CN110478370A - 预防关节炎的鱼软骨提取物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了预防关节炎的鱼软骨提取物，该鱼骨提取物含有80‑90%的低分子量硫酸软骨素和10‑20%的胶原蛋白肽，低分子量硫酸软骨素的分子量为400‑500Da。鱼软骨提取物的制备方法，具体包括以下步骤：将鱼软骨用蒸馏水浸泡后沸腾煮，剔除鱼肉和油脂，烘干，超微粉碎得鱼软骨粉；鱼软骨粉中加入蒸馏水和复合酶，酶解，灭酶，离心，超滤后干燥得超滤粉；超滤粉中加入蒸馏水和硫酸软骨素AC酶进行酶降解，灭酶，过滤，超滤，浓缩，透析，冷冻干燥即为鱼软骨提取物。有益效果为：本发明鱼软骨提取物具有抗补体激活的作用，能保护软骨细胞不被裂解，在预防和治疗关节炎中具有更好的潜在疗效。

Description

预防关节炎的鱼软骨提取物

技术领域

本发明涉及多糖技术领域，尤其是涉及预防关节炎的鱼软骨提取物。

背景技术

我国鱼类产量居世界首位，年产量近4000万吨，在一般的水产品加工过程中，鱼软骨、废弃鱼头常作为下脚料，或加工成鱼骨粉添加于家禽饲料中，但更多的鱼软骨、鱼头被丢弃，造成环境污染和资源浪费。鱼类软骨的结构比较松散，主要成分是粘多糖、蛋白质和无机盐。粘多糖是由氨基己糖和己糖醛酸交替结合形成的酸性杂聚多糖，软骨中的主要成分为硫酸软骨素。硫酸软骨素与胶原蛋白也是鱼类软骨基质的重要组成部分。因此，利用鱼类软骨生产硫酸软骨素和胶原蛋白，一方面能实现了鱼类软骨的综合利用，减少环境污染；另一方面，可以作为提供硫酸软骨素和骨胶原蛋白的重要来源。目前，从鱼类软骨中提取硫酸软骨素和胶原蛋白已经引起研究者的重视。硫酸软骨素（CS）是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺组成的双糖单位交替连接组成，由于硫酸化的位点的不同硫酸软骨素大约可分为25种不同的双糖，常见的为CS-A、CS-C、CS-D和CS-E。硫酸软骨素是构成关节软骨的重要成分，可以上调软骨细胞中II型胶原mRNA表达水平和促进软骨的再生，已广泛用于治疗各种类型骨关节炎，并取得了显著疗效，但近年来研究发现，硫酸软骨素的相对分子量大，它的大体积往往妨碍其顺利的穿过胃和肠道黏膜，因而不能在机体内良好地发挥其多种药理功能，且其亲水集团多，脂溶性差，故体内吸收不完全，而低分子量的硫酸软骨素（LMWCS）具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特点，可以顺利穿过胃和肠道黏膜，具有更好的生物利用度和治疗II型胶原诱导的风湿性关节炎效果。近年来，低分子硫酸软骨素在防治冠心病、关节炎以及抗肿瘤等方面正日益受到广泛重视。因此，含低分子量硫酸软骨素的鱼骨提取物的开发具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有低分子量硫酸软骨素和胶原蛋白肽，具有抗补体激活的作用，能保护软骨细胞不被裂解，在预防和治疗关节炎中具有更好的潜在疗效的预防关节炎的鱼软骨提取物。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

预防关节炎的鱼软骨提取物，该鱼骨提取物含有80-90%的低分子量硫酸软骨素和10-20%的胶原蛋白肽，上述低分子量硫酸软骨素的分子量为400-500Da。上述鱼软骨提取物预防退行性骨关节炎引起的骨损伤或归因于关节老化引起的磨损，可以作为一种制备预防、治疗或改善关节炎疾病的保健食品的候选成分。

作为优选，预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

鱼软骨粉制备：将鱼软骨洗净，按料液比为1:10-15（g/mL）向鱼软骨中加入蒸馏水，然后加入鱼软骨重量0.03-0.05‰的阿卡波糖和鱼软骨重量0.2-0.3%的维生素C，浸泡1-3h后沸腾煮20-40min，捞出后剔除鱼肉和油脂，用清水冲洗，烘干，粗粉碎至20-50目，然后在超微粉碎机中超微粉碎，即得鱼软骨粉，备用，硫酸软骨素遇到较高温度不稳定，阿卡波糖和维生素C的加入可避免硫酸软骨素在脱脂和超微粉碎过程中乙酰基或者降解成不同聚合度的低聚糖，保持硫酸软骨素的活性不被破坏，减少了硫酸软骨素在超微粉碎中的损失，阿卡波糖和维生素C可在彻底除去，能够保证鱼软骨提取物的纯度，超微粉碎可使鱼软骨加工成微微纳米级的微粉，使得鱼软骨粉具有极大的比表面，在生物、化学等反应过程中，反应接触的面积大大增加了，因而可以提高反应速度，缩短提取时间；

酶解提取：按料液比为1:3-4（g/mL）向鱼软骨粉中加入蒸馏水，然后按添加量为0.8-1.2%加入复合酶，在温度为50-60℃、pH为7.0-8.0的条件下酶解6-8h，酶解结束后升高温度为至80-100℃进行灭酶处理18-22min，然后在4000-6000r/min的离心机中离心15-25min，上清液用分子量4000-6000Da的超滤膜超滤，超滤液喷雾干燥得超滤粉，备用，上述复合酶是胰蛋白酶和碱性蛋白酶的混合物，其中胰蛋白酶和碱性蛋白酶的添加比例为1:1.22-1.46，该步骤中碱性蛋白酶切断鱼软骨中粘多糖与蛋白的结合，将硫酸软骨素从蛋白上酶解下来，使硫酸软骨素与蛋白分离，实现粘多糖与胶原蛋白初步分离，胰蛋白酶能将鱼软骨中大分子的胶原蛋白酶解成小分子的胶原蛋白肽，溶于酶解液中，该酶解提取具有收率高，产品成色较好，生产时间短等优点；

酶降解：按料液比为1:30-40（g/mL）向超滤粉中加入蒸馏水，然后按添加量为8-12U/g加入硫酸软骨素AC酶，再加入超滤粉重量0.02-0.03%的齐墩果酸和超滤粉重量0.1-0.2%的D-葡萄吡喃糖醛酸，在pH为5.5-6.0、温度物30-40℃的条件下酶降解3-5h，灭酶，然后将酶解液用0.22μm滤膜过滤，滤液继续用4000-6000Da超滤膜进行超滤，超滤液浓缩，浓缩后的溶液再用500Da透析袋透析20-30h，透析液冷冻干燥即为鱼软骨提取物，酶法降解硫酸软骨素的条件相对温和，可使硫酸软骨素酶解成低分子量硫酸软骨素，而的齐墩果酸和D-葡萄吡喃糖醛酸存在可避免低分子量硫酸软骨素的非还原端形成了△4,5-不饱和糖醇酸，进而保持低分子量硫酸软骨素的抗补体活性，同时齐墩果酸和D-葡萄吡喃糖醛酸的加入能够保证酶降解体系的pH值，提高酶解效率高和鱼软骨提取物中低分子量硫酸软骨素的得率，且可改善鱼软骨提取物的口感，该步骤产生的低分子量硫酸软骨素的非还原端和硫酸软骨素的结构一致，能抑制C3b的活性从而抑制C5b-9的形成，进而发挥更好的抗补体的活性，同时通过低分子量硫酸软骨素与血清中的补体蛋白相互作用，从而发挥其抗补体激活的作用，最终保护软骨细胞不被裂解，在预防和治疗关节炎中具有更好的潜在疗效。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明鱼软骨提取物含有低分子量硫酸软骨素和胶原蛋白肽，具有抗补体激活的作用，能保护软骨细胞不被裂解，在预防和治疗关节炎中具有更好的潜在疗效；2）该鱼软骨提取物的制备方法简单可行，能在制备鱼软骨粉的过程中避免硫酸软骨素乙酰基或者降解成不同聚合度的低聚糖，保持硫酸软骨素的活性不被破坏，减少了硫酸软骨素在超微粉碎中的损失；3）本发明鱼软骨提取物的制备方法中利用酶法降解硫酸软骨素，条件相对温和，使硫酸软骨素酶解成低分子量硫酸软骨素，且产生的低分子量硫酸软骨素的非还原端和硫酸软骨素的结构一致，保证硫酸软骨素的抗补体活性。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

预防关节炎的鱼软骨提取物，该鱼骨提取物含有80-90%的低分子量硫酸软骨素和10-20%的胶原蛋白肽，上述低分子量硫酸软骨素的分子量为400-500Da。上述鱼软骨提取物预防退行性骨关节炎引起的骨损伤或归因于关节老化引起的磨损，可以作为一种制备预防、治疗或改善关节炎疾病的保健食品的候选成分。

预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

1）鱼软骨粉制备：将鱼软骨洗净，按料液比为1:15（g/mL）向鱼软骨中加入蒸馏水，然后加入鱼软骨重量0.03‰的阿卡波糖和鱼软骨重量0.3%的维生素C，浸泡1h后沸腾煮40min，捞出后剔除鱼肉和油脂，用清水冲洗，烘干，粗粉碎至20目，然后在超微粉碎机中超微粉碎，即得鱼软骨粉，备用，硫酸软骨素遇到较高温度不稳定，阿卡波糖和维生素C的加入可避免硫酸软骨素在脱脂和超微粉碎过程中乙酰基或者降解成不同聚合度的低聚糖，保持硫酸软骨素的活性不被破坏，减少了硫酸软骨素在超微粉碎中的损失，阿卡波糖和维生素C可在彻底除去，能够保证鱼软骨提取物的纯度，超微粉碎可使鱼软骨加工成微微纳米级的微粉，使得鱼软骨粉具有极大的比表面，在生物、化学等反应过程中，反应接触的面积大大增加了，因而可以提高反应速度，缩短提取时间；

2）酶解提取：按料液比为1:4（g/mL）向鱼软骨粉中加入蒸馏水，然后按添加量为0.8%加入复合酶，在温度为60℃、pH为7.0的条件下酶解8h，酶解结束后升高温度为至80℃进行灭酶处理22min，然后在4000r/min的离心机中离心25min，上清液用分子量4000Da的超滤膜超滤，超滤液喷雾干燥得超滤粉，备用，上述复合酶是胰蛋白酶和碱性蛋白酶的混合物，其中胰蛋白酶和碱性蛋白酶的添加比例为1:1.46，该步骤中碱性蛋白酶切断鱼软骨中粘多糖与蛋白的结合，将硫酸软骨素从蛋白上酶解下来，使硫酸软骨素与蛋白分离，实现粘多糖与胶原蛋白初步分离，胰蛋白酶能将鱼软骨中大分子的胶原蛋白酶解成小分子的胶原蛋白肽，溶于酶解液中，该酶解提取具有收率高，产品成色较好，生产时间短等优点；

3）酶降解：按料液比为1:30（g/mL）向超滤粉中加入蒸馏水，然后按添加量为12U/g加入硫酸软骨素AC酶，再加入超滤粉重量0.02%的齐墩果酸和超滤粉重量0.2%的D-葡萄吡喃糖醛酸，在pH为5.5、温度物40℃的条件下酶降解3h，酶解结束后升高温度为至80℃进行灭酶处理22min，然后将酶解液用0.22μm滤膜过滤，滤液继续用6000Da超滤膜进行超滤，超滤液浓缩，浓缩后的溶液再用500Da透析袋透析20h，透析液冷冻干燥即为鱼软骨提取物，酶法降解硫酸软骨素的条件相对温和，可使硫酸软骨素酶解成低分子量硫酸软骨素，而的齐墩果酸和D-葡萄吡喃糖醛酸存在可避免低分子量硫酸软骨素的非还原端形成了△4,5-不饱和糖醇酸，进而保持低分子量硫酸软骨素的抗补体活性，同时齐墩果酸和D-葡萄吡喃糖醛酸的加入能够保证酶降解体系的pH值，提高酶解效率高和鱼软骨提取物中低分子量硫酸软骨素的得率，且可改善鱼软骨提取物的口感，该步骤产生的低分子量硫酸软骨素的非还原端和硫酸软骨素的结构一致，能抑制C3b的活性从而抑制C5b-9的形成，进而发挥更好的抗补体的活性，同时通过低分子量硫酸软骨素与血清中的补体蛋白相互作用，从而发挥其抗补体激活的作用，最终保护软骨细胞不被裂解，在预防和治疗关节炎中具有更好的潜在疗效。

实施例2：

预防关节炎的鱼软骨提取物，该鱼骨提取物含有80-90%的低分子量硫酸软骨素和10-20%的胶原蛋白肽，上述低分子量硫酸软骨素的分子量为400-500Da。

预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

1）鱼软骨粉制备：将鱼软骨洗净，按料液比为1:10（g/mL）向鱼软骨中加入蒸馏水，然后加入鱼软骨重量0.05‰的阿卡波糖和鱼软骨重量0.2%的维生素C，浸泡3h后沸腾煮20min，捞出后剔除鱼肉和油脂，用清水冲洗，烘干，粗粉碎至50目，然后在超微粉碎机中超微粉碎，即得鱼软骨粉，备用；

2）酶解提取：按料液比为1:3（g/mL）向鱼软骨粉中加入蒸馏水，然后按添加量为1.2%加入复合酶，在温度为50℃、pH为8.0的条件下酶解6h，酶解结束后升高温度为至100℃进行灭酶处理18min，然后在6000r/min的离心机中离心15min，上清液用分子量6000Da的超滤膜超滤，超滤液喷雾干燥得超滤粉，备用，上述复合酶是胰蛋白酶和碱性蛋白酶的混合物，其中胰蛋白酶和碱性蛋白酶的添加比例为1:1.22；

3）酶降解：按料液比为1:40（g/mL）向超滤粉中加入蒸馏水，然后按添加量为8U/g加入硫酸软骨素AC酶，再加入超滤粉重量0.03%的齐墩果酸和超滤粉重量0.1%的D-葡萄吡喃糖醛酸，在pH为6.0、温度物30℃的条件下酶降解5h，酶解结束后升高温度为至100℃进行灭酶处理18min，然后将酶解液用0.22μm滤膜过滤，滤液继续用4000Da超滤膜进行超滤，超滤液浓缩，浓缩后的溶液再用500Da透析袋透析30h，透析液冷冻干燥即为鱼软骨提取物。

实施例3：

预防关节炎的鱼软骨提取物，该鱼骨提取物含有80-90%的低分子量硫酸软骨素和10-20%的胶原蛋白肽，上述低分子量硫酸软骨素的分子量为400-500Da。

预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

1）鱼软骨粉制备：将鱼软骨洗净，按料液比为1:12（g/mL）向鱼软骨中加入蒸馏水，然后加入鱼软骨重量0.04‰的阿卡波糖和鱼软骨重量0.25%的维生素C，浸泡2h后沸腾煮30min，捞出后剔除鱼肉和油脂，用清水冲洗，烘干，粗粉碎至30目，然后在超微粉碎机中超微粉碎，即得鱼软骨粉，备用；

2）酶解提取：按料液比为1:3.5（g/mL）向鱼软骨粉中加入蒸馏水，然后按添加量为1.0%加入复合酶，在温度为55℃、pH为7.5的条件下酶解7h，酶解结束后升高温度为至90℃进行灭酶处理20min，然后在5000r/min的离心机中离心20min，上清液用分子量5000Da的超滤膜超滤，超滤液喷雾干燥得超滤粉，备用，上述复合酶是胰蛋白酶和碱性蛋白酶的混合物，其中胰蛋白酶和碱性蛋白酶的添加比例为1:1.35；

3）酶降解：按料液比为1:35（g/mL）向超滤粉中加入蒸馏水，然后按添加量为10U/g加入硫酸软骨素AC酶，再加入超滤粉重量0.025%的齐墩果酸和超滤粉重量0.15%的D-葡萄吡喃糖醛酸，在pH为5.7、温度物35℃的条件下酶降解4h，酶解结束后升高温度为至90℃进行灭酶处理20min，然后将酶解液用0.22μm滤膜过滤，滤液继续用5000Da超滤膜进行超滤，超滤液浓缩，浓缩后的溶液再用500Da透析袋透析24h，透析液冷冻干燥即为鱼软骨提取物。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.预防关节炎的鱼软骨提取物，其特征在于：所述鱼骨提取物含有80-90%的低分子量硫酸软骨素和10-20%的胶原蛋白肽，所述低分子量硫酸软骨素的分子量为400-500Da。

2.根据权利要求1所述的预防关节炎的鱼软骨提取物，其特征在于：所述鱼软骨提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

1）鱼软骨粉制备：将鱼软骨洗净，向鱼软骨中加入蒸馏水，然后加入阿卡波糖和维生素C，浸泡后沸腾煮，捞出后剔除鱼肉和油脂，用清水冲洗，烘干，粗粉碎，超微粉碎，即得鱼软骨粉，备用；

2）酶解提取：向鱼软骨粉中加入蒸馏水，然后加入复合酶酶解，灭酶，离心，上清液用超滤膜超滤，超滤液喷雾干燥得超滤粉；

3）酶降解：向超滤粉中加入蒸馏水和硫酸软骨素AC酶，再加入齐墩果酸和D-葡萄吡喃糖醛酸，酶降解，灭酶，然后将酶解液用滤膜过滤，滤液继续进行超滤，超滤液浓缩，浓缩后的溶液再用透析袋透析，透析液冷冻干燥即为鱼软骨提取物。

3.根据权利要求2所述的预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤1中鱼软骨和蒸馏水的料液比为1:10-15（g/mL），阿卡波糖的添加量为鱼软骨重量0.03-0.05‰，维生素C的添加量为鱼软骨重量0.2-0.3%。

4.根据权利要求2所述的预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤2中鱼软骨粉中和蒸馏水的料液比为1:3-4（g/mL），复合酶的添加量为0.8-1.2%，酶解温度为50-60℃、pH为7.0-8.0、时间为6-8h。

5.根据权利要求2所述的预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤2中复合酶是胰蛋白酶和碱性蛋白酶的混合物，其中胰蛋白酶和碱性蛋白酶的添加比例为1:1.22-1.46。

6.根据权利要求2所述的预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤2中超滤膜的分子量为4000-6000Da。

7.根据权利要求2所述的预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤3中超滤粉和蒸馏水的料液比为1:30-40（g/mL），硫酸软骨素AC酶的添加量为8-12U/g，酶降解pH为5.5-6.0、温度物30-40℃、时间为3-5h。

8.根据权利要求2所述的预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤3中齐墩果酸的添加量为超滤粉重量0.02-0.03%，D-葡萄吡喃糖醛酸的添加量为超滤粉重量0.1-0.2%。

9.根据权利要求2所述的预防关节炎的鱼软骨提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤3中透析袋的分子量为500Da，透析20-30h。