CN110441371A - 一种高灵敏的吲哚电化学检测方法 - Google Patents

一种高灵敏的吲哚电化学检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高灵敏的吲哚电化学检测方法。本发明采用金磁纳米粒子(GMPs)复合材料，通过Au‑S键将4‑氨基苯硫酚(4‑ATP)固定于AuNPs上，将吲哚与重氮化反应后的ATP@GMPs发生偶合反应，形成Indole‑diazo‑ATP@GMPs复合物，利用外加磁场将该复合物富集于丝网印刷碳电极工作电极表面。采用示差脉冲伏安法进行电化学检测，根据电化学响应信号与待测物浓度之间的线性关系，实现对吲哚的灵敏、高效、准确的定量检测。

Description

一种高灵敏的吲哚电化学检测方法
技术领域
本发明属于电化学检测领域，具体涉及一种高灵敏的吲哚电化学检测方法。
背景技术
吲哚是由色氨酸在含色氨酸酶的细菌作用下产生的一种杂环化合物，具有独特的气味。它在真核和原核生物中广泛存在。作为一种重要的种间信号传递分子，吲哚发挥着重要的生理作用。因其特殊气味，吲哚可保护某些植物免受昆虫袭击，同时作为信号分子它也参与植物的生长发育。吲哚在细菌中的积累可促进细菌集落中细胞的衰老及死亡，并且死细胞可作为存活细胞的营养源。因此，吲哚是固定期细菌延长存活的必需条件。此外，吲哚还可通过氧化应激、肠道炎症和激素分泌等途径参与人体生理功能调节，在人体健康与疾病中发挥着重要作用。吲哚及其衍生物已被证明是药物化学和药物开发中重要的靶分子，是未来开发抗HIV和抗癌的重要候选药物。
目前，检测吲哚的方法主要有高效液相色谱-荧光法、气相色谱-质谱法及液相色谱-质谱法。以上三种方法虽然灵敏度高但是仪器成本高、操作复杂，维护繁琐，难以在普通实验室及临床普及使用。目前已有文献报道吲哚的电化学检测方法，但灵敏度较低。因此，开发一种高灵敏及低成本的吲哚检测方法，有助于更好地发现吲哚的生物特性，为疾病机制研究、临床早期诊断及药物开发等提供一种新思路。
发明内容
本发明致力于提供一种高灵敏的吲哚电化学检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高灵敏的吲哚电化学检测方法，包括如下具体步骤：
(1)金磁纳米粒子(Gold magnetic particles,GMPs)复合材料的合成：
将5.0mg/mL磁性Fe3O4纳米粒子分散于含0.05mmol/L HAuCl4、125.0mmol/L异丙醇和10.0mg/mL聚乙烯醇水溶液中，形成含0.1mg/mL Fe3O4纳米粒子的混合溶液；将混合溶液超声15min，超声功率为120W，分散均匀后，置于玻璃试剂瓶中，采用6.0MeV的高能电子束进行辐照，辐照剂量为6kGy，得到分散均匀的GMPs复合材料，再置于4℃冰箱避光保存；
(2)Indole-diazo-ATP@GMPs复合物的制备：
a.将上述步骤(1)中制备的所述GMPs复合材料与等体积的1.0mmol/L 4-氨基苯硫酚(4-ATP)甲醇/水(1/49，v/v)溶液(由1mL 50.0mmol/L的4-ATP甲醇溶液加49mL水稀释而成)混合均匀，孵育12h；将混合溶液置于磁性分离器上，用超纯水洗涤后，再用1mL盐酸(pH3.0)重新分散，得到ATP@GMPs复合物水溶液，置于4℃冰箱避光保存；
b.取1mL步骤a中得到的所述ATP@GMPs复合物，加入100μL 10.0mmol/L NaNO2水溶液得到混合溶液，在冰水浴条件下置于快速振荡器中的微孔板上进行重氮化反应，反应时间30min，得到diazo-ATP@GMPs复合物溶液；
c.吲哚标准溶液准备：将1.0mg吲哚标准品溶于1mL水中配置成1.00g/L吲哚标准储存液，用0.1mol/L PBS(pH 5.0)稀释1.00g/L吲哚标准储备液得到系列浓度的吲哚标准溶液；
d.取70μL步骤b中得到的所述diazo-ATP@GMPs复合物溶液，加入100μL步骤c中得到的吲哚标准液，用NaOH溶液调节混合溶液的pH值至5.0，在冰水浴条件下置于快速振荡器中的微孔板上进行偶合反应，反应时间35min，制得Indole-diazo-ATP@GMPs复合物；
(3)电化学检测
将步骤(2)中得到的所述Indole-diazo-ATP@GMPs复合物置于磁性分离器上，用0.1mol/L PBS(pH 5.0)洗涤3次，然后滴涂于丝网印刷碳电极(Screen printed carbonelectrode,SPCE)工作电极表面，自然晾干；将SPCE与电化学工作站连接，并在SPCE下面放置磁铁，滴加50μL pH值为7.0的支持电解质溶液于所述电极表面，采用示差脉冲伏安法，进行吲哚的检测。
