CN110447662B - 作为植物防御诱导剂/刺激剂的红藻洋菜植物的提取物及提取物馏分的用途及应用 - Google Patents
作为植物防御诱导剂/刺激剂的红藻洋菜植物的提取物及提取物馏分的用途及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110447662B CN110447662B CN201910375874.8A CN201910375874A CN110447662B CN 110447662 B CN110447662 B CN 110447662B CN 201910375874 A CN201910375874 A CN 201910375874A CN 110447662 B CN110447662 B CN 110447662B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- extract
- plant
- residue
- fraction
- plants
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
- A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
- A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/03—Algae
Abstract
本发明提供作为植物防御诱导剂/刺激剂的红藻洋菜植物的提取物及提取物馏分的用途及应用。从至少一种红藻洋菜植物中提取的提取物或提取物馏分，作为陆生植物防御的诱导剂/刺激剂来使用；所述提取物或提取物馏分含有至少一种具有2至50个彼此共价连接的糖单元的寡糖，以及具有多于50个彼此共价连接的糖单元的多糖，其含量不超过总寡糖/多糖重量的0.01％。
Description
技术领域
本发明涉及在陆地植物中作为天然防御刺激物出现的红藻洋菜(agarophyte redalga)植物的提取物，特别是天然提取物或提取物馏分的用途。本发明还同时涉及获得这些提取物或提取物馏分的方法。
本发明包括获取红藻洋菜植物的提取物及其作为天然防御的诱导剂或刺激物的用途，天然防御指的是植物面对生物胁迫所具有抗性表达的能力。
背景技术
在农业领域使用杀虫剂等化学品受到法国Ecophyto2计划的限制。目标是到2025年将农药等植物保护化学品的使用减半，同时保持农业产量，并建议开发和实施替代方法，如使用诱导剂。这将有助于实现Ecophyto计划的目标，并减少与使用农药有关的风险和影响。
诱导剂是发出识别植物中病原微生物的信号分子，能够特异性结合膜受体。作为诱导剂和特异性受体之间相互作用的结果，在细胞水平观察到级联的信号传导事件。有各种各样的膜受体，每个可以容纳明确定义的诱导剂(Benhamou,N.,和Rey,P.，(2012)，植物天然防御的刺激物：在可持续生态生产背景下的新植物检疫战略：一、诱导抗性原理，植物保护(Stimulateurs des défenses naturelles des plantes:une nouvelle stratégiephytosanitaire dans un contexte d'écoproduction durable.:I.Principes de la résistance induite.Phytoprotection)92，1)。
在此种意义上，依据相互作用，将观察到：
-膜去极化，G蛋白及蛋白激酶激活，细胞内钙离子释放；
-植物激素、酶、应激蛋白、蛋白酶抑制剂、具有抗菌潜力的次级代谢产物(包括植物抗毒素)的生物合成途径中涉及的防御基因表达；
-活性氧形式(FAOs，active forms of oxygen)的积累，FAOs是具有直接抗菌活性的高活性分子，也参与过敏反应和细胞壁强化的过程。
活性氧形式(FAOs)的积累是一种触发自由基产生的事件，通常自由基在植物中少量存在。在受到攻击的过程中，该平衡遭到破坏，自由基的过量产生会对病原体有毒性，但因为过量的自由基会破坏DNA、蛋白质、某些酶类和膜脂等分子，同时对植物自身也产生毒性。因此病原体的攻击区可能是坏死的(过敏反应)。为了最大程度减少活性氧形式(FAOs)的此种负面影响，植物具有引导其周围作用的酶，例如过氧化物酶。因此，氧化爆发通常伴随着过氧化物酶的产生。酶的产生会使FAOs(例如H2O2)失活，因此过氧化物酶可能是植物的防御标记。
信号事件在强度和外观顺序方面因植物而异，并且在应激信号转导中起主要作用。根据诱导剂性质的不同，机体采取不同的反应来抵抗病原体。在这些反应中，可以观察到细胞壁强化，且在致病生物进入的地方合成了小突起。
酚类化合物、二氧化硅、胼胝质、蛋白质、糖蛋白(HRGPs)、木栓质或木质素的快速和局部外积可以增厚细胞壁(Garcia-Brugger A.,Lamotte O.,Vandelle,E.,Bourque,S.,Le-courieux,D.,Poinssot,B.,Wendehenne,D.和Pugin,A.，(2006)，植物防御诱导剂引发的早期信号事件，分子植物-微生物相互作用(Early Signaling Events Induced byElicitors of Plant Defenses.Microbe Interactions)，19,711–724；Senthil-Kumar,M.和Mysore,K.S.，(2013)，非宿主抗细菌病原体：回顾与展望，植物病理学年度回顾(NonhostResistance Against Bacterial Pathogens:Retrospective and Prospects,AnnualReview of Phytopathology)，51,407–427)。
在攻击区域中木质素的产生是通过使用催化酶，如苯丙氨酸解氨酶(PAL)来进行的，苯丙氨酸解氨酶是苯丙酸的生物合成所必需的。
该植物具有多样化的“武器库”，使其能够自我保护并适应它所承受的压力类型。诱导剂诱导的抗性类型是获得性系统抗性。它是对整株植物的广泛抗性。此种抗性允许针对病原体及新的潜在攻击开启优化防御。尤其是，在SDN有效时，此种抗性使植物处在恒定警觉状态中。它是一种预防性方法，可在植物中诱导抗性并大大减少对病原体攻击的响应时间。所采用的策略是为植物提供低浓度的诱导剂，以便大大减少对攻击的反应时间(Levine,A.,Tenhaken,R.,Dixon,R.和Lamb,C.，(1994)，来自氧化爆发的H2O2协调植物过敏性疾病抗性反应，79号细胞(H2O2from the oxidative burst orchestrates the planthypersensitive disease resistance response,Cell 79)，583–593；Bolwell,G.P，(1999)，活性氧和一氧化氮在植物防御反应中的作用，植物生物学的当前观点(Role ofactive oxygen species and NO in plant defence responses.Current Opinion inPlant Biology)，2，287–294)。
