CN110484643A - 一种木霉属病害检测用引物及检测方法 - Google Patents

一种木霉属病害检测用引物及检测方法 Download PDF

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陈明杰
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Abstract

一种木霉属病害检测用引物及检测方法，上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。本发明不仅可以用于木霉属病害鉴定，而且也可以用于定量检测，极大简化鉴定和定量检测的时间，具有重复性好、特异性强等优点。

Description

一种木霉属病害检测用引物及检测方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种木霉属病害检测用引物及检测方法，特别涉及一种用于双孢蘑菇培养料和覆土材料中木霉属病害鉴定和检测的实时荧光定量PCR引物及方法。
背景技术
双孢蘑菇是一种草腐菌，它的栽培过程包括培养料混制、发酵、播种、发菌、覆土、出菇和采收等过程，与其它木腐菌在一个袋子或瓶子里生长和出菇相比，双孢蘑菇工厂化栽培许多过程处于暴露作业的状态，极易受到各种病虫害侵染。而且一旦受到侵染，它传播速度和损害程度要远远大于瓶栽或袋栽的木腐菌。
木霉属(Trichoderma)物种分布范围广、生长基质多，是许多食用菌栽培过程中极易感染和传播的真菌性病害。Fletcher and Gaze(2010)汇总发现在双孢蘑菇栽培过程中最常见的木霉属物种就有10个。虽然每个木霉属物种感染双孢蘑菇的能力不同，但一旦有任何木霉属物种分生孢子的形成，它会随风、水、动物和人等传播，会潜隐在双孢蘑菇工厂化栽培过程的材料中，不知道什么时候会爆发出来，对双孢蘑菇工厂化栽培是个极大的隐患。
在木霉属通用引物方面，魏巍等(2013)为了检测土壤中的木霉属物种，基于核糖体DNA基因间隔区序列(internal transcribed spacer,ITS)设计了一种用于土壤木霉属基因组DNA实时荧光定量PCR检测的通用引物，扩增长度在258bp(包括引物)。我们将该引物序列在NCBI数据库中进行检索，发现在扩增长度的3’端有一小部分序列存在多态性，说明该扩增序列应该再短一点才更能代表整个木霉属的通用引物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种木霉属病害检测用引物及检测方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种木霉属病害检测用引物，上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种木霉属病害检测方法，包括下列步骤：
步骤1：引物特异性检测
将木霉属菌株和非木霉属菌株的菌丝分别制成菌丝裂解液，然后分别以设计的木霉属通用引物进行PCR扩增，如果该引物仅在木霉属菌株中扩增成功，而在非木霉属菌株中扩增不成功，该引物则具有特异性；
步骤2：实时荧光定量PCR引物筛选
用真菌DNA提取试剂盒分别提取多个木霉属菌株的基因组DNA，然后分别取木霉属菌株的基因组DNA各20μL后混合，稀释30倍后得到基因组DNA混合物；
以步骤1确定的具有特异性的引物对基因组DNA混合物进行PCR扩增，然后将目的条带切胶回收，取1μL回收的产物先用ddH2O进行10倍稀释，然后再将10倍稀释液按10倍梯度稀释成7个梯度后得到模板稀释样；
上机体系：将8μL mixture A和8μL模板稀释样上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-time PCR premixture，0.4μL 10uM的特异性的引物的上游引物，0.4μL 10uM特异性的引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃30s，共40个循环；
通过实时荧光定量PCR的溶解曲线有无杂峰来判断引物有无非特异性扩增，通过不同稀释梯度对应Ct值之间距离来判断线性关系，筛选出适于实时荧光定量PCR引物；
步骤3：标准曲线的绘制
标准品构建：将步骤2筛选出的适于实时荧光定量PCR引物对基因组DNA混合物进行PCR扩增，然后将目的条带切胶回收，进行TA克隆、测序，获得质粒标准品；
