CN110484644B - 一种日本落叶松种质的指纹图谱构建方法及应用 - Google Patents

一种日本落叶松种质的指纹图谱构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种日本落叶松种质的指纹图谱构建方法及应用。本发明是基于SSR分子标记鉴定方法构建的，利用9对SSR引物构建92份收集自中国和日本共10个省市的日本落叶松种质的指纹图谱并进行种质鉴定的技术体系。该技术体系不仅能够准确、高效地构建不同日本落叶松种质的指纹图谱，还能对日本落叶松种质进行鉴定，有利于日本落叶松种质的利用和保护。

Description

一种日本落叶松种质的指纹图谱构建方法及应用
技术领域
本发明属于种质鉴别技术领域，尤其涉及一种日本落叶松种质的指纹图谱构建方法及应用。
背景技术
日本落叶松(Larix kaempferi(Lamb.)Carr.)为松科落叶松属，原产于日本本州岛中部地区，自引入我国后，在我国的温带(吉林、辽宁、内蒙古等)、暖温带(山东、河南、甘肃等)及中北亚热带(湖北、湖南、四川等)高山区得到迅速推广应用，表现出抗性强，病虫害少，生长快，材质优等特性，已逐渐成为我国制浆造纸业和高密度纤维板生产的主要树种之一，具有重要的经济和生态价值。
日本落叶松在原生地的分布范围较小，作为外来引进树种，国内的日本落叶松引种资源有限，加上长期高频率地使用少数种质作为育种亲本，使得日本落叶松资源的遗传基础比较狭窄，品系之间的形态学差异小，很难实现通过表型性状鉴定或区别不同日本落叶松种质，这就给品系鉴定和知识产权保护增加了困难。随着分子生物学的快速发展，DNA指纹图谱作为一种遗传种质分析的新方法，可以直接反映植物遗传物质在DNA分子水平上的差异，具有准确、高效、经济、不受环境影响等优点。目前构建DNA指纹图谱的标记方法有多种，SSR(simple sequence repeat)分子标记由于扩增稳定、重复性好、操作简便、易于推广，已被国际植物品种权保护联盟(UPOV)认定为植物新品种保护最广泛应用的标记体系。特别是利用荧光标记检测PCR扩增产物，使得多态性产物的检测结果更加准确，从而保证了所构建指纹图谱具有更高的可信度。另外，DNA指纹图谱对于辅助育种、杂种鉴定、遗传多样性分析等方面均具有重要的意义。
然而，目前在构建日本落叶松种质DNA指纹图谱、并利用SSR分子标记技术进行日本落叶松种质资源鉴定的方法尚未见报道。
发明内容
为了解决现有日本落叶松种质资源无有效鉴定方法的问题，本发明的目的在于提供一种日本落叶松种质的指纹图谱的构建方法，可鉴定或辅助鉴定日本落叶松种质资源，为梳理种质资源亲缘关系，开展育种亲本的选择，实现种质资源科学管理和高效利用以及品种保护方面奠定基础。
为了实现上述发明目的，本发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：一种日本落叶松种质的指纹图谱构建方法，该方法包括以下步骤：
(1)选取不同种质来源的日本落叶松标准品，分别提取基因组DNA；需要说明的是，本发明对如何提取基因组DNA的方式无特殊限定，采用本领域已知的方式即可。在本发明具体的实施例中，采用改良的CTAB提取法，也可采用市售试剂盒或者自行按照基因组DNA提取方法制备。
(2)以各标准品基因组DNA为模板，采用(AGTCC)4+(GTCCA)6、(GA)9、(GA)13、(TC)6、(CAG)5、(CTG)5、(ACTGGC)4、(AGGCGG)3和(AGC)7中的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；不同来源的日本落叶松种质在本发明所述的SSR分子标记中有不同体现，采用上述的SSR分子标记的引物越多则最终构建的指纹图谱特异性越强。在本发明中，优选对PCR扩增得到的产物进行毛细管电泳检测，以确定是否有PCR产物。
(3)将各标准品基因组DNA的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到日本落叶松种质的指纹图谱。
需要说明的是，本发明中(AGTCC)4+(GTCCA)6、(GA)9、(GA)13、(TC)6、(CAG)5、(CTG)5、(ACTGGC)4、(AGGCGG)3和(AGC)7中的数字指重复括号内碱基排列的次数。
进一步优选地，如上所述的日本落叶松种质的指纹图谱构建方法，步骤(2)中各SSR分子标记的引物采用不同颜色的荧光染料标记，本发明对荧光标记的颜色和修饰方式无特殊限定，可在DNA测序仪上实现荧光检测即可。SSR分子标记的引物序列具体为：
(AGTCC)4+(GTCCA)6的引物由SEQ ID NO:1所示的单链引物和SEQ ID NO:2所示的单链引物组成；
(GA)9的引物由SEQ ID NO:3所示的单链引物和SEQ ID NO:4所示的单链引物组成；
(GA)13的引物由SEQ ID NO:5所示的单链引物和SEQ ID NO:6所示的单链引物组成；
(TC)6的引物由SEQ ID NO:7所示的单链引物和SEQ ID NO:8所示的单链引物组成；
(CAG)5的引物由SEQ ID NO:9所示的单链引物和SEQ ID NO:10所示的单链引物组成；
(CTG)5的引物由SEQ ID NO:11所示的单链引物和SEQ ID NO:12所示的单链引物组成；