可以区分生物来源的诱导剂、非生物来源的外界压力(如重金属)、某些洗涤剂、某些抗生素和紫外线辐射。在藻类中发现生物诱导剂是常见的。实际上，红色、绿色和褐色藻类具有各种特定的壁多糖，这些多糖能够作为生物诱导剂本身或以解聚形式发挥作用(Vera，2011)。特别是，富含角叉菜胶的红藻具有角叉菜胶，其寡糖衍生物具有诱导剂属性(US20100173779A1和US20110099898A1)。应该注意的是，在没有琼脂专属L-半乳糖(agar-exclusive L-galactose)和3,6脱水-L-半乳糖(3,6anhydro-L-galactose)的情况下，角叉菜胶与琼脂不同。一些绿藻具有石莼聚糖(ulvans)，其一旦解聚，就可以作为诱导剂(WO2005094588A1)。关于褐藻，它们富含层粘连蛋白，这是一种作为诱导剂的保留葡聚糖(WO1994000993A1)。通过酶促解聚得到聚合度(DP)4的寡糖琼脂，能够引起红藻江蓠菜的反应(Weinberger,F.,Friedlander,M.和Hoppe,H.-G.，(1999)，寡糖琼脂引起红藻属江蓠菜的生理反应，植物学杂志(Oligoagars elicit a physiological response inGracilaria conferta(Rhodophyta),Journal of Phycology)，35，747–755)。
申请人公司现在已经发现了红藻洋菜植物(例如具有诱导活性的石花菜(generaGelidium)和江蓠菜(Gracilaria)属)中的糖类和糖类片段。这些天然来源物质的获取是以尊重环境的生态应用为目标来进行的。这些天然物质不需要事先解聚以激活其诱导剂特性，它们自身是活跃的。此外，这些诱发物质是水溶性的，这增强了它们的天然特性。
发明内容
因此，本发明特别涉及天然存在于尺半石花菜(Gelidium sesquipedale)中的分子的提取物，且其能够引起某些诱导标志物，例如胼胝质、酚类化合物，过氧化物酶的酶活性和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的酶活性的增加。本发明可以通过加速系统抗性实施及确保植物整体防御，增加植物获得性系统抗性和/或系统抗性。
日本专利申请JP2014091709公开了由碱处理水组成的植物生长促进剂，在碱性处理红藻并洗涤在琼脂制造过程中获得的处理水之后获得。这是与本发明不同的应用，因为这些试剂以良好平衡的方式呈现为含有来自海水的矿物质，这些矿物质有助于植物的生长。
Antonio Ramkissoon、Adesh Ramsubhag及Jayaray Jayaraman在J.Appl.Phycol(2017)29：3235-3244中描述了三种加勒比海藻物种提取物的植物活性，导致番茄植物中病原性感染的症状减轻。获得的提取物是分子的复杂混合物。与此相反，本发明涉及提取物或提取物馏分含有明确定义的寡糖，在所引用的文章中从未提及。此外，根据所述文章，提取物的喷雾浓度为0.5％，即5g/L。根据本发明，提取物或提取物馏分已经以更有利的浓度施用于植物，其为1至10mg/L，即低约1000倍。这证实了本发明的提取物/馏分的新颖性和有利性。
本发明的第一个目的是至少一种红藻洋菜植物的提取物或提取物馏分的使用，可作为陆地植物的防御诱导剂/刺激剂，所述提取物或所述提取物馏分含有至少一种含有2至50个彼此共价连接的糖单元(ose unit)的寡糖，以及具有多于50个彼此共价连接的糖单元的多糖，其含量不超过总寡糖/多糖重量的0.01％。
这里将寡糖定义为含有2-50个糖单元的化合物，将多糖定义为含有多于50个糖单元的化合物。
以下还使用术语“聚合度”(DP)来表示该糖单位的数量。
红藻洋菜植物可以选自石花菜和江蓠菜属，并且特别可以是尺半石花菜。
特别地，提取物或提取物馏分可以含有寡糖，所述寡糖为选自如下的至少一种天然或取代寡糖：
-(Gal)n-甘油，Gal＝半乳糖单元，2≤n≤4；
-由两个己糖单元组成的二糖；
-由两个半乳糖醛酸单元组成的二糖。
提取物或提取物馏分还可含有至少一种天然单糖或者被甘油或甲基取代的单糖。一种或多种单糖可选自弗罗里多苷(floridoside)/异弗罗里多苷(半乳糖甘油)、3,6-脱水半乳糖、半乳糖醛酸己糖或戊糖。
所述提取物可以由以下方式获得的提取物组成：
-在碱性pH下用碱性水溶液，特别是用0.1～10％(重量)，优选2～5％(重量)的氢氧化钠，然后用酸中和并至少部分除去具有多于50个彼此共价连接的糖单元的多糖，例如通过乙醇来使滤液沉淀，或者
-通过水醇溶液，随后除去醇，或者
-通过乙醇等醇，随后除去醇；
所述提取物也可以是：分别在藻类的碱处理后、用水冲洗所获得的残留物后、将冲洗所获得的残留物用酸中和之后、在用水冲洗中和过程中所得到的残留物之后，在用红藻洋菜植物提取琼脂的过程中进行过滤而获得的水相之一；或者是，在最后用水冲洗后所获得的残余物的热提取/过滤期间，通过对与琼脂凝胶同时获得的残余物的热提取所获得的提取物；以及冷冻-解冻和/或机械压制该琼脂凝胶后得到的脱水收缩液；由超滤或空间排阻色谱法分离提取物得到馏分，然后可以将所述提取物或提取物馏分浓缩、脱水或冻干。
提取物或提取物馏分可以通过一种方法制备，通过该方法进行所述红藻洋菜植物或藻类的水、醇或水醇的提取(当加热时)，随后在醇或水醇提取的情况下除去醇，
所述提取是碱性水提取，特别是碱性水提取，根据该提取，在所述碱处理和过滤后，一方面得到水相(A1)，另一方面得到残余物(R1)；
然后，所述残余物(R1)可以用蒸馏水冲洗，过滤后，一方面得到水相(A2)，另一方面得到残留物(R2)；
然后，所述残余物(R2)可以用酸中和，过滤后，一方面得到水相(A3)，另一方面得到残余物(R3)；
然后，所述残余物(R3)可以用蒸馏水冲洗，过滤后，一方面得到水相(A4)，另一方面得到残留物(R4)；
然后，可以进行所述残留物(R4)的热提取和过滤，一方面得到残余物(R5)，另一方面得到琼脂凝胶；
然后，用热水提取所述残留物(R5)，得到水相(A5)；
然后，可以进行所述琼脂凝胶的冷冻-解冻和/或机械压制，一方面获得脱水收缩液(JS)和纯琼脂凝胶；
所述水相(A1)至(A5)和所述脱水收缩液(JS)各自也代表所需的提取物，