标准品曲线的绘制：测定质粒标准品的浓度和纯度，然后取1μL质粒标准品用ddH2O进行10倍稀释，然后将10倍稀释液按10倍梯度稀释成7个梯度后得到质粒标准品模板稀释样；
上机体系：将8μL mixture A和8μL质粒标准品模板稀释样上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-time PCR premixture，0.4μL 10uM的实时荧光定量PCR引物的上游引物，0.4μL 10uM实时荧光定量PCR引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃30s，共40个循环；
测定每个稀释梯度的循环阈值；然后以质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标、测得的Ct值为纵坐标，绘制得到标准曲线图；
质粒标准品拷贝数计算公式：质粒标准品拷贝数(copies/μL)＝(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)，其中6.02×1023为摩尔常数，ng/μL×10-9为质粒标准品浓度，DNA length为载体大小+目的片段大小，660为碱基平均分子量；
步骤4：提取待检测材料的基因组，然后与步骤2制得的不同稀释梯度的质粒标准品模板稀释样和阴性对照同时进行实时荧光定量PCR检测，
上机体系：将8μL mixture A分别与提取待检测材料的基因组、8μL质粒标准品模板稀释样和阴性对照上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-timePCR premixture，0.4μL 10uM的实时荧光定量PCR引物的上游引物，0.4μL 10uM实时荧光定量PCR引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃30s，共40个循环；
测定每个样品的Ct值，根据标准曲线，计算每个样品的基因拷贝数。
优选的实施方式为：步骤1中：PCR扩增反应的体系为：
优选的实施方式为：步骤1中：PCR扩增反应的条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸5min；35个循环。
优选的实施方式为：步骤1中：所述菌丝裂解液的制备方法包括：将木霉属菌株和非木霉属菌株的菌丝分别加入一含有裂解液的容器中，然后在混匀仪上1650r/min混匀1min。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
快速精准鉴定是有效排查、预防和控制木霉属病害的关键。对木霉属病害的精准鉴定，一般都是在获得纯合木霉属病害菌丝的基础上，从形态和分子两方面对木霉属病害进行鉴定。在整个过程中，仅获得纯合木霉菌丝这一步就得花很长时间，而且一次只能鉴定一个木霉属物种，更谈不上对量的监测，更不能检测出许多原材料中潜隐的木霉属物种的分生孢子。实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR)不仅可以用于木霉属病害鉴定，而且也可以用于定量检测，极大简化鉴定和定量检测的时间，具有重复性好、特异性强等优点。目前，尚无用实时荧光定量PCR检测双孢蘑菇培养料和覆土材料中木霉属病害的报道。
附图说明
图1为对木霉属通用引物特异性检测。
图2为对木霉属通用引物不同稀释梯度的溶解曲线。
图3为对木霉属通用引物不同稀释梯度的扩增曲线图。
图4为标准曲线。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-4。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种木霉属病害检测用引物及检测方法
本实施例使用的材料与方法。
1、供试菌株。
本实施例供试菌株10个，除2个香菇菌株直接来自上海市农业科学院食用菌研究所(表中简称上海农科院)外，其它8个双孢蘑菇病害菌株分别采自上海联中食用菌专业合作社(表中简称上海联中)和山东临沂瑞泽生物科技股份有限公司(表中简称山东瑞泽)，具体病害样本采集、菌株分离和鉴定方法参照宋晓霞等描述的方法。现10个菌株都保存在上海市农业科学院食用菌所。
表1供试菌株
2、试剂与仪器设备.
