CN110431233A - 用于单细胞的大量平行组合分析的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了使得能够在与其他类型的单细胞孵育的背景下平行评估个体细胞或细胞亚群中的多种功能性核酸的方法。关键的见解是同时测量衍生自至少两种不同细胞类型的小群体的多核酸，使得一种细胞类型的功能与另一细胞的克隆身份相关联。这些方法同时处理数千、数百万或更多单细胞或小细胞群。所述方法集成了分子、算法和工程方法。本发明在许多生物学和医学领域中具有广泛和有用的应用，包括免疫学和药物发现。

Description

用于单细胞的大量平行组合分析的系统和方法

相关申请的交叉引用

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序列表

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背景技术

生物细胞是极其多样的和产生极其多样化的生物学功能。因此，细胞的功能性分析几乎是任何生物学实验的基本要求。因为甚至遗传上同质的单细胞群具有异质的生物学功能，所以生物学实验最好在单细胞水平上进行。然而，使用常规方法难以或不可能进行单细胞功能性分析。

传统地，在响应于暴露于“诱导细胞”，“靶细胞”的功能性分析在组织培养板中进行，例如，6孔或96孔板上。将感兴趣的靶细胞与诱导细胞类型一起孵育，然后通过评估蛋白质、转录物或其他种类的生物标志物来测量靶细胞的应答。这样的方法总是在大量群体上进行，即数百、数千或数百万个靶细胞与数百、数千或数百万个诱导细胞一起孵育，以确定靶细胞对诱导细胞的响应。然而，靶细胞群和诱导细胞群在遗传和表型上具有固有的多样性。即使具有难以区分的基因组序列的细胞也可能对诱导细胞产生不同的反应，因为表观遗传差异、环境差异或科学目前未知的原因。

此外，尚未获得对单个靶细胞或诱导细胞进行功能测定足够灵敏的方法。通常，诱导细胞和非诱导细胞之间的转录物计数的定量差异仅为2倍、5倍或10倍，因此需要高度灵敏的方法。类似地，尚未获得足够高通量以平行测定数百万个单靶细胞或诱导细胞的方法。另外，功能性分析通常需要同时测量靶细胞和诱导细胞两者中的转录物，例如，通过同时测量和测序两种细胞类型中的转录物。如果没有这样的灵敏、高通量和组合筛选方法，就很难理解暴露于诱导细胞的单个靶细胞的功能响应，更不用说平行的数百万个单靶细胞或诱导细胞。

发明内容

本发明涉及一种与用于检测靶细胞对诱导细胞的响应的方法相结合的可以分离单靶细胞与单诱导细胞或诱导细胞群的高通量技术(图1)。在一些实施方式中，靶细胞和诱导细胞另外与“中间”细胞一起孵育，所述“中间”细胞是一种诱导细胞。本发明提供了一种用于检测诱导和非诱导细胞之间仅为2倍、5倍或10倍的转录物计数定量差异的高灵敏度的方法。本发明还能够进行组合测量，使得可以以数百万种可能的成对组合分析不同的靶细胞群和诱导细胞群。本发明的一些方法涉及通过系链(tether)或连接来自一种以上细胞类型的多核酸而产生的多核酸的定量。所述方法提供了在孔板方法中不可能的单细胞功能筛选的新方法。所述方法进一步提供了追踪功能性读取结果至单靶细胞、中间细胞或诱导细胞中的遗传差异的能力。

本发明的一个方面涉及一种用于生物细胞的功能性分析的方法，其包括：(1)将来自第一细胞类型的多个靶细胞克隆的单个靶细胞和来自第二细胞类型的多个诱导细胞克隆的一个或多个诱导细胞分离成单分散乳液微滴；(2)在所述单分散乳液微滴中孵育分离细胞，其中所述分离细胞包含所述单个靶细胞和所述一个或多个诱导细胞；(3)将含有裂解试剂的水溶液引入到所述单分散乳液微滴中，从而诱导所述分离细胞的裂解；(4)捕获从固体表面上的所述分离细胞释放的RNA；和(5)产生包含来自所述分离细胞的转录物的杂交多核酸的文库，其中所述杂交多核酸指示在孵育所述分离细胞的步骤后所述单个靶细胞的转录变化。

在一些实施方式中，所述杂交多核酸进一步指示在孵育所述分离细胞的步骤后所述一个或多个诱导细胞的转录变化。在一些实施方式中，所述一个或多个诱导细胞的所述转录变化包括基因的转录物的增加小于10倍。

在一些实施方式中，所述多个靶细胞克隆包含超过10,000个独特的细胞克隆，其中所述多个靶细胞克隆的各个靶细胞克隆在遗传上彼此不同。在一些实施方式中，所述多个诱导细胞克隆包含超过10,000个独特的细胞克隆，其中所述多个诱导细胞克隆的各个诱导细胞克隆在遗传上彼此不同。在一些实施方式中，通过将核酸序列的文库引入到至少100,000个细胞的群中来创造所述靶细胞克隆的遗传多样性。在一些实施方式中，通过将核酸序列的文库引入到至少100,000个细胞的群中来创造所述诱导细胞克隆的遗传多样性。

在一些实施方式中，使用粘附(affix)至珠子的寡核苷酸进行RNA捕获，其中各个珠子的直径为小于10μm。

在一些实施方式中，通过重叠延伸聚合酶链式反应产生所述杂交多核酸。在一些实施方式中，通过第一链合成产生所述杂交多核酸。

在一些实施方式中，所述第一细胞类型是表达T细胞受体的细胞的文库。在一些实施方式中，所述第一细胞类型是表达抗体的细胞的文库。在一些实施方式中，所述第一细胞类型是表达肽:MHC的细胞的文库。在一些实施方式中，所述第一细胞类型是表达多核酸条形码的细胞的文库。

在一些实施方式中，使用微流体将细胞分离成乳液。

本发明的另一个方面涉及一种组合物，其包含杂交多核酸的文库。在一些实施方式中，所述组合物包含具有至少10,000个独特序列的杂交多核酸。在一些实施方式中，所述组合物包含具有至少1,000,000个独特序列的杂交多核酸。

本发明的另一个方面涉及一种用于细胞群的功能性分析的方法，其包括深度测序杂交多核酸的文库。

本发明的另一个方面涉及一种组合物，其包含从包含杂交多核酸的文库的组合物产生的重组蛋白的文库。在一些实施方式中，所述重组蛋白的文库包含T细胞受体。在一些实施方式中，所述重组蛋白的文库包含肽:MHC。在一些实施方式中，所述重组蛋白的文库包含抗体。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其包含第一探针和第二探针，其中：(1)所述第一探针包含与第一细胞类型的诱导细胞的转录物互补的第一子序列和与所述第二探针的至少一部分互补的第二子序列，其中所述转录物对于所述第一细胞类型是独特的；和(2)所述第二探针包含与第二细胞类型的靶细胞的不同转录物互补的第三子序列和与所述第一探针的至少一部分互补的第四子序列，其中当所述靶细胞与所述诱导细胞一起孵育时所述不同转录物的量变化

在一些实施方式中，对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码T细胞受体。在一些实施方式中，对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码抗体。在一些实施方式中，对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码肽:MHC。在一些实施方式中，对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码多核酸条形码。在一些实施方式中，对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码重组蛋白。

本发明的另一个方面涉及一种用于生物细胞的功能性分析的方法，其包括以下步骤：(1)将来自第一细胞类型的多个靶细胞克隆的靶细胞和来自第二细胞类型的多个诱导细胞克隆的一个或多个诱导细胞分离成单分散乳液微滴；(2)在所述单分散乳液微滴中孵育分离细胞，其中所述分离细胞包含所述单个靶细胞和所述一个或多个诱导细胞；(3)从所述分离细胞中分离RNA；(4)使用包含所述第一探针和所述第二探针的组合物产生杂交多核酸的文库；和(5)深度测序所述杂交多核酸的文库。

本发明的另一方面涉及一种用于生物细胞的功能性分析的方法，其包括以下步骤：(1)将来自第一细胞类型的多个靶细胞克隆的单个靶细胞、来自第二细胞类型的多个诱导细胞克隆的一个或多个诱导细胞和来自第三细胞类型的多个中间细胞克隆的一个或多个中间细胞分离成单分散乳液微滴；(2)在所述单分散乳液微滴中孵育分离细胞，其中所述分离细胞包含所述单个靶细胞、所述一个或多个诱导细胞和所述一个或多个中间细胞；(3)将含有裂解试剂的水溶液引入到所述单分散乳液微滴中，从而诱导所述分离细胞的裂解；(4)捕获从固体表面上的所述分离细胞释放的RNA；和(5)产生包含来自所述分离细胞的转录物的杂交多核酸的文库，其中所述杂交多核酸指示在孵育所述分离细胞的步骤后所述单个中间细胞的转录变化。

在一些实施方式中，所述杂交多核酸指示在孵育所述分离细胞的步骤后所述一个或多个中间细胞的转录变化。在一些实施方式中，所述一个或多个中间细胞的所述转录变化包括基因的转录物的增加小于10倍。

在一些实施方式中，所述多个靶细胞克隆包含超过10,000个独特的细胞克隆，其中所述多个靶细胞克隆的各个靶细胞克隆在遗传学上不同于所述多个细胞克隆的其他细胞克隆。在一些实施方式中，所述多个诱导细胞克隆包含超过10,000个独特的细胞克隆，其中所述多个细胞克隆的各个诱导细胞克隆在遗传上不同于所述多个细胞克隆的其他细胞克隆。

在一些实施方式中，通过将核酸序列的文库引入到至少100,000个细胞的群中来创造所述靶细胞克隆的遗传多样性。在一些实施方式中，通过将核酸序列的文库引入到至少100,000个细胞的群来创造所述诱导细胞克隆的遗传多样性。

在一些实施方式中，使用粘附至珠子的寡核苷酸进行RNA捕获，其中各个珠子的直径为小于10μm。

在一些实施方式中，裂解试剂是表面活性剂。

在一些实施方式中，通过重叠延伸聚合酶链式反应产生所述杂交多核酸。在一些实施方式中，通过第一链合成产生所述杂交多核酸。

在一些实施方式中，所述第一细胞类型是表达T细胞受体的细胞的文库。在一些实施方式中，所述第一细胞类型是表达抗体的细胞的文库。在一些实施方式中，所述第一细胞类型是表达肽:MHC的细胞的文库。在一些实施方式中，所述第一细胞类型是转录地表达多核酸条形码的细胞的文库。

在一些实施方式中，使用微流体将细胞分离成乳液。

本发明的另一个方面涉及一种组合物，其包含由本文所述的方法产生的杂交多核酸的文库。在一些实施方式中，所述组合物包含具有至少1,000、10,000、100,000或1,000,000个独特序列的杂交多核酸。

本发明的另一个方面涉及一种用于细胞群的功能性分析的方法，其通过深度测序由本文所述的方法产生的杂交多核酸的文库。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其包含从包含由本文所述的方法产生的杂交多核酸的文库的组合物产生的重组蛋白的文库。在一些实施方式中，所述重组蛋白的文库包含T细胞受体。在一些实施方式中，所述重组蛋白的文库包含肽:MHC。在一些实施方式中，所述重组蛋白的文库包含抗体。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其包含第一探针和第二探针，其中：(1)所述第一探针包含与第一细胞类型的诱导细胞的转录物互补的第一子序列和与所述第二探针的至少一部分互补的第二子序列，其中所述转录物对于所述第一细胞类型是独特的；和(2)所述第二探针包含与第二细胞类型的中间细胞的不同转录物互补的第三子序列和与所述第一探针的至少一部分互补的第四子序列，其中当所述中间细胞与所述诱导细胞和靶细胞一起孵育时所述不同转录物的量变化。

