CN110484495A - 一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法 - Google Patents

一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，属于人体组织工程技术领域。其从老年关节软骨中获取大量且具有代谢活性的细胞，应用于临床自体软骨细胞移植修复软骨组织缺损和软骨退行性病变的分子病理与生物治疗基础研究。本发明所阐述的软骨细胞分离方法，结合机械切割与酶解软骨组织，在高温高压灭菌的组织分解瓶（Spinner flask）和细胞培养箱中，使软骨碎片与可降解软骨细胞外基质蛋白特异蛋白酶充分接触，达到完全溶解基质最大程度释放软骨细胞的目的。本发明相较于现有的人负重滑膜关节软骨细胞分离方法，软骨细胞的产量更高，活软骨细胞的比例更大，污染几率更低。

Description

一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种人体细胞原代培养技术，具体涉及一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，属于人体组织工程技术领域。
背景技术
人体骨骼的负重关节，如髋、膝、踝关节，是由关节囊包裹关节面、关节腔形成的、可在一定范围内进行伸、屈、旋转活动的滑膜关节。覆盖于该类型关节面表面的软骨组织，因含有丰富的二型胶原蛋白纤维（Type II collagen fibers）和能够吸附大量水分子的蛋白聚糖（Proteoglycans），具有很好的缓解、吸收机械压力的作用。然而，软骨组织因不含血管，细胞所需营养来自关节腔中的滑液，依靠关节运动所产生的挤压力摄取营养物质，所以一旦关节损伤发生，运动受限，软骨细胞摄取营养障碍，受损软骨组织则很难自愈。更加严重的是，因受损软骨组织中的细胞代谢发生异常，导致组织呈不可逆降解直至完全消失，形成晚期骨关节炎所表现出的关节疼痛、僵硬、乃至关节功能完全丧失。
不同于人体中以细胞为主体的组织类型，软骨组织中的细胞外基质为主要成分，而软骨细胞（Chondrocytes）作为组织中唯一的细胞类型，在成熟软骨组织内，每个软骨细胞嵌入由自身制造分泌的、主要由胶原纤维与蛋白聚糖形成的软骨小窝（Lacuna）内，分散分布于整个软骨组织。针对于骨关节炎发病机制的研究和使用自体细胞进行软骨缺损修补的自体软骨细胞移植手术（Autologous chondrocyte implant surgery），均需要从软骨组织中分离出软骨细胞，并进行体外培养。由于软骨组织的这种细胞外基质为主体、细胞个体分散分布的组织学特征，如何最大限度地将软骨细胞从丰富得细胞外基质中释放出来，同时保持细胞的整性和代谢活性，是亟需解决的一个难题。
根据文献报道，目前使用的滑膜关节软骨细胞分离方法主要为两种：1）胰蛋白酶、二型胶原蛋白酶顺序酶解法；2）二型胶原蛋白酶酶解法。胰蛋白酶是一种中性丝氨酸蛋白酶，可水解肽链中精氨酸（Arg）或赖氨酸（Lys）羧基端的肽键，但是对于软骨细胞细胞外基质中大量的蛋白聚糖的核心蛋白和二型胶原蛋白肽链的水解作用较弱，而二型胶原蛋白酶虽然含较高的溶组织梭菌蛋白酶B和胰蛋白酶活性，但因两种酶对底物的要求接近，故仍不可达到最大程度破坏二型胶原蛋白三螺旋结构肽链的目的，不能够最大程度地释放被胶原纤维和蛋白聚糖所包裹得软骨细胞。而且，根据文献所报道的数据与我们的实验数据的对比结果，这两种酶解软骨的方法亦存在所分离出的软骨细胞活性较低的缺陷。
发明内容
本发明的目的是针对目前滑膜关节软骨细胞分离培养方法存在细胞产量低、活性低的问题，提供一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，能够有效促进分离出的软骨细胞在培养器皿中以单层贴壁生长的方式进行体外增殖。
本发明的技术方案，一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，步骤如下：
（1）取样：取软骨标本，全程无菌冷藏；对软骨标本进行切割，得到直径小于0.5cm组织片；
（2）第一步降解：将步骤（1）所得软骨组织片在无菌飞旋瓶内，使用重量/体积比为0.4%的Pronase E进行细胞外基质蛋白质的第一步降解，反应在细胞培养箱内进行90分钟；反应条件为：37℃，5% CO2，100%湿度；
（3）第二步降解：将步骤（2）所得降解后软骨组织片采用0.02% collagenase IA进行细胞外基质蛋白质的第二步降解，反应在细胞培养箱内反应16-20小时；反应条件为：37℃，5%CO2，100%湿度；
（4）后处理：将步骤（3）所得降解液，即软骨细胞悬液，使用细胞筛过滤除去未消化组织或细胞团，随后室温800-1000 rpm低速离心8-10分钟后，得到软骨细胞；进行细胞计数及活细胞比率计算；
（5）接种：将步骤（4）分离出得软骨细胞接种于DMEM/F12细胞培养液进行原代培养，接种密度为2 – 4*105 cells/cm2。