试剂：马铃薯葡萄糖琼脂粉(PDA)(美国BD公司)；Phire植物直接PCR试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；即用型PCR试剂盒3.0(北京天恩泽基因科技有限公司产品)；常规琼脂糖(西班牙Biowest)；真菌DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek)；爱思进DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50(美国Axygen)；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix Q112-02(美国Vazyme)；磁珠土壤DNA小量提取试剂盒(Omega Bio-Tek)。
仪器设备：无菌塑料平板(直径90mm)(Greiner Bio-One GmbH)；SX-500高压灭菌锅(Tomy Digital Biology)；1300L-U洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；BSP-250培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；混匀小精灵(Eppendorf)；用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific)；实时荧光定量PCR仪器TIB8600(泰普生物科学(中国)有限公司)；荧光定量PCR 96孔板(美国Axygen)。
3、检测方法
1、菌株活化
将10个菌株在PDA培养基上活化两次，在25℃暗光培养，备用。其中，转接8个双孢蘑菇病害菌株时，超净工作台不开通风，在酒精灯处操作即可。
2、从NCBI数据库中下载不同木霉属物种的ITS序列(最好是有公开发表文章的序列)，然后用MEGA v7.0软件进行多重比较，找到它们序列完全相同的区域，然后用NCBI数据库中的Primer designing tool软件设计扩增长度在80-150bp的木霉属通用引物。
3、引物特异性检测
用设计的木霉属通用引物分别扩增10个供试菌株的ITS序列以检测引物的特异性。具体为：将木霉属菌株和非木霉属菌株的菌丝分别加入一含有裂解液的容器中，然后在混匀仪上1650r/min混匀1min，得到菌丝裂解液。PCR反应体系、反应条件如下：
PCR扩增反应的体系为：
PCR扩增反应的条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸5min；35个循环。
扩增结束后，取4μL反应产物在1.2％(w/v)琼脂糖凝胶电泳上检测。如果该引物仅在木霉属菌株中扩增成功，而在非木霉属菌株中扩增不成功，该引物则具有特异性。
4、实时荧光定量PCR引物筛选
混合DNA样品：用真菌DNA提取试剂盒分别提取4个木霉属菌株(表1中1-4号菌株)的基因组DNA，然后分别取20μL混合后稀释30倍，备用。
实时荧光定量PCR模板稀释样：将设计的具有特异性的木霉属通用引物对混合DNA样品进行常规PCR扩增，PCR反应体系、反应条件及产物检测参如下：
PCR扩增反应的体系为：
PCR扩增反应的条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸5min；35个循环。
扩增结束后，取4μL反应产物在1.2％(w/v)琼脂糖凝胶电泳上检测。
然后将目的条带进行回收，取1μL回收的产物先用ddH2O进行10倍稀释，然后再将10倍稀释液按10倍梯度稀释成7个梯度后作为模板上机，每个梯度的模板做3次重复，备用。
荧光染料SYBR和引物的mixture A配制：取10μL 2×SYBR real-time PCRpremixture，0.4μL 10uM的上游引物，0.4μL 10uM下游引物制备mixture A。
上机体系：将8μL mixture A和8μL模板稀释样上实时荧光定量PCR仪器上测定。
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃30s，共40个循环。
实时荧光定量PCR筛选引物：通过溶解曲线和扩增曲线图来筛选适于实时荧光定量PCR的引物。
5、标准曲线绘制
将筛选出的适于实时荧光定量PCR的引物重新进行常规PCR扩增4个木霉属菌株的混合DNA样品，然后用将目的条带切胶回收，进行TA克隆、测序，获得质粒标准品。
常规PCR反应体系、反应条件及产物检测参如下：
PCR扩增反应的体系为：
PCR扩增反应的条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸5min；35个循环。
将特异性条带切胶回收(SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit)连接至pUCm-T载体(pUCm-T Vector Cloning Kit)，转入感受态细胞(Ultra-Competent CellPreps Kit)经蓝白斑筛选每个菌丝各挑取9个阳性克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，获得质粒标准品。