(ACTGGC)4的引物由SEQ ID NO:13所示的单链引物和SEQ ID NO:14所示的单链引物组成；
(AGGCGG)3的引物由SEQ ID NO:15所示的单链引物和SEQ ID NO:16所示的单链引物组成；
(AGC)7的引物由SEQ ID NO:17所示的单链引物和SEQ ID NO:18所示的单链引物组成；
进一步优选地，如上所述的日本落叶松种质的指纹图谱构建方法，步骤(2)中所述PCR扩增使用的体系，每15μL，包括：dNTP 1.5μL，Buffer(Mg2+plus)1.5μL，Taq酶0.2μL(5u/μL)，上下游引物各0.6μL，模板DNA1μL，超纯水9.6μL；所述上游引物或下游引物浓度分别为10μmol/L，基因组DNA模板的浓度为30ng/μL。
进一步优选地，如上所述的日本落叶松种质的指纹图谱构建方法，步骤(2)中所述的PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60～50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；再经72℃延伸7min后于4℃保存；
所述PCR扩增程序采用Touch down PCR程序，30个循环中前20个循环每个循环退火温度降低0.5℃，退火温度保持在50℃完成剩余10个循环。
进一步优选地，如上所述的日本落叶松种质的指纹图谱构建方法，步骤(3)中将各标准品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码是：PCR产物在DNA测序仪上进行自动荧光检测，用GeneMarker软件对原始数据进行分析，将各峰值的位置与同一泳道GL500分子内标进行比较，得出SSR扩增产物的长度数值，缺失该SSR分子标记扩增产物计作“000”，转化为依次排列的矩阵，得到计算机可识别的日本落叶松种质的指纹图谱。
本发明对日本落叶松标准品的来源无特殊限定，包括但不限于源自中国收集保存的和原产地日本的日本落叶松。因此进一步优选地，如上所述的日本落叶松种质的指纹图谱构建方法，步骤(1)中日本落叶松标准品为实施例1表1中的LK001～LK092，共计92个日本落叶松种质标准品材料。
另外，本发明提供了上述方法构建的指纹图谱在区分不同种质来源的日本落叶松中的应用。具体的应用方法为：提取待测日本落叶松样品的基因组DNA，采用上述步骤(2)中相同的SSR分子标记的引物进行PCR扩增，根据扩增结果在所述指纹图谱中的位置，判断待测样品的种质来源。
与现有技术相比，本发明提供的日本落叶松种质指纹图谱的构建方法及种质鉴定方法，具有如下优点和显著的进步性：
(1)选用了9对SSR引物，采用这9对SSR分子标记的引物对日本落叶松样品DNA进行扩增，同一SSR分子标记位点上，不同来源的日本落叶松种质资源得到的SSR扩增产物的长度各不相同，根据产物长度的差异可以快速有效地区分不同种质来源的日本落叶松。加之本发明将指纹图谱转化为计算机可识别的指纹图谱，直接利用计算机进行检索，结果比对方便、快速又准确。
(2)本发明采用Touch down PCR程序，可有效避开针对不同引物确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化及设置过程，所有9对引物在同一PCR程序设置下均可获得理想的扩增效果。
(3)本发明利用荧光标记进行PCR扩增，采用DNA测序仪进行PCR扩增产物检测，利用毛细管电泳代替传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳，可将不同的PCR扩增产物按荧光颜色和产物片段大小合理组合后同时检测，利用软件进行结果批量判读，与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，检测数据更为精确，检测效率更高，具有快速、简便、可靠及高通量的优点，而且随着分子标记技术的不断发展，毛细管电泳检测方法的成本越来越低，特别适合大规模的检测。
具体实施方式
以下实施例进一步描述本发明方法的实施过程和有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变也包含在本发明范围之内。
在本发明中，所述(AGTCC)4+(GTCCA)6的引物优选的如序列1和序列2所示：
上游引物序列1：GGCTGAGGTTGCGAAAGA
下游引物序列2：CAATTACATAAGTGGGACGAGA
在本发明中，所述(GA)9的引物优选的如序列3和序列4所示：
上游引物序列3：TCTGAATCAATGTATCATGTATCGAA
下游引物序列4：CTGTCAGTCATGCTGCGTTT
在本发明中，所述(GA)13的引物优选的如序列5和序列6所示：
上游引物序列5：TCCATCTTTATTTGGCAGGC
下游引物序列6：CCATCAGAGATGGGAGTGCT
在本发明中，所述(TC)6的引物优选的如序列7和序列8所示：
上游引物序列7：AGTGGCAGTCAGCATCTCCT
下游引物序列8：AGAAGATTTTGCAGAGGGCA
在本发明中，所述(CAG)5的引物优选的如序列9和序列10所示：
上游引物序列9：AGGCGTCTGAGCTACCAAAA
下游引物序列10：CGACGACACCCAATACCTTT
