子共存来制备得到。关于水溶液中的各种离子的浓度，只要能够形成碳酸羟基磷灰石粒子即可，没有特别限制，能够参考下述适当设置。
作为水溶液中的钙离子浓度，可举出：通常为0.1～1000mM，优选为0.5～100mM，进一步优选为1～10mM。
作为水溶液中的磷酸根离子浓度，可举出：通常为0.1～1000mM，优选为0.5～100mM，进一步优选为1～10mM。
作为水溶液中的碳酸氢根离子浓度，可举出：通常为1.0～10000mM，优选为5～1000mM，进一步优选为10～100mM。
作为钙离子、磷酸根离子及碳酸氢根离子的供应源，只要能够向水溶液中供应这些离子即可，没有特别限制，例如，可举出这些离子的水溶性盐。具体而言，作为钙离子源，能够使用CaCl2，作为磷酸根离子源，能够使用NaH2PO4·2H2O，作为碳酸氢根离子离子源，能够使用NaHCO3。
只要能够形成碳酸羟基磷灰石粒子，则用于制备碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液也可以包含除上述各离子供应源及其它物质以外的成分。例如，可以通过在水溶液中向上述组合物中添加氟离子、氯离子、Sr、Mn、聚乙二醇(PEG)等来部分取代或修饰碳酸羟基磷灰石中的Ca或CO3等。其中，氟离子、氯离子、Sr、Mn、PEG等的添加量优选在不会对所形成的复合体粒子的pH溶解性、粒径范围产生明显影响的范围内。另外，用于制备碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液使用水作为基剂即可，也可以使用用于细胞培养的各种培养基或缓冲液等。
在制备本发明中所使用的碳酸羟基磷灰石粒子时，向水溶液中混合各离子供应源及其它物质的顺序没有特别限定，只要能够获得所需的碳酸羟基磷灰石粒子，则可以按照任何的混合顺序制备水溶液。例如，能够制备含有钙离子及其它物质的第一溶液，同时，另外制备含有磷酸根离子及碳酸氢根离子的第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合，从而制备水溶液。
能够通过将上述含有各离子的水溶液的pH调节在6.0～9.0的范围内并放置一定时间(孵育)而获得碳酸羟基磷灰石粒子。作为形成碳酸羟基磷灰石粒子时的该水溶液的pH，例如，可举出：7.0～8.5，优选为7.1～8.5，进一步优选为7.2～8.5，更进一步优选为7.3～8.5，特别优选为7.4～8.5，最优选为7.5～8.0。
只要能够形成碳酸羟基磷灰石粒子，形成碳酸羟基磷灰石粒子时的该水溶液的温度条件则没有特别限制，可举出：通常为4℃以上，优选为25～80℃，进一步优选为37～70℃以上。
只要能够形成碳酸羟基磷灰石粒子，用于形成碳酸羟基磷灰石粒子的该水溶液的孵育时间则没有特别限制，可举出：通常为1分钟～24小时，优选为5分钟～1小时。有无粒子形成能够通过例如在显微镜下观察而确认。
另外，作为将碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径控制在所述范围的方法，没有特别限制，例如，可举出：对所述水溶液中所形成的碳酸羟基磷灰石粒子进行超声波振动处理的方法。作为超声波振动处理，具体而言，可举出：使超声波破碎机等的超声波振子直接与试样接触从而施加超声波的处理；使用具备超声波振子及水槽(清洗槽)的超声波清洗器，向该水槽中加入液体(例如，水)，并使装有碳酸羟基磷灰石粒子的容器(例如，塑料制造的管子)浮在其中，经由液体向包含碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液施加超声波的处理等。通过这样的超声波振动处理，能够简便且高效地使碳酸羟基磷灰石粒子的粒径细化至所述范围。而且，超声波处理之后，也可以通过利用规定的孔径的过滤器分离所需粒径的碳酸羟基磷灰石粒子来将碳酸羟基磷灰石粒子的粒径调节至所述范围。
只要能够将粒径控制至规定范围，上述超声波振动处理的条件则没有特别限制。例如，如果使用具备超声波振子及水槽(清洗槽)的超声波清洗器来进行，则示例以下的条件。
水槽的温度：例如5～45℃，优选为10～35℃，进一步优选为20～30℃
高频输出：例如10～500W，优选为20～400W，进一步优选为30～300W，更优选为40～100W。
振荡频率：例如10～60Hz，优选为20～50Hz，进一步优选为30～40Hz。
处理时间：例如，30秒～30分钟，优选为1～20分钟，进一步优选为3～10分钟。
只要能够将粒子细化至规定的粒径范围，则进行超声波振动处理时所使用的包含碳酸羟基磷灰石粒子的容器的种类没有限制，能够根据水溶液的体积及使用目的适当选择。例如，能够使用1～1000ml容量的塑料制造的管子。
另外，超声波振动处理优选在分散剂存在下(即，将分散剂添加在包含碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液中的状态)进行。这是因为，通过在分散剂与碳酸羟基磷灰石粒子共存的环境进行超声波振动处理，能够得到具有更细微的粒径的碳酸羟基磷灰石纳米粒子，也能够抑制粒子的再聚集。关于分散剂的种类，以能够分散碳酸羟基磷灰石粒子为限度，没有特别限制，只要为通常添加于药品的分散剂即可，作为一例，可举出白蛋白。分散剂可以单独使用一种，另外，也可以组合使用两种以上。作为分散剂在包含碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液中的浓度，只要能够得到细化和/或抑制再聚集的效果，则没有特别限制，例如，可举出：0.1～500mg/ml，优选为1～100mg/ml，进一步优选为1～10mg/ml左右；或0.001～10重量％左右。