所述提取物能够用乙醇处理，一方面获得乙醇提取物(EE)，另一方面获得沉淀物，所述乙醇提取物通过超滤或空间排阻分级来分离，以分离出含有至少一种具有2至50个彼此共价连接的糖单元的寡糖，以及具有多于50个彼此共价连接的糖单元的多糖，其含量不超过总寡糖/多糖重量的0.01％的提取物馏分，
然后可以将所述提取物或所述提取物馏分浓缩、脱水或冻干。
根据本发明的提取物或提取物馏分可以存在于水性介质中，或者以粉末形式存在。
本发明还涉及一种刺激陆生植物天然防御的方法，其特征在于，它包括对于整株植物或其一部分(包括所述植物的植物器官、根系、果实、种子和籽粒)，或者培养植物的土壤或基质，施用本发明定义的提取物或提取物馏分，施用其有效剂量以刺激所述植物的天然防御机制，提取物或提取物馏分可以是液体状态或粉末或颗粒形式。
可以处理农艺上有用的植物、大田作物，包括向日葵或大豆等油籽作物，鹰嘴豆等蛋白质作物，玉米、小麦等谷物，梨树、苹果树、油桃树等果树，玫瑰等园艺植物，草原植物和如西红柿、甜瓜、生菜或菠菜等蔬菜植物。
液体提取物或液体提取物馏分可以以0.0001至100g/L浓度，优选1至10mg/L的寡糖浓度施用于植物或植物的部分、种子或籽粒、或者土壤或基质中。提取物或提取物馏分也可以以液体状态或者粉末或颗粒形式以每公顷1-1000g寡糖的比率施用。
每个作物年份可施用1至20次，优选3至5次。
本发明还涉及用于实施本发明方法的组合物，其特征在于，它是由如上定义的提取物或提取物馏分组成，呈液体状态或者粉末或颗粒形式，适当时，加入植物保护产品或肥料或至少以下一种佐剂：表面活性剂、分散剂、防腐剂、抗结块剂、微量元素、改良剂、缺乏矫正剂、杀菌剂、杀虫剂、除草剂和生长激素。
具体实施方式
实施例1：获得碱性提取物和馏分
将100g的尺半石花菜干海藻与1500mL2％重量体积比的氢氧化钠溶液混合，并在70-80℃下搅拌1小时。用1％体积浓度的硫酸中和。
然后，将混合物在孔隙率为53μM的尼龙布上过滤。不溶性颗粒保留在过滤器上并除去。
通过用3体积的乙醇沉淀除去聚合度大于约50的多糖馏分。
尤其是，乙醇部分含有寡糖和单糖。然后，通过旋转蒸发除去乙醇，得到水性提取溶液。
实施例2：通过超滤分离实施例1的提取物
首先通过在5kDa孔隙率膜上超滤来分离所得滤液(或水性提取溶液)，以除去质量大于或等于5000Da(包括多糖)的化合物以及含在滞留物中的。
回收渗透物并在1000Da膜上进行超滤，这使在滞留物-1000Da中产生富含寡糖的馏分。
根据Dubois等人的方法(DuBois,M.,Gilles,K.A.,Hamilton,J.K.,Rebers,P.A.和Smith,F.，(1956)，比色法测定糖和有关物质，分析化学(Colorimetric Method forDetermination of Sugars and Related Substances,Analytical Chemistry)，28，350–356)，使用糖类的比色测定法表征馏分。根据糖醛酸的测定法(Blumenkrantz,N.和Asboe-Hansen,G.，(1973)，定量测定糖醛酸的新方法，分析生物化学(Blumenkrantz,N.andAsboe-Hansen,G.(1973),New methods for quantitative Determination of uronicacids,Analytical Biochemistry)，54,484–489)表征馏分。根据酚类化合物的测定法(辛格尔顿法，Singleton V L和Rossi.J.Jr，磷钼-磷钨酸试剂对总酚的比色法(Colorimetryof Total,phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents)，AmerJ.J.Enol.Viticult.16：144-58,1965)表征馏分。根据蛋白质的测定法(Bradford,M.M.，(1976)，一种利用蛋白质-染料结合原理定量微克量蛋白质的快速灵敏方法，分析生物化学(A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding,AnalyticalBiochemistry)，72，248–254)表征馏分。
然后，在获得糖醇乙酸酯衍生物后，由Stevenson等人的方法(Stevenson,T.T.及Furneaux,R.H.，用于分析红藻中硫酸化半乳聚糖的化学方法，碳水化合物研究(Chemicalmethods for the analysis of sulphated galactans from red algae.CarbohydrateResearch)，210，277–298(1991))通过气相色谱法(GPC)测定单糖组成。通过冷冻干燥后称重来确定提取物的干物质含量。
表1通过比色测定确定的组成(质量％)
Re：滞留物
Pe：渗透物
比色测量显示糖类占优势。这些馏分还含有蛋白质、酚类化合物和糖醛酸，但比例低于中性糖。存在的糖类具有硫酸盐官能团，其比例根据馏分不同而相异。
表2单糖组成(摩尔％)
ND：未检测出
Re：滞留物
Pe：渗透物
在从气相色谱法分析推断的单糖组合物中可以看出，半乳糖是主要的，特别是3,6脱水半乳糖的形式。
表3质量产额
| 馏分 | 基于起始藻类质量的质量百分比(％MS) |
| Re 5kDa | 5.2 |
| Pe 5kDa | 32.8 |
| Re 1kDa | 5.8 |
| Pe 1kDa | 26.4 |
质量产额反映了来自5kDa超滤的滞留物和渗透物的不均匀质量分布，并且可以观察到大于5kDa的化合物占初始藻类干质量的5％，并且在渗透物中回收了33％质量的初始干生物质，因此其含有小于5kDa的化合物。
对在5kDa超滤期间回收的渗透物进行1kDa超滤，获得的新渗透物和滞留物具有接近5kDa超滤所获得的分布。
1kDa的超滤也消除了渗透物中的无机化合物和单糖及二糖。
实施例3：获得含水提取物或醇提取物或水醇提取物
将100g干燥藻类与1L水或乙醇或水-乙醇混合物(20/80体积/体积)混合，并在50-60℃下搅拌1小时。然后将混合物在孔隙率为53μm的尼龙布上过滤。不溶性颗粒保留在过滤器上并将其除去。
表4馏分中的中性糖占比
| 馏分 | ％中性糖 |
| 水提取 | 15.2 |
| 水/乙醇提取 | 54 |
| 乙醇提取 | 1.5 |
表5与最初干燥藻类质量相比的馏分质量占比
| 馏分 | 质量占比(％干物质) |
| 水提取 | 1.83 |
| 水/乙醇提取 | 0.49 |
| 乙醇提取 | 0.19 |
用水或乙醇提取使得可以回收含有糖类的馏分，其范围为馏分质量的1-15％。
