CN110452938A - 一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法 - Google Patents

一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法,针对现有的谷氨酰胺的生产成本较高、安全性低、所得率不高至产量低的问题,现如今提出如下方案,包括以下步骤:(1)发酵菌株的选择:取2000株黄色短杆菌的变种菌株;(2)菌株斜面的制备:将所述步骤(1)的菌株接种斜面,在25‑35℃恒温培养6‑21小时,得第一斜面,然后再将第一斜面接种第二斜面,在25‑35℃恒温培养6‑21小时,制得菌株斜面。本发明的发酵生成方法可替代化工合成生产方法的谷氨酰胺,发酵所得的谷氨酰胺能获得较好的得率,产量高,同时采用低廉的材料,降低了生产成本,操作简单,安全性高,更加利于工业化规模生产。

Description

一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法
技术领域
本发明涉及发酵领域,尤其涉及一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法。
背景技术
谷氨酰胺是一种中性多功能氨基酸,因其独特而复杂的生理功能逐渐成为了营养学、生理学、免疫学等学科的研究热点。谷氨酰胺具有维持机体酸碱平衡,调节机体免疫功能等诸多的生理作用,是治疗肠溃疡、慢性胃炎的有效药物,它不仅为机体物质和能量代谢提供原料,而且为核酸、糖蛋白等的生物合成提供氮。
目前谷氨酰胺的生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法。现有化学合成法均采用浓硫酸作为必需的催化剂,反应条件苛刻、反应步骤多、收率低。酶法合成谷氨酰胺主要是以NH3、三磷酸腺苷(ATP)及谷氨酸作为原料经合成酶催化生成谷氨酰胺。与化学合成法相比,酶法合成反应步骤相对简单。然而其中ATP是必需的,而ATP价格昂贵,难以在工业上应用。同时,酶反应底物NH 、副产物二磷酸腺苷(ADP)都明显抑制谷氨酰胺的生成,反应收率低。因此酶法合成谷氨酰胺不能满足大规模工业化生产的需要。同时发酵液中分离提取谷氨酰胺是发酵法生产谷氨酰胺的重要步骤,直接影响谷氨酰胺产品生产效率,造成提取成本高,进而造成生成成本高,因此,我们提出了一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点,而提出的一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法。
一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法,包括以下步骤:
(1)发酵菌株的选择:取2000株黄色短杆菌的变种菌株;
(2)菌株斜面的制备:将所述步骤(1)的菌株接种斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,得第一斜面,然后再将第一斜面接种第二斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,制得菌株斜面;
(3)菌种混液的制备:取所述步骤(2)的菌株斜面的表面覆盖的孢子,制成孢子活化液,在培养过程的4-7h控制风量和转速使溶氧降低至17-22%,培养结束得到菌种混液;
(4)发酵培养基的制备:取玉米粉50-150g/L、黄豆饼粉4-9g/L、酵母粉7-20g/L,之后加入100ml/L蒸馏水,充分搅拌后通入蒸汽升温加热,保持120-125℃、0.4MPa的条件1小时,然后加入葡萄糖10-40g/L、磷酸二氢钾6-10g/L、硫酸镁1-1.8g/L、碳酸锌3-6g/L、碳酸氢钠3-10g/L、碳酸钠10-15g/L、硫酸锰1g-2g/L、硫酸铜0.1-0.2g/L、维生素B1 0.1-.02g/L、硫酸铁0.01-0.03g/L、生物素H 0.01-0.02mg/L,余量加入蒸馏水,搅拌后静置10min,制得发酵培养基;
(5)混合密封发酵:将所述步骤(3)菌种混液与所述步骤(4)的发酵培养基按照体积比为1:15的比例配比进行充分混合搅拌后密封,制得发酵罐体;