(miR-29a和/或miR-29b和碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子)
在本发明的预防或治疗剂中，使用使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子并复合化而成的复合粒子。通过这样地使miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子复合化，不仅能够将miR-29a和/或miR-29b输送至炎症性肠病的患处，还能够使其高效地吸收至树突状细胞。另外，该复合粒子被导入细胞内之后，在细胞内miR-29a和/或miR-29b能够从碳酸羟基磷灰石粒子中游离出来，因此，能够使miR-29a和/或miR-29b发挥所需的活性。
在本发明中，使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子并复合化而成的复合粒子是指miR-29a和/或miR-29b通过离子键、氢键等吸附而负载于碳酸羟基磷灰石粒子的状态。关于miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子的形成方法，没有特别限制，例如，可举出如下方法等：通过使miR-29a和/或miR-29b和碳酸羟基磷灰石粒子在水溶液中共存而形成；在制备碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液中，使miR-29a和/或miR-29b与钙离子、磷酸根离子及碳酸氢根离子共存，从而同时进行碳酸羟基磷灰石粒子的形成和所述miRNA与碳酸羟基磷灰石粒子的复合化。
关于miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子的形成，在同时进行碳酸羟基磷灰石粒子的形成和miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合化的情况下，以达到例如0.1～1000nM，优选为0.5～500nM，进一步优选为1～200nM的方式，向用于制备碳酸羟基磷灰石的水溶液中添加miR-29a和/或miR-29b。通常，水溶液中存在的miR-29a和/或miR-29b的60％左右被内含于碳酸羟基磷灰石粒子从而被复合化。
在miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子中，关于miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的比率，没有特别限制，根据miR-29a和/或miR-29b的给药量等适当设置即可。例如，在使2mg miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子复合化的情况下，向前述用于制备碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液2.5L中添加5mg miR-29a和/或miR-29b，并同时进行碳酸羟基磷灰石粒子的形成和miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合化即可。
另外，在本发明中，以分散在适合向生物体给药的溶剂中的状态来使用miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子。如上所述，通过将作为各种离子供应源的物质溶解在水、培养基或缓冲液等溶剂中而得到碳酸羟基磷灰石粒子，但从渗透压、缓冲能力、无菌性等观点出发，这样得到的碳酸羟基磷灰石粒子分散溶液不一定适合向生物体全身给药。为了将供碳酸羟基磷灰石粒子分散的溶剂替换为适合向生物体给药的溶剂(例如，生理盐水等)，通常，需要如下操作：通过离心分离、过滤、重力沉降等从溶剂中分离并回收碳酸羟基磷灰石粒子，从而替换溶剂。将碳酸羟基磷灰石粒子添加在适合向生物体给药的溶剂中之后，进行前述的超声波振动处理，由此能够使miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子在适合向生物体给药的溶剂中以所述适度的粒径分散。优选这样使其分散之后，在该复合粒子聚集之前快速向生物体给药。例如，超声波振动处理后1分钟以内，优选为30秒以内给药是合适的。但是，在如上所述地通过添加分散剂来抑制碳酸羟基磷灰石粒子的聚集的情况下，也可以在超声波振动处理后，经过数分钟～数十分钟、或1天至数天后再给药。
用途