用水/乙醇混合物进行的提取可以回收含有52-54％糖类的馏分。用水、乙醇或水/乙醇溶剂进行的提取，质量产额相对于干藻的质量不超过2％。
实施例4：通过空间排阻色谱法分提实施例1的提取物
将实施例1中得到的水性提取溶液通过柱状空间排阻色谱法分级，用聚丙烯酰胺凝胶作为固定相，排阻阈值为100-1800Da。流动相为脱气超纯水；流速为0.18ml.min-1。收集的馏分为1.8ml。通过薄层色谱法(TLC)分析它们，并将含有糖类和具有相同分布的成分组合：获得三个馏分F1、F2和F3。
使用比色测定、气相色谱法和电喷雾电离质谱(ESI-MS)表征这些馏分。
表6质量产额
| 馏分 | 与最初干燥藻类质量相比的馏分质量占比(％干物质) |
| F1 | 3.4 |
| F2 | 3.2 |
| F3 | 1.8 |
馏分F1和F2各自代表起始藻类质量的3-4％的重量，馏分F3代表1.8％。
表7通过比色测定法测定的成分
比色测定法显示糖类占优势。馏分中还含有蛋白质、酚类化合物和糖醛酸，回收的糖类是硫酸化的，特别是在馏分F1和F3中。
下表8给出了F1，F2和F3馏分中的单糖组成(摩尔％)。
表8
ND：未检测出
在从气相色谱法分析推断的单糖组成中可以看出，半乳糖是主要的，特别是3,6脱水半乳糖的形式。还存在木糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖及半乳糖醛酸。
通过电喷雾电离光谱法(ESI)得到馏分F1、F2和F3的组成：
F1馏分的ESI质谱：
在负模式的质谱中，观察到存在聚合度为1的3,6脱水半乳糖和己糖(半乳糖、甘露糖或葡萄糖)。
在质谱正模式中，观察到聚合度为1的己糖、羟乙基磺酸、弗罗里多苷/异弗罗里多苷、聚合度为2的己糖及聚合度为2的半乳糖醛酸。
F2馏分的ESI质谱：
在负模式的质谱中，观察到聚合度为1的3,6脱水半乳糖和己糖。在正模式质谱中，我们注意到聚合度为1-4的己糖，羟乙基磺酸、弗罗里多苷/异弗罗里多苷及聚合度为2的弗罗里多苷衍生物，由2个己糖和1个甘油组成，聚合度为3的弗罗里多苷衍生物，由3个己糖和1个甘油组成，聚合度为4的弗罗里多苷衍生物，由4个己糖和1个甘油组成。
F3馏分的ESI质谱正模式：
在正模式质谱中，观察到羟乙基磺酸、弗罗里多苷/异弗罗里多苷及聚合度为2和3的弗罗里多苷衍生物。
MS/MS质谱峰值对应质量为253Da的是弗罗里多苷/异弗罗里多苷(M-H)：
Juanjuan Chen,Dandan Song,Qijun Luo,Tong Mou,Rui Yang,Haimin Chen,Shan He和Xiaojun Yan，(2014)，高效液相色谱-串联质谱法测定红藻中的弗罗里多苷及异弗罗里多苷，分析快报(Determination of Floridoside and Isofloridoside in RedAlgae by High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryAnalytical Letters)，第47卷，2307-2316页
观察到，弗罗里多苷/异弗罗里多苷的理论碎裂谱(MS/MS)的峰值对应于实验获得的峰值。这证明了在F1至F3馏分中存在弗罗里多苷/异弗罗里多苷。
MS/MS质谱峰值对应质量为416Da的是聚合度为2的弗罗里多苷衍生物(M-H)。
存在的质荷比峰值416对应于聚合度为2的弗罗里多苷衍生物，在碎裂后(失掉一个己糖)，实验质荷比峰值的碎裂质谱峰值在253出现。这说明了在F2和F3馏分中出现聚合度为2的弗罗里多苷衍生物(峰值对应于416Da的质量)。在己糖碎裂后，发现了弗罗里多苷/异弗罗里多苷的碎裂质谱。
MS/MS质谱峰值对应质量为601Da的是聚合度为3的弗罗里多苷衍生物(M-H)：
峰值在601断裂说明在F2及F3馏分中存在聚合度为3的弗罗里多苷衍生物。
电喷雾电离(ESI)光谱法的分析报告：
图例说明：
加粗：馏分中主要种类
(+)：在正模式中观察到的种类
(-)：在负模式中观察到的种类
实施例5：实施例4中的馏分对遭受生物胁迫后植物中防御机制激活的影响
培养成批的番茄植物(Solanum lycopersicum marmand品种)。制备均质的6周龄植物(颜色，叶数)。将实施例4中获得的馏分加以0.05％体积浓度的吐温溶液，制备为1、2和10mg/L的溶液。将其作为叶面喷雾施用，直到溶液完全流到番茄幼苗上。准备4株试验用苗进行对比，分别在第0天，第2天及第5天喷洒溶液。
将真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)孢子以105-106孢子/mL浓度置于0.05％体积浓度的吐温溶液中，将其100μL的悬浮液于第7天用于叶面上。在第14天采集叶子，在液氮中冷冻，然后在-20℃下储存直至分析。
这包括确定诱导标记，例如胼胝质含量、酚类化合物含量、过氧化物酶活性和苯丙氨酸解氨酶酶活性。
结果是三次不同且独立采摘后分析的平均值(每种方式及每次采摘均涉及4株植物)。
胼胝质含量和酚类化合物含量分别根据以下文献确定研究方法测定含量：Hirano,Y.,Pannatier,E.G.,Zimmermann,S.和Brunner,I.，(2004)，短期接触铝后胼胝质在挪威云杉幼苗根部的诱导作用，树生理学24(Induction of callose in roots ofNorway spruce seedlings after short-term exposure to aluminum.TreePhysiology),1279–1283)，以及Singleton V L和Rossi J.Jr，磷钼酸-磷钨酸试剂对总酚的比色法(Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungsticacid reagents)，Amer.J.Enol.Viticult.16：144-58,1965。
过氧化物酶的酶活性测定根据以下方法测定：Shindler JS,Childs RE,BradsleyWG.，(1976)，来自人宫颈粘液的过氧化物酶，分离和表征(Peroxidase from humancervical mucus,the isolation and characterization)，Eur J Biochem.；65(2)：325–331。苯丙氨酸解氨酶(PAL)的酶活性测定根据以下方法测定：Francini,A.,Nali,C.,Pellegrini,E.和Lorenzini,G.，(2008)，臭氧暴露后的敏感和抗性棕色矢车菊植物的莽草酸途径某些基因的表征和分离，环境污染(Characterization and isolation of somegenes of the shikimate pathway in sensitive and resistant Centaurea jaceaplants after ozone exposure，Environmental Pollution)，151，272–279。