(6)温度和PH的控制:将所述步骤(5)的发酵罐体在33℃下培养,在第1-36小时将PH控制在7.0-7.4,36小时后将PH控制在6.3-6.7,并发酵46-50小时,能获得高产的谷氨酰胺获得率,并结束发酵,得谷氨酰胺发酵液;
(7)发酵液的结晶:取步骤(6)的谷氨酰胺发酵液降温至常温,经过陶瓷膜的过滤得滤液浓缩,后冷却结晶、分离得到结晶粗品,然后加入结晶粗品重量35-65%的水洗晶,分离得洗晶粗品;
(8)洗晶粗品的脱盐:取所述步骤(7)的洗晶粗品加水溶解,先加入阳离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阳离子交换树脂,然后再加入阴离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阴离子交换树脂,得到脱盐液,过滤得到脱盐液;
(9)谷氨酰胺的提取:取所述步骤(8)的脱盐液经过纳滤膜过滤得到纳滤液,纳滤液加热至45-50℃后加入活性炭脱色、过滤得脱色液,后冷却结晶,干燥后得谷氨酰胺成品。
优选的,所述步骤(7)和步骤(9)的冷却结晶为缓慢降温至5-10℃,维持12-16小时。
优选的,所述步骤(4)中的搅拌转速均控制为70-100r/min,控制时间18-25min。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明提出的一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法,发酵所得的谷氨酰胺能获得较好的得率,产量高;同时采用低廉的材料,降低了生产成本,更加利于工业化规模生产;同时谷氨酰胺的提取方法大大提高了提取谷氨酰胺的纯度,操作简单,安全性高,成本低,适合工业化生产;
本发明,本发明的发酵生成方法可替代化工合成生产方法的谷氨酰胺,发酵所得的谷氨酰胺能获得较好的得率,产量高,同时采用低廉的材料,降低了生产成本,操作简单,安全性高,更加利于工业化规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例一
本发明提出的一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法,包括以下步骤:
(1)发酵菌株的选择:取2000株黄色短杆菌的变种菌株;
(2)菌株斜面的制备:将步骤(1)的菌株接种斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,得第一斜面,然后再将第一斜面接种第二斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,制得菌株斜面;
(3)菌种混液的制备:取步骤(2)的菌株斜面的表面覆盖的孢子,制成孢子活化液,在培养过程的4-7h控制风量和转速使溶氧降低至17-22%,培养结束得到菌种混液;
(4)发酵培养基的制备:取玉米粉50-150g/L、黄豆饼粉4-9g/L、酵母粉7-20g/L,之后加入100ml/L蒸馏水,充分搅拌后通入蒸汽升温加热,保持120-125℃、0.4MPa的条件1小时,然后加入葡萄糖10-40g/L、磷酸二氢钾6-10g/L、硫酸镁1-1.8g/L、碳酸锌3-6g/L、碳酸氢钠3-10g/L、碳酸钠10-15g/L、硫酸锰1g-2g/L、硫酸铜0.1-0.2g/L、维生素B1 0.1-.02g/L、硫酸铁0.01-0.03g/L、生物素H 0.01-0.02mg/L,余量加入蒸馏水,搅拌后静置10min,制得发酵培养基;
(5)混合密封发酵:将步骤(3)菌种混液与步骤(4)的发酵培养基按照体积比为1:15的比例配比进行充分混合搅拌后密封,制得发酵罐体;
(6)温度和PH的控制:将步骤(5)的发酵罐体在33℃下培养,在第1-36小时将PH控制在7.0-7.4,36小时后将PH控制在6.3-6.7,并发酵46-50小时,能获得高产的谷氨酰胺获得率,并结束发酵,得谷氨酰胺发酵液;
(7)发酵液的结晶:取步骤(6)的谷氨酰胺发酵液降温至常温,经过陶瓷膜的过滤得滤液浓缩,后冷却结晶、分离得到结晶粗品,然后加入结晶粗品重量35-65%的水洗晶,分离得洗晶粗品;
