CN110484482A - 一种猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR - Google Patents

一种猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR，该突变株SH1510ΔGalR已于2019年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M2019477。所述的突变株SH1510ΔGalR是将猪链球菌4型强毒株SH1510基因组中转录调控因子GalR基因敲除后并被氯霉素抗性基因取代获得。通过构建含有同源重组片段的基因敲除质粒pSET4s::GalR，将基因敲除质粒pSET4s::GalR电转化进猪链球菌血清4型SH1510内得到。本发明突变株为进一步研究猪链球菌4型GalR蛋白功能及其致病机制奠定了基础。

Description

一种猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种猪链球菌4型GalR 基因敲除突变株SH1510ΔGalR。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的猪病原菌，可导致猪关节炎、败血症、心内膜炎、脑膜炎、肺炎等病症，也可导致畜牧与兽医相关从业人员的发病及死亡。根据细菌荚膜抗原，猪链球菌可分为 33个血清型(1-31型，33型和1/2型)，其中，猪链球菌2型被公认为是致病性最强血清型。另外，在亚洲国家也经常出现3，4，5，7， 8，1/2血清型；加拿大经常分离出3，4，8，22，1/2血清型。猪链球菌4型(Streptococcus suis type 4，SS4)也是一种致病血清型，可导致人和动物发病甚至死亡。1968-1984年，荷兰分离出30株引起人脑膜炎的猪链球菌菌株，其中1株为SS4。2009-2012年，泰国在患有猪链球菌病的人群中分离出了668株猪链球菌，血清型比例SS4为 0.15％。2001年，Han D U于韩国不同生猪屠宰场406份扁桃体中分离出55株猪链球菌，SS4占5.5％。Prufer T L将1996-2016年间从德国分离的711株猪链球菌进行血清学分型，结果1996-2004年间的189 株分离株中出现19个猪链球菌血清型，其中SS4占10％；2015-2016 年间的522株分离株中出现23个猪链球菌血清型，SS4占10.3％；并将研究结果与猪链球菌的临床背景联系起来，SS4经常分离自具有呼吸道疾病和中枢神经系统疾病的患病猪，证明SS4可引起肺病和脑膜炎；将结果与毒力因子结合分析，SS4分离菌株高频率携带毒力因子mrp和sly。ChaturvediVK等用4周龄仔猪为动物模型评价SS4的毒力，结果导致仔猪死亡。近几年来，在中国健康猪场和发病猪场均经常分离到SS4，且分离率逐渐上升，王娟对2011-2014年间在广东省不同地区发病猪厂分离的58株猪链球菌进行血清学分型，SS4血清型比例为3.45％。周明瑶在苏南地区某健康猪场80份鼻拭子中检测到猪链球菌4型竟高达46.25％，这证明猪链球菌4型在我国某些地区已成为优势血清型，严重威胁猪群健康。
当前，国内外对猪链球菌的研究主要集中在猪链球菌2型上，对 SS4的研究较少，范围仅限于血清型分型PCR鉴定，对SS4毒力因子的研究还没有报道。申请人前期通过比较蛋白组学分析猪链球菌4 型强弱毒株的菌体蛋白表达谱，筛选到了16个差异表达蛋白，其中包括转录调控因子GalR。GalR是参与半乳糖转运和代谢的调控蛋白。在大肠杆菌中，GalR可调控D-半乳糖代谢途径相关基因galETKM， galP，galS，和mglBAC的转录。GalR蛋白是SS4强弱毒株中显著差异表达蛋白之一，推测其可能与SS4的致病性相关。因此，本申请构建了SS4强毒株SH1510的GalR基因缺失株，对其生物学特性进行比较，包括细菌的形态、生长特性、糖的利用率、在猪全血中的存活能力及对BALB/c小鼠的致病性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR，为进一步研究GalR对半乳糖代谢途径的调控及其致病机理提供一定的理论依据。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明提供了猪链球菌(Streptococcus suis)SH1510ΔGalR，是一种猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR，该突变株 SH1510ΔGalR已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2019年6月20日，保藏编号为CCTCC NO：M2019477。