结果表示为占对照组的百分比，吐温溶液为0.05％体积浓度。
施用于番茄植物的浓度为1mg/L的F3馏分导致胼胝质含量是对照组的两倍；浓度为2mg/L时，胼胝质含量是对照组的三倍；1mg/L的F1馏分导致酚类化合物含量增加，与对照组相比增加约50％。
表9：胼胝质含量占对照组的百分比
表10：酚类化合物含量占对照组的百分比
浓度为1mg/L的F1馏分刺激了过氧化物酶活性，使其提高70％；浓度为2mg/L的F1馏分使苯丙氨酸解氨酶酶活性增加了82％。
表11：过氧化物酶的酶活性占对照组的百分比
表12：苯丙氨酸解氨酶酶活性占对照组的百分比
获得的结果证实了所提取馏分具有诱导活性功能。
数据显示根据实施例2获得的馏分具有诱导活性功能，因为处理组植物中诱导标记比在对照组植物中更高。而且，使用的馏分不同，植物的反应也不同。三种馏分以不同浓度应用在植物上，其所引起的过氧化物酶活性升高的程度也不相同。
当植物产生活性氧形式(FAOs)以限制氧化应激时，会合成过氧化物酶。此外，苯丙氨酸解氨酶参与抗菌苯丙素的生物合成途径，但也参与木质素的合成，从而加强细胞壁，其活性受到刺激。
细胞壁的增强还包括胼胝质和酚类化合物的形成，其含量通过应用分离形式的石花菜馏分而增加。对于植物天然防御的刺激可以减缓病原体发展，也是植物抗性的最初迹象之一。根据本发明，植物可以在有提取物和馏分的存在下更好地进行自身保护。
诱导性馏分给予植物更强的抗性，同时刺激及增强其诱导标记。
Claims (16)
1.从至少一种红藻洋菜植物中提取的提取物或提取物馏分作为陆生植物防御的诱导剂/刺激剂的用途，所述提取物或所述提取物馏分含有至少一种具有2至50个彼此共价连接的糖单元的寡糖，以及具有多于50个彼此共价连接的糖单元的多糖，其含量不超过总寡糖/多糖重量的0.01％，其中，所述提取物或所述提取物馏分含有选自如下的至少一种天然寡糖或取代寡糖：
(Gal)n-甘油，Gal＝半乳糖单元，2≤n≤4；
由两个己糖单元组成的二糖；
由两个半乳糖醛酸单元组成的二糖，其中，
所述提取物由以下方式获得的提取物组成：
-在碱性pH下用碱性水溶液，所述碱性水溶液具有0.1～10重量％的氢氧化钠，然后用酸中和并至少部分除去具有多于50个彼此共价连接的糖单元的多糖，或者
-通过水醇溶液，随后除去醇，或者
-通过醇，随后除去醇；
所述提取物也可以是：分别在藻类的碱处理后、用水冲洗所获得的残留物后、将冲洗所获得的残留物用酸中和之后、在用水冲洗中和过程中所得到的残留物之后，在用红藻洋菜植物提取琼脂的过程中进行过滤而获得的水相之一；或者是，在最后用水冲洗后所获得的残余物的热提取/过滤期间，通过对与琼脂凝胶同时获得的残余物的热提取而获得的提取物；以及冷冻-解冻和/或机械压制该琼脂凝胶后得到的脱水收缩液；
提取物馏分由超滤或空间排阻色谱法分离提取物得到，
然后可以将所述提取物或所述提取物馏分浓缩、脱水或冻干。
2.如权利要求1所述的用途，其特征为，所述红藻洋菜植物选自石花菜及江蓠菜属。
3.如权利要求2所述的用途，其特征为，所述红藻洋菜植物为尺半石花菜。
4.如权利要求1所述的用途，其特征为，所述提取物或所述提取物馏分还含有至少一种天然单糖或者被甘油或甲基取代的单糖。
5.如权利要求4所述的用途，其特征为，至少一种单糖选自弗罗里多苷/异弗罗里多苷(半乳糖甘油)、3,6-脱水半乳糖、半乳糖醛酸、己糖或戊糖。
6.如权利要求1所述的用途，其特征为，所述碱性水溶液具有2～5重量％的氢氧化钠。
7.如权利要求6所述的用途，其特征为，所述提取物或所述提取物馏分可以通过下述方法制备，通过该方法进行所述红藻洋菜植物或藻类的水、醇或水醇的提取，当加热时，随后在醇或水醇提取的情况下除去醇，
所述提取是碱性水提取，根据所述提取，在所述碱处理和过滤后，一方面得到水相(A1)，另一方面得到残余物(R1)；
然后，所述残余物(R1)用蒸馏水冲洗，过滤后，一方面得到水相(A2)，另一方面得到残余 物(R2)；
然后，所述残余物(R2)可以用酸中和，过滤后，一方面得到水相(A3)，另一方面得到残余物(R3)；
然后，所述残余物(R3)用蒸馏水冲洗，过滤后，一方面得到水相(A4)，另一方面得到残留物(R4)；
然后，可以进行所述残留物(R4)的热提取和过滤，一方面得到残余物(R5)，另一方面得到琼脂凝胶；
然后，用热水提取所述残余 物(R5)，得到水相(A5)；
然后，可以进行所述琼脂凝胶的冷冻-解冻和/或机械压制，一方面获得脱水收缩液(JS)和纯琼脂凝胶；
所述水相(A1)至(A5)和所述脱水收缩液(JS)各自也代表所需的提取物，
所述提取物能够用乙醇处理，一方面获得乙醇提取物(EE)，另一方面获得沉淀物，所述乙醇提取物通过超滤或空间排阻分级分离，以分离出含有至少一种具有2至50个彼此共价连接的糖单元的寡糖，以及具有多于50个彼此共价连接的糖单元的多糖，其含量不超过总寡糖/多糖重量的0.01％的提取物馏分，
然后，可以将所述提取物或所述提取物馏分浓缩、脱水或冻干。
8.如权利要求1～7任一项所述的用途，其特征为，所述提取物或所述提取物馏分存在于水性介质中或者以粉末形式存在。
9.一种刺激陆生植物天然防御的方法，其特征为，对于整株植物或包括所述植物的植物器官、根系、果实、种子和籽粒的一部分，或者培养植物的土壤或基质，施用权利要求1～8任一项所定义的提取物或提取物馏分，施用其有效剂量以刺激所述植物的天然防御机制，所述提取物或所述提取物馏分可以是液体状态或者粉末或颗粒形式。
10.如权利要求9所述的方法，其特征为，可以处理农艺上有用的植物、大田作物，包括向日葵或大豆等油籽作物，鹰嘴豆等蛋白质作物，玉米、小麦等谷物，梨树、苹果树、油桃树等果树，玫瑰等园艺植物，草原植物，以及西红柿、甜瓜、生菜或菠菜等蔬菜植物。
11.如权利要求9所述的方法，其特征为，液体提取物或液体馏分可以以0.0001至100g/L的寡糖浓度施用于植物或植物的部分、种子或籽粒，或者土壤或基质中。
12.如权利要求11所述的方法，其特征为，液体提取物或液体馏分可以以1至10mg/L的寡糖浓度施用于植物或植物的部分、种子或籽粒，或者土壤或基质中。
13.如权利要求9所述的方法，其特征为，所述提取物或所述提取物馏分也可以以液体状态或者粉末或颗粒形式以每公顷1～1000g寡糖的比率施用。
14.如权利要求9所述的方法，其特征为，每个作物年份可施用1至20次。
