CN110465335B - 一种微流控芯片及夹具 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微流控芯片及其夹具，包括硅基衬底和氮化硅层，其中，氮化硅层沉积在硅基衬底的上下两侧，氮化硅层图形化为多个构成阵列的栅形孔。成功将微滤与微流控技术相结合，并采用栅形孔设计替代微滤中常用的圆孔，通过仿真设计的3‑D栅形微纳芯片，并根据常见肿瘤细胞的物理特性，优化栅形结构参数、富集分离条件，相比于单独采用微滤或微流控技术，实现了不同类型稀有细胞的富集分离和转移，大大提高了分离能力。同时独创性地设置的涂层和环形侧冲流路，也能降低氮化硅表面的静电作用，减少细胞与氮化硅间的粘附，以及让细胞与芯片间不易形成稳定粘附，有利于细胞高效率转移。

Description

一种微流控芯片及夹具

技术领域

本发明属于微流控芯片及夹具技术领域，尤其涉及一种用于血液稀有细胞富集分离和细胞转移的微流控芯片及夹具。

背景技术

血液中存在一些含量非常少的细胞，它们在生命活动中发挥各自重要功能，对这类细胞的研究与检测一直存在困难，循环肿瘤细胞就是其中一种。CTCs来源于肿瘤原发灶，它既是肿瘤状态信息载体，也是肿瘤转移特异且直接的标志物；并且能多次采集外周血获得，被称为“液体活病理”。外周血中CTCs 非常稀少，通常CTCs 检测利用细胞的生物特性或物理性质等对CTCs 加以分离富集。

CTC细胞具有独特的生化特性和物理特征。其中，（1）生化特性：缺乏具有共性的特征性标志物，即使是上皮细胞粘附分子之类生物标志物，也应细胞类型和细胞处于不同生物阶段而表达存在差异甚至缺失；（2）物理特征：包括细胞密度、体积大小、变形性和电性能等，不同来源细胞的物理特征存在差异。研究显示肿瘤细胞变形性与正常细胞存在差异。外周血中CTCs有单细胞和成团簇两种形式，单个CTCs直径在8-19μm之间；CTCs团簇细胞数量可达数十个，整体直径可达100μm以上。

目前经FDA批准用于临床的CTCs检测平台只有Cellsearch系统、CTC-chip和IsoFlux细胞分选仪3种，它们基本采用细胞表面粘附因子和角蛋白为特征生物标志物进行细胞富集分离后检测，其他很少或基本未进入临床应用。根据以上对CTC细胞特性描述，基于生化特征的细胞富集分离技术必然存在漏检，而这种漏检对于具有转移成瘤高风险的CTC具有倾向性，这种漏检可以说对患者非常不利。现有的三种FDA都是基于此技术，其中第一个临床应用的Cellsearch系统已经与2015年底停产。

基于物理特征的物理法中，目前其他用于CTC方面的技术甚至相关专利技术均为单独采用微滤或微流控技术。但是，微滤技术采用高分子材料制成圆形多孔滤膜，只能细胞富集分离和之后分析；微滤技术完全基于大小的CTCs检测技术容易受到血中体积较大白细胞的影响，且这类方法面临最大问题是滤膜上细胞堆积和吸附，从而限制其使用效果；另外由于细胞堆积是随机发生，且堆积的细胞增加微结构上膜的流体阻力，所以通过增加过滤压力改善堆积引起的堵塞无效，甚至导致细胞破裂，最终影响样本的CTCs检出率。至于微流控技术芯片，有螺旋形、梯度柱状等形式，能部分实现富集分离和转移目的，但是微流控技术让细胞在不同构型的微流体环境中移动分离，并保留需要的细胞，该方法为了提高富集分离效果，每分钟流速仅数十微升，整个实验耗时十小时以上；虽然有技术试图改变流动路径，在不造成细胞堆积堵塞时，也能具有高达12ml/min的流速，但是由于高流速造成血小板和红细胞的裂解对后续细胞识别造成影响。