在本发明中，所述(CTG)5的引物优选的如序列11和序列12所示：
上游引物序列11：AAACCAATGAAAATGCCTGC
下游引物序列12：TCCCCAGCCAACTCTCATAC
在本发明中，所述(ACTGGC)4的引物优选的如序列13和序列14所示：
上游引物序列13：AGCGTATGAATTGGTCCAGG
下游引物序列14：ACGAAGATAGCTCGAACGGA
在本发明中，所述(AGGCGG)3的引物优选的如序列15和序列16所示：
上游引物序列15：TAAATACGCACAAGCCCACA
下游引物序列16：GGAGGAGCAAATGGATCAAA
在本发明中，所述(AGC)7的引物优选的如序列17和序列18所示：
上游引物序列17：AATTCGTTGGCCTTCAGATG
下游引物序列18：CGATCTCGGGCATTATGAGT
实施例1利用9对SSR引物构建日本落叶松种质指纹图谱的应用
1、日本落叶松基因组DNA提取
参照改良的CTAB法，具体操作如下：
1)采集日本落叶松不同种质标准品材料的幼嫩、洁净的叶片，硅胶干燥后保存于-80℃冰箱；
2)在研钵中用液氮将1g标准品磨成细粉末状，并在加入液氮保护的情况下立即放入2mL离心管，同时立即加入800μL 65℃预热的DNA抽提缓冲溶液，然后放入65℃水浴锅中水浴30～45min，水浴过程中每5min轻微翻转下离心管；
3)水浴后冷却至室温后加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，温和翻转50次以上至充分混合均匀，常温离心12000rmp10 min；
4)取上清于新的离心管中，按上一步骤再抽提1次；
5)重复步骤4)；
6)抽提后，取上清于新的离心管中，并加入0.6～1.0倍体积-20℃预冷的的异丙醇，并静置于-20℃下1h以上；
7)用75％的乙醇和无水乙醇各洗一次；
8)倒掉酒精风干，加50μL ddH2O溶解DNA，4℃保存；
9)取出少量DNA电泳检测其纯度，并利用紫外分光光度计测定DNA浓度，将DNA溶液稀释到30ng/μL备用。
采用上述方法提取表1所示的92个日本落叶松种质标准品材料的基因组DNA。
表1日本落叶松种质标准品材料
2、SSR引物序列
人工合成表2所示的9对SSR引物，并加上不同颜色荧光修饰。引物由北京睿博兴科生物技术有限公司提供。
表2日本落叶松SSR引物序列
3、SSR-PCR扩增
利用上述9对引物对日本落叶松样品基因组DNA进行PCR扩增，反应体系和程序如下：
1)PCR扩增采用15μL体系，包括：dNTP 1.5μL，Buffer(Mg2+plus)1.5μL，Taq酶0.2μL(5u/μL)，上下游引物各0.6μL，模板DNA1μL，超纯水9.6μL。上游引物或下游引物浓度独立地为10μmol/L，基因组DNA模板的浓度为30ng/μL。试剂由TAKARA公司提供。
2)PCR扩增采用Touch down PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60～50℃退火30s，72℃延伸45s，20个循环，每个循环退火温度降低0.5℃；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环；72℃延伸7min后于4℃保存。采用PE9700型PCR仪(AppliedBiosystems，USA)运行PCR反应。
依据上述方法得到92个日本落叶松种质的9对SSR扩增产物。
4、电泳检测并构建指纹图谱
将PCR扩增产物在ABI 3730XLDNA测序仪上进行自动荧光检测，用GeneMarker2.2.0软件对原始数据进行分析，将各峰值的位置与同一泳道GL 500分子内标进行比较，得出SSR扩增产物的长度数值，录入到Excel中，缺失该SSR分子标记扩增产物计作“000”，将扩增产物长度数值依次排列为矩阵，得到计算机可识别的日本落叶松种质鉴定的指纹图谱。92个日本落叶松种质的指纹图谱如表3所示。
表3日本落叶松种质的指纹图谱
*数字表示品种DNA利用SSR引物进行扩增，在自动荧光检测仪上读出的SSR扩增产物的长度数值。每对引物读出两个数值，按照从小到大的顺序排列。
实施例2利用构建的日本落叶松种质指纹图谱进行种质鉴定
1、日本落叶松种质的DNA提取
采用实施例1的方法提取来源于表1范围内、临时编号为U01、U02、U03、U04和U05的5份日本落叶松种质的基因组DNA。
2、日本落叶松种质的SSR-PCR扩增
以上述5份日本落叶松种质基因组DNA为模板，利用实施例1的9对SSR引物分别进行PCR扩增，得到5份日本落叶松种质的9对SSR引物的扩增产物。
3、电泳并构建指纹图谱
将上述5份日本落叶松种质的9对SSR引物的扩增产物按照实施例1的方法进行电泳检测并构建SSR指纹图谱，结果如表4所示。
将5份日本落叶松种质的SSR指纹图谱与表3中各种质的SSR指纹图谱进行比对，其中U01与LK030、U02与LK048、U03与LK062、U04与LK073、U05与LK083的指纹图谱完全一致，则判定该5份日本落叶松种质分别为LK030、LK048、LK062、LK073和LK083。
表4日本落叶松种质样品的指纹图谱
序列表
<110> 湖北省林业科学研究院