15.如权利要求14所述的方法，其特征为，每个作物年份可施用3至5次。
16.实施权利要求9～15任一项所述方法的组合物，其特征为，其是由权利要求1～8中任一项定义的提取物或提取物馏分组成，呈液体状态或者粉末或颗粒形式，并且，适当时，加入植物保护产品或肥料或至少以下一种佐剂：表面活性剂、分散剂、防腐剂、抗结块剂、微量元素、改良剂、缺乏矫正剂、杀菌剂、杀虫剂、除草剂和生长激素。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1870542A FR3080742B1 (fr) | 2018-05-07 | 2018-05-07 | Utilisation d'un extrait ou d'une fraction d'extrait d'algue rouge agarophyte comme eliciteur stimulateur de defense vegetal et application dudit extrait ou de ladite fraction d'extrait |
| FR1870542 | 2018-05-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110447662A CN110447662A (zh) | 2019-11-15 |
| CN110447662B true CN110447662B (zh) | 2022-04-26 |
Family
ID=62952178
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910375874.8A Active CN110447662B (zh) | 2018-05-07 | 2019-05-07 | 作为植物防御诱导剂/刺激剂的红藻洋菜植物的提取物及提取物馏分的用途及应用 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3566580B1 (zh) |
| JP (1) | JP7228890B2 (zh) |
| CN (1) | CN110447662B (zh) |
| CL (1) | CL2019001257A1 (zh) |
| ES (1) | ES2958668T3 (zh) |
| FR (1) | FR3080742B1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022087753A1 (en) * | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Crop Aid Nutrition Ltd. | Soil additive composition and method of use |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2605185A1 (fr) * | 1986-10-17 | 1988-04-22 | Meiji Seika Kaisha | Procede de culture des plantes |
| CN104542660A (zh) * | 2014-12-03 | 2015-04-29 | 江西省新龙生物科技有限公司 | 一种含有海藻多糖和吡唑醚菌酯的杀菌防病混合物 |
| CN105104381A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-12-02 | 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所 | 复合糖制剂及其在作物抗盐胁迫中的应用 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63101302A (ja) * | 1986-10-17 | 1988-05-06 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 農作物の栽培方法 |
| FR2693454B1 (fr) | 1992-07-07 | 1994-10-07 | Goemar Laboratoires | Compositions à usage agricole contenant de la laminarine; procédé de culture de plantes utilisant ces compositions. |
| JPH10101704A (ja) * | 1996-10-01 | 1998-04-21 | Japan Atom Energy Res Inst | 放射線照射を利用した植物に対する生物活性を有する多糖類の分解物を製造する方法 |
| JP3617912B2 (ja) * | 1997-10-08 | 2005-02-09 | 日本原子力研究所 | 植物成長促進剤 |
| DE60230905D1 (de) * | 2001-11-14 | 2009-03-05 | Larena | Mittel enthaltend ein rote algen extrakt der gattulen |
| FR2868253B1 (fr) | 2004-03-30 | 2006-07-21 | Cie Financiere Et De Participa | Utilisation des ulvanes comme activateurs des reactions de defense des plantes et de resistance contre des contraintes biotiques ou abiotiques |
| CL2007002369A1 (es) | 2007-08-16 | 2008-02-15 | Leonor Solange Moenn Alejandra | Composicion acuosa para estimular el crecimiento y la defensa contra patogenos y otras propiedades productivas favorables en plantas que comprende un oligocarragenano seleccionado de oligocarragenano kappa1, kappa2, lambda o iota; metodo de aplicacio |