上述电化学检测方法，所述SPCE包括一印制电极的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基片、PET基片上印制的外部绝缘层和基片上一端的导线接口，其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，分别为碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和Ag/AgCl对电极，三个电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下印制的导线与接口相连；
作为优选，所述的pH值为7.0的支持电解质溶液由含0.10mol/L K2SO4的0.10mol/LNaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液组成；
作为优选，所述电化学工作站的参数设置为：低电位0.2V，高电位1.0V，振幅100mV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s。
电化学分析方法是根据待测物质的电化学活性及其变化规律，建立以电流、电位及电量等物理量与待测物的计量关系，从而对组分进行定性或定量的仪器分析方法。SPCE具有制作简单、方便、价格低廉、可批量生产及一次性使用等优点。采用纳米材料对电极表面进行修饰，可显著增加电极的比表面积，且纳米材料本身具有吸附性和催化性能，可使检测的灵敏度显著提高。GMPs即将金纳米粒子包裹于磁性Fe3O4表面而形成的纳米复合材料，具有比表面积大、稳定性好、杰出的磁分离性能和良好的生物相容性等优点。
本发明采用GMPs复合材料，通过Au-S键将4-ATP固定于AuNPs上，将吲哚与重氮化反应后的ATP@GMPs发生偶合反应，形成Indole-diazo-ATP@GMPs复合物，利用外加磁场将该复合物富集于SPCE工作电极表面，对吲哚进行电化学检测，具有协同增效的作用。该方法不仅可增大电极比表面积，增强电子传递速率，而且能通过磁分离特性将结合有吲哚的复合材料富集于电极表面，大大提高检测灵敏度，从而实现吲哚的高灵敏度定量检测。
本发明所述一种吲哚的电化学检测方法的有益效果如下：
1)本发明所述的电化学检测方法，通过使用SPCE配合电化学工作站对吲哚进行定量测定，检测仪器操作简单、检测快速，具有良好的精密度，较高的灵敏度、准确度。
2)本发明所述的电化学检测方法中所用的丝网印刷电极，制作成本低廉，制作过程简单，可实现批量生产。SPCE为一次性使用电极，既避免对传统柱电极进行打磨抛光耗时耗力，又避免了柱电极重复使用过程中可能造成的试剂交叉污染。
3)本发明所述的电化学检测方法，结合复合材料以增大比表面积、加速电子传递，同时采用重氮化反应和偶合反应进行待测物富集，具有检测信号放大的作用，能实现吲哚的高灵敏度定量检测。
附图说明
图1为本发明Indole-diazo-ATP@GMPs复合物的形成过程与电化学检测原理示意图。
图2为本发明GMPs复合材料的透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)图。
图3为本发明不同物质修饰的电极测定100.00μg/L吲哚的DPV曲线。
图中短点划线a为未修饰SPCE测定未加吲哚的空白溶液的DPV曲线；虚线b为未修饰SPCE测定100.00μg/L吲哚的DPV曲线；点线c为diazo-ATP@GMPs修饰SPCE测定100.00μg/L吲哚的DPV曲线；实线d为Indole-diazo-ATP@GMPs复合物修饰SPCE测定100.00μg/L吲哚的DPV曲线。
图4为本发明重氮化反应的pH值影响吲哚氧化峰电流的曲线图。
图5为本发明偶合反应的pH值影响吲哚氧化峰电流的曲线图。
图6为本发明偶合反应的时间影响吲哚氧化峰电流的曲线图。
图7为本发明GMPs.复合材料的体积影响吲哚氧化峰电流的曲线图。
图8为本发明同离子浓度下支持电解质溶液的种类影响氧化峰电流的柱形图。
图9为本发明支持电解质溶液的pH值影响吲哚氧化峰电流的曲线图。
图10为本发明支持电解质溶液中K2SO4水溶液浓度影响吲哚氧化峰电流的曲线图。
图11为本发明氧化峰电流增量对吲哚浓度的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行详细说明，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。本发明电化学工作站仅以CHI852C电化学工作站为例，其购自于上海辰华仪器有限公司。