用NanoDrop 2000测定质粒标准品的浓度和纯度，然后取1μL质粒标准品用ddH2O进行10倍稀释，然后将10倍稀释液按10倍梯度稀释成7个梯度作为模板上机，每个梯度的模板做3次重复。参照实时荧光定量PCR引物筛选时的反应体系和程序扩增，测定每个稀释梯度的循环阈值(Cycle threshold，Ct)。然后以质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标、测得的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线图。
上机体系：将8μL mixture A和8μL质粒标准品模板稀释样上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-time PCR premixture，0.4μL 10uM的实时荧光定量PCR引物的上游引物，0.4μL 10uM实时荧光定量PCR引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃30s，共40个循环。
质粒标准品拷贝数计算公式：质粒标准品拷贝数(copies/μL)＝(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)，其中6.02×1023为摩尔常数，ng/μL×10-9为质粒标准品浓度，DNAlength为载体大小+目的片段大小，660为碱基(AGCT)平均分子量。
7、实时荧光定量PCR方法检测
从上海联中采集5份已发好菌的培养料和7份灭菌前及灭菌后的覆土材料，具体采集方法：先用相机拍照病害样本，然后手戴无菌手套取2～3块表面携带病害样本的覆土或2个双孢蘑菇子实体放入无菌的塑料培养皿中(直径90mm)，用封口膜封住培养皿，平放进袋内带回实验室。整个运输过程中保证培养皿呈平放状态。等样本带入实验室后，立即在实体解剖镜下观察病害样本的形态特征、拍照，并确定菌种分离的位置。
在超净工作台中进行菌种分离。由于木霉病害样本有许多孢子，所以分种时不通风，在近酒精灯处操作即可。用无菌的接种针轻轻接触一下菌种分离的位置，然后在事先做好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上划一下，封口后在25℃下暗光培养。每天观察培养皿中的菌落情况，如有细菌污染，通过不断转接挑取菌落最前沿菌丝的方式获得纯菌种；如有多种真菌，也通过挑取每个形态单一的真菌菌落最前沿菌丝的方式获得每个真菌的纯菌种。每个纯菌种各有2个培养皿。
然后用磁珠土壤DNA小量提取试剂盒提取每份培养料和覆土材料的基因组(提取前每个材料进行称重)，最终DNA洗脱体积为50μL。测定样品时，不同稀释梯度的标准品、12份材料的基因组与阴性对照同时进行实时荧光定量PCR检测，每个样品重复3次，具体实时荧光定量PCR反应体系、程序：
上机体系：将8μL mixture A分别与提取待检测材料的基因组、8μL质粒标准品模板稀释样和阴性对照上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-timePCR premixture，0.4μL 10uM的实时荧光定量PCR引物的上游引物，0.4μL 10uM实时荧光定量PCR引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃30s，共40个循环。
其中，12份材料的上机模板样为每个材料8μL稀释30倍后的基因组。阴性对照为ddH2O。
最终获得每个材料的Ct值后，首先根据标准曲线计算出每个材料基因拷贝数的对数值，然后根据以下公式即可获得原始材料的基因拷贝数：培养料或覆土材料基因拷贝数(copies/g)＝[10^基因拷贝数对数值×30(稀释倍数)/8μL(上机体积)]×50(DNA洗脱体积)/提取基因组前的重量。
用SPSS 17.0软件分析12个培养料和覆土材料的基因拷贝数显著性，多重比较方法为Tukey氏固定差距检验法。
木霉属通用引物设计及特异性检测：通过多重比较，共找到不同木霉属物种完全相同的ITS序列210bp左右(部分ITS1、完整5.8S和部分ITS2序列)，然后在该序列基础上共设计出了9对木霉属通用引物(表2)。
将9对木霉属通用引物分别扩增10个供试菌株，从PCR产物的电泳图谱(图1)可以看出，仅5个木霉属菌株有条带，其它5个非木霉属菌株都没有条带，说明这9对木霉属通用引物都有特异性。
实时荧光定量PCR引物筛选：为了进一步挖掘9对引物的不同之处，将它们分别扩增混合DNA样品，以常规PCR回收产物为模板进行不同稀释梯度的实时荧光定量PCR检测。由于通过实时荧光定量PCR的溶解曲线有无杂峰可以判断引物有无非特异性扩增，通过不同稀释梯度对应Ct值(与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小)之间距离可以判断线性关系的好坏。综合图2和图3中9对引物的溶解曲线和扩增曲线图，可以看到木霉属病害检测用引物，上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ IDNo.2所示(TG-its-3)不仅没有非特异性扩增，而且不同梯度之间的线性关系较好，可以作为进一步鉴定和检测木霉属病害的实时荧光定量PCR引物。
