CN110464880B - 一种人工胰岛或人工胰腺及其制备方法 - Google Patents

一种人工胰岛或人工胰腺及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人工胰岛或人工胰腺及其制备方法，所述人工胰岛或人工胰腺包括具有多孔结构的支撑体和生长于所述支撑体的多孔结构中的能够分泌胰岛素的细胞；人工胰岛或人工胰腺的制备步骤包括：制备PLGA多孔球支撑体；将能够分泌胰岛素的细胞种植于所述PLGA多孔球支撑体中，以及检测所述PLGA多孔球支撑体中种植的细胞。本发明的人工胰岛或人工胰腺的构建基于PLGA或聚乳酸高分子球的多孔结构及其良好的生物降解性和生物相容性，有利于有效模拟胰岛的结构和生理功能。本发明构建的人工胰岛或人工胰腺多孔球内有胰岛素分泌细胞且细胞形态良好，整体形貌及尺寸与正常小鼠胰岛类似，为解决临床胰岛移植缺少供体提供了有效的解决方案。

Description

一种人工胰岛或人工胰腺及其制备方法
技术领域
本发明属于人工胰岛技术领域，具体涉及一种人工胰岛或人工胰腺及其制备方法。
背景技术
目前全球糖尿病患病人数约为4.25亿，而每年死于糖尿病人数也超过400万人。糖尿病是胰岛素分泌相对或绝对不足所致的代谢性疾病，因此，胰岛素是治疗糖尿病的首选药物。然而，目前糖尿病的治疗主要依赖于外源性胰岛素注射，其无法准确模拟体内随时变化的胰岛素需求。因此在控制空腹血糖、治疗糖尿病及其并发症方面，胰岛素注射仍然存在缺陷。而降糖类药物大都是依赖于刺激胰岛细胞释放胰岛素或增强代谢器官对胰岛素的敏感度，也不适用于大部分胰岛细胞坏死的重度糖尿病患者。
胰腺的胰岛包含不同种类的细胞，是可表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑制素的混合细胞团，其中大多数为可产生胰岛素的β细胞，占总胰岛数目的65-80％，胰岛β细胞也是迄今为止已知的，体内唯一能够分泌胰岛素的细胞。
理论上，胰岛移植能够逆转糖尿病患者的高血糖。然而，器官捐献供体胰岛的缺乏和慢性免疫抑制对健康的风险限制了胰岛移植成为一种临床可行的糖尿病治疗方式。因此,对人工胰腺/人工胰岛的需求仍是临床根治糖尿病的难点之一。人工胰岛的构建，主要围绕的是能够构建释放胰岛素的、可模拟胰岛分泌胰岛素功能的胰岛素分泌细胞团。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是一种被美国Food&Drug Association(FDA)认可的可用于人类药用辅料的高分子聚合物。研究发现，PLGA具有良好的生物降解性和生物相容性，作为生物材料在临床应用中有广泛的用途。利用多孔微球具有低密度特性，常作为吸入式肺部给药研究(Science 1997，276，1868)；而利用其多孔结构物质转运特性和细胞负载功能，在可注射细胞载体方面受到关注(Biomaterials 2012，33，4069)。同时，利用多孔微球作为组分形成复合凝胶在植入式胰岛素长效缓释方面具有应用前景(专利申请201610493506.X，一种葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物复合凝胶及其制备方法和应用)。然而，与传统认为多孔球负载无选择性负载各种细胞作为可注射细胞递送载体相比，利用多孔球近似的胰腺“网兜”状结构，特异性负载胰岛细胞构建人工胰岛或人工胰腺，使之具备分泌胰岛素功能，在人工器官领域还未见报道。该人工胰岛或人工胰腺类人工器官在糖尿病治疗方面具有重要应用前景。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的一个目的是提供一种人工胰岛或人工胰腺，以多孔微球作为支撑，使beta-TC-6细胞在多孔微球内生长，促进类似于胰岛生理结构的细胞团的形成，以模拟胰岛的结构和生理功能。
本发明的又一个目的是提供一种制备上述人工胰岛或人工胰腺的制备方法。
本发明采用如下的技术实现上述目的：
一种人工胰岛或人工胰腺，包括具有多孔结构的可降解的高分子支撑体和生长于所述支撑体的多孔结构中的能够分泌胰岛素的细胞。
优选地，所述支撑体为PLGA多孔微球结构或聚乳酸多孔微球。即本发明的人工胰岛或人工胰腺的构建基于PLGA多孔球。
优选地，所述支撑体为PLGA多孔微球结构，且所述支撑体的平均粒径范围为50-500μm。
优选地，所述多孔微球结构中孔的直径为5-50μm。
优选地，所述细胞为具有向特定功能细胞分化潜能的胰岛β细胞。
进一步地，所述细胞为beta-TC-6细胞、能够分泌胰岛素的干细胞或胰腺细胞中的一种或多种。
本发明还提供了上述的人工胰岛或人工胰腺的制备方法，包括步骤：
(1)制备PLGA多孔球支撑体；
(2)将能够分泌胰岛素的细胞种植于所述PLGA多孔球支撑体中；
(3)检测所述PLGA多孔球支撑体中种植的细胞。
优选地，还包括检测共培养细胞在葡萄糖溶液刺激下分泌的胰岛素含量。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明效果之一在于本发明人工胰岛或人工胰腺的构建基于PLGA或聚乳酸的多孔结构，PLGA具有良好的生物降解性和生物相容性，PLGA多孔微球既能够促进类似于胰岛生理结构的细胞团的形成，还允许营养物质和胰岛素进出，有利于有效模拟胰岛的结构和生理功能。
(2)本发明构建的人工胰岛或人工胰腺多孔球内有胰岛素分泌细胞且细胞形态良好；整体形貌及尺寸与正常小鼠胰岛类似；
(3)本发明方法简单，反应条件温和，操作简便易行，易于工业化，所得的人工胰岛或人工胰腺可为解决临床胰岛移植缺少供体的关键问题提供有效的解决方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为beta-TC-6细胞正常条件下的细胞培养图；
图2为beta-TC-6细胞表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑制素信使RNA的结果图；
图3为显微镜下小鼠胰岛形貌图；
图4为制备的得到的PLGA多孔微球的SEM图；
图5为显微镜下PLGA多孔球形貌图；
图6为冰冻切片观察到的内部细胞形貌图，图中高亮区域为细胞；
图7为PLGA多孔球在葡萄糖刺激下分泌胰岛素的情况图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
考虑到PLGA良好的生物学特性以及其在化学加工方面的灵活性，本发明构建并制备了一种人工胰岛或人工胰腺。本发明采用ATCC提供的beta-TC-6细胞(源于小鼠胰腺)作为具体的能够分泌胰岛素的细胞。如图1所示，beta-TC-6细胞为贴壁细胞，虽能够在高浓度葡萄糖刺激下分泌胰岛素，但无法形成存活率高的类胰岛细胞团。
考虑到beta-TC-6细胞对高浓度葡萄糖的响应性，该类细胞(以及其他类似胰腺细胞及胰岛素分泌干细胞等)具备可构建的基本条件。本发明的研究发现beta-TC-6细胞可表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑制素信使RNA，聚合酶链式反应polymerase chainreaction引物及结果见图2。图3为显微镜下观察到的小鼠胰岛形貌。
胰岛是包含可表达这三种激素的混合细胞团，因此使用上述细胞或可构建更加类似于生理胰岛特性及功能的类胰岛细胞团(人工胰岛或人工胰腺)。然而beta-TC-6细胞为贴壁细胞，而胰岛是悬浮细胞团，因此PLGA多孔微球作为支撑体，使beta-TC-6细胞在多孔微球内生长，以多孔微球作为支撑，这样既能够促进类似于胰岛生理结构的细胞团的形成，多孔球表面的孔也能够允许养分以及胰岛素等激素的进出，以此模拟胰岛的结构和生理功能。
实施例1：制备PLGA多孔微球支撑体：
S1、将200毫克PLGA(分子量为10000-100000)充分溶解在8毫升的二氯甲烷中制备成油相，在搅拌条件下滴加1％的NH4HCO3溶液(致孔剂)形成初乳。
S2、将初乳转移至0.1％的PVA水溶液中，形成复乳，搅拌3小时；收集PLGA多孔微球。
S3、去离子水洗涤3次，使用0.1M的NaOH溶液洗涤20分钟后去离子水洗涤3次后分装。
S4、冷冻干燥后得到PLGA多孔微球固体粉末。
所得PLGA多孔微球的SEM图如图4所示。得到的PLGA多孔微球的平均粒径范围为50-500μm，多孔微球结构中孔的直径为5-50μm。
实施例2：将beta-TC-6细胞种植于PLGA多孔微球
静置步实施例1所得PLGA微球悬液，除去悬浮液，备用；胰酶消化beta-TC-6细胞后计数，取约1×10^7个细胞置于20mL注射器中，定容至4mL，负压抽打40-60次，并置于加有PLGA多孔球的培养基中培养7天。取PLGA微球和beta-TC-6细胞的共培养体系固定、制作包埋切片，冷冻切片染色，分析PLGA多孔球内细胞的形态和存活情况，如图5和图6所示。通过冰冻切片发现，多孔球内有胰岛素分泌细胞且细胞形态良好；整体形貌及尺寸与正常小鼠胰岛类似。
实施例3
对共培养细胞在第7天进行胰岛素释放试验：即在细胞和/或PLGA多孔微球中加入20mmol/L的高浓度葡萄糖溶液，检测体系中胰岛素含量。
本发明的实施例还分析了共培养细胞在低浓度的葡萄糖溶液(2-5mmol/L)下分泌胰岛素的情况，如图7所示。研究发现基于多孔球的人工胰岛或人工胰腺具有高糖刺激后分泌胰岛素的功能。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (5)

1.一种人工胰岛或人工胰腺，其特征在于，包括具有多孔结构的可降解的高分子支撑体和生长于所述支撑体的多孔结构中的能够分泌胰岛素的细胞；
所述支撑体为PLGA多孔微球结构，且所述支撑体的平均粒径范围为50-500μm；
所述PLGA多孔微球结构中孔的直径为5-50μm。
2.如权利要求1所述的人工胰岛或人工胰腺，其特征在于，所述细胞为具有向特定功能细胞分化潜能的胰岛β细胞。
3.如权利要求2所述的人工胰岛或人工胰腺，其特征在于，所述细胞为beta-TC-6细胞、能够分泌胰岛素的干细胞或胰腺细胞中的一种或多种。
4.权利要求1-3任意一项所述的人工胰岛或人工胰腺的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)制备PLGA多孔球支撑体；
(2)将能够分泌胰岛素的细胞种植于所述PLGA多孔球支撑体中；
(3)检测所述PLGA多孔球支撑体中种植的细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括检测共培养细胞在葡萄糖溶液刺激下分泌的胰岛素含量。
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