| CL2009002014A1 (es) | 2009-10-30 | 2010-06-04 | Univ Santiago Chile | Metodo para estimular la fijacion de carbono en plantas que comprende asperjar sobre la planta una solucion acuosa de un oligo-carragenano seleccionado del grupo kappa 1 o 2, lambda o iota. |
| JP6145858B2 (ja) | 2012-11-02 | 2017-06-14 | 伊那食品工業株式会社 | 植物生育促進剤の製造方法及び植物生育促進方法 |
| CL2014001464A1 (es) * | 2014-06-04 | 2014-08-22 | Patagonia Biotecnologia S A | Proceso para elaborar un bioestimulante en base a algas, que comprende selección y molienda del alga fresca, lavado del alga, tratamiento del alga con acido acetico, tratamiento alcalino con koh, separacion y recuperacion de la fase liquida y adicion de leonardita americana hidrolizada, secado y obtencion de polvo; composicion bioestimulante; y su uso. |
| CA2985593C (en) * | 2015-05-10 | 2023-02-14 | Sea6 Energy Pvt. Ltd. | A biostimulant formulation for improving plant growth and uses thereof |
| CN105732734B (zh) * | 2016-02-16 | 2021-06-11 | 珀莱雅化妆品股份有限公司 | 一种可工业化制备红藻糖苷的方法 |
-
2018
- 2018-05-07 FR FR1870542A patent/FR3080742B1/fr active Active
-
2019
- 2019-04-26 JP JP2019085282A patent/JP7228890B2/ja active Active
- 2019-05-07 EP EP19173064.7A patent/EP3566580B1/fr active Active
- 2019-05-07 CN CN201910375874.8A patent/CN110447662B/zh active Active
- 2019-05-07 ES ES19173064T patent/ES2958668T3/es active Active
- 2019-05-07 CL CL2019001257A patent/CL2019001257A1/es unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2605185A1 (fr) * | 1986-10-17 | 1988-04-22 | Meiji Seika Kaisha | Procede de culture des plantes |
| CN104542660A (zh) * | 2014-12-03 | 2015-04-29 | 江西省新龙生物科技有限公司 | 一种含有海藻多糖和吡唑醚菌酯的杀菌防病混合物 |
| CN105104381A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-12-02 | 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所 | 复合糖制剂及其在作物抗盐胁迫中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Phytoelicitor activity of three Caribbean seaweed species on suppression of pathogenic infections in tomato plants;Antonio Ramkissoon, et al.;《Journal of Applied Phycology》;20170601;第29卷(第6期);第3235-3244页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7228890B2 (ja) | 2023-02-27 |
| FR3080742A1 (fr) | 2019-11-08 |
| ES2958668T3 (es) | 2024-02-13 |
| JP2019202993A (ja) | 2019-11-28 |
| EP3566580B1 (fr) | 2023-07-05 |
| CN110447662A (zh) | 2019-11-15 |
| EP3566580C0 (fr) | 2023-07-05 |
| EP3566580A1 (fr) | 2019-11-13 |
| CL2019001257A1 (es) | 2020-05-29 |
| FR3080742B1 (fr) | 2021-09-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Chitin and chitosan fragments responsible for plant elicitor and growth stimulator | |
| Nunkaew et al. | Characterization of exopolymeric substances from selected Rhodopseudomonas palustris strains and their ability to adsorb sodium ions | |
| Stadnik et al. | Algal polysaccharides as source of plant resistance inducers | |