负载有miR-29a和/或miR-29b的碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子能够有效地治愈或改善炎症性肠病的症状，因此，本发明的预防或治疗剂能够用于炎症性肠病的治疗用途。另外，炎症性肠病有时也会反复复发和缓解，同时缓慢地发展，因此，本发明的预防或治疗剂也能够用于炎症性肠病的预防及防治复发。
炎症性肠病大致分为溃疡性结肠炎和克罗恩病，本发明的预防或治疗剂能够用于这些中的任意一种。
给药方法
本发明的预防或治疗剂通过全身给药而给药。如果局部给药，则不能将miR-29a和/或miR-29b输送至树突状细胞，但通过全身给药，能够将所述miRNA的一部分直接输送至患处，并将所述miRNA的一部分高效地吸收至树突状细胞。
作为全身给药，具体而言，可举出：血管内(动脉内或静脉内)给药、皮下给药、肌肉内给药、腹膜内给药等。其中，从更进一步提高炎症性肠病的治疗效果的观点出发，优选为血管内给药，皮下给药，进一步优选为静脉内注射。
关于本发明的预防或治疗剂的给药量，根据炎症性肠病的程度、患者的性别、年龄、症状等适当确定，因此不能一概而论，例如，可举出：以miR-29a和/或miR-29b的成熟型miRNA量换算，每天1～100mg/m2(体表面积)左右。
实施例
下面，根据实施例等对本发明进行详细地说明，但本发明不受其限制。需要指出，下面所示的试验全部在大阪大学医学部的动物管理使用委员会及大阪大学动物实验委员会(许可号:260033-006)的许可下进行。
参考例1：miRNA及碳酸羟基磷灰石的复合体的制备
除试验例6以外，使用通过以下的方法所制造的miRNA及碳酸羟基磷灰石的复合体。首先，制备无机水溶液(NaHCO3；44mM,NaH2PO4；0.9mM,CaCl2；1.8mM,pH 7.5)。向该无机水溶液50ml中添加miRNA100μg，在37℃下孵育30分钟。然后，以12,000rpm×3分离心沉降，获得包含60μg miRNA的颗粒(使miRNA内含在碳酸羟基磷灰石粒子中而得到的复合粒子；miRNA/sCA复合体)。以达到200μL的方式向该颗粒中添加生理盐水(含有0.5重量％白蛋白)并使其分散，对其进行超声波振动处理(38kHz,80W)10分钟之后立刻用于试验。需要指出，得到的miRNA/sCA复合体的平均粒径为400～2000nm这一点是利用Zetasizer Nano ZS(马尔文)的动态光散射法粒子测量(DLS)确认的。
在下面的试验例中，使用下面所示的成熟miRAN(双链)。在下面的试验例中，所使用的miRNA的量为正义链和反义链的合计量。下面，有时也将包含miR-29a的碳酸羟基磷灰石粒子记作“miRNA-29a/sCA复合体”。另外，关于包含其它miRNA的碳酸羟基磷灰石粒子，有时也按照相同的记载形式来记录。
[表1]
参考试验例1
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含硫酸葡聚糖(DSS)2重量％的水7天，使炎症性肠炎发病，从而制得DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型尾静脉给药MIRTX/sCA复合体或Alexa647-miRNA/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到60μg/小鼠。
在给药MIRTX/sCA复合体的组中，给药4小时后处死小鼠，磨碎直肠、横结肠、盲肠及回肠，回收RNA。接着，通过定量RT-PCR测定MIRTX的各肠管中的吸收量(n＝3)。需要指出，MIRTX的定量将RNU6B作为内标并作为MIRTX量相对于RNU6B量的相对值而求得。
另外，在给药Alexa647-miRNA/sCA复合体的组中，给药4小时后，从小鼠取下直肠(炎症最严重的直肠部位)并制成冷冻切片，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行核染色，并利用荧光显微镜进行观察。
需要指出，为了进行比较，使用未给药DSS的正常小鼠，除此之外，在与所述相同的条件下进行试验。
将给药MIRTX/sCA复合体并测定MIRTX在各肠管中的吸收量而得到的结果示于图1的a。其结果，与未给与DSS的正常小鼠相比，在DSS诱导小鼠肠炎模型中，MIRTX在肠管中的吸收量显著提高，但MIRTX的吸收量自身并不很高。
另外，将给药Alexa647-miRNA后所回收的直肠进行核染色并进行显微镜观察而得到的结果示于图1的b。需要指出，在图1的b中，比例尺为50μm。其结果，在DSS诱导小鼠肠炎模型中，与未给与DSS的正常小鼠相比，直肠中表示吸收了Alexa647-miRNA的红色信号(Alexa647的荧光)稍微增加，但该信号仍较少。从以上的结果可确认到，即使尾静脉给药miRNA/sCA复合体，miRNA向肠管的吸收量也没有达到高水平。
试验例1
将7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)分为表2所示的六组。向各组小鼠在表2所示的条件下给药DSS和miRNA/sCA复合体或miRNA。
[表2]
从试验开始至结束时为止，测量小鼠的体重(n＝5)。另外，关于试验开始时的Normal组、试验开始第4天及第6天的DSS组及DSS+sCA-miR-29b组，处死小鼠，回收并磨碎大肠粘膜，回收RNA。接着，通过定量RT-PCR测定miR-29b-3p表达量(n＝3)。需要指出，miR-29b-3p表达量的定量将RNU6B用作内标并作为miR-29b的表达量相对于RNU6B量的相对值而求得。