实施例1
本实施例提出所述的一种吲哚的电化学检测方法，具体包括如下步骤：
(1)GMPs复合材料的合成：
将5.0mg/mL磁性Fe3O4纳米粒子分散于含0.05mmol/L HAuCl4、125.0mmol/L异丙醇和10.0mg/mL聚乙烯醇水溶液中，形成含0.1mg/mL Fe3O4纳米粒子的混合溶液；将混合溶液超声15min，超声功率为120W，分散均匀后，置于玻璃试剂瓶中，采用6.0MeV的高能电子束进行辐照，辐照剂量为6kGy，得到分散均匀的GMPs复合材料，再置于4℃冰箱避光保存；
(2)Indole-diazo-ATP@GMPs复合物的制备：
a.将上述步骤(1)中制备的所述GMPs复合材料与等体积的1.0mmol/L 4-ATP甲醇/水(1/49，v/v)溶液(由1mL 50.0mmol/L的4-ATP甲醇溶液加49mL水稀释而成)混合均匀，孵育12h；将混合溶液置于磁性分离器上，用超纯水洗涤后，再用1mL盐酸(pH 3.0)重新分散，得到ATP@GMPs复合物水溶液，置于4℃冰箱避光保存；
b.取1mL步骤a中得到的所述ATP@GMPs复合物，加入100μL 10.0mmol/L NaNO2水溶液得到混合溶液，在冰水浴条件下置于快速振荡器中的微孔板上进行重氮化反应，反应时间30min，得到diazo-ATP@GMPs复合物溶液；
c.吲哚标准溶液准备：将1.0mg吲哚标准品溶于1mL水中配置成1.00g/L吲哚标准储存液，用0.1mol/L PBS(pH 5.0)稀释1.00g/L吲哚标准储备液得到系列浓度的吲哚标准溶液；
d.取70μL步骤b中得到的所述diazo-ATP@GMPs复合物溶液，加入100μL步骤c中得到的吲哚标准液，用NaOH溶液调节混合溶液的pH值至5.0，在冰水浴条件下置于快速振荡器中的微孔板上进行偶合反应，反应时间35min，制得Indole-diazo-ATP@GMPs复合物；
(3)电化学检测
将步骤(2)中得到的所述Indole-diazo-ATP@GMPs复合物置于磁性分离器上，用0.1mol/L PBS(pH 5.0)洗涤3次，然后滴涂于SPCE工作电极表面，自然晾干；将SPCE与电化学工作站连接，并在SPCE下面放置磁铁，滴加50μL pH值为7.0的支持电解质溶液于所述电极表面，采用示差脉冲伏安法，进行吲哚的检测。
上述电化学检测方法，所述SPCE包括一印制电极的PET基片、PET基片上印制的外部绝缘层和基片上一端的导线接口，其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，分别为碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和Ag/AgCl对电极，三个电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下印制的导线与接口相连；
作为优选，所述的pH值为7.0的支持电解质溶液由含0.10mol/L K2SO4的0.10mol/LNaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液组成；
作为优选，所述电化学工作站的参数设置为：低电位0.2V，高电位1.0V，振幅100mV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s。
Indole-diazo-ATP@GMPs复合物的形成过程与电化学检测原理示意图见图1。
实施例2
本实施例采用TEM对所述的GMPs复合材料的形貌进行表征，结果见图2。金纳米粒子成功包裹在磁性Fe3O4粒子表面，该复合物具有较大的比表面积，且磁性Fe3O4粒子的稳定性和分散性得以增强。
实施例3
本实施例是采用DPV表征GMPs纳米复合材料结合偶氮反应检测吲哚的电化学行为，结果见图3。采用未修饰SPCE对等体积的不含吲哚的空白溶液进行检测时，未发现明显的氧化峰电流(短点划线a)；采用未修饰SPCE检测含100.00μg/L吲哚的溶液，测得一个很小的氧化峰(虚线b)。结果表明，本发明方法检测到的氧化峰为吲哚的氧化所产生。采用经重氮反应后用ATP@GMPs修饰SPCE检测含100.00μg/L吲哚的溶液，未出现明显的氧化峰(点线c)；采用GMPs复合材料结合偶氮反应形成的Indole-diazo-ATP@GMPs复合物，对含100.00μg/L吲哚的溶液进行检测，得到一个明显增大的氧化峰(实线d)。结果表明，本发明中电极的修饰不仅可使工作电极的比表面积增大，加速电子传递，且在外加磁铁作用下还可将待测物富集于工作电极表面，从而大大提高检测灵敏度。