(8)洗晶粗品的脱盐:取步骤(7)的洗晶粗品加水溶解,先加入阳离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阳离子交换树脂,然后再加入阴离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阴离子交换树脂,得到脱盐液,过滤得到脱盐液;
(9)谷氨酰胺的提取:取步骤(8)的脱盐液经过纳滤膜过滤得到纳滤液,纳滤液加热至45-50℃后加入活性炭脱色、过滤得脱色液,后冷却结晶,干燥后得谷氨酰胺成品。
其中,步骤(7)和步骤(9)的冷却结晶为缓慢降温至5℃,维持12小时。
其中,步骤(4)中的搅拌转速均控制为70r/min,控制时间18min。
实施例二
本发明提出的一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法,包括以下步骤:
(1)发酵菌株的选择:取2000株黄色短杆菌的变种菌株;
(2)菌株斜面的制备:将步骤(1)的菌株接种斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,得第一斜面,然后再将第一斜面接种第二斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,制得菌株斜面;
(3)菌种混液的制备:取步骤(2)的菌株斜面的表面覆盖的孢子,制成孢子活化液,在培养过程的4-7h控制风量和转速使溶氧降低至17-22%,培养结束得到菌种混液;
(4)发酵培养基的制备:取玉米粉50-150g/L、黄豆饼粉4-9g/L、酵母粉7-20g/L,之后加入100ml/L蒸馏水,充分搅拌后通入蒸汽升温加热,保持120-125℃、0.4MPa的条件1小时,然后加入葡萄糖10-40g/L、磷酸二氢钾6-10g/L、硫酸镁1-1.8g/L、碳酸锌3-6g/L、碳酸氢钠3-10g/L、碳酸钠10-15g/L、硫酸锰1g-2g/L、硫酸铜0.1-0.2g/L、维生素B1 0.1-.02g/L、硫酸铁0.01-0.03g/L、生物素H 0.01-0.02mg/L,余量加入蒸馏水,搅拌后静置10min,制得发酵培养基;
(5)混合密封发酵:将步骤(3)菌种混液与步骤(4)的发酵培养基按照体积比为1:15的比例配比进行充分混合搅拌后密封,制得发酵罐体;
(6)温度和PH的控制:将步骤(5)的发酵罐体在33℃下培养,在第1-36小时将PH控制在7.0-7.4,36小时后将PH控制在6.3-6.7,并发酵46-50小时,能获得高产的谷氨酰胺获得率,并结束发酵,得谷氨酰胺发酵液;
(7)发酵液的结晶:取步骤(6)的谷氨酰胺发酵液降温至常温,经过陶瓷膜的过滤得滤液浓缩,后冷却结晶、分离得到结晶粗品,然后加入结晶粗品重量35-65%的水洗晶,分离得洗晶粗品;
(8)洗晶粗品的脱盐:取步骤(7)的洗晶粗品加水溶解,先加入阳离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阳离子交换树脂,然后再加入阴离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阴离子交换树脂,得到脱盐液,过滤得到脱盐液;
(9)谷氨酰胺的提取:取步骤(8)的脱盐液经过纳滤膜过滤得到纳滤液,纳滤液加热至45-50℃后加入活性炭脱色、过滤得脱色液,后冷却结晶,干燥后得谷氨酰胺成品。
其中,步骤(7)和步骤(9)的冷却结晶为缓慢降温至8℃,维持13小时。
其中,步骤(4)中的搅拌转速均控制为80r/min,控制时间20min。
实施例三
本发明提出的一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法,包括以下步骤:
(1)发酵菌株的选择:取2000株黄色短杆菌的变种菌株;
(2)菌株斜面的制备:将步骤(1)的菌株接种斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,得第一斜面,然后再将第一斜面接种第二斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,制得菌株斜面;