另外，从第9天处死的小鼠中回收大肠。对所回收的大肠测定大肠的长度，并对炎症最严重的直肠部位进行苏木精-伊红(HE)染色，利用显微镜观察炎症的状态(n＝5)。另外，根据下述的标准对炎症最严重的直肠部位的炎症的程度就粘膜损伤、粘膜下组织损伤、及肌肉层损伤进行评分，将这些得分的合计值作为组织学炎症评分(Histologicalinflammation score)而算出(n＝5)。
<粘膜损伤>
0：正常
1：3-10上皮淋巴细胞(IEL)/高倍视野(HPF)和局灶性损伤
2：10IEL/HPF和罕见的隐窝脓肿
3：10IEL/HPF，多个隐窝脓肿和糜烂/溃疡
<粘膜下组织损伤>
0：正常或广泛分散的白细胞
1：白细胞聚集
2：弥漫性白细胞浸润伴粘膜下层扩张
3：弥漫性白细胞浸润
<肌肉层损伤>
0：正常或广泛分散的白细胞
1：肌肉层之间广泛分散的白细胞聚集体
2：白细胞浸润伴肌肉萎缩
3：广泛的白细胞浸润，肌肉透壁性消失
将针对DSS组及DSS+sCA-miR-29b组，测定大肠粘膜中的miR-29b-3p表达量而得到的结果示于图2的a。其结果，在DSS组中，与Normal组相比，可以确认到miR-29b的表达量降低，而在DSS+sCA-miR-29b组中确认到，与DSS组相比，能够显著抑制miR-29b的表达量的降低。
将对直肠进行HE染色并观察到的结果示于图2的b。其结果，在DSS组、DSS+sCA-NC-miR组及DSS+miR-29b组中确认到，直肠的粘膜结构被破坏，大量炎症细胞浸润至粘膜。而在DSS+sCA-miR-29a组及DSS+sCA-miR-29b组中，结肠的粘膜结构基本保持正常，也几乎未见炎症细胞的浸润。
将随着时间的经过而测得的小鼠的体重的结果示于图2的c，将测定试验开始7天后的小鼠的体重而得到的结果示于图2的d。另外，将测定大肠的长度而得到的结果示于图3的a，将组织学炎症评分的结果示于图3的b。其结果，在DSS+sCA-miR-29a组及DSS+sCA-miR-29b组中，与DSS组、DSS+sCA-NC-miR组及DSS+miR-29b组相比，可见抑制小鼠的体重的减少、显著抑制大肠缩短及组织学炎症评分降低均显著。
以上结果表明，当miR-29a/sCA复合体及miR-29b/sCA复合体静脉给药时，虽然miRNA的肠管直接吸收较低(所述参考试验例1的结果)，但能够有效地改善炎症性肠病。
另外，将针对试验开始时的正常组、试验开始4天后及6天后的DSS组，测定大肠中的miR-29b的表达量而得到的结果示于图3的c。其结果表明，在炎症性肠病发病的小鼠中，大肠中的miR-29b的表达量降低。
参考试验例2
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含DSS 2重量％的水7天，使炎症性肠炎发病，制得DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型尾静脉给药Alexa647-miRNA/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到60μg/小鼠。给药Alexa647-miRNA/sCA复合体4小时后从小鼠中取下大肠，针对炎症最严重的直肠部位制作冷冻切片，使用抗CD11c抗体及DAPI进行免疫染色(CD11c为绿色)，并使用荧光显微镜及共聚焦显微镜进行观察。另外，为了进行比较，使用未给药DSS的正常小鼠，除此之外，在与所述相同的条件下进行试验。
将针对免疫染色后的冷冻切片利用荧光显微镜进行观察而得到的结果示于图4的a，将在使用DSS诱导小鼠肠炎模型时利用共聚焦显微镜所观察到的结果示于图4的b。需要指出，图4的a中比例尺为50μm，图4的b中的比例尺为5μm。在图4的a中，上方的图像为Alexa647-miRNA所发出的红色信号和DAPI所发出的蓝色信号的观察结果，中部的图像为抗CD11c抗体所发出的绿色信号和DAPI所发出的蓝色信号的观察结果，下方的图像为上方的图像和中部的图像的叠加图像。由抗CD11c抗体所产生的显色表示存在树突状细胞。
由图4的a可知，Alexa647-miRNA所发出的红色信号和由抗CD11c抗体所产生的绿色信号的分布一致。另外，由图4的b可知，由抗CD11c抗体所产生的绿色信号存在于细胞表面，Alexa647-miRNA所发出的红色信号充满细胞质内。由以上结果表明，若静脉给药siRNA/sCA复合体，则siRNA/sCA复合体被吸收至树突状细胞，该树突状细胞在肠管内活动。
试验例2