实施例4
本实施例是考察重氮化反应的pH值影响吲哚的氧化峰电流，结果见图4。重氮化反应的pH值在1.0～3.0时，pH值为3.0时吲哚的氧化峰电流最高，而重氮化反应的pH值大于3.0时，吲哚的氧化峰电流降低，故选择4-ATP发生重氮化反应的最佳pH值为3.0。
实施例5
本实施例是考察偶合反应的pH值影响吲哚的氧化峰电流，结果见图5。偶合反应的pH值在4.0～5.0时，吲哚的氧化峰电流随pH值升高逐渐增大；而偶合反应的pH值大于5.0时，吲哚的氧化峰电流降低。结果表明，4-ATP与吲哚发生偶合反应的最佳pH值为5.0。
实施例6
本实施例是考察偶合反应的时间对吲哚氧化峰电流的影响，结果见图6。偶合反应时间在10～35min时，吲哚的氧化峰电流随时间增长逐渐增大；而偶合反应时间大于35min时，吲哚的氧化峰电流反而降低。结果表明，超过偶合反应的最佳时间时，生成的化合物反而会发生分解导致测定灵敏度降低。因此，选择4-ATP与吲哚的偶合反应最佳时间为35min。
实施例7
本实施例是考察GMPs复合材料的体积对吲哚氧化峰电流影响，结果见图7。在重氮化反应的pH值为3.0，偶合反应pH值为5.0，偶合反应时间35min条件下，考察GMPs复合材料体积对100.00μg/L吲哚检测氧化峰电流的影响。GMPs纳米复合材料的体积在30～70μL时，吲哚的氧化峰电流随体积增加而逐渐增大；而其体积大于70μL时，吲哚的氧化峰电流随体积增加而逐渐降低。因此，选择GMPs纳米复合材料的最佳体积为70μL。
实施例8
本实施例是考察支持电解质种类对吲哚的氧化峰电流的影响，结果见图8。在0.10mol/L PBS缓冲溶液中添加盐溶液作为支持电解质可以增强溶液的离子强度和提高电导率，因此探索了三种相同离子浓度的盐溶液(K2SO4、NaCl和KCl)对吲哚氧化峰电流强度的影响。当向电解质溶液中加入0.10mol/L的K2SO4时，吲哚氧化峰电流最高。因此，选择在0.10mol/L PBS缓冲溶液中添加K2SO4作为支持电解质。
实施例9
本实施例是考察支持电解质溶液的pH值对吲哚氧化峰电流的,影响，结果见图9。pH值在5.0～7.0时，吲哚的氧化峰电流逐渐增大；pH值大于7.0时，吲哚的氧化峰电流逐渐降低。故选择支持电解质溶液的pH值为7.0。
实施例10
本实施例是考察支持电解质溶液中K2SO4溶液浓度对吲哚氧化峰电流的影响，结果见图10。K2SO4水溶液浓度小于0.10mol/L时，吲哚的氧化峰电流逐渐增大；在0.10～0.20mol/L时，其氧化峰电流逐渐减小。故选择K2SO4溶液的浓度为0.10mol/L。
实施例11
本实施例是考察所述电化学检测方法用于定量氧化峰电流I与吲哚浓度c之间的线性关系，结果见图11。配制系列标准溶液(其中吲哚的浓度分别为0.50，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00，75.00，100.00μg/L)，在最优的检测条件下进行DPV测定。吲哚的氧化峰电流和浓度在0.50～100.00μg/L范围内呈现良好的线性关系，线性方程为I＝0.0324c+1.3067，R2＝0.9965。本发明方法测定吲哚的最低定量限(LOQ)为0.50μg/L，最低检测限(LOD)为0.10μg/L(S/N＝3)，灵敏度较高。
实施例12
本实施例是考察本发明所述电化学检测方法用于测定血浆基质中吲哚的精密度。在290μL血浆基质(将15mg活性炭加入400μL健康人血浆中混合均匀，然后以13 300×g离心10min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后制得)中分别加入10μL不同浓度的吲哚标准溶液，最终得到高(100.00μg/L)、中(50.00μg/L)、低(1.00μg/L)三个不同浓度的混合血浆吲哚溶液，经样品预处理(在300μL混合血浆吲哚溶液中加入800μL乙醚，将得到的混合溶液置于摇床上以250rpm充分振荡18min，以13 300×g离心5min；取上清液置于真空离心浓缩仪离心至干；复溶于300μL 0.1mol/L PBS(pH 5.0)中)后，在最优实验条件下测定吲哚的含量，日内重复测定5次，日间连续测定5天。分别计算不同浓度吲哚的日内和日间相对标准偏差，结果见表1。日内标准偏差在3.2％～4.9％之间，日间标准偏差在5.0％～8.2％之间，表明本发明所述电化学检测方法具有良好的重复性。
表1.精密度
实施例13