(3)菌种混液的制备:取步骤(2)的菌株斜面的表面覆盖的孢子,制成孢子活化液,在培养过程的4-7h控制风量和转速使溶氧降低至17-22%,培养结束得到菌种混液;
(4)发酵培养基的制备:取玉米粉50-150g/L、黄豆饼粉4-9g/L、酵母粉7-20g/L,之后加入100ml/L蒸馏水,充分搅拌后通入蒸汽升温加热,保持120-125℃、0.4MPa的条件1小时,然后加入葡萄糖10-40g/L、磷酸二氢钾6-10g/L、硫酸镁1-1.8g/L、碳酸锌3-6g/L、碳酸氢钠3-10g/L、碳酸钠10-15g/L、硫酸锰1g-2g/L、硫酸铜0.1-0.2g/L、维生素B1 0.1-.02g/L、硫酸铁0.01-0.03g/L、生物素H 0.01-0.02mg/L,余量加入蒸馏水,搅拌后静置10min,制得发酵培养基;
(5)混合密封发酵:将步骤(3)菌种混液与步骤(4)的发酵培养基按照体积比为1:15的比例配比进行充分混合搅拌后密封,制得发酵罐体;
(6)温度和PH的控制:将步骤(5)的发酵罐体在33℃下培养,在第1-36小时将PH控制在7.0-7.4,36小时后将PH控制在6.3-6.7,并发酵46-50小时,能获得高产的谷氨酰胺获得率,并结束发酵,得谷氨酰胺发酵液;
(7)发酵液的结晶:取步骤(6)的谷氨酰胺发酵液降温至常温,经过陶瓷膜的过滤得滤液浓缩,后冷却结晶、分离得到结晶粗品,然后加入结晶粗品重量35-65%的水洗晶,分离得洗晶粗品;
(8)洗晶粗品的脱盐:取步骤(7)的洗晶粗品加水溶解,先加入阳离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阳离子交换树脂,然后再加入阴离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阴离子交换树脂,得到脱盐液,过滤得到脱盐液;
(9)谷氨酰胺的提取:取步骤(8)的脱盐液经过纳滤膜过滤得到纳滤液,纳滤液加热至45-50℃后加入活性炭脱色、过滤得脱色液,后冷却结晶,干燥后得谷氨酰胺成品。
其中,步骤(7)和步骤(9)的冷却结晶为缓慢降温至9℃,维持15小时。
其中,步骤(4)中的搅拌转速均控制为90r/min,控制时间22min。
实施例四
本发明提出的一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法,包括以下步骤:
(1)发酵菌株的选择:取2000株黄色短杆菌的变种菌株;
(2)菌株斜面的制备:将步骤(1)的菌株接种斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,得第一斜面,然后再将第一斜面接种第二斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,制得菌株斜面;
(3)菌种混液的制备:取步骤(2)的菌株斜面的表面覆盖的孢子,制成孢子活化液,在培养过程的4-7h控制风量和转速使溶氧降低至17-22%,培养结束得到菌种混液;
(4)发酵培养基的制备:取玉米粉50-150g/L、黄豆饼粉4-9g/L、酵母粉7-20g/L,之后加入100ml/L蒸馏水,充分搅拌后通入蒸汽升温加热,保持120-125℃、0.4MPa的条件1小时,然后加入葡萄糖10-40g/L、磷酸二氢钾6-10g/L、硫酸镁1-1.8g/L、碳酸锌3-6g/L、碳酸氢钠3-10g/L、碳酸钠10-15g/L、硫酸锰1g-2g/L、硫酸铜0.1-0.2g/L、维生素B1 0.1-.02g/L、硫酸铁0.01-0.03g/L、生物素H 0.01-0.02mg/L,余量加入蒸馏水,搅拌后静置10min,制得发酵培养基;
(5)混合密封发酵:将步骤(3)菌种混液与步骤(4)的发酵培养基按照体积比为1:15的比例配比进行充分混合搅拌后密封,制得发酵罐体;
(6)温度和PH的控制:将步骤(5)的发酵罐体在33℃下培养,在第1-36小时将PH控制在7.0-7.4,36小时后将PH控制在6.3-6.7,并发酵46-50小时,能获得高产的谷氨酰胺获得率,并结束发酵,得谷氨酰胺发酵液;
(7)发酵液的结晶:取步骤(6)的谷氨酰胺发酵液降温至常温,经过陶瓷膜的过滤得滤液浓缩,后冷却结晶、分离得到结晶粗品,然后加入结晶粗品重量35-65%的水洗晶,分离得洗晶粗品;
(8)洗晶粗品的脱盐:取步骤(7)的洗晶粗品加水溶解,先加入阳离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阳离子交换树脂,然后再加入阴离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阴离子交换树脂,得到脱盐液,过滤得到脱盐液;
(9)谷氨酰胺的提取:取步骤(8)的脱盐液经过纳滤膜过滤得到纳滤液,纳滤液加热至45-50℃后加入活性炭脱色、过滤得脱色液,后冷却结晶,干燥后得谷氨酰胺成品。
其中,步骤(7)和步骤(9)的冷却结晶为缓慢降温至10℃,维持16小时。
其中,步骤(4)中的搅拌转速均控制为100r/min,控制时间25min。
本发明提出的一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法,发酵所得的谷氨酰胺能获得较好的得率,产量高;同时采用低廉的材料,降低了生产成本,更加利于工业化规模生产;同时谷氨酰胺的提取方法大大提高了提取谷氨酰胺的纯度,操作简单,安全性高,成本低,适合工业化生产。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种高产谷氨酰胺的发酵生产方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)发酵菌株的选择:取2000株黄色短杆菌的变种菌株;
(2)菌株斜面的制备:将所述步骤(1)的菌株接种斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,得第一斜面,然后再将第一斜面接种第二斜面,在25-35℃恒温培养6-21小时,制得菌株斜面;
(3)菌种混液的制备:取所述步骤(2)的菌株斜面的表面覆盖的孢子,制成孢子活化液,在培养过程的4-7h控制风量和转速使溶氧降低至17-22%,培养结束得到菌种混液;
(4)发酵培养基的制备:取玉米粉50-150g/L、黄豆饼粉4-9g/L、酵母粉7-20g/L,之后加入100ml/L蒸馏水,充分搅拌后通入蒸汽升温加热,保持120-125℃、0.4MPa的条件1小时,然后加入葡萄糖10-40g/L、磷酸二氢钾6-10g/L、硫酸镁1-1.8g/L、碳酸锌3-6g/L、碳酸氢钠3-10g/L、碳酸钠10-15g/L、硫酸锰1g-2g/L、硫酸铜0.1-0.2g/L、维生素B1 0.1-.02g/L、硫酸铁0.01-0.03g/L、生物素H 0.01-0.02mg/L,余量加入蒸馏水,搅拌后静置10min,制得发酵培养基;
(5)混合密封发酵:将所述步骤(3)菌种混液与所述步骤(4)的发酵培养基按照体积比为1:15的比例配比进行充分混合搅拌后密封,制得发酵罐体;
(6)温度和PH的控制:将所述步骤(5)的发酵罐体在33℃下培养,在第1-36小时将PH控制在7.0-7.4,36小时后将PH控制在6.3-6.7,并发酵46-50小时,能获得高产的谷氨酰胺获得率,并结束发酵,得谷氨酰胺发酵液;
(7)发酵液的结晶:取步骤(6)的谷氨酰胺发酵液降温至常温,经过陶瓷膜的过滤得滤液浓缩,后冷却结晶、分离得到结晶粗品,然后加入结晶粗品重量35-65%的水洗晶,分离得洗晶粗品;
(8)洗晶粗品的脱盐:取所述步骤(7)的洗晶粗品加水溶解,先加入阳离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阳离子交换树脂,然后再加入阴离子交换树脂,搅拌1.5小时,过滤除去阴离子交换树脂,得到脱盐液,过滤得到脱盐液;
(9)谷氨酰胺的提取:取所述步骤(8)的脱盐液经过纳滤膜过滤得到纳滤液,纳滤液加热至45-50℃后加入活性炭脱色、过滤得脱色液,后冷却结晶,干燥后得谷氨酰胺成品。
2.根据权利要求1所述的一种青稞麦绿素的提取方法,其特征在于,所述步骤(7)和步骤(9)的冷却结晶为缓慢降温至5-10℃,维持12-16小时。
3.根据权利要求1所述的一种青稞麦绿素的提取方法,其特征在于,所述步骤(4)中的搅拌转速均控制为70-100r/min,控制时间18-25min。
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