步骤（2）所述Pronase E为使用无菌DMEM/F12配制的Pronase E ，即Protease XIVfrom Streptomyces griseus酶溶液。
步骤（3）所述Collagenase IA为使用无菌DMEM/F12配制的Collagenase IA fromClostridium histolyticum溶液。
步骤（2）和步骤（3）降解时，转速为均为70-90 rpm。
步骤（4）所述细胞筛的孔径为40-70 μm。
步骤（5）中DMEM/F12细胞培养液中含有10%胎牛血清、1%青连双抗。
本发明采用飞旋瓶（Spinner flask）进行软骨组织的两步酶解反应，利用飞旋瓶可以被高温高压灭菌的特点，保证了软骨组织在整个酶解过程中，始终处于无菌环境中。而且，飞旋瓶的特殊设计，可以使软骨组织片在酶溶液内，以固定转速（70 rpm）进行旋转，能到达到软骨细胞外基质蛋白与对应蛋白酶的充分接触，有利于酶解效应的最大发挥。
本发明采用二氧化碳细胞培养箱作为两步酶解反应的场所，提供了37℃、5%二氧化碳浓度、100%湿度的环境，模拟了软骨细胞在人体内的生存环境，从而最大程度保证了软骨组织在被蛋白酶溶解细胞外基质的过程中，所释放出的软骨细胞的代谢活性，为随后开展的体外培养，打下良好基础。
本发明采用Pronase E (Protease XIV from Streptomyces griseus)作为第一步酶解反应的蛋白酶。该酶是由以下四种重点破坏软骨细胞外基质中蛋白聚糖成分的蛋白酶或氨基端肽酶组成的混合物：Streptomyces griseus Protease A, Streptomycesgriseus Protease B, Streptomyces griseus Trypsin, aminopeptidase。由于该酶混合物对软骨细胞外基质中蛋白聚糖的降解，为第二步以胶原蛋白降解为目标的酶解反应提供了更适合的反应条件。
由于软骨细胞外基质中蛋白聚糖成分在第一步酶解反应中被基本移除，第二步酶解反应所使用的Collagenase IA (from Clostridium histolyticum)与其底物，二型胶原蛋白纤维，有了最大面积的接触。Collagenase IA同样为几种蛋白酶的混合物，具有以下五种酶活性：collagenase, non-specific proteases, clostripain, neutral protease,aminopeptidase。经过长达16小时的酶解过程，软骨组织中的胶原纤维可被完全降解，从而将所含软骨细胞完全从组织中释放出来。
本发明采用DMEM/F12作为分离出的软骨细胞的基本培养液，该培养液含有较高的葡萄糖浓度（4.5 g/L）、多种哺乳动物细胞，包括人体滑膜关节软骨细胞，生长所必需的氨基酸和维生素，在增添10%胎牛血清的条件下，能够有效促进分离出的软骨细胞在培养器皿中以单层贴壁生长的方式进行体外增殖。
本发明的有益效果：本发明相较于现有的人负重滑膜关节软骨细胞分离方法，软骨细胞的产量更高，活软骨细胞的比例更大，污染几率更低。
附图说明
图1是本发明用于软骨细胞分离培养的老年滑膜关节软骨组织来源。
图2是本发明软骨细胞产量示意图。
图3是本发明软骨细胞的活细胞比率示意图。
图4是本发明体外单层细胞培养的光镜下生长状态示意图。
具体实施方式
申请人使用18例股骨头或胫骨平台软骨组织（17例来自股骨颈骨折接受全髋关节置换手术的患者，1例来自晚期骨关节炎接受全膝关节置换手术的患者。所有患者年龄均为65岁之上。
下面以一个从髋关节置换术产生的股骨头标本为例，对本发明的具体实施方式做进一步说明。
在手术室内，将取下的股骨头置入盛有无菌生理盐水的无菌采样袋中，封闭好后，在冰盒中于术后四小时内，从手术室运送至细胞培养室。在有无菌风吹送的生物安全柜内，将股骨头内从无菌采样袋转移至无菌15厘米培养皿内，并加入约10毫升DMEM/F12。
具体来源如图1所示，A为股骨头组织，来源于接受全髋关节置换的股骨颈骨折患者；B为股骨头组织，来源于接受全髋关节置换的股骨头坏死患者；C为胫骨平台和股骨髁组织，来源于接受全膝关节置换的膝骨关节炎患者；D为股骨头组织，来源于接受全髋关节置换的髋骨关节炎患者。
在有无菌风吹送的生物安全柜内，使用无菌手术刀（20# – 24#刀片）和血管钳或手术镊子，从股骨头表面切割全层软骨片，并收集至一个盛有约20毫升DMEM/F12、已知重量的50毫升无菌离心管内。将盛有所采集的软骨片的离心管称重后，计算得出所获得的软骨片的湿重（Grams），以用来计算软骨细胞产量（Yield of chondrocytes; # of chondrocytesisolated from one milligram wet weight of cartilage）。
在有无菌风吹送的生物安全柜内，使用两把无菌手术刀（20# – 24#刀片），将所采集的软骨片切割成直径小于0.5厘米的组织片后，转移入盛有“Wet weight of cartilage(grams) X 12 mL/mg wet weight of cartilage”体积数的DMEM/F12、含0.4% Pronase E（W/V）、高温高压灭菌后的飞旋瓶内，将飞旋瓶置于二氧化碳细胞培养箱（37℃、5%二氧化碳浓度、100%湿度）内的磁力搅拌仪上，调整转速至70 rpm。
90分钟后，将飞旋瓶从细胞培养箱内取出后，置于有无菌风吹送的生物安全柜内，移除Pronase E酶溶液后，使用等体积DMEM/F12冲洗软骨组织两遍后，加入等体积、含0.02%Collagenase IA的DMEM/F12，将飞旋瓶重新置于二氧化碳细胞培养箱（37℃、5%二氧化碳浓度、100%湿度）内的磁力搅拌仪上，调整转速至70 rpm。
16小时后，将飞旋瓶从细胞培养箱内取出后，置于有无菌风吹送的生物安全柜内，将细胞悬液经孔径为70微米的细胞筛（Cell strainer）过滤后，室温离心（1000 rpm X 10mins）沉淀细胞。
移除含Collagenase IA的上清，根据所采集软骨的重量，准确加入1 – 5毫升完全培养液（DMEM/F12/10% FBS/1% Pen-Strep），重悬细胞后，使用台盼蓝染色并计数，计算出细胞总数、产量（Cell yield）及活细胞比例（Cell viability）。
使用 Pronase E 和 Collagenase IA 法所得软骨细胞产量（Cell yield, # ofchondrocytes per mg wet cartilage）统计学上显著高于使用Collagenase II 法或Pronase E 和 Collagenase II 法所得得软骨细胞产量如图2所示。使用 Pronase E 和Collagenase IA 法所得软骨细胞的活细胞比率（Chondrocyte viability）如图3所示，虚线代表平均活软骨细胞比率。
根据细胞计数结果，以2 – 4*105 cells/cm2密度，对所得细胞进行接种培养。根据细胞贴壁情况，通常每两天更换一次细胞培养液，直至细胞Confluence达90%，进行实验、传代或冻存操作。
体外单层细胞培养的光镜下生长状态如图4所示。其中4-A为分离出的P0代软骨细胞在接种后第二天的光镜下生长状态，标尺长度代表200微米；B为图4-A中黑框内细胞在高倍镜下的影像，标尺长度代表50微米；C为分离出的P0代软骨细胞在接种后第十天的光镜下生长状态，标尺长度代表200微米；D为P1代软骨细胞在传代后第一天的光镜下生长状态，标尺长度代表200微米。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的基本构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是步骤如下：
（1）取样：取软骨标本，全程无菌冷藏；对软骨标本进行切割，得到直径小于0.5cm组织片；
（2）第一步降解：将步骤（1）所得软骨组织片在无菌飞旋瓶内，使用重量/体积比为0.4%的Pronase E进行细胞外基质蛋白质的第一步降解，反应在细胞培养箱内进行90分钟；反应条件为：37℃，5% CO2，100%湿度；
（3）第二步降解：将步骤（2）所得降解后软骨组织片采用0.02% collagenase IA进行细胞外基质蛋白质的第二步降解，反应在细胞培养箱内反应16-20小时；反应条件为：37℃，5%CO2，100%湿度；
（4）后处理：将步骤（3）所得降解液，即软骨细胞悬液，使用细胞筛过滤除去未消化组织或细胞团，随后室温800-1000 rpm低速离心8-10分钟后，得到软骨细胞；进行细胞计数及活细胞比率计算；
（5）接种：将步骤（4）分离出得软骨细胞接种于DMEM/F12细胞培养液进行原代培养，接种密度为2 – 4*105 cells/cm2。
2.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（2）所述Pronase E为使用无菌DMEM/F12配制的Pronase E ，即Protease XIV fromStreptomyces griseus酶溶液。
3.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（3）所述Collagenase IA为使用无菌DMEM/F12配制的Collagenase IA from Clostridiumhistolyticum溶液。
4.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（2）和步骤（3）降解时，转速为均为70-90 rpm。
5.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（4）所述细胞筛的孔径为40-70 μm。
6.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（5）中DMEM/F12细胞培养液中含有10%胎牛血清、1%青连双抗。
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