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含DSS 2重量％的水7天，使炎症性肠炎发病，制作DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型在第1天、第2天及第3天尾静脉给药sCA-miR-29a/sCA复合体或sCA-miR-29b/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到每次60μg/小鼠，第4天从小鼠中取下大肠。从该大肠的粘膜提取粘膜固有层细胞(Laminapropria cells)，使用抗CD11c抗体和autoMACS Pro Separator，分离CD11c阳性细胞。从得到的CD11c阳性细胞中提取RNA。接着，通过定量RT-PCR测定各种细胞因子(IL12 p40、IL23p19、IL-6及TGF-β)的表达量(n＝3)。需要指出，各细胞因子的表达量的定量将β-肌动蛋白用作内标并作为各细胞因子的表达量相对于β-肌动蛋白量的相对值而求出。
另外，为了进行比较，针对未给药DSS及miRNA/sCA复合体的正常小鼠(Normal)、以及仅给药DSS而未给药miRNA/sCA复合体的DSS诱导小鼠肠炎模型(DSS)，也与所述相同地进行各细胞因子表达量的测定。
得到的结果示于图5。其结果，通过向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药sCA-miR-29a/sCA复合体或sCA-miR-29b/sCA复合体，确认到IL12 p40、IL23 p19、IL-6及TGF-β的表达量显著降低。我们知道，IL-6及TGF-β是已知参与幼稚T细胞向Th-17细胞的分化的细胞因子，IL12 p40及IL23 p19是激活Th-17细胞并导向病原性Th-17细胞(pathogenic Th17cells)的细胞因子。即推测，通过静脉给药sCA-miR-29a/sCA复合体或sCA-miR-29b/sCA复合体，使miR-29a或miR-29b积蓄于树突状细胞，由此，下调IL-6及TGF-β从而抑制幼稚T细胞向Th-17细胞分化，并下调IL12 p40及IL23 p19从而抑制Th-17细胞激活为病原性Th-17细胞。
试验例3
将7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)分为表3所示的四组。对各组小鼠在表3所示的条件下给药DSS和miRNA/sCA复合体。
[表3]
从处死的小鼠中回收大肠。从回收的大肠中提取RNA，使用TruSeq stranded mRNAsample prep kit(Illumina,San Diego,CA)，按照生产商的说明书制作mRNA库。基因测序使用Illumina HiSeq 2500 platform(75-base single-end mode)来进行。碱基识别使用Illumina Casava1.8.2软件来进行。确定的序列使用组合有Bowtie2 ver.2.2.3和SAMtools ver.0.1.19TopHat v2.0.13的TopHat v2.0.13映射到小鼠参照基因组序列(mm10)。映射100万个前导序列，使用Cuffnorm version2.2.1来算出将转录产物(片断)的长度为1k base时的归一化的基因表达量。
接着，使用QIAGEN's Ingenuity Pathway Analysis(IPA,QIAGENRedwood City，www.qiagen.com/ingenuity)进行pathway解析(作为截止值，对于各基因设置为P<0.05)。
将通过IPA对基因表达量进行分析而得到的结果示于图6的a。图6中，通过Normal组和sCA-NC-miR组的对比，选取在sCA-NC-miR组中确认到激活的分子，即通过给药DSS而激活的分子。图6中，颜色越浓，表示激活(表达量)的程度越高。另外，图6中显示下划线的分子为多个被鉴定的IFN通路相关分子。其结果确认到，在sCA-miR-29a组及sCA-miR-29b组中，具有使sCA-NC-miR组中确认到激活的分子的Z评分(激活的程度)降低的倾向。
另外，图7中示出了与由Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)产生IFN及炎症性细胞因子相关的细胞内信号通路图。图7中带有＊的分子，通过给药DSS而确认到激活。而且，图8中示出了公知的IFN信号通路图。图8中，带有＊的分子被预测将激活预测可通过IPA而被激活的基因，带有○的分子是通过mRNA阵列确认到下调的分子。
试验例4
将7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)分为表4所示的四组(各组n＝3)。对各组小鼠在表4所示的条件下给药DSS和miRNA/sCA复合体。
[表4]
从试验开始至结束时为止，测量小鼠的体重。另外，从小鼠中回收大肠，并测定大肠的长度，同时对炎症最严重的直肠部位进行苏木精-伊红(HE)染色，利用显微镜观察炎症的状态。而且，通过与所述试验例1相同的方法对炎症最严重的直肠部位的炎症的程度进行评分，求得组织学炎症评分(Histological inflammation score)。
将随着时间经过测定小鼠的体重而得到的结果示于图9的a，将测定试验结束时(miRNA/sCA复合体给药开始后的第9天)的小鼠的体重而得到的结果示于图9的b。另外，将测定大肠的长度而得到的结果示于图9的c，及将组织学炎症评分的结果示于图9的d。其结果，在DSS+sCA-miR-29b组中，与DSS组及DSS+sCA-NC-miR组相比，确认到抑制小鼠的体重减少、抑制大肠的缩短及组织学炎症评分降低均显著。
另外，将针对DSS+sCA-miR-29b组对直肠进行HE染色并观察到的结果示于图9的e。由图9的e可知，在DSS+sCA-miR-29b组中，结肠的粘膜结构几乎保持正常，也几乎未见炎症细胞的浸润。
由以上结果确认到，即使miR-29b/sCA复合体不是静脉给药而是皮下给药，也能够有效地改善炎症性肠病。即，这些结果明确表明，miR-29a/sCA复合体及miR-29b/sCA复合体通过全身给药能够有效地治疗炎症性肠病。
试验例5
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含DSS 2重量％的水7天，使炎症性肠炎发病，制作DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药Alexa647conjugated miR-29b/sCA复合体，以使得miRNA的给药量达到60μg/小鼠。
给药所述复合体4小时后，从小鼠中取下大肠，制作炎症最严重的直肠部位的冷冻切片，使用抗CD11c抗体、抗Ly-6G抗体、抗F4/80抗体、抗CD4抗体、抗CD45R抗体、及DAPI进行免疫染色，并利用荧光显微镜进行观察。
将针对利用抗CD11c抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和CD11c+树突状细胞进行了免疫染色而得到的冷冻切片利用荧光显微镜进行观察而得到的结果示于图10a。由图10a可知，Alexa647-miRNA所发出的红色信号和由抗CD11c抗体所产生的绿色信号的分布一致。即，由该结果确认到，在皮下给药Alexa647 conjugated miR-29b/sCA复合体时，miRNA被高效地吸收至树突状细胞，并定位于引起了炎症的肠管。
另外，从所述取下的大肠中提取粘膜固有层细胞(Lamina propria cells)，使用抗CD11c抗体和autoMACS Pro Separator，分离出CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞。从得到的CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞中分别回收RNA。接着，通过定量RT-PCR测定miR-29b量。需要指出，miR-29b量的定量作为将未给药所述复合体时的miR-29b的表达量设为1时的相对值而求出。将结果示于图10b。其结果，在CD11c阳性细胞中，给药Alexa647-miRNA的组(DSS+sCA-miR-29b)与仅给药DSS的组(DSS alone)相比确认到miR-29b量增大。可以认为，该miR-29b量的增大是由于外来的miR-29b(即，Alexa 647 conjugated miR-29b)被吸收至CD11c阳性细胞而产生的。由以上结果表明，皮下给药的Alexa 647 conjugated miR-29b与CD11c阳性细胞的定位模式一致，皮下给药的Alexa 647 conjugated miR-29b被吸收至树突状细胞中，并定位于引起了炎症的肠管。
另外，将通过抗Ly-6G抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和Ly-6G+中性粒细胞进行免疫染色而得到的结果、通过抗F4/80抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和F4/80+巨噬细胞进行免疫染色而得到的结果、通过抗CD4抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和CD4+辅助T细胞进行免疫染色而得到的结果、通过抗CD45R抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和CD45R+B细胞进行免疫染色而得到的结果示于图11。其结果确认到，Alexa 647 conjugated miR-29b所呈现的红色未与所述各免疫细胞所呈现的绿色重叠，皮下给药的Alexa 647 conjugated miR-29b未被吸收至除树突状细胞以外的免疫细胞。
试验例6
(1)miR-29b/sCA复合体的制备
首先，制备无机水溶液(NaHCO3；44mM,NaH2PO4；0.9mM,CaCl2；1.8mM,pH 7.5)。向该无机水溶液50ml中添加miR-29b 100μg，在37℃下孵育30分钟。然后，以12,000rpm×3分钟离心沉降，获得包含60μg miRNA的颗粒(使miRNA内含在碳酸羟基磷灰石粒子中而得到的复合粒子；miRNA/sCA复合体)。以达到200μL的方式向该颗粒中添加生理盐水(含有0.5重量％白蛋白)并使其分散，对其进行超声波振动处理(38kHz,80W)之后，通过薄膜过滤器分离为大于50nm且约3000nm以下的粒子(下面称为miR-29b/sCA复合体(>50nm))和10nm以上且50nm以下的粒子(下面称为miR-29b/sCA复合体(≤50nm))之后，立刻用于试验。
(2)试验方法
将8周龄的BALB/cAJcl小鼠(雌)分为表5所示的三组(每组两只)。对各组小鼠在表5所示的条件下给药DSS和miR-29b/sCA复合体。
[表5]
从处死的小鼠中回收大肠并进行苏木精-伊红(HE)染色，利用显微镜观察炎症的状态，通过组织学方式评价炎症度。关于炎症度，针对“粘膜固有层的伤害”，“粘膜下层的伤害”及“肌肉层的伤害”这三项，按照下述判定标准评为0～3分，以总分9分进行评价。另外，作为炎症度的评价，将所回收的大肠的全长10等分，并分别将10个视野的评价结果进行平均，由此进行评分。
<粘膜固有层的伤害的判定标准>
0分：正常所见。
1分：每一高倍视野(high power field；HPF)，存在3～10个无上皮的细胞(intraepithelial lymphocytes；IEL)，可见局部的粘膜损伤。
2分：每一HPF可见10个以上IEL和轻微的隐窝脓肿。
3分：每一HPF可见10个以上IEL和轻微的散在隐窝脓肿及糜烂和溃疡。
<粘膜下层的伤害的判定标准>
0分：正常、或散见少量的中性粒细胞浸润图像。
1分：可见局部的中性粒细胞浸润。
2分：可见弥漫性的中性粒细胞浸润，伴随粘膜下层的扩大。
3分：粘膜下层整体可见中性粒细胞浸润。
<肌肉层的伤害的判定标准>
0分：正常、或好肌肉层的一部分散见中性粒细胞。
1分：肌肉层得以保持，但肌肉层之间可见弥漫性的中性粒细胞浸润。
2分：由于中性粒细胞浸润，可见肌肉层排列杂乱。
3分：由于大范围的中性粒细胞浸润，可见跨壁性的肌肉层的序列杂乱。
(3)试验结果
将进行HE染色并观察到的结果示于图12的a。由图12的a可知，在DSS+sCA(>50nm)-miR-29b组及DSS+sCA(≤50nm)-miR-29b组中，与DSS相比，大肠的粘膜结构的破坏程度降低，特别是在DSS+sCA(>50nm)-miR-29b组中，与DSS+sCA(≤50nm)-miR-29b组相比，大肠的粘膜结构的破坏程度大幅度降低。
另外，将通过组织学方式评价炎症度而得到的结果示于图12的b。从组织学评价结果也确认到，在DSS+sCA(>50nm)-miR-29b组中，与DSS组相比可见显著差异，炎症抑制效果大幅提高。
由以上结果表明，通过使用粒径超过50nm的大粒子作为负载miR-29b的碳酸羟基磷灰石，使炎症性肠病的治疗效果更进一步提高。
参考试验例3
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含DSS 2重量％的水7天，使炎症性肠炎发病，制作DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药Alexa647-miRNA/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到60μg/小鼠。给药Alexa647-miRNA/sCA复合体4小时后，从小鼠中取下大肠，制作炎症最严重的直肠部位的冷冻切片，使用抗CD11c抗体及DAPI进行免疫染色(CD11c为绿色)，并利用荧光显微镜进行观察。
将针对免疫染色后的冷冻切片利用荧光显微镜进行观察而得到的结果示于图13。由图13可知，Alexa647-miRNA所发出的红色信号和由抗CD11c抗体所产生的绿色信号的分布一致。即，即使皮下给药miRNA/sCA复合体，也与静脉给药的情况相同，miRNA被高效地吸收至树突状细胞，并定位于引起了炎症的肠管。
参考试验例4
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含硫酸葡聚糖(DSS)2重量％的水7天，使炎症性肠炎发病，制作DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型皮下脉(日语：皮下脈)给药MIRTX/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到60μg/小鼠。
给药MIRTX/sCA复合体4小时后，处死小鼠，取出大肠。从该结肠的粘膜中提取粘膜固有层细胞(Lamina propria cells)，使用抗CD11c抗体和autoMACS Pro Separator，分离出CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞。从得到的CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞中分别回收RNA。接着，通过定量RT-PCR测定MIRTX在各肠管中的吸收量。需要指出，MIRTX的定量将RNU6B用作内标并作为MIRTX量相对于RNU6B量的相对值而求出。
另外，为了进行比较，不给药MIRTX/sCA复合体，在与所述相同的条件下进行MIRTX的定量。
得到的结果示于图14。其结果，在皮下脉给药MIRTX/sCA复合体的情况下，CD11c阳性细胞中确认到了较高的MIRTX量，而在CD11c阴性细胞中，MIRTX量则较少。即，由该结果也确认到，在皮下给药miRNA/sCA复合体时，其高效地被吸收至树突状细胞，并定位于引起了炎症的肠管。
参考试验例5
将7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)分为表6所示的四组(各组n＝5)。对各组小鼠在表6所示的条件下给药DSS和miRNA/sCA复合体。
[表6]
从试验开始至结束时为止，测量小鼠的体重。另外，从小鼠中回收大肠，并测定大肠的长度，同时进行苏木精-伊红(HE)染色，利用显微镜观察炎症的状态。而且，通过与所述试验例1相同的方法，对炎症最严重的直肠部位的炎症的程度进行评分，求得组织学炎症评分(Histological inflammation score)。
将随时间经过测定小鼠的体重而得到的结果示于图15的a，将测定试验结束时(miRNA/sCA复合体给药开始后第9天)的小鼠的体重而得到的结果示于图15的b。另外，将测定大肠的长度而得到的结果示于图15的c，及将组织学炎症评分的结果示于图15的d。其结果，与DSS组及DSS+sCA-NC-miR组相同，DSS+sCA-miR-29b组也几乎未见抑制小鼠的体重减少，未见抑制大肠的缩短，及未见组织学炎症评分降低。
另外，将针对DSS+sCA-miR-29b组对直肠进行HE染色并观察而得到的结果示于图15的e。其结果也确认到，DSS+sCA-miR-29b组的结肠的炎症几乎未得到改善。
即，从本结果确认到，miR-29b/sCA复合体即使对于炎症性肠病而局部给药，也几乎未见改善效果。
序列表
<110> 山本浩文（YAMAMOTO，Hirofumi）
森正树（MORI，Masaki）
<120> 炎症性肠病的预防或治疗剂
<130> 18005WO
<150> JP2017-085318
<151> 2017-04-24
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
uaaccgauuu cagauggugc ua 22
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
aacacugauu ucaaauggug cua 23
<210> 5
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工miRNA(MIRTX)的正义链
<400> 5
ucuaaaccac cauaugaaac cagc 24
<210> 6
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工 miRNA(MIRTX)的反义链
<400> 6
gcugguuuua uauggugguu uaga 24
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Alexa647-miRNA的正义链
<400> 7
auccgcgcga uaguacgua 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Alexa647-miRNA的反义链
<400> 8
uacguacuau cgcgcggau 19
<210> 9
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NC-miR正义链
<400> 9
uaaauguacc gcgcguggag aggaa 25
<210> 10
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NC-miR反义链
<400> 10
uuccucucca cgcgcaguac auuua 25

Claims (9)

1.一种炎症性肠病的预防或治疗剂，其包含使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子，
所述预防或治疗剂被全身给药。
2.根据权利要求1所述的炎症性肠病的预防或治疗剂，其中，
所述预防或治疗剂通过血管内给药或皮下给药而给药。
3.根据权利要求1或2所述的炎症性肠病的预防或治疗剂，其中，
所述碳酸磷灰石粒子的平均粒径为400～3000nm。
4.一种使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子在用于制造全身给药的炎症性肠病的预防或治疗剂中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，
所述全身给药为血管内给药或皮下给药。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其中，
所述碳酸磷灰石粒子的平均粒径为400～3000nm。
7.一种炎症性肠病的预防或治疗方法，其将使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子向需要预防或治疗炎症性肠病的患者全身给药。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，
所述全身给药为血管内给药或皮下给药。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，
所述碳酸磷灰石粒子的平均粒径为400～3000nm。
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