本实施例是考察本发明所述电化学检测方法用于测定血浆基质中吲哚的回收率。在血浆基质(处理过程同实施例12)中分别加入高、中、低三个不同浓度的吲哚标准溶液，经样本预处理后(预处理过程同实施例12)测定其氧化峰电流值，各浓度平行测定5次，进行回收率实验。相对回收率＝(加标后血浆基质中吲哚的检测浓度–未加标血浆基质中吲哚的检测浓度)/加入吲哚标准溶液浓度×100％，结果见表2。血浆基质中吲哚的平均回收率在97.2％～105.4％间，相对标准偏差≤7.1％，表明本发明所述电化学检测方法具有较好的准确度。
表2.回收率

Claims (4)

1.一种高灵敏的吲哚电化学检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)金磁纳米粒子(Gold magnetic particles,GMPs)复合材料的合成：
将5.0mg/mL磁性Fe3O4纳米粒子分散于含0.05mmol/L HAuCl4、125.0mmol/L异丙醇和10.0mg/mL聚乙烯醇水溶液中，形成含0.1mg/mL Fe3O4纳米粒子的混合溶液；将混合溶液超声15min，超声功率为120W，分散均匀后，置于玻璃试剂瓶中，采用6.0MeV的高能电子束进行辐照，辐照剂量为6kGy，得到分散均匀的GMPs复合材料，再置于4℃冰箱避光保存。
(2)Indole-diazo-ATP@GMPs复合物的制备：
a.将上述步骤(1)中制备的所述GMPs复合材料与等体积的1.0mmol/L 4-氨基苯硫酚(4-ATP)甲醇/水(1/49，v/v)溶液(由1mL 50.0mmol/L的4-ATP甲醇溶液加49mL水稀释而成)混合均匀，孵育12h；将混合溶液置于磁性分离器上，用超纯水洗涤后，再用1mL盐酸(pH3.0)重新分散，得到ATP@GMPs复合物水溶液，置于4℃冰箱避光保存；
b.取1mL步骤a中得到的所述ATP@GMPs复合物，加入100μL 10.0mmol/L NaNO2水溶液得到混合溶液，在冰水浴条件下置于快速振荡器中的微孔板上进行重氮化反应，反应时间30min，得到diazo-ATP@GMPs复合物溶液；
c.吲哚标准溶液准备：将1.0mg吲哚标准品溶于1mL水中配置成1.00g/L吲哚标准储存液，用0.1mol/L PBS(pH 5.0)稀释1.00g/L吲哚标准储备液得到系列浓度的吲哚标准溶液；
d.取70μL步骤b中得到的所述diazo-ATP@GMPs复合物溶液，加入100μL步骤c中得到的吲哚标准液，用NaOH溶液调节混合溶液的pH值至5.0，在冰水浴条件下置于快速振荡器中的微孔板上进行偶合反应，反应时间35min，制得Indole-diazo-ATP@GMPs复合物。
(3)电化学检测
将步骤(2)中得到的所述Indole-diazo-ATP@GMPs复合物置于磁性分离器上，用0.1mol/L PBS(pH 5.0)洗涤3次，然后滴涂于丝网印刷碳电极(Screen printed carbonelectrode,SPCE)工作电极表面，自然晾干；将SPCE与电化学工作站连接，并在SPCE下面放置磁铁，滴加50μL pH值为7.0的支持电解质溶液于所述电极表面，采用示差脉冲伏安法，进行吲哚的检测。
2.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于，所述SPCE包括一印制电极的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基片、PET基片上印制的外部绝缘层和基片上一端的导线接口，其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，分别为碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和Ag/AgCl对电极，三个电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下印制的导线与接口相连。
3.根据权利要求1-3所述的电化学检测方法，其特征在于，所述的pH值为7.0的支持电解质溶液由含0.10mol/L K2SO4的0.10mol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液组成。
4.根据权利要求1-3所述的电化学检测方法，其特征在于，所述电化学工作站的参数设置为：低电位0.2V，高电位1.0V，振幅100mV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s。
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