| Briceño-Domínguez et al. | Plant growth promoting activity of seaweed liquid extracts produced from Macrocystis pyrifera under different pH and temperature conditions | |
| Paulert et al. | Effects of sulfated polysaccharide and alcoholic extracts from green seaweed Ulva fasciata on anthracnose severity and growth of common bean (Phaseolus vulgaris L.)/Die Wirkung von sulfonierten Polysacchariden und alkoholischen Extrakten aus der Grünalge Ulva fasciata auf den Anthracnosebefall und das Wachstum von Buschbonenpflanzen (Phaseolus vulgaris L.) | |
| Skriptsova et al. | Monthly changes in the content and monosaccharide composition of fucoidan from Undaria pinnatifida (Laminariales, Phaeophyta) | |
| Hardouin et al. | Biochemical and antiviral activities of enzymatic hydrolysates from different invasive French seaweeds | |
| US20110172102A1 (en) | Use of oligoapiogalacturonans and their derivatives to simulate defence and resistance reactions in plants against biotic and abiotic stress sources | |
| MXPA01010067A (es) | Composicion y metodo para controlar la enfermedad fungal en las plantas. | |
| US20190350208A1 (en) | Activators of Plant Metabolic Changes | |
| Goñi et al. | Seaweed carbohydrates | |
| EP2983477A1 (en) | Gibberellic acid (ga3) free kappaphycus alvarezii sap and its application thereof | |
| CN110447662B (zh) | 作为植物防御诱导剂/刺激剂的红藻洋菜植物的提取物及提取物馏分的用途及应用 | |
| Chiu et al. | A polysaccharide derived from a Trichosporon sp. culture strongly primes plant resistance to viruses | |
| Shefer et al. | Ulvan crude extract’s chemical and biophysical profile and its effect as a biostimulant on Arabidopsis thaliana | |
| US20190335761A1 (en) | Use of an extract or an extract fraction of agarophyte red algae as a plant defense elicitor/stimulator and application of said extract or said extract fraction | |
| WO2007042557A2 (fr) | Composition pour application phytopharmaceutique pour stimuler les defenses naturelles des plantes | |
| WO2020083871A1 (fr) | Composes polysaccharidiques, et leur utilisation pour stimuler des reponses de defense des plantes contre les microorganismes pathogenes | |
| CN116634872A (zh) | 一种获得基于寡聚半乳糖醛酸的制剂的方法及其在农业中的用途 | |
| WO2009082792A1 (en) | Antimicrobial composition comprising an extract of a polyporaceae and a process for making the same. | |
| Vinoth et al. | Biostimulant activity of sulfated polysaccharide extract from red seaweed Halymenia dilatata on yield of Mung bean in greenhouse conditions | |
| Penyejatan | Sugars, minerals composition and metal ion chelating activity of Arenga pinnata syrup using vacuum evaporation | |
| Hossain et al. | Carrageenans as biostimulants and bio-elicitors: plant growth and defense responses | |
| Garcés-Fiallos et al. | Marine Resources with Potential in Controlling Plant Diseases | |
| Zhang et al. | Separation of anti-TMV active components and modes of action of Omphalia lapidescens |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |