CN110475556A - 治疗肝疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及预防和/或治疗肝病的方法，包括向需要的患者给药ASK1抑制剂与ACC抑制剂的组合。

Description

治疗肝疾病的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年3月28日提交的美国临时申请号62/477,859、2017年4月5日提交的62/482,097、2017年5月25日提交的62/511,027和2017年5月31日提交的62/513,311的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及预防和/或治疗肝疾病的方法。
背景技术
肝病是全世界死亡的主要原因。肝病可以由感染、损伤、暴露于药物或有毒化合物、酒精、食物中的杂质，以及血液中正常物质的异常积累、自身免疫过程、遗传缺陷(例如血色素沉着病)或未知原因而引起。根据疾病的持续时间，肝病通常被分类为急性或慢性。
根据美国肝脏基金会的统计，超过20％的人口患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。如果不及时治疗，NAFLD可以进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，造成严重的不良反应。据估计，美国有1600万成年人患有NASH，大约50％的人患有与NASH相关的晚期肝纤维化(桥接纤维化或肝硬化)。基于这些数据，预计到2020年NASH将成为肝移植的主要指征。NASH的特征在于存在脂肪变性和其他特征，包括肝细胞变性(气球样变，马洛里玻璃样变)、炎性细胞浸润和进行性纤维化的发展。
目前尚无批准用于治疗NASH的疗法，也没有用于减少NASH患者纤维化和/或脂肪变性的疗法。因此，仍然需要提供新的有效药剂来治疗肝病或肝病的症状。
发明内容
本文公开了在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的凋亡信号调节激酶1(ASK1)抑制剂与治疗有效量的乙酰基-CoA羧化酶(ACC)抑制剂的组合。所述肝病可为任何肝病，包括，但不限于，慢性和/或代谢肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在具体实施方案中，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂组合。
在本文提供的方法中，ASK1抑制剂与ACC抑制剂可共同给药。在这些实施方案中，ASK1抑制剂与ACC抑制剂可作为单一药物组合物一起给药，或在多于一种药物组合物中分开给药。因此，本文还提供包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的ACC抑制剂的药物组合物。
附图说明
图1.作为％大泡面积的大泡性脂肪变性。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001，通过ANOVA证明与载体显著不同；#显著不同于任一单一药剂)。图表显示平均值±SEM。
图2.肝甘油三酯，umol/g。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001，通过ANOVA证明与载体显著不同；#通过t-检验证明显著不同于任一单一药剂)。图表显示平均值±SEM。
图3.肝脏胆固醇，mg/g。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001，通过ANOVA证明与载体显著不同；#通过t-检验证明显著不同于任一单一药剂)。图表显示平均值±SEM。
图4.ALT IU/L。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001，通过ANOVA证明与载体显著不同；#通过t-检验证明显著不同于任一单一药剂)。图表显示平均值±SEM。
图5.通过定量RT-PCR测量的肝纤维化基因Timp1的肝脏表达。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001，通过ANOVA证明与载体显著不同；#通过t-检验证明显著不同于任一单一药剂)。图表显示平均值±SEM。
图6.通过定量RT-PCR测量的肝纤维化基因Col1a1的肝脏表达。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001，通过ANOVA证明与载体显著不同；#通过t-检验证明显著不同于任一单一药剂)。图表显示平均值±SEM。
图7.PSR面积百分比。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001，通过ANOVA证明与载体显著不同；#通过t-检验证明显著不同于任一单一药剂)。图表显示平均值±SEM。
图8.血浆TIMP1 ng/mL(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001，通过ANOVA证明与载体显著不同；#通过t-检验证明显著不同于任一单一药剂)。图表显示平均值±SEM。
图9.血浆HA ng/ml(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001，通过ANOVA证明与载体显著不同；#通过t-检验证明显著不同于任一单一药剂)。图表显示平均值±SEM。
发明详述
定义和通用参数
本说明书使用的以下术语和短语通常意图具有如在下文中阐述的含义，但上下文另外说明的情况除外。
如本文所使用的，在定量测量的背景下使用的术语“约”是指指示量±10％，或者指示量±5％或±1％。
术语“药学上可接受的盐”是指本文公开的化合物的盐，其保持基础化合物的生物有效性和性质，且不是生物上或其它方面不合需要的。存在酸加成盐和碱加成盐。药学上可接受的酸加成盐可从无机和有机酸制备。用于与基础化合物反应形成药学上可接受的盐(分别为酸加成盐或碱加成盐)的酸和碱是本领域技术人员已知的。如果本文所述的化合物是作为酸加成盐获得的，则可以通过碱化酸式盐的溶液来获得游离碱。相反，如果产物是游离碱，则可以通过将游离碱溶解在合适的有机溶剂中并用酸处理该溶液，按照从碱化合物制备酸加成盐的常规方法制备加成盐，特别是药学上可接受的加成盐。本领域技术人员将认识到可用于制备无毒的药学上可接受的加成盐的各种合成方法。药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸和有机酸制备。源自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。源自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙烷磺酸、对甲苯-磺酸、水杨酸，等。同样，药学上可接受的碱加成盐可从无机和有机碱制备。源自无机碱的盐包括，仅作为实例，钠，钾，锂，铵，钙和镁盐。源自有机碱的盐包括，但不限于，伯、仲和叔胺的盐，如烷基胺(即，NH2(烷基))、二烷基胺(即，HN(烷基)2)、三烷基胺(即，N(烷基)3)、取代的烷基胺(即，NH2(取代的烷基))、二(取代的烷基)胺(即，HN(取代的烷基)2)、三(取代的烷基)胺(即，N(取代的烷基)3)、烯基胺(即，NH2(烯基))、二烯基胺(即，HN(烯基)2)、三烯基胺(即，N(烯基)3)、取代的烯基胺(即，NH2(取代的烯基))、二(取代的烯基)胺(即，HN(取代的烯基)2)、三(取代的烯基)胺(即，N(取代的烯基)3、单-、二-或三-环烷基胺(即，NH2(环烷基)、HN(环烷基)2、N(环烷基)3)、单-、二-或三-芳基胺(即，NH2(芳基)、HN(芳基)2、N(芳基)3)、或混合胺，等。