总之，上述基于物理特征的物理法中，细胞富集率和细胞富集纯度，二者互为矛盾，难有两全；同时还具有多个技术问题：流速慢，每分钟仅几微升，实验时间长，多达十几到二十多小时；实际操作容易堵塞，细胞活性受损，甚至破裂等现象；进而导致芯片滤孔变形降低捕获率；捕获的细胞转移出来难，捕获的细胞由于粘附等原因难以被有效转移出来。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微流控芯片，它有效结合了微滤和微流控技术，克服了上述现有技术的缺陷，可以解决血液中稀有细胞，尤其是循环肿瘤细胞的分离富集与转移问题。

本发明的另一目的还在于提供一种微流控芯片夹具，提高了密封效果，并有效克服了芯片滤孔变形的问题。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种微流控芯片，包括硅基衬底和氮化硅层，其中，氮化硅层沉积在硅基衬底的上下两侧，氮化硅层图形化为多个构成阵列的栅形孔。成功将微滤与微流控技术相结合。

优选地，所述多个栅形孔为长方形，相互平行排列。

进一步地，所述栅形孔长宽比10-20:1，宽度为5-10μm，相邻栅形孔氮化硅宽度5-15μm。

优选地，所述氮化硅层为低应力薄膜，其厚度为150-500nm。

优选地，所述芯片的每个单元滤膜结构长度为1.5-6μm。

优选地，还包括一背部保护层，其中，所述上侧的氮化硅层为微过滤膜结构层，所述背部保护层为充液池。

优选地，所述氮化硅层外表面还具有乙烯基吡咯烷酮类单体结构化合物和BSA材料涂层。降低氮化硅表面的静电作用，减少细胞与氮化硅间的粘附，有利于后面高效率转移。

进一步地，所述特殊材料涂层是将微流控芯片加入一定浓度的涂层剂溶液中，在50℃条件下包被反应5-15小时制得。

本发明解决技术问题所采用的另一技术方案是：

一种芯片夹具，包括上夹片、下夹片、密封圈和上述的微流控芯片；

上夹片靠近微流控芯片的一侧具有进样管道，下夹片靠近微流控芯片的一侧具有废液管道。

优选地，所述密封圈为O型圈，上夹片靠近微流控芯片的一侧具有一半弧形圆圈，下夹片靠近微流控芯片的一侧具有一半弧形圆圈，两个半弧形圆圈相面对，用于放置所述O型圈。提高了密封效果，有利于出液端流出，同时大大降低了检测过程中芯片滤孔的变形性，保证了所富集的细胞选择性。

进一步地，微流控芯片在O型圈之内，优选过滤区全部在O型圈之内。

进一步地，上夹片靠近微流控芯片的一侧还具有一环形侧冲流路。优选和O型圈具有同一圆心。配合泵提供持续的波动液流，让细胞与芯片间不易形成稳定粘附，多点对称设计保证芯片各位置均收到有效冲洗。

本发明的有益效果为：

（1）微流控芯片成功将微滤与微流控技术相结合，并采用栅形孔设计替代微滤中常用的圆孔，通过仿真设计的3-D栅形微纳芯片，并根据常见肿瘤细胞的物理特性，优化栅形结构参数、富集分离条件，相比于单独采用微滤或微流控技术，实现了不同类型稀有细胞的富集分离和转移，大大提高了分离能力；

（2）特定栅形参数和氮化硅层厚度的微流控芯片，不仅相比同类芯片在细胞富集和细胞活性方面具有较大优势，其制备成品率也更高；

（3）突破性地在微流控芯片表面形成特殊材料涂层，相比于现有技术中没有特殊材料涂层的芯片，能降低氮化硅表面的静电作用，减少细胞与氮化硅间的粘附，有利于后面高效率转移；

（4）夹具上、下夹片以及O形圈设计将芯片悬空不与上、下夹片直接接触，提高密封效果，有利于出液端流出，同时O形圈将芯片四周固定绷紧，相比于其他同类芯片检测，大大降低了检测过程中芯片滤孔的变形性，保证了所富集的细胞选择性；

（5）独特的环形侧冲流路设计，配合泵提供持续的波动液流，相比于现有技术中没有环形侧冲流路的芯片，让细胞与芯片间不易形成稳定粘附，多点对称设计保证芯片各位置均收到有效冲洗。

附图说明

图1（A）、（B）和（C）、（D）和（E）分别是微流控芯片的微过滤膜结构的示意图、光学显微镜图、扫描电镜（SEM）图。

图2是芯片及夹具空间位置与结构示意图。

图3是芯片夹具组装示意图。

图4是芯片夹具上夹片仰视图。

图5是整体设备示意图。

图6是血液稀有细胞富集分离与转移流程示意图。

具体实施方式

一种微流控芯片，包括硅基衬底和氮化硅层、背部保护层，其中，氮化硅层沉积在硅基衬底的上下两侧，氮化硅层图形化为多个构成阵列的栅形孔。

该微流控芯片成功将微滤与微流控技术相结合，并采用栅形孔设计替代微滤中常用的圆孔，通过仿真设计的3-D栅形微纳芯片，并根据常见肿瘤细胞的物理特性，优化栅形结构参数、富集分离条件，相比于单独采用微滤或微流控技术，实现了不同类型稀有细胞的富集分离和转移，大大提高了分离能力。

微流控芯片的具体制备可以采用如下流程：首先在硅基上下分别沉积150-500nm均一厚度的氮化硅；再分别采用涂胶-光刻-显影-RIE刻蚀的步骤，分别图形化上下层的氮化硅层；最后通过KOH湿法刻蚀方法整体释放出微过滤膜结构。该微流控芯片的微过滤膜结构可参见图1。

其中，上层氮化硅层为微过滤膜结构层，背部保护层为充液池。

其中，根据细胞形态大小等特点初步选取的微过滤单元结构特征尺寸即宽度为5-10微米来分别设计并加工。其优化尺寸根据筛选过程机理研究的结果决定。

微流控芯片的硅基衬底参数为N<100>，400+/-15um；每个单元滤膜结构总尺寸规格1.5-6毫米。

微流控芯片的栅形设计减少降低同类芯片细胞富集过程堵塞现象，也为提高流速和缩短分离时间提供基础，多个栅形孔为长方形，相互平行排列，优选单个栅形孔尺寸长宽比10-20:1，宽度为5-10微米，相邻栅形孔氮化硅宽度5-15微米；芯片氮化硅层厚度影响获得细胞的活性，芯片中氮化硅厚度范围能保证获得的细胞活性不受影响，优选低应力氮化硅薄膜双面厚度（h）为150nm<h<500nm；基于上述参数的芯片制备成品率高，达90%以上，其他类似材料制备芯片成品率远低于采用该参数的芯片。

还可将上述微流控芯片，加入一定浓度的上述涂层剂溶液中，在50℃条件下包被反应5-15小时，最终在氮化硅表面形成涂层; 为进一步提高转移效果，用一定浓度的牛血清白蛋白进行包埋处理。

本发明突破性地在微流控芯片表面形成涂层，相比于现有技术中没有涂层的芯片，能降低氮化硅表面的静电作用，减少细胞与氮化硅间的粘附，有利于后面高效率转移。

本发明还提供了一种相应的芯片夹具，其包括上夹片、下夹片、密封圈和微流控芯片；上夹片靠近微流控芯片的一侧具有进样管道，下夹片靠近微流控芯片的一侧具有废液管道。

其中，芯片夹具整体结构采用三明治结构堆叠方式进行组装设计，芯片的微过滤膜处于结构中间层，上、下夹片分别为微流道及腔室层。上、下夹片可采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），厚度各5-6毫米，上夹片相邻三侧面包埋有侧冲洗管路的两个第一端口1和一个第二端口2，第二端口2在两个第一端口1中间；上夹片靠近微流控芯片的一侧另有一环形流路；下夹片仅有第三端口3，上、下夹片以中央点（对角线交叉点）为原点，直径16-14.5毫米区域间各开一半弧形圆圈，用于放置O形圈。O型圈外径16毫米，线径1.5毫米，采用熟橡胶材质，使得O形圈刚好紧密放置在两个半弧形圆圈组成的完整弧形圆圈内。组装时芯片置于夹具中间位置，优选置于夹具正中央位置，保证O形圈将芯片过滤区全部包含在内。另外夹具下板有两个销柱，上夹片对应位置有两个销孔。整个芯片夹具如图2和图3所示。

