CN110433337B - 双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，包括以下步骤：基底预处理；碱活化处理；配置有机膦酸混合溶液；构建双向调控功能涂层。还包括采用上述构建方法制得的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层。本发明优化了多膦酸与双膦酸分子的含量配比，所使用的多膦酸分子与双膦酸分子分别有助于促进成骨和抑制破骨，得到高质量的涂层，达到多种有机膦酸释放可控以实现双向调节功能。
Description
技术领域
本发明属于细胞响应行为涂层构件技术领域，具体涉及一种双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层及其构建方法。
背景技术
骨损伤是影响人类生活质量的主要病因，且发病人数随人口结构老龄化的影响正呈不断上升的态势。目前，植入体介入是治疗骨损伤的有效手段。然而，大多数植入体表面生物功能化不足，无法促进损伤部位的骨重塑，长时间的骨受损愈合周期会给病患带来经济和心理负担。因此，通过表面改性的方式使骨植入材料表面具有促成骨功能变得刻不容缓。
目前应用较多的植入材料表面改性方法为高分子搭载促成骨药物。根据临床数据显示，高分子涂层在体内降解过程中产生的酸性降解产物会引起患处的炎症反应，造成患者骨损伤部位疼痛，严重者需二次手术取出植入物。同时，骨重塑过程由成骨与骨吸收过程共同作用完成，调控成骨与骨吸收过程的平衡是促进成骨的关键。然而，目前表面改性方法大多功能单一，只能满足促进成骨或抑制破骨过程其一，无法对成骨与破骨的响应行为进行有效的调控，进而会影响骨损伤愈合，甚至重生骨的结构。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层及其构建方法，优化多膦酸与双膦酸分子的含量配比，所使用的多膦酸分子与双膦酸分子分别有助于促进成骨和抑制破骨，得到高质量的涂层，达到多种有机膦酸释放可控以实现双向调节功能。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，包括以下步骤：
(1)基底预处理：将金属片打磨、清洗、干燥；
(2)碱活化处理：将步骤(1)干燥后的金属片放入氢氧化钠溶液中，50℃～60℃条件下浸泡12～24h，然后将金属片取出，用去离子水清洗2～4次，再吹干后放入真空干燥箱中；
(3)配置有机膦酸混合溶液：分别取浓度为1～16mg/mL的有机多膦酸分子溶液和浓度为0.6～7mg/mL的有机双膦酸分子溶液，按体积比1:1混合，并加入氢氧化钠调节pH至5～6，得有机混合溶液；
(4)构建双向调控功能涂层：将步骤(2)所得碱活化后的金属片，放入步骤(3)所得有机混合溶液中，在50～60℃条件下浸泡3～4h，用去离子水清洗2～4次并干燥，即可在金属片表面构建出双向调控功能涂层。
进一步，步骤(1)在进行基底预处理时，将金属片用碳化硅砂纸进行打磨，直至表面无明显划痕为止，然后将打磨后的金属片加入酒精超声清洗1～2min，清洗2～4次，最后将清洗好的金属片用洗耳球吹干，放入真空干燥箱中。
进一步，步骤(1)中使用目数为320#、600#、1200#和2000#的碳化硅砂纸对金属片依次进行打磨。
进一步，步骤(2)中氢氧化钠溶液浓度为2～4mol/L。
进一步，步骤(3)中有机多膦酸分子溶液为植酸、羟基乙叉二膦酸或亚甲基膦酸。
进一步，步骤(3)中有机双膦酸分子溶液为唑来膦酸或阿伦膦酸。
进一步，金属片为镁金属片。
采用上述的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法制得的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的涂层构件方法通过碱活化处理，在金属表面形成活化层，为有机膦酸小分子提供结合位点，形成均匀致密的有机膦酸小分子涂层，使得本发明涂层与基体间结合良好、不易脱落；同时，外加金属离子，使不同膦酸分子通过与金属离子的螯合作用联结，最终形成涂层。在服役过程中，涂层释放不同的有机膦酸药物分子，达到促成骨和抑制破骨的双向作用。
2、该涂层不是依赖于高分子涂层的载药体系，一是通过有机双膦酸小分子与金属基体通过化学作用紧密结合，二是不同有机膦酸基团之间通过基体释放的金属离子形成稳定的化学配位键，所以涂层本身均匀致密、结构稳定。
3、本发明所用的有机膦酸是一种生物安全的有机小分子。此外，有机多膦酸分子(如植酸、羟基乙叉二膦酸、亚甲基膦酸)能够促进成骨细胞的生长，有机双膦酸分子(如唑来膦酸、阿伦膦酸)可以抑制破骨细胞的生长。
4、本发明的有机膦酸涂层通过液相沉积的方法构建，所需温度为40-80℃，涂层的构建工艺方便简单，同时涂层的构建对金属植入体的形状没有限制，易于推广。
附图说明
图1为功能涂层的扫描电镜图；
图2为功能涂层XPS检测结果示意图；
图3为成骨细胞培养实验CCK-8活性检测结果示意图；
图4为破骨细胞实验扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1
一种双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，包括以下步骤：
(1)基底预处理：将镁金属片分别用目数为320#、600#、1200#和2000#的碳化硅砂纸进行打磨，直至表面无明显划痕为止，然后将打磨后的金属片加入酒精超声清洗1min，清洗3次，最后将清洗好的金属片用洗耳球吹干，放入真空干燥箱中；
(2)碱活化处理：将步骤(1)干燥后的金属片放入浓度为3mol/L的氢氧化钠溶液中，60℃条件下浸泡24h，然后将金属片取出，用去离子水清洗3次，再吹干后放入真空干燥箱中；
(3)配置有机膦酸混合溶液：分别取浓度为5mg/mL的植酸溶液和浓度为1mg/mL的唑来膦酸溶液，按体积比1:1混合，并加入氢氧化钠调节pH至5，得有机混合溶液；
(4)构建双向调控功能涂层：将步骤(2)所得碱活化后的金属片，放入步骤(3)所得有机混合溶液中，在60℃条件下浸泡3h，用去离子水清洗3次并干燥，即可在金属片表面构建出双向调控功能涂层。
实施例2
一种双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，包括以下步骤：
(1)基底预处理：将镁金属片分别用目数为320#、600#、1200#和2000#的碳化硅砂纸进行打磨，直至表面无明显划痕为止，然后将打磨后的金属片加入酒精超声清洗1min，清洗3次，最后将清洗好的金属片用洗耳球吹干，放入真空干燥箱中；
(2)碱活化处理：将步骤(1)干燥后的金属片放入浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液中，60℃条件下浸泡20h，然后将金属片取出，用去离子水清洗3次，再吹干后放入真空干燥箱中；
(3)配置有机膦酸混合溶液：分别取浓度为5mg/mL的植酸溶液和浓度为5mg/mL的唑来膦酸溶液，按体积比1:1混合，并加入氢氧化钠调节pH至5.2，得有机混合溶液；
(4)构建双向调控功能涂层：将步骤(2)所得碱活化后的金属片，放入步骤(3)所得有机混合溶液中，在50℃条件下浸泡3h，用去离子水清洗3次并干燥，即可在金属片表面构建出双向调控功能涂层。
实施例3
一种双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，包括以下步骤：
(1)基底预处理：将镁金属片分别用目数为320#、600#、1200#和2000#的碳化硅砂纸进行打磨，直至表面无明显划痕为止，然后将打磨后的金属片加入酒精超声清洗1min，清洗3次，最后将清洗好的金属片用洗耳球吹干，放入真空干燥箱中；
(2)碱活化处理：将步骤(1)干燥后的金属片放入浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液中，60℃条件下浸泡24h，然后将金属片取出，用去离子水清洗3次，再吹干后放入真空干燥箱中；
(3)配置有机膦酸混合溶液：分别取浓度为5mg/mL的羟基乙叉二膦酸溶液和浓度为5mg/mL的唑来膦酸溶液，按体积比1:1混合，并加入氢氧化钠调节pH至5.2，得有机混合溶液；
(4)构建双向调控功能涂层：将步骤(2)所得碱活化后的金属片，放入步骤(3)所得有机混合溶液中，在60℃条件下浸泡4h，用去离子水清洗3次并干燥，即可在金属片表面构建出双向调控功能涂层。
实施例4
一种双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，包括以下步骤：
(1)基底预处理：将镁金属片分别用目数为320#、600#、1200#和2000#的碳化硅砂纸进行打磨，直至表面无明显划痕为止，然后将打磨后的金属片加入酒精超声清洗2min，清3次，最后将清洗好的金属片用洗耳球吹干，放入真空干燥箱中；
(2)碱活化处理：将步骤(1)干燥后的金属片放入浓度为3mol/L的氢氧化钠溶液中，60℃条件下浸泡24h，然后将金属片取出，用去离子水清洗3次，再吹干后放入真空干燥箱中；
(3)配置有机膦酸混合溶液：分别取浓度为5mg/mL的酒石酸溶液和浓度为1mg/mL的唑来膦酸溶液，按体积比1:1混合，并加入氢氧化钠调节pH至5.5，得有机混合溶液；
(4)构建双向调控功能涂层：将步骤(2)所得碱活化后的金属片，放入步骤(3)所得有机混合溶液中，在50℃条件下浸泡4h，用去离子水清洗3次并干燥，即可在金属片表面构建出双向调控功能涂层。
实施例5
一种双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，包括以下步骤：
(1)基底预处理：将镁金属片分别用目数为320#、600#、1200#和2000#的碳化硅砂纸进行打磨，直至表面无明显划痕为止，然后将打磨后的金属片加入酒精超声清洗2min，清洗3次，最后将清洗好的金属片用洗耳球吹干，放入真空干燥箱中；
(2)碱活化处理：将步骤(1)干燥后的金属片放入浓度为3mol/L的氢氧化钠溶液中，60℃条件下浸泡24h，然后将金属片取出，用去离子水清洗3次，再吹干后放入真空干燥箱中；
(3)配置有机膦酸混合溶液：分别取浓度为1mg/mL的植酸溶液和浓度为5mg/mL的唑来膦酸溶液，按体积比1:1混合，并加入氢氧化钠调节pH至5，得有机混合溶液；
(4)构建双向调控功能涂层：将步骤(2)所得碱活化后的金属片，放入步骤(3)所得有机混合溶液中，在55℃条件下浸泡3h，用去离子水清洗3次并干燥，即可在金属片表面构建出双向调控功能涂层。
对实施例2所得功能涂层进行电镜扫描，其扫描电镜结果见图1；并进行XPS检测，分析表面涂层的化学成分和结合状态，其结果见图2。对实施例2所得样品进行成骨细胞培养实验：将样品紫外辐照半小时后，放入24孔板中，每孔1个样品；以1.25cm2/mL的样品表面积与细胞培养基体积比，在每孔中加入添加了10％胎牛血清的α-MEM培养基，随后将孔板置于细胞孵箱(孵箱参数：37℃，5％CO2)中静置3天，浸泡后所得细胞培养基为样品浸提液；将成骨细胞悬液加入96孔板中，每孔200μL，置于孵箱中预培养1天，随后将细胞培养基替换为样品浸提液继续培养1、3和5天，培养后对成骨细胞进行CCK-8活性检测，其结果见图3。再对实施例2所得样品进行破骨细胞实验：将单核巨噬细胞悬液加入96孔板中，每孔200μL，置于孵箱中预培养1天，随后将细胞培养基替换为样品浸提液，并在每孔中加入6ng M-CSF和10ng RANKL，培养7天后进行TRAP染色，并利用显微镜观察，其结果见图4。
从图1中可以看出，涂层结构致密、均匀，形成微绒球状并伴随着许多非常微小的孔洞结构，孔洞有利于成骨细胞的黏附，促进成骨细胞的增值。从图2中可以看出，出现了P元素的特征峰，证明有机膦酸被成功的构筑在了基体表面，还可以看到出现了P-O-Mg的特征峰，可以得知膦酸基团与镁离子发生了配位螯合作用；还出现了N元素的特征峰，证明唑来膦酸也成功的固定在了涂层中；另外，N-C和N＝C特征峰的出现来自于唑来膦酸分子中的咪唑基。从图3中可以看出，培养1天时，涂层对于成骨细胞活性有一定影响，但与对照组相比没有太大差异，培养3天和5天时，改性后样品的成骨细胞活性均高于对照组的活性，5天时的效果显著；实验证明植酸和唑来膦酸杂化涂层的成功构筑有利于成骨细胞的生长。从图4中可以看出，对照组中形成了许多多核破骨细胞，而改性后样品表面的破骨细胞的尺寸和数量都明显降低。实验证明，植酸和唑来膦酸杂化涂层有利于抑制破骨细胞的生长。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (8)
1.双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)基底预处理：将金属片打磨、清洗、干燥；
(2)碱活化处理：将步骤(1)干燥后的金属片放入氢氧化钠溶液中，50℃～60℃条件下浸泡12～24h，然后将金属片取出，用去离子水清洗2～4次，再吹干后放入真空干燥箱中；
(3)配置有机膦酸混合溶液：分别取浓度为1～16mg/mL的有机多膦酸分子溶液和浓度为0.6～7mg/mL的有机双膦酸分子溶液，按体积比1:1混合，并加入氢氧化钠调节pH至5～6，得有机混合溶液；
(4)构建双向调控功能涂层：将步骤(2)所得碱活化后的金属片，放入步骤(3)所得有机混合溶液中，在50～60℃条件下浸泡3～4h，用去离子水清洗2～4次并干燥，即可在金属片表面构建出双向调控功能涂层。
2.如权利要求1所述的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，其特征在于，步骤(1)在进行基底预处理时，将金属片用碳化硅砂纸进行打磨，直至表面无明显划痕为止，然后将打磨后的金属片加入酒精超声清洗1～2min，清洗2～4次，最后将清洗好的金属片用洗耳球吹干，放入真空干燥箱中。
3.如权利要求2所述的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，其特征在于，步骤(1)中使用目数为320#、600#、1200#和2000#的碳化硅砂纸对金属片依次进行打磨。
4.如权利要求1所述的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，其特征在于，步骤(2)中氢氧化钠溶液浓度为2～4mol/L。
5.如权利要求1所述的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述有机多膦酸分子溶液为植酸、羟基乙叉二膦酸或亚甲基膦酸。
6.如权利要求1所述的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述有机双膦酸分子溶液为唑来膦酸或阿伦膦酸。
7.如权利要求1所述的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法，其特征在于，所述金属片为镁金属片。
8.采用权利要求1～7任一项所述的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层的构建方法制得的双向调控成骨与破骨细胞响应行为涂层。
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