合适的胺的具体实例包括，仅作为实例，异丙基胺、三甲基胺、二乙基胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。类似地，从基础化合物制备药学上可接受的盐的方法(在公开时)是本领域技术人员已知的，并且公开在例如Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science，Jan.1977vol.66，No.1等来源。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括对所公开的化合物或其用途无害的赋形剂或试剂，例如溶剂、稀释剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。使用这样的载体和试剂制备药物活性物质的组合物是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Co.，Philadelphia，PA 17thEd(1985)；和Modern Pharmaceutics，Marcel Dekker，Inc.3rd Ed.(G.S.Banker&C.T.Rhodes，Eds.)。
术语“治疗有效量”和“有效量”可互换使用，并且是指当一个或多个剂量给药于需要这种治疗的患者(例如，人)时足以实现如下定义的治疗的化合物的量。治疗有效量将根据患者、所治疗的疾病、患者的体重和/或年龄、疾病的严重性或由合格的药师或护理者确定的给药方式而变化。
术语“治疗”或“治疗”是指给予本文所述的化合物或药物组合物用于以下目的：(i)延迟疾病的发作，即导致疾病的临床症状不出现或延迟其出现；(ii)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；和/或(iii)缓解疾病，即引起临床症状或其严重性的消退。
肝病
肝病是在疾病持续期间对肝脏的急性或慢性损害。肝损伤可以由感染、损伤、暴露于药物或有毒化合物例如酒精或食物中的杂质、血液中正常物质的异常积累、自身免疫过程、遗传缺陷(例如血色病)或其他未知原因引起。示例性肝病包括但不限于肝硬化，肝纤维化，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，酒精性脂肪性肝炎(ASH)，肝缺血再灌注损伤，原发性胆汁性肝硬化(PBC)和肝炎，包括病毒性和酒精性肝炎。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是并非由酒精引起的肝细胞中额外脂肪的积聚。NAFLD的特征在于脂肪在肝细胞中的积累，并且通常与代谢综合征(例如2型糖尿病、胰岛素抵抗、高脂血症、高血压)的一些方面相关。这种疾病的频率已经变得越来越常见，这是由于消耗富含碳水化合物和高脂肪的饮食。NAFLD患者的一个亚组发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
NASH是脂肪肝疾病的亚型，是更严重的NAFLD形式。其特征在于大泡性脂肪变性、肝细胞的球囊变性和/或炎症，最终导致肝瘢痕形成(即纤维化)。诊断为NASH的患者进展到晚期肝纤维化并最终肝硬化。目前对具有晚期疾病的肝硬化NASH患者的治疗是肝移植。
另一种常见的肝病是原发性硬化性胆管炎(PSC)。它是慢性或长期肝病，慢慢损伤肝脏内部和外部的胆管。在患有PSC的患者中，胆汁由于胆管堵塞而积聚在肝脏中，其逐渐损伤肝细胞并引起肝硬化或肝脏瘢痕形成。目前，没有有效的治疗方法来治愈PSC。许多患有PSC的患者由于肝衰竭最终需要肝移植，通常在被诊断患有该疾病大约10年后。PSC也可能导致胆管癌。
肝纤维化是在大多数类型的慢性肝病中发生的细胞外基质蛋白(包括胶原)的过度积累。晚期肝纤维化导致肝硬化、肝衰竭和门静脉高血压，并且通常需要肝移植。
方法
本文公开了在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合。活性肝病的存在可以通过血液中升高的酶水平的存在来检测。具体来说，已知高于临床上接受的正常范围的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血液水平指示正在进行的肝损伤。对肝病患者的ALT和AST的血液水平的常规监测在临床上用于测量在医疗治疗时肝病的进展。将升高的ALT和AST降低到接受的正常范围内作为临床证据，反映患者正在进行的肝损伤的严重性的降低。
在具体实施方案中，肝病是慢性肝病。慢性肝病涉及肝实质的进行性破坏和再生，导致纤维化和肝硬化。一般来说，慢性肝病可由病毒(例如乙型肝炎、丙型肝炎、巨细胞病毒(CMV)或Epstein Barr病毒(EBV))、毒性剂或药物(例如酒精、甲氨蝶呤或呋喃妥因)、代谢性疾病(例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血色素沉着病或威尔逊氏病)、自身免疫性疾病(例如自身免疫性慢性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(以前称为原发性胆汁性肝硬变)或原发性硬化性胆管炎)或其他原因(例如右心衰竭)引起。
在一个实施方案中，本文提供了用于降低肝硬化水平的方法。在一个实施方案中，肝硬化在病理上的特征为正常微小小叶结构的损失，伴有纤维化和结节再生。测量肝硬化程度的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，肝硬化水平降低约5％至约100％。在一个实施方案中，在受试者中肝硬化水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％。
在具体实施方案中，所述肝病为代谢肝病。在一个实施方案中，所述肝病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征(肥胖症、混合型高脂血症、糖尿病(II型)和高血压)相关。认为NAFLD涵盖一系列疾病活性，且开始为在肝中的脂肪累积(肝脂肪变性)。
已经显示，肥胖和胰岛素抵抗可能在NAFLD的疾病过程中发挥强烈的作用。除了饮食不良之外，NAFLD还有几种其他已知的原因。例如，NAFLD可由某些药物引起，例如胺碘酮，抗病毒药物(例如核苷类似物)，阿司匹林(很少作为儿童Reye综合征的一部分)，皮质类固醇，甲氨蝶呤，他莫昔芬或四环素。NAFLD还通过高果糖玉米糖浆的存在与软饮料的消耗相关，这可能引起脂肪在腹部增加的沉积，尽管蔗糖的消耗显示类似的效果(可能是由于其分解成果糖)。遗传学也被认为发挥了作用，因为已经确定了这种易感性的两个遗传突变。
如果不治疗，NAFLD可以发展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH被认为是肝硬化的主要原因。因此，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合。
本文还提供在需要的患者中治疗和/或预防肝纤维化的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合。肝纤维化是在大多数类型的慢性肝病中发生的细胞外基质蛋白(包括胶原)的过度积累。在具体实施方案中，晚期肝纤维化导致肝硬化和肝衰竭。用于测量肝组织学的方法，例如纤维化程度、小叶性肝炎和门静脉周围桥接坏死的变化是本领域公知的。
在一个实施方案中，肝纤维化(其为纤维组织、纤维瘤或纤维变性的形成)的水平降低超过约90％。在一个实施方案中，肝纤维化(其为纤维组织、纤维瘤或纤维变性的形成)的水平降低至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、至少约5％或至少约2％。
本文描述的一些实施方案涉及治疗肝病的方法，包括给予治疗有效量的如本文所述的化合物I或如本文所述的药物组合物的形式。肝病可分为4个阶段：F0表示无纤维化；F1表示轻度纤维化；F2表示中度纤维化；F3表示严重的纤维化；且F4表示肝硬化。在一个实施方案中，通过纤维化阶段测量的肝纤维化水平从基线降低。在一个实施方案中，在一段时间内每日治疗后，肝纤维化阶段改善从基线开始大于1或从基线开始大于2。在另一实施方案中，肝纤维化阶段从F4改善为F3，从F3改善为F2，或从F2改善为F1，其通过包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合的方法。在另一实施方案中，提供了在需要的患者中治疗肝纤维化的方法，其中患者的肝纤维化阶段为F3，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合。在另一实施方案中，提供了在需要的患者中治疗肝纤维化的方法，其中患者的肝纤维化阶段为F4，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合。在一个实施方案中，在24周每日给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合后，从基线的肝纤维化阶段改善大于1。在另一实施方案中，在48或92周每日给药本文所述的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合后，从基线的肝纤维化阶段改善大于1。在另一实施方案中，在48或92周每日给药本文所述的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合后，从基线的肝纤维化阶段改善大于1。
在一个实施方案中，本文提供的化合物降低肝脏中的纤维形成水平。肝纤维形成是导致称为纤维化的肝中过量细胞外基质组分沉积的过程。它在诸如慢性病毒性乙型肝炎和丙型肝炎、酒精性肝病、药物诱导的肝病、血色素沉着病、自身免疫性肝炎、威尔逊病、原发性胆汁性胆管炎(以前称为原发性胆汁性肝硬变)、硬化性胆管炎、肝血吸虫病等许多病症中观察到。在一个实施方案中，纤维形成水平降低超过约90％。在一个实施方案中，纤维形成水平降低至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、至少约5％或至少2％。
在其它实施方案中，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防原发性硬化性胆管炎(PSC)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合。
已经观察到患有NASH的患者在表观遗传测试中平均比健康患者大约2.8岁。因此，在一个实施方案中，可用于治疗NASH的化合物可用于减缓、改善或逆转由NASH引起的表观遗传年龄或衰老的影响。在另一个实施方案中，用于治疗NASH的组合疗法，例如本文公开的ASK1抑制剂化合物与ACC抑制剂化合物的组合，可用于改善或逆转由NASH引起的衰老影响。
在一个实施方案中，ASK1抑制剂和ACC抑制剂可以在组合制剂中或在单独的药物组合物中一起施用，其中每种抑制剂可以配制成任何合适的剂型。在某些实施方案中，本文提供的方法包括分别给药包含ASK1抑制剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物和包含ACC抑制剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。根据本发明的组合制剂包含ASK1抑制剂和ACC抑制剂以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和任选的其他治疗剂。含有所述活性成分的组合制剂可以是适合于预期给药方法的任何形式。
可以通过磁共振弹性成像(MRE)测量纤维化改善。MRE可用于区分纤维化改善≥1-阶段的僵硬度。在一个实施方案中，本公开内容提供了向诊断为NASH的人患者施用选自式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物的化合物，且通过MRE测量纤维化改善的方法。在一个实施方案中，本发明提供将式(I)的化合物或式(II)的化合物与式(III)的化合物或式(IV)的化合物的组合给药或将式(I)的化合物或式(II)的化合物与式(III)的化合物或式(IV)的化合物同时给药至诊断为NASH的人患者，并通过MRE测量纤维化改善的方法。在另一个实施方案中，本公开内容提供了通过MRE诊断患有NASH的人并给予式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物或它们的组合以治疗NASH的方法。用于预测纤维化改善的MRE-僵硬度的AUROC为0.62(95％CI 0.45-0.78)，且最佳阈值为≥0％相对减少。
组织学改善也可以通过质子密度脂肪分数(PDFF)来测量。PDFF可用于预测≥1-级的脂肪变性改善。PDFF还可用于预测NAS响应(≥2点减少)。在一个实施方案中，本公开内容提供了施用选自式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物或其组合的化合物的方法，以提供≥1-级脂肪变性改善。在另一个实施方案中，本公开内容提供了施用选自式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物或其组合的化合物的方法，以提供NAS分数降低≥2点。预测NAS响应的PDFF的AUROC为0.70(95％CI0.51-0.89)，最佳阈值为≥25％相对减少。对于脂肪变性改善，PDFF的AUROC为0.70(95％CI 57-83)，最佳阈值为≥0％相对减少。
ASK1抑制剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(I)的结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(II)的结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
式(I)和式(II)的化合物可以使用本领域技术人员已知的方法合成和表征，例如美国专利号8,742,126和美国专利申请公开号2011/0009410和2013/0197037中描述的那些。在一个实施方案中，ASK1抑制剂是式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，ASK1抑制剂是式(II)化合物或其药学上可接受的盐。
ACC抑制剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ACC抑制剂为具有式(III)的结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ACC抑制剂为具有式(IV)的结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
式(III)和式(IV)的化合物可以使用本领域技术人员已知的方法合成和表征，例如国际申请公开号WO/2013071169中描述的那些。
给药和施用
虽然可以单独给药活性成分，但是可将其作为如下所述的药物制剂或药物组合物给药。本公开的用于兽医和人类使用的制剂包含至少一种活性成分，以及一种或多种可接受的载体和任选的其它治疗成分。载体必须是“可接受的”，意思是与制剂的其它成分相容并且对其接受者是生理上无害的。
每种活性成分可以与常规载体和赋形剂一起配制，其将根据通常的实践进行选择。片剂可以含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性制剂以无菌形式制备，并且当打算用于通过除口服给药之外的递送时，通常将是等渗的。所有制剂将任选地含有赋形剂，例如Handbook of Pharmaceutical Excipients(1986)中所述的那些。赋形剂包括抗坏血酸和其它抗氧化剂、螯合剂如EDTA、碳水化合物如糊精、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸等。制剂的pH范围为约3至约11，但通常为约7至10。
活性成分的治疗有效量可由熟练的临床医生使用常规剂量递增研究容易地确定。通常，活性成分(即，本文所述的化合物)将以0.01毫克至2克的剂量给药。在一个实施方案中，剂量为约10毫克至450毫克。在另一个实施方案中，剂量为约25至约250毫克。在另一个实施方案中，剂量为约50或100毫克。在一个实施方案中，剂量为约100毫克。预期活性成分可以每天给药一次、两次或三次。此外，活性成分可以每周一次或两次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次或每六周一次给药。在一个实施方案中，ASK1抑制剂的剂量为6至25毫克且ACC抑制剂的剂量为5至30毫克。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂的剂量为约6毫克且ACC抑制剂的剂量为约10毫克。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂的剂量为约6毫克且ACC抑制剂的剂量为约20毫克。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂的剂量为18毫克且所述ACC抑制剂的剂量为20毫克。在某些实施方案中，所述剂量为总日剂量。
用于活性成分的药物组合物可以包括适合于上述给药途径的那些。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。技术和制剂通常参见Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA)。这样的方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，制剂通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀和密切地混合，然后如果需要，使产品成型来制备。
适合于口服给药的制剂可以作为离散单位存在，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每个含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂给药。在具体实施方案中，活性成分可以作为皮下注射给药。
片剂可以通过压缩或模制，任选地使用一种或多种辅助成分制备。压制片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂或表面活性剂混合来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且任选地被配制以便提供活性成分的缓慢或控制释放。
活性成分可以通过适于该病症的任何途径给药。合适的途径包括口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等。应当理解，优选的途径可以随例如接受者的状况而变化。在具体实施方案中，活性成分是口服生物可利用的，因此可以口服给药。在一个实施方案中，患者是人。
当在本文公开的方法中组合使用时，ASK1抑制剂和ACC抑制剂可以在单一药物组合物中一起给药，或在多于一种药物组合物中分开(同时或依次)给药。在具体实施方案中，ASK1抑制剂和ACC抑制剂一起给药。在其他实施方案中，ASK1抑制剂和ACC抑制剂分开给药。在一些方面，ASK1抑制剂在ACC抑制剂之前给药。在一些方面，ACC抑制剂在ASK1抑制剂之前给药。当分别给药时，ASK1抑制剂和ACC抑制剂可以通过相同或不同的递送途径给药于患者。
药物组合物
本公开的药物组合物包含有效量的选自式(I)的化合物和式(II)的化合物的ASK1抑制剂和有效量的选自式(III)的化合物和式(IV)的化合物的ACC抑制剂。
当用于口服使用时，可以制备例如片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备，并且这种组合物可以含有一种或多种试剂，包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供可口制剂。含有与无毒的药学上可接受的赋形剂(其适于制备片剂)混合的活性成分的片剂，是可接受的。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、一水合乳糖、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如纤维素、微晶纤维素、淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术包括微囊化来包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供更长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料，例如单独的或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服使用的制剂也可以是硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如磷酸钙或高岭土混合，或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
本公开的水性悬浮液含有活性材料与适于制备水性悬浮液的赋形剂的混合物。这样的赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶，以及分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇)，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如，蔗糖或糖精。
油悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或在矿物油(例如液体石蜡)中配制。口服混悬液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂，例如上述的那些，以及调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。
适于通过加入水制备水性悬浮液的本公开的可分散粉末和颗粒提供与分散或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由上面公开的那些举例说明。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本公开的药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，矿物油，例如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶和黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。糖浆和酏剂可以用甜味剂，例如甘油，山梨醇或蔗糖配制。这样的制剂还可以含有缓和剂、防腐剂、矫味剂或着色剂。
本公开的药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射的水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据已知技术使用上述合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液或制备为冻干粉末。可以使用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油通常可用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸也可以用于制备注射剂。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和具体的给药方式(例如口服给药或皮下注射)而变化。例如，旨在用于人类口服给药的时间释放制剂可以含有约1至1000mg的活性物质，其与合适和方便量的载体材料混合，载体材料可为总组合物的约5至约95％(重量：重量)。可以制备药物组合物以提供易于测量的给药量。例如，用于静脉内输注的水溶液可以含有每毫升溶液约3至500μg的活性成分，以便能够以约30mL/hr的速率输注合适的体积。当配制用于皮下给药时，通常在约2至约4个月的时间内每月约两次给药制剂。
适于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。
制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在仅需要在即将使用前加入无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)状态下。临时注射溶液和悬浮液由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。优选的单位剂量制剂是含有活性成分的如上文所述的日剂量或单位每日亚剂量或其适当部分的那些。
实施例
实施例1.在NASH小鼠模型中的功效
进行以下研究以评估ASK1抑制剂和ACC抑制剂的组合在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型中的功效，相对于单独的个体药剂在模型中的功效。通过长期施用富含饱和脂肪、胆固醇和糖的“快餐”饮食(FFD)总共6个月，在雄性C57BL/6小鼠中诱导NASH，而瘦(lean)对照动物维持正常饲料。在6个月后，与对照小鼠相比，在FFD小鼠中建立了NASH表型，其特征在于大泡性脂肪变性、ALT和AST升高、以及与肝星状细胞活化相关的转录物水平增加。参见Charlton M等人Fast food diet mouse:novel small animal model of NASHwith ballooning,progressive fibrosis,and high physiological fidelity to thehuman condition.American Journal of Physiology.Gastrointestinal and LiverPhysiology 2011；301(5):G825-34。
5个月后，用安慰剂(载体)、ASK1抑制剂(式(I))、ACC抑制剂(式(III))或式(I)和式(III)的组合处理FFD小鼠1个月。在整个6个月的研究期间，对照小鼠保持正常的饲料。终点分析包括肝脏脂肪变性(脂肪变性面积％)、肝脏甘油三酯、肝脏胆固醇、ALT的形态测量定量，以及促纤维化转录物Timp1和Col1A1的测量。
方法
动物
在该研究中使用雄性C57CL/6小鼠(在研究开始时年龄为12周)。用于研究动物的所有程序均符合美国农业部动物福利法(9CFR第1、2和3部分)；实验动物护理和使用指南(Institute for Laboratory Animal Research,The National Academies Press,Washington,D.C.)；和国立卫生研究院，实验动物福利办公室。
FFD小鼠模型的活体实验方案
实验设计显示在表1中。研究动物给予标准饲料(Harlan Teklad Global Diets2014，TD2014)或市售高脂肪、高胆固醇饮食(Research Diets Inc，DB12079B)，下文称为NASH饮食。将动物施用如下配制的饮用水中的果糖/葡萄糖：将23.1g果糖(Sigma，F2543)和17.2g葡萄糖(Sigma，49158)混合到1000mL饮用水中。
在研究的最后一个月(第5个月-第6个月)给予单独的式(I)化合物或式(III)化合物或式(I)和式(III)化合物的组合的治疗。式(I)化合物以在FFD饮食中的0.15％混合物给药，式(III)化合物配制在反渗透水中的0.5％羧甲基纤维素钠(中等粘度)、1％乙醇、98.5％50mM Tris缓冲液、pH8中。将式(III)化合物配制成0.1或0.2mg/mL，并以表中提供的剂量给予。
在开始PO给药前5天，将第2组和第5组置于含有0.15％式(I)化合物(研磨至饮食中)的DB12079B中，保持35天。设计式(I)化合物的一周长引入剂量以在引入式(I)化合物的第一周期间克服食物厌恶。在PO给药前7天开始，将组1-7中的动物假给药载体BID。假给药设计用于使动物适应口服强饲剂量给药。从研究的第1天开始，所有剂量组的动物每天给药三次；在AM中连续两次(7:00+/-1小时)，一次在晚上(19:00+/-1小时)，其给予相同体积的不含化合物的制剂(第1组，载体)或含适当的化合物的制剂，如下所述(表1)，持续28天(直至给药第29天)。每组分成两半，一半在给药后2小时处死，一半在第29天给药后8小时处死。
表1.实验设计和剂量组
肝脂肪变性的测量
使用AperioAT2扫描仪以40X放大率(Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL)捕获苏木精和曙红(H&E)染色的载玻片的整个载玻片扫描图像。检查数字载玻片图像的扫描质量，注释并导出到Leica Digital Image Hub(Leica Biosystems)存档中的相应网络文件夹。使用Visiopharm图像分析软件(Visopharm，Hoersholm，Denmark)对整个载玻片扫描图像进行脂肪变性的定量。肝实质内的脂质空泡是低光密度的圆形区域(白色)。列举这些区域的数量和大小，并将总的脂肪变性面积表示为总肝脏组织横截面积的百分比。根据大小和形状，从该分析中排除肝内血管(例如门静脉和中央静脉的分支)。单独检查自动分析的掩模(masks)以确认结果的准确性。在给药后8小时处死的动物(每组的一半)上确定肝脏脂肪变性。对所有动物进行所有其他分析。
来自小鼠肝脏的甘油三酯和胆固醇的定量
组织提取：将小鼠肝脏组织样品(25±10mg，在冷冻状态下精确称重)均质化并用与水不混溶的有机溶剂混合物提取，该混合物将三酰基甘油酯级分以及游离和酯化的胆固醇级分提取到有机相中。离心后，将含有三酰基甘油酯、胆固醇和胆固醇酯的有机上层的等分试样用乙醇稀释10倍或25倍。取两份这种稀释的单独的等分试样。分析一个等分试样的三酰基甘油酯，第二个等分试样用于总胆固醇测定。
三酰基甘油酯测定：对于三酰基甘油酯测定，在氮气流下蒸发一份25倍稀释液(或在具有低三酰基甘油酯含量的样品的情况下不稀释)。在超声波处理下，用PBS溶液中的0.1％十二烷基硫酸钠逐步重构干燥的提取物，然后与三酰基甘油酯测定试剂(InfinityTM甘油三酯液体稳定试剂，Thermo Scientific，产品数据表，InfinityTM，甘油三酯液体稳定试剂)混合。
该试剂溶液含有数种酶、辅因子和显色试剂4氨基安替比林。用该试剂测定三酰基甘油酯(TAG)是基于以下方法，Wako,Product Data Sheet,Triacylglyceride–G CodeNo.997-69801,Wako Pure Chemical Industries Ltd.,Dallas,TX,和McGowan等人的修改版,(McGowan,MW等人,Clin.Chem 1983:29:538)和Fossati等人(Fosseti,P.PrencipleL.Clin Chem.1892:28:2077-80)，如下：
1.甘油三酯被脂肪酶酶促水解成游离脂肪酸和甘油。
2.用三磷酸腺苷(ATP)与甘油激酶(GK)磷酸化甘油，产生甘油-3-磷酸和二磷酸腺苷。
3.甘油-3-磷酸通过磷酸甘油氧化酶被磷酸二羟丙酮(DAP)氧化，产生过氧化氢(H2O2)。
4.在过氧化物酶催化的Trinder5型显色反应中，H2O2与4-氨基安替比林(4-AAP)和3,5-二氯-2-羟基苯磺酸盐(DHBS)反应生成红色染料。该染料的吸光度与样品中存在的甘油三酯浓度成比例。
在37℃下用三酰基甘油酯测定试剂孵育30分钟后，将样品转移到微量滴定板中，并在酶标仪(SpectraMax M2，Molecular Devices)中在540nm处测量吸光度。使用由强化校准标准品产生的线性最小二乘回归分析进行定量，使用甘油三油酸酯(三油精)作为三酰基甘油酯参考标准。通过与组织样品相同的提取和孵育步骤获取校准标准样品。使用Microsoft Excel 2013进行重量校正和浓度计算。最终组织含量以μmol三酰基甘油酯(TAG)/g肝组织给出。
总胆固醇测定：对于总胆固醇测定，将内标溶液(胆固醇-d6)和1M乙醇氢氧化钾溶液加入到10倍样品稀释液的等分试样中(参见上文)。将混合物在70℃孵育1小时，以使胆固醇酯水解成游离脂肪酸和胆固醇。然后，将反应混合物用冰醋酸酸化并用己烷萃取。除去己烷层，蒸发并在乙腈中重构。
将重构提取物的等分试样注射到配备有C18反相柱的Waters Acquity/AB SciexQTrap 4000LC-MS/MS系统上。质谱仪使用大气压化学电离(APCI)以正模式操作。
测量胆固醇的m/z 369[M-H2O]+→161+产物离子的峰面积，相对于m/z375[M-H2O]+→167+的胆固醇-D6产物离子的峰面积。使用加权的(1/x)线性最小二乘回归分析进行定量，所述加权(1/x)线性最小二乘回归分析使用油酸胆固醇酯作为参考标准由强化校准标准产生。通过与组织样品相同的提取和水解步骤获取校准标准样品。使用AB SCIEX软件Analyst1.5.1收集和处理原始数据。使用Microsoft Excel 2013进行数据减少、重量校正、油酸胆固醇酯至胆固醇水解的校正和浓度计算。最终组织含量以mg总胆固醇/g肝组织给出。
ALT
在最终尸体解剖中从所有小鼠收集血清。通过丙酮酸与吡哆醛-5'-磷酸测量血清ALT，并在Cobas Hitachi 6000Chemistry System，Roche Diagnostics上分析。
基因表达
将大约100mg冷冻的左侧叶的块送至DC3进行裂解和RNA提取。根据制造商的说明，使用nCounter主试剂盒(NanoString)中包含的所有试剂和消耗品进行NanoString测定，以测量RNA转录物。简而言之，将靶向110个肝纤维化相关基因和6个对照管家基因(表2)的颜色编码的报告探针在预热的65℃热循环仪中与100ng RNA样品在含有杂交缓冲液和捕获探针的反应中杂交过夜16至22小时。孵育后，将样品置于制备台上，除去过量的探针，并将探针-转录物复合物固定在链霉亲和素包被的筒上。最后，在nCounter数字分析仪(NanoString Technologies，Seattle，WA)中对筒进行成像。使用nSover 3.0软件将所有转录物归一化为6个管家基因(B2m、HPRT、Pgk1、RPL13a、Rpn1和SFRS4)的几何平均值。
表2：Nanostring探针
结果
实施例1表明，与单独给药的任一种药剂相比，用ASK1抑制剂和ACC抑制剂的组合治疗产生更高的抗脂肪变性功效。特别地，图1显示了式(I)化合物和式(III)化合物的组合对大泡性脂肪变性的显著降低。实施例1还显示了式(I)化合物和式(III)化合物的组合对肝脏甘油三酯(图2)、肝脏胆固醇(图3)和血清ALT(图4)的显著改善。另外，式(I)化合物和式(III)化合物的组合显示出促纤维化转录物Col1A1减少的趋势(图6)，并且该组合显示Timp1转录物显著减少(图5)。
实施例2.胆碱-缺乏的、高脂肪、高胆固醇NASH模型中的功效
进行以下研究以评估ASK1抑制剂(ASK1i)和ACC抑制剂(ACCi)的组合在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的啮齿动物模型中的功效，与模型中单独个体药剂的功效相对比。在该模型中，通过施用胆碱缺乏的高脂肪饮食(CDHFD)在雄性Wistar大鼠中诱导NASH。
动物
雄性Wistar(Crl:Wi(Han))大鼠(到达时为8-9周龄)从Charles River，Raleigh，NC获得，并用于当前研究。本研究符合动物福利法案最终规则(Final Rules of theAnimal Welfare Act regulations)(Code of Federal Regulations，Title9)、PublicHealth Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals from theOffice of Laboratory Animal Welfare和国家研究理事会关于实验动物护理和使用的指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the NationalResearch Council)的所有适用章节。
载体制备