夹具上、下夹片以及O形圈设计将芯片悬空不与上、下夹片直接接触，提高密封效果，有利于出液端流出，同时O形圈将芯片四周固定绷紧，相比于其他同类芯片检测，大大降低了检测过程中芯片滤孔的变形性，保证了所富集的细胞选择性。

夹具上夹片的环形流路为环形侧冲流路设计，在上夹片的O型圈内侧，与O型圈为同心圆关系，该环路直径13毫米，管径1.8毫米，环路设两个第一端口1，位置相对设计，两个第一端口1间连线将该环路分为两个半圆；如图4所示，环形流路上在夹具对角线4个交叉点位置开孔，开孔方向为向环外45度倾角。

本发明独特的环形侧冲流路设计，配合第二泵7可以提供持续的波动液流，相比于现有技术中没有环形侧冲流路的芯片，让细胞与芯片间不易形成稳定粘附，多点对称设计保证芯片各位置均收到有效冲洗。

总之，本发明通过优化芯片夹具结构保证芯片在运行中在光学显微镜下无可见变形；通过芯片表面涂层减少芯片与细胞粘附；通过加入抗粘附生物试剂，降低细胞间粘附；最后通过引入间歇波动性流体，将富集分离得细胞从芯片上转移出来，供下游检测需要。

参见图5，本发明的微流控芯片及夹具，可与主机、液体控制系统、样品管4、废液管5相配合，用于血液稀有细胞，尤其是循环肿瘤细胞的富集分离和细胞转移。主机控制所有液体控制系统运行与切换，液体控制系统通过管线、多个第一泵6和一个第二泵7，分别与上样缓冲液管、侧冲缓冲液管、转移缓冲液管、样品管和废液管相连接，所述的样品管4与微流控芯片夹具连接并且相互连通，所述的微流控芯片通过管线与废液管5连接。

血液稀有细胞富集分离与转移具体流程如图6所示。

利用本发明的微流控芯片及夹具，最终的检测结果显示：上样流速0.1-0.2ml/mim，富集分离时间30-40分钟，转移时间10分钟，能去除血液中99.9%以上的红细胞，70%以上的白细胞，富集分离得细胞直径大于8微米，富集细胞转移率大于90%，活性细胞大于90%。基本解决现在同类芯片流速慢、易堵塞、细胞活性低且难以转移的问题。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种微流控芯片，其特征在于：包括硅基衬底和氮化硅层，

其中，氮化硅层沉积在硅基衬底的上下两侧，氮化硅层图形化为多个构成阵列的栅形孔；所述栅形孔长宽比10-20:1，宽度为5-10μm，相邻栅形孔氮化硅宽度为5-15μm；所述氮化硅层为低应力薄膜，其厚度为150-500nm；

所述微流控芯片还包括一背部保护层，其中，所述上侧的氮化硅层为微过滤膜结构层，所述背部保护层为充液池；

所述氮化硅层外表面还具有乙烯基吡咯烷酮类单体结构化合物和BSA特殊材料涂层，可以降低氮化硅的静电作用，减少与细胞间粘附；

所述特殊材料涂层是将微流控芯片加入一定浓度的涂层剂溶液中，在50℃条件下包被反应5-15小时制得。

2.一种芯片夹具，其特征在于：包括上夹片、下夹片、密封圈和权利要求1所述的微流控芯片；

上夹片靠近微流控芯片的一侧具有进样管道，下夹片靠近微流控芯片的一侧具有废液管道；

其中，所述密封圈为O型圈，上夹片靠近微流控芯片的一侧具有一半弧形圆圈，下夹片靠近微流控芯片的一侧具有一半弧形圆圈，两个半弧形圆圈相面对，用于放置所述O型圈；微流控芯片在所述O型圈之内；上夹片靠近微流控芯片的一侧还具有一环形侧冲流路。

Images