<120> 一种日本落叶松种质的指纹图谱构建方法及应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctgaggtt gcgaaaga 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caattacata agtgggacga ga 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgaatcaa tgtatcatgt atcgaa 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgtcagtca tgctgcgttt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccatcttta tttggcaggc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccatcagaga tgggagtgct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtggcagtc agcatctcct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agaagatttt gcagagggca 20
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<211> 20
<212> DNA
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aggcgtctga gctaccaaaa 20
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<211> 20
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<211> 20
<212> DNA
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aaaccaatga aaatgcctgc 20
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tccccagcca actctcatac 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
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<400> 13
agcgtatgaa ttggtccagg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
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<210> 15
<211> 20
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<400> 15
taaatacgca caagcccaca 20
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ggaggagcaa atggatcaaa 20
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<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgatctcggg cattatgagt 20

Claims (1)

1.一种构建日本落叶松种质的指纹图谱的引物组，其特征在于，该引物组包括SSR分子标记的引物(AGTCC)4+(GTCCA)6、(GA)9、(GA)13、(TC)6、(CAG)5、(CTG)5 、(ACTGGC)4、(AGGCGG)3和(AGC)7，采用不同颜色的荧光染料标记，其序列具体为：
(AGTCC)4+(GTCCA)6的引物由SEQ ID NO:1所示的单链引物和SEQ ID NO:2所示的单链引物组成；
(GA)9的引物由SEQ ID NO:3所示的单链引物和SEQ ID NO:4所示的单链引物组成；
(GA)13的引物由SEQ ID NO:5所示的单链引物和SEQ ID NO:6所示的单链引物组成；
(TC)6的引物由SEQ ID NO:7所示的单链引物和SEQ ID NO:8所示的单链引物组成；
(CAG)5的引物由SEQ ID NO:9所示的单链引物和SEQ ID NO:10所示的单链引物组成；
(CTG)5的引物由SEQ ID NO:11所示的单链引物和SEQ ID NO:12所示的单链引物组成；
(ACTGGC)4的引物由SEQ ID NO:13所示的单链引物和SEQ ID NO:14所示的单链引物组成；
(AGGCGG)3的引物由SEQ ID NO:15所示的单链引物和SEQ ID NO:16所示的单链引物组成；
(AGC)7的引物由SEQ ID NO:17所示的单链引物和SEQ ID NO:18所示的单链引物组成。
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