本发明所述的突变株SH1510ΔGalR是将猪链球菌4型强毒株 SH1510基因组中转录调控因子GalR基因敲除后并被氯霉素抗性基因取代获得，所述的转录调控因子GalR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
在本发明的另一方面，提供了上述猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR的构建方法，构建含有同源重组片段的基因敲除质粒pSET4s::GalR，将基因敲除质粒pSET4s::GalR电转化进猪链球菌血清4型SH1510内得到。
进一步的，所述的基因敲除质粒pSET4s::GalR的构建方法，包括以下步骤：
1)以强毒株SH1510 DNA模板扩增GalR编码基因的上下游同源臂基因，以pR326质粒为模板扩增氯霉素抗性基因；
2)将扩增得到的上游同源臂基因、氯霉素抗性基因、下游同源臂基因按顺序依次连接到pSET4s载体上。
优选的，所述的上游同源臂基因的扩增引物为L1/L2，所述的下游同源臂基因的扩增引物为R1/R2，所述的氯霉素抗性基因的扩增引物为C1/C2。
所述的引物L1/L2、R1/R2和C1/C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～7所示。
在本发明的另一方面，还提供了所述的突变株SH1510ΔGalR在制备猪链球菌疫苗中的应用。为进一步研究猪链球菌4型GalR蛋白功能及其致病机制奠定了基础。
本发明的有益效果为：
本发明公开的猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR 与亲本株均呈链状排列，长度相似，形态无显著差异。在葡萄糖和蔗糖作为唯一糖原的生长条件下，亲本株和缺失株的生长情况相仿。小鼠致病性试验中，亲本株和缺失株的LD50分别为1×108CFU和1.62×108CFU，缺失株对小鼠的致病性下降了1.62倍。同时突变株 SH1510ΔGalR的构建简单高效，为进一步研究猪链球菌4型GalR蛋白功能及其致病机制奠定了基础。
附图说明
图1是本发明SH1510ΔGalR缺失株的构建示意图；
图2是本发明缺失株SH1510ΔGalR的PCR鉴定；其中，M： DNA分子质量标准；1、3、5、7、9：菌株SH1510；2、4、6、8、 10：菌株SH1510ΔGalR；1、2：引物I1/I2；3、4：引物C1/C2；5、 6：引物O1/C2；7、8：引物O2/C1；9、10：引物O1/O2；
图3是本发明缺失株SH1510ΔGalR的Western blotting鉴定；其中，M：DNA分子质量标准；1：SH1510菌株；2：SH1510ΔGalR 菌株；
图4是本发明缺失株SH1510ΔGalR革兰氏染色结果；其中，A：菌株SH1510(1000×)；B：菌株SH1510ΔGalR(1000×)；
图5是本发明缺失株SH1510ΔGalR不同糖环境下的生长曲线；其中，A：葡萄糖；B：蔗糖；C：D-半乳糖；
图6是亲本株和缺失株在不同脏器中的数量；其中，A：血液； B：脑；C：脾；
图7是亲本株和缺失株在全血中的存活能力。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1突变株SH1510ΔGalR的构建
1)引物
本试验所设计的引物序列详情见表1。L1/L2，R1/R2分别扩增 GalR编码基因的上下游同源臂基因序列；C1/C2扩增氯霉素抗性基因；I1/I2扩增GalR基因的ORF内部基因序列(用于缺失株的初步筛选)；在GalR基因上下游同源臂外部设计一对引物O1/O2，扩增包括GalR基因、上下游同源臂基因及其外部的一段基因序列的总长(用于外部检测)。
表1引物序列表
2)缺失株SH1510ΔGalR的构建
A.基因缺失质粒pSET4s::GalR的构建如图1所示，使用引物 L1/L2、R1/R2及SH1510 DNA模板扩增出GalR编码基因的上下游同源臂基因，使用引物C1/C2及pR326质粒为模板扩增氯霉素抗性基因。
B.各扩增产物使用MiniBEST DNA Fragment Purification进行纯化回收，通过限制性内切酶对纯化后的DNA片段进行酶切，然后将酶切后的各产物进行纯化。
C.利用DNA Ligation Kit，将3个片段以上游同源臂、氯霉素抗性基因、下游同源臂的顺序依次连接到pSET4s载体上。
D.通过转化进大肠杆菌DH5α进行大量克隆
本试验参照Takamatsu的方法制备SH1510感受态细胞。分别取 4μL、5μL、6μL、7μL、8μL pSET4s::GalR缺失质粒加入80μL SH1510感受态细胞轻柔混匀，将混合物转移进已预冷的电击杯当中，冰浴30min，然后进行电转化，电转参数为2.35KV/cm、200Ω和25 μF，加入900μL THY液体培养基吹打混匀，将混合物转移至3mL THY液体培养基中，28℃摇床培养至OD600为0.4左右，吸取100μL 菌液涂布于双抗THY平板(壮观霉素100μg/mL，氯霉素12.5μg/mL)， 28℃培养24h后挑单菌于5mL THY液体培养基(氯霉素12.5μg/mL) 中，菌液生长至OD600值为0.4左右，转移试管于37℃摇床继续培养 4～6h，菌液倍比稀释后涂布于单抗THY平板(氯霉素12.5μg/mL)， 37℃培养24h。
3)缺失株的筛选与PCR鉴定
挑取200个单菌进行增菌培养，吸取1mL菌液制成DNA模板，使用内部检测引物I1/I2进行缺失株初步筛选，鉴定为阴性的菌株，进一步使用引物C1/C2，O1/C2，O2/C1，O1/O2进行鉴定，并将扩增的阳性片段送上海英潍捷基生物有限公司测序，测序结果通过比对进行验证。
缺失株SH1510ΔGalR的PCR鉴定结果见图2，使用内部检测引物I1/I2做PCR，亲本株扩增出723bp的片段，缺失株为阴性；使用氯霉素抗性基因检测引物C1/C2做PCR，亲本株为阴性，缺失株扩增出1056bp的片段；使用O1/C2和O2/C1进行交叉PCR检测，引物O1/C2检测亲本株为阴性，缺失株扩增出2121bp的片段，引物 O2/C1检测亲本株同为阴性，缺失株扩增出2094bp的片段；使用外部检测引物O1/O2做PCR，亲本株扩增出2826bp的片段，缺失株扩增出3147bp的片段。以上结果表明缺失株SH1510ΔGalR构建成功。
4)缺失株的Western blotting鉴定
将亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR按2％比例接种进 3mLTHB液体培养基，过夜培养后，8000r/min离心10min，弃上清，菌体沉淀使用100μLPBS重悬，加入25μL蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，进行SDS-PAGE。半干转印法转移蛋白至PVDF膜，5％脱脂乳进行过夜封闭，次日弃掉脱脂乳，TBST洗涤4次，粗制GalR 多抗兔血清(1:400)为一抗，室温孵育2h，TBST洗涤4次，HRP- 羊抗兔IgG(1:10000)为二抗，室温孵育1h，TBST洗涤4次，ECL 显色。
Western blotting鉴定结果可见图3，亲本株SH1510可与粗制 GalR多抗兔血清发生特异性结合，在37kDa处出现单一条带。缺失株SH1510ΔGalR不能发生反应，没有条带出现，结果表明缺失株 SH1510ΔGalR构建成功。
实施例2革兰氏染色
将冻存的亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR平板划线进行复苏，挑取亲本株和缺失株的单菌落分别接种于THB肉汤中，200 r/min，37℃振荡培养至对数生长期，将亲本株SH1510和缺失株 SH1510ΔGalR进行涂片、革兰氏染色和镜检，在油镜镜头下观察并比较两株菌的形态。
在图4中可以看出两株菌均呈圆形或卵圆形，链状排列，长度相似，无明显差异。
实施例3不同糖利用率的比较
参照唐玉龙的方法配制基础培养基，试验配制六瓶基础培养基，两瓶为一组，分别加入10mmol/L葡萄糖、蔗糖和D-半乳糖。复苏细菌，挑取亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR的单菌落分别接种于THB肉汤中，200r/min，37℃振荡培养至OD600＝0.7，12000r/min离心10min，弃上清，用灭菌生理盐水洗涤菌体2次，等体积重悬细菌。将亲本株和缺失株的菌液按1％的比例加入3组培养基中，每隔 1h，测定OD600值，直到细菌OD600值到达稳定方可停止，试验重复 3次，计算每小时OD600平均值以绘制生长曲线。
结果见图5，在葡萄糖和蔗糖作为唯一糖原的情况下，亲本株和缺失株的生长情况相仿；在D-半乳糖作为唯一糖原的情况下，缺失株的生长速率和OD600值明显低于亲本株；同时，从最高OD600值可以看出，猪链球菌SH1510对糖的利用率为葡萄糖＞蔗糖＞D-半乳糖。
实施例4小鼠致病性试验
细菌经复苏后，挑取亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR的单菌落分别接种于THB肉汤中，200r/min，37℃振荡培养至对数生长期，12000r/min离心10min，弃上清，用灭菌生理盐水洗涤菌体 2次，调整菌液浓度为2.5×109CFU/mL、5×108CFU/mL、1×108 CFU/mL、2×107CFU/mL。将BALB/c小鼠随机分成8组，每组10 只，每只小鼠腹腔注射1mL菌液；另设对照组10只，每只腹腔注射 1mL无菌生理盐水。注射后每天观察并记录小鼠的临床表现和死亡情况，连续观察7d。用Reed-Muench法计算出菌株对BALB/c小鼠的LD50。
攻毒过后，BALB/c小鼠表现嗜睡，不食或少食，脓眼等临床症状并发生死亡，对照组小鼠无异常表现。两菌株对BALB/c小鼠的致死率和半数致死量LD50见表2。结果可知，缺失株SH1510ΔGalR的 LD50(1.62×108CFU)是亲本株SH1510LD50(1×108CFU)的1.62 倍，缺失株SH1510ΔGalR比亲本株SH1510的BALB/c小鼠致病力下降1.62倍，可见转录调控因子GalR基因和猪链球菌SH1510的毒力有关。
表2 BALB/c小鼠致死率和半数致死量
实施例5体内竞争感染试验
将亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR的菌液浓度均调整为 2×107CFU/mL。按照1:1的比例混合两菌液。试验小鼠共5只，每只小鼠腹腔注射1mL混合菌液。攻毒24小时后，每只小鼠均取脑、脾、血放入破碎管中，加入PBS使用匀浆机将其破碎，倍比稀释后分别涂布无抗THY平板和单抗THY平板(氯霉素12.5μg/mL)，涂布的平板设置3次重复，37℃过夜培养后进行平板计数。其中，无抗平板上长的菌落数为亲本株和缺失株菌落数的总和，单抗平板上长的菌落数为缺失株菌落数，亲本株的菌落数等于无抗平板菌落数减去单抗平板菌落数。
攻毒后观察到小鼠出现嗜睡、脓眼、跛行等发病症状，采集小鼠脑、脾、血液进行处理，处理后分别在无抗THY平板和单抗THY平板(氯霉素12.5μg/mL)上进行细菌计数，试验结果如图6所示，在BALB/c小鼠脑、脾和血液当中，亲本株的菌落数均远高于缺失株菌落数，差异极显著(P<0.01)。体内竞争感染试验结果表明GalR基因缺失后，细菌在体内的定植能力显著减弱。
实施例6全血存活试验
采集健康猪血，经酶联免疫试验检测血清中SS4抗体为阴性。培养亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR菌液，OD600至0.6～0.8之间，12000r/min离心10min，弃上清，用灭菌生理盐水洗涤菌体2 次，调整菌液OD600至0.1。取1mL全血、300μL SS4抗血清、100μL 菌液进行混匀，37℃温箱孵育2h。分别在0h、2h取孵育混合物，倍比稀释涂布THY平板，过夜培养后进行细菌平板计数。设定0h孵育混合物的细菌平板计数结果为100％标准，计算2h细菌全血中存活百分比。
全血存活试验结果见图7，2h后，亲本株SH1510的存活率为 35.2％，缺失株SH1510ΔGalR的存活率为27.3％，缺失株 SH1510ΔGalR比亲本株SH1510在全血中的存活率下降显著(P<0.01)。全血存活试验结果表明GalR基因缺失后，细菌在全血中的存活能力显著下降。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 转录调控因子(GalR)
<400> 1
atggttacaa tcaaagacat agcaaaacaa gcccaccttt cctctgccac cgtttcccgc 60
gttctcaagg gagacctgac cctatccgtc agccaagaaa cccgcgaccg cattttcaac 120
ttggcacagg acctgggcta caccaaacac ctcaaaaaac aagctcctca acaaaaaggc 180
accatcggca ttgtccaatg gtatacggag agtgaagagc tggctgacct ctactactac 240
tctatccgag ctagcatcga gcaaaccgcc agcctcttgg gctaccaaat cgtccgctcc 300
ttcaacgact tgaccaatcc cctcctccaa ggattggacg gcatcatcgc agttggcaaa 360
ttttcttctg ggcaaatagc agagctgacc aacttgtctt ccaagctaat ctttgtggat 420
tctgatacac tgaccgaggg attctcctgc gtcacgactg actttgaaca ctctgttcag 480
acagttattg accacttcca ttcgcaaggt ttgacagaca ttggcctatt ggttggacag 540
gaagaaacca cagacggcca ccaactgcca acagatcccc gcctgactgc ctttcggacc 600
tatctaggct ccttgggtat tctccaagaa gactacatat accaaggaaa attctccacc 660
cagtcgggtt atgagctgat gagtcaggct attgcagacc taggcgacca gctacccact 720
gcctttttca tggctaatga taccctggct gtcggcgccc ttcgagcact tcaagagcgt 780
caaatcgcag tgccagaaag agttcaactc atcaccttta acgatacagc catcacgcgc 840
caggtctacc cagccctgtc ttctataagt gtcttcaccg aggaaatggg gcaagaagcc 900
atgcagctgc tagaccgtgt gattgctagt ccgcagcccc accatccccg taagattaaa 960
ctaggtaccc agctagttat acgggagagt tcttactaa 999
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagcttccat acaactcttc tgcg 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgaccagc tcttcactct ccgt 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatcccagc tagttatacg ggag 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagctcggcg agtaactact tcac 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcgaccacc gaactagagc ttgatg 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggatcctaat tcgatgggtt ccgagg 26
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttcaacttgg cacaggac 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgtgatggct gtatcgtt 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttttcacat tccgcacg 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttttgaagg aaatgccca 19

Claims (6)

1.一种猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR，其特征在于，所述的该突变株SH1510ΔGalR已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期：2019年6月20日，保藏编号为CCTCC NO：M2019477。
2.根据权利要求1所述的一种猪链球菌4型GalR基因敲除突变株SH1510ΔGalR，其特征在于，所述的突变株SH1510ΔGalR是将猪链球菌4型强毒株SH1510基因组中转录调控因子GalR基因敲除后并被氯霉素抗性基因取代获得。
3.权利要求1所述的突变株SH1510ΔGalR的构建方法，其特征在于，构建含有同源重组片段的基因敲除质粒pSET4s::GalR，将基因敲除质粒pSET4s::GalR电转化进猪链球菌血清4型SH1510内得到。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的基因敲除质粒pSET4s::GalR的构建方法，包括以下步骤：
1)以强毒株SH1510 DNA模板扩增GalR编码基因的上下游同源臂基因，以pR326质粒为模板扩增氯霉素抗性基因；
2)将扩增得到的上游同源臂基因、氯霉素抗性基因、下游同源臂基因按顺序依次连接到pSET4s载体上。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的上游同源臂基因的扩增引物为L1/L2，所述的下游同源臂基因的扩增引物为R1/R2，所述的氯霉素抗性基因的扩增引物为C1/C2；
所述的引物L1/L2、R1/R2和C1/C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～7所示。
6.权利要求1所述的突变株SH1510ΔGalR在制备猪链球菌疫苗中的应用。
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CHAPUY-REGAUD,S 等: "RegR，a global LacⅠ/GalR family regulator,modulates virulence and competence in Streptococcus pneumonia", 《INFECTION AND IMMUNITY》 *
孙珂 等: "猪链球菌4型分离株生物学特性研究", 《中国畜牧兽医》 *

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