在使用前制备载体(w/v 50mM tris缓冲液，pH 8，在去离子水中)，并储存在冰箱中，保持2-8℃。为了制备1L，将800mL热水(～80℃)加入合适的容器中并剧烈搅拌直至形成陡峭的涡旋。将5.0克甲基纤维素钠缓慢加入羧甲基纤维素钠中至涡旋。继续搅拌直至所有羧甲基纤维素溶解并将溶液冷却至环境温度。将5.12g Tris HCl加入容器中。将2.12克Tris碱加入容器中。向容器中加入10g乙醇。将组分搅拌约15分钟，确保所有固体已溶解。在温和混合下将适量水加入至1L。
式(III)制剂
通过将式(III)稀释至所需浓度使用载体制备式(III)制剂。
研究设计
食物是自由采食的，并且研究的所有动物在研究的第1天给予胆碱缺乏的、高脂肪、高胆固醇饮食(CDHFD；Research Diets，A16092003)，除了第1组，即对照食物组，其接受标准饮食(5CR4)，如表3所示。对于接受ASK1抑制剂的那些动物，ASK1i在饮食(饮食A16111101)中给予。饮食A16111101为胆碱-缺乏的、高脂肪、高胆固醇饮食，其已添加ASK1i(0.03％)。在处死当天，收获肝脏并用石蜡包埋，收集血浆并冷冻。在处死的当天没有给动物服药。
表3.实验设计和剂量组
组织由Charles River in Reno，Nevada收集，加工并在Hayward，CA的Histo-tec在石蜡中包埋，然后运往Foster City的Gilead Sciences。制备5μm厚的组织切片用于染色。
天狼猩红(Picrosirius red)染色：切片在0.2％磷钼酸(EMS，Cat#26357-01)中预处理，然后在室温在饱和苦味酸溶液(EMS，Cat#26357-02)中的0.1％(W/V)Sirius Red 88-89-1中孵育1小时。然后在0.01N HCl(EMS，Cat#26357)中分化并在分级醇中脱水。
使用Leica AT2扫描仪以40X放大率捕获天狼猩红(PSR)染色的载玻片的整个载玻片图像。检查数字载玻片图像的扫描质量，注释并导出到Leica Digital Image Hub归档中的相应网络文件夹。使用Visiopharm图像分析软件(Visiopharm，Hoersholm，Denmark)对整个载玻片图像进行定量图像分析，以确定PSR的程度和强度。测量总PSR染色面积并表示为染色的总肝脏面积的百分比。结果显示在图7中。
血浆TIMP-1ELISA：使用市售的大鼠TIMP-1特异性ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)一式两份测定血浆TIMP-1浓度。根据制造商的说明书并进行少量修改，对TIMP-1进行血浆测定。将缓冲液RD1-21(50μL)加入预先涂有小鼠抗TIMP-1的ELISA板孔中。在ELISA之前，产生大鼠TIMP-1(NS0-表达的重组TIMP-1：2400-37.5pg/mL)的7点标准曲线，并将血浆样品在缓冲液RD5-17中1:100稀释。将样品和标准品(各50μL)一式两份加入到含有RD1-21的孔中，并在轨道板振荡器(300rpm)上孵育(室温)2小时。在抗原捕获后，使用自动洗板机将板用洗涤缓冲液洗涤5次(350μL/孔/洗涤)。洗涤后，将大鼠TIMP-1缀合物(100μL)加入各孔中，并将板在轨道板振荡器(300rpm)上孵育(室温)2小时。然后将板洗涤5次并向每个孔中加入底物溶液(100μL)。将板在室温下避光孵育30分钟。最后，向每个孔中加入终止溶液(100μL)。立即在SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale CA)上在450nm处测定光密度(O.D.)吸光度。针对空白样品对每个标准品和样品的相对O.D.进行背景校正，并使用4参数曲线拟合方法产生用于将O.D.转化为TIMP-1浓度的标准曲线。使用SoftMax Pro5软件使用稀释因子100测定未知样品TIMP-1浓度。结果显示在图8中。
血浆透明质酸(HA)测定：使用市售的HA测试试剂盒(Corgenix，Inc.，Broomfield，CO)一式两份测定血浆HA浓度。根据制造商的说明书并稍作修改，对血浆中的HA进行测定。在测定之前，产生HA参比溶液的7点标准曲线(800-12.5ng/mL)，并将每个参考样品和血浆样品用反应缓冲液以1:10(30μl参比/样品比300μl反应缓冲液)稀释。将样品和标准品(100μl)一式两份加入预先用HA结合蛋白(HABP)包被的微孔板孔中，并在轨道板振荡器(300rpm)上孵育(室温)60分钟。在抗原捕获后，使用自动洗板机将板用PBS洗涤4次(350μL/孔/洗涤)。洗涤后，将HRP-缀合的HABP(100μL)加入各孔中，并将板在轨道板振荡器(300rpm)上孵育(室温)30分钟。然后将板洗涤4次，并向每个孔中加入单组分底物溶液(100μl)。将板在室温下避光孵育30分钟。最后，向每个孔中加入终止溶液(100μl)。立即在SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale CA)上在450nm处测定光密度(O.D.)吸光度。每种标准品和样品的相对O.D.针对空白样品进行背景校正，并使用4参数曲线拟合法生成用于将O.D.转化为HA浓度的标准曲线。使用SoftMax Pro5软件测定未知样品HA浓度。结果显示在图9中。
结果
实施例2证明了ASK1i和ACCi的抗纤维化功效。与正常饮食的大鼠相比，CDHFD在6周(2.7％面积)和12周(8.3％面积)显著增加肝PSR。用ASK1i、ACCi或ASK1i+ACCi治疗分别使PSR降低18％(ns)、50％(p<0.05)和59％(p<0.01)。CDHFD大鼠血浆TIMP1水平升高，且通过ASK1i+ACCi降低至低于治疗开始水平(p<0.05)。所有含ACCi的组中HA均降低。
实施例3.NASH中细胞凋亡信号调节激酶(ASK1)抑制剂(式(II))与乙酰-CoA羧化酶抑制剂(式(IV))的组合的临床前研究
纳入70名受试者，其通过MRE测定肝脏质子密度脂肪分数(PDFF)≥10％且肝硬度≥2.88kPa而诊断患有NASH，或肝活检与NASH和2-3阶段纤维化一致。连续组群接受式(II)18mg、式(IV)20mg的单一治疗，或式(II)+式(IV)的组合治疗(18/20mg)，口服QD持续12周。在基线(BL)、W4和W12测量集中读取的PDFF和MRE以及血清纤维化标志物。施用氘化水以测量脂质的分数合成(从头脂肪生成[DNL])。
在12周内，所有方案都是安全且耐受良好的。在单一疗法和组合组群之间观察到相似的AE率(表4)。没有受试者过早停止治疗。与BL相比，式(IV)导致PDFF(p＝0.006)和TIMP-1(p＝0.049)的显著改善，以及ALT和PIII-NP的非显著性降低(表4)。式(II)+式(IV)的组合导致PDFF(p<0.001)、ALT(p＝0.019)和PIII-NP(p＝0.057)的显著降低。
表4：在W12的安全性和成像、肝生物化学和血清纤维化标志物的相对(％)变化
所有数据均为从BL或％(n)的中值(IQR)相对(％)变化。
*p<0.05，与BL相比。
在NASH患者的这项研究中，使用式(II)+式(IV)的组合进行12周治疗是安全的并且导致肝脂肪变性、肝生物化学和纤维化标志物的改善。
序列表
<110> 吉利德科学公司
<120> 治疗肝疾病的方法
<130> 37JD-267757-WO
<150> 62/477,859
<151> 2017-03-28
<150> 62/482,097
<151> 2017-04-05
<150> 62/511,027
<151> 2017-05-25
<150> 62/513,311
<151> 2017-05-31
<160> 8
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
aagcctctgt ggatatgccc acaagtccca gaaccgcagt gaagagtttc tcatcacggg 60
ccgcctaagg aacggaaatt tgcacatcag tgcctgcagc 100
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
caatggtgag acgtggaaac ccgaggtatg cttgatctgt atctgccaca atggcacggc 60
tgtgtgcgat gacgtgcaat gcaatgaaga actggactgt 100
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
ctctctgaag ccatgatgca aaacctccaa tctgtcatga gacctccggg ccttcctaaa 60
tcaaagagcg ctgtctgggt cacggaaggg atgtatgcct 100
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
catacgcctg cagagttaag catgccagta tggccgagcc caagaccgtc tactgggatc 60
gagacatgtg atcaagcatc atgatgctct gaagattcat 100
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
tgctgaggcg gcgagggaga gcgttgggct tacctcactg ctttccggag cggtagcacc 60
tcctccgccg gcttcctcct cagaccgctt tttgccgcga 100
<210> 6
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
ccggcattct gcacgcttca aaagcgcacg tctgccgcgc tgttctcctc ttcctcatct 60
ccgggccttt cgacctcacg gtgttgccaa aatgtcgctt 100
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
atgggatccc tccaccctat gacaagaaaa agcggatggt ggtccctgct gctctcaagg 60
ttgttcggct gaagcctacc agaaagtttg cttacctggg 100
<210> 8
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
ggcagcctga cagtgggatc tcctccattc gttcttttaa gaccatcctt cctgctgccg 60
cccaggatgt ctattaccgg gatgagattg gtaatgtttc 100

Claims (12)

1.在需要的患者中治疗和/或预防肝疾病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合，其中所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述ACC抑制剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
2.在需要的患者中治疗和/或预防肝疾病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合，其中所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述ACC抑制剂为式(IV)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
3.在需要的患者中治疗和/或预防肝疾病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合，其中所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述ACC抑制剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
4.在需要的患者中治疗和/或预防肝疾病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂的组合，其中所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述ACC抑制剂为式(IV)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述ASK1抑制剂和ACC抑制剂一起给药。
6.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述ASK1抑制剂和ACC抑制剂分开给药。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述肝疾病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
8.药物组合物，其包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的ACC抑制剂，其中所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述ACC抑制剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
9.药物组合物，其包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的ACC抑制剂，其中所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述ACC抑制剂为式(IV)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
10.药物组合物，其包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的ACC抑制剂，其中所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述ACC抑制剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
11.药物组合物，其包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的ACC抑制剂，其中所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述ACC抑制剂为式(IV)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
12.权利要求8-11任一项所述的药物组合物，还包含药学上可接受的载体。
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