以TG-its-3为引物，以TG-its-3常规PCR扩增混合DNA样品的质粒产物为标准品，通过测定不同梯度浓度标准品的Ct值以构建实时荧光定量PCR的标准曲线(图4)。该标准曲线的截距为40.4、斜率为-3.86、相关系数R2为0.9971。
利用建立的实时荧光定量PCR方法对12份培养料和覆土材料的木霉菌基因拷贝数进行绝对定量检测，获得每个样品的Ct值和基因拷贝数(表3)。从表3可以看出，编号为2的未处理覆土中木霉属基因拷贝数显著高于其它材料中。
表3 12份双孢蘑菇培养料和覆土材料中木霉属的基因拷贝数
#+数字：上海金山联中食用菌专业合作社菇房号；未处理覆土：直接购买的覆土材料；已处理覆土：已用甲醛熏蒸完准备覆盖到已发好菌的培养料表层的；数据为平均数±标准误；小写字母表示0.05显著水平。
实时荧光定量PCR定量结果的准确性在很大程度上依赖于标准品的准确性，而标准品可以是纯化的PCR产物、纯化的质粒DNA、体外转录的RNA等。因质粒DNA在低温条件下可长期稳定保存，能与目的基因保持较高的同源性等优点，目前多数标准品为纯合的质粒DNA。在筛选9对木霉属通用引物时，由于没有涉及到绘制标准曲线，所以用的实时荧光定量PCR模板为9对引物分别扩增混合DNA样品的常规PCR回收产物，而在筛选出通用引物TG-its-3之后，为了绘制稳定的标准曲线，这时的荧光定量PCR模板改为了该引物扩增混合DNA样品的常规PCR回收产物的质粒DNA。
目前，木霉属物种鉴定主要基于形态和分子序列。对于潜隐在培养料和覆土材料中的木霉属物种来说，传统方法都是首先将培养料和覆土材料进行培养，然后通过分离纯化菌株，再通过形态和分子鉴定才能最终确定哪些是木霉。本文在用实时荧光定量PCR检测12份培养料和覆土材料中的木霉属病害基因拷贝数的同时，也参照章家恩的描述的土壤微生物的稀释平板培养技术鉴定了每份材料中的木霉属病害的有无。结果发好菌的培养料多为细菌污染，而覆土中存在多种真菌和放线菌，其中未处理的覆土材料中出现的真菌和放线菌菌落最多。其中，在编号为2的未处理覆土材料中检测到了3个木霉菌落，编号为3的已处理覆土材料和编号为7的已处理覆土材料中都检测到了1个木霉属菌落，其它材料中都没有。这个结果与表3中每个材料中的木霉属基因拷贝数略有不同。
两种方法产生差异的最大原因就是取样点的问题，因为无论是培养料、覆土材料培养或提取DNA，使用的数量都不会很多。所以取样点木霉属病害的有无或量多少都直接影响了两个方法呈现的不同结果。另外，由于培养条件和时间限制，并不是所有的木霉属物种都能在短时间内被培养出来，所以这也大大限制了形态学统计木霉属物种的结果。因此，与传统的形态学统计方法相比，实时荧光定量PCR方法具有很高的灵敏性和特异性，其结果是比较可信的。下一步只要确定好什么样的取样点、取样量材料代表整个培养料和覆土材料的结果，实时荧光定量PCR检测到的木霉属基因拷贝数达到什么值才能在出菇阶段爆发出来等等具体应用问题，就能该方法广泛推广于双孢蘑菇生长实践中。
实施例2：一种木霉属病害检测用引物及检测方法
一种木霉属病害检测用引物，上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种木霉属病害检测方法，包括下列步骤：
步骤1：引物特异性检测
将木霉属菌株和非木霉属菌株的菌丝分别制成菌丝裂解液，然后分别以设计的木霉属通用引物进行PCR扩增，如果该引物仅在木霉属菌株中扩增成功，而在非木霉属菌株中扩增不成功，该引物则具有特异性；
步骤2：实时荧光定量PCR引物筛选
用真菌DNA提取试剂盒分别提取多个木霉属菌株的基因组DNA，然后分别取木霉属菌株的基因组DNA各20μL后混合，稀释30倍后得到基因组DNA混合物；
以步骤1确定的具有特异性的引物对基因组DNA混合物进行PCR扩增，然后将目的条带切胶回收，取1μL回收的产物先用ddH2O进行10倍稀释，然后再将10倍稀释液按10倍梯度稀释成7个梯度后得到模板稀释样；
上机体系：将8μL mixture A和8μL模板稀释样上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-time PCR premixture，0.4μL 10uM的特异性的引物的上游引物，0.4μL 10uM特异性的引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃30s，共40个循环；
通过实时荧光定量PCR的溶解曲线有无杂峰来判断引物有无非特异性扩增，通过不同稀释梯度对应Ct值之间距离来判断线性关系，筛选出适于实时荧光定量PCR引物；
步骤3：标准曲线的绘制
标准品构建：将步骤2筛选出的适于实时荧光定量PCR引物对基因组DNA混合物进行PCR扩增，然后将目的条带切胶回收，进行TA克隆、测序，获得质粒标准品；
标准品曲线的绘制：测定质粒标准品的浓度和纯度，然后取1μL质粒标准品用ddH2O进行10倍稀释，然后将10倍稀释液按10倍梯度稀释成7个梯度后得到质粒标准品模板稀释样；
上机体系：将8μL mixture A和8μL质粒标准品模板稀释样上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-time PCR premixture，0.4μL 10uM的实时荧光定量PCR引物的上游引物，0.4μL 10uM实时荧光定量PCR引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃30s，共40个循环；
测定每个稀释梯度的循环阈值；然后以质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标、测得的Ct值为纵坐标，绘制得到标准曲线图；
质粒标准品拷贝数计算公式：质粒标准品拷贝数(copies/μL)＝(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)，其中6.02×1023为摩尔常数，ng/μL×10-9为质粒标准品浓度，DNA length为载体大小+目的片段大小，660为碱基平均分子量；
步骤4：提取待检测材料的基因组，然后与步骤2制得的不同稀释梯度的质粒标准品模板稀释样和阴性对照同时进行实时荧光定量PCR检测，
上机体系：将8μL mixture A分别与提取待检测材料的基因组、8μL质粒标准品模板稀释样和阴性对照上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-timePCR premixture，0.4μL 10uM的实时荧光定量PCR引物的上游引物，0.4μL 10uM实时荧光定量PCR引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃变性15s，60℃退火30s，共40个循环；
测定每个样品的Ct值，根据标准曲线，计算每个样品的基因拷贝数。
优选的实施方式为：步骤1中：PCR扩增反应的体系为：
优选的实施方式为：步骤1中：PCR扩增反应的条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸5min；35个循环。
优选的实施方式为：步骤1中：所述菌丝裂解液的制备方法包括：将木霉属菌株和非木霉属菌株的菌丝分别加入一含有裂解液的容器中，然后在混匀仪上1650r/min混匀1min。
参考文献
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上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120>一种木霉属病害检测用引物及检测方法
<130> 20190829
<160> 18
<210> 1
<211> 20 <212> DNA
<223> 上游引物
<400> 1
ACGGATCTCT TGGTTCTGGC 20
<210> 2
<211> 295
<212> DNA
<223> 下游引物
<400> 2
GGTTGAAAT GACGCTCGGAC 20
<210> 3
<211> 20 <212> DNA
<223> 上游引物
<400> 3
TGAAGAACGC AGCGAAATGC 20
<210> 4
<211> 295
<212> DNA
<223> 下游引物
<400> 4
TCGAGGGTTG AAATGACGCT 20
<210> 5
<211> 20 <212> DNA
<223> 上游引物
<400> 5
ATCGATGAAG AACGCAGCGA 20
<210> 6
<211> 295
<212> DNA
<223> 下游引物
<400> 6
TGAAATGACG CTCGGACAGG 20
<210> 7
<211> 20 <212> DNA
<223> 上游引物
<400> 7
CGCAGCGAAA TGCGATAAGT 20
<210> 8
<211> 295
<212> DNA
<223> 下游引物
<400> 8
GGGTTGAAAT GACGCTCGGA 20
<210> 9
<211> 20 <212> DNA
<223> 上游引物
<400> 9
ACGCAGCGAA ATGCGATAAG 20
<210> 10
<211> 295
<212> DNA
<223> 下游引物
<400> 10
AGGGTTGAAA TGACGCTCGG 20
<210> 11
<211> 20 <212> DNA
<223> 上游引物
<400> 11
GGCATCGATG AAGAACGCAG 20
<210> 12
<211> 295
<212> DNA
<223> 下游引物
<400> 12
GAGGGTTGAA ATGACGCTCG 20
<210> 13
<211> 20 <212> DNA
<223> 上游引物
<400> 13
GCATCGATGA AGAACGCAGC 20
<210> 14
<211> 295
<212> DNA
<223> 下游引物
<400> 14
GAGGGGTTCG AGGGTTGAAAT 20
<210> 15
<211> 20 <212> DNA
<223> 上游引物
<400> 15
TGGCATCGAT GAAGAACGCA 20
<210> 16
<211> 295
<212> DNA
<223> 下游引物
<400> 16
GTTGAAATGA CGCTCGGACAG 20
<210> 17
<211> 20 <212> DNA
<223> 上游引物
<400> 17
CGATGAAGAA CGCAGCGAAA 20
<210> 18
<211> 295
<212> DNA
<223> 下游引物
<400> 18
GTTCGAGGGT TGAAATGACGC 20

Claims (5)

1.一种木霉属病害检测用引物，其特征在于：上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种木霉属病害检测方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：引物特异性检测
将木霉属菌株和非木霉属菌株的菌丝分别制成菌丝裂解液，然后分别以设计的木霉属通用引物进行PCR扩增，如果该引物仅在木霉属菌株中扩增成功，而在非木霉属菌株中扩增不成功，该引物则具有特异性；
步骤2：实时荧光定量PCR引物筛选
用真菌DNA提取试剂盒分别提取多个木霉属菌株的基因组DNA，然后分别取木霉属菌株的基因组DNA各20μL后混合，稀释30倍后得到基因组DNA混合物；
以步骤1确定的具有特异性的引物对基因组DNA混合物进行PCR扩增，然后将目的条带切胶回收，取1μL回收的产物先用ddH2O进行10倍稀释，然后再将10倍稀释液按10倍梯度稀释成7个梯度后得到模板稀释样；
上机体系：将8μL mixture A和8μL模板稀释样上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-time PCR premixture，0.4μL 10uM的特异性的引物的上游引物，0.4μL 10uM特异性的引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃ 15s，60℃ 30s，共40个循环；
通过实时荧光定量PCR的溶解曲线有无杂峰来判断引物有无非特异性扩增，通过不同稀释梯度对应Ct值之间距离来判断线性关系，筛选出适于实时荧光定量PCR引物；
步骤3：标准曲线的绘制
标准品构建：将步骤2筛选出的适于实时荧光定量PCR引物对基因组DNA混合物进行PCR扩增，然后将目的条带切胶回收，进行TA克隆、测序，获得质粒标准品；
标准品曲线的绘制：测定质粒标准品的浓度和纯度，然后取1μL质粒标准品用ddH2O进行10倍稀释，然后将10倍稀释液按10倍梯度稀释成7个梯度后得到质粒标准品模板稀释样；
上机体系：将8μL mixture A和8μL质粒标准品模板稀释样上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-time PCR premixture，0.4μL 10uM的实时荧光定量PCR引物的上游引物，0.4μL 10uM实时荧光定量PCR引物的下游引物，混合后制得mixtureA；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃ 15s，60℃ 30s，共40个循环；
测定每个稀释梯度的循环阈值；然后以质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标、测得的Ct值为纵坐标，绘制得到标准曲线图；
质粒标准品拷贝数计算公式：质粒标准品拷贝数(copies/μL)＝(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)，其中6.02×1023为摩尔常数，ng/μL×10-9为质粒标准品浓度，DNA length为载体大小+目的片段大小，660为碱基平均分子量；
步骤4：提取待检测材料的基因组，然后与步骤2制得的不同稀释梯度的质粒标准品模板稀释样和阴性对照同时进行实时荧光定量PCR检测，
上机体系：将8μL mixture A分别与提取待检测材料的基因组、8μL质粒标准品模板稀释样和阴性对照上实时荧光定量PCR仪器进行测定；其中，取10μL 2×SYBR real-time PCRpremixture，0.4μL 10uM的实时荧光定量PCR引物的上游引物，0.4μL 10uM实时荧光定量PCR引物的下游引物，混合后制得mixture A；
实时荧光定量PCR反应采用两步法程序：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃30s，共40个循环；
测定每个样品的Ct值，根据标准曲线，计算每个样品的基因拷贝数。
3.根据权利要求2所述的木霉属病害检测方法，其特征在于：步骤1中：PCR扩增反应的体系为：
4.根据权利要求2所述的木霉属病害检测方法，其特征在于：步骤1中：PCR扩增反应的条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸5min；35个循环。
5.根据权利要求2所述的木霉属病害检测方法，其特征在于：步骤1中：所述菌丝裂解液的制备方法包括：将木霉属菌株和非木霉属菌株的菌丝分别加入一含有裂解液的容器中，然后在混匀仪上1650r/min混匀1min。
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