在一些实施方式中，对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码T细胞受体、抗体、肽:MHC、多核酸条形码、或重组蛋白。

本发明的另一方面涉及一种用于生物细胞的功能性分析的方法，其包括以下步骤：(1)将来自第一细胞类型的多个靶细胞克隆的靶细胞、来自第二细胞类型的多个诱导细胞克隆的一个或多个诱导细胞和来自第三细胞类型的多个中间细胞克隆的一个或多个中间细胞分离成单分散乳液微滴；(2)在所述单分散乳液微滴中孵育分离细胞，其中所述分离细胞包含所述单个靶细胞、所述一个或多个诱导细胞和所述一个或多个中间细胞；(3)从所述分离细胞分离RNA；(4)使用包含所述第一探针和所述第二探针的组合物产生杂交多核酸的文库；和深度测序所述杂交多核酸的文库。

附图说明

图1是示出用于单细胞的平行功能性分析的本发明的方法的示意性工作流程。

图2示出了在乳液微滴中的细胞封装。1.通道收缩。2.刻有微通道的玻璃。3.细胞输入。4.裂解/RNA捕获珠子混合输入。5.油输入。6.乳液微滴。

图3示出了用于细胞裂解的液滴合并。1.PDMS芯片材料。2.输入通道。3.细胞混合物输入。4.裂解/珠子混合物液滴。5.用于液滴融合的加宽通道。6.出口通道。7.电极。8.融合微滴。

图4是具有至少两种不同的单细胞、具有一个克隆诱导细胞和一个靶细胞的本发明的示意性工作流程。1.细胞混合物包封乳液微滴芯片。2.克隆诱导细胞。3.靶细胞。4.克隆诱导细胞。5.靶细胞。6.乳液微滴内的细胞培养基。7.乳液微滴融合芯片。8.细胞混合物乳液微滴。9.裂解/RNA捕获珠子混合物乳液微滴。10.可追溯回克隆诱导细胞的转录物。11.用于将转录物结合至RNA捕获珠子的乳液微滴。12.来自由诱导细胞诱导的靶细胞的转录物。13.OE-RT-PCR乳液微滴芯片。14.RNA结合的珠子/OE-RT-PCR混合输入。15.RNA结合的珠子/OE-RT-PCR混合输入。16.扩增子，其包含来自可追溯回克隆诱导细胞的转录物的cDNA与来自由诱导细胞诱导的靶细胞的转录物的cDNA之间的融合物。17.在乳液微滴中的OE-RT-PCR混合。

图5是将来自具有三种细胞类型(靶细胞、诱导细胞和中间细胞)的至少三种不同的单细胞的转录物连接的示意性工作流程。1.细胞混合物包封乳液微滴芯片。2.克隆诱导细胞。3.靶细胞和中间细胞。4.克隆诱导细胞。5.中间细胞。6.靶细胞。7.乳液微滴内的细胞培养基。8.乳液微滴融合芯片。9.细胞混合物乳液微滴。10.裂解/RNA捕获珠子混合物乳液微滴。11.可追溯回克隆诱导细胞的转录物。12.用于将转录物结合至RNA捕获珠子的乳液微滴。13.来自由诱导细胞诱导的靶细胞的转录物。14.OE-RT-PCR乳液微滴芯片。15.RNA结合的珠子/OE-RT-PCR混合输入。16.RNA结合的珠子/OE-RT-PCR混合输入。17.扩增子，其包含来自可追溯回克隆诱导细胞的转录物的cDNA与来自由诱导细胞诱导的靶细胞的转录物的cDNA之间的融合物。18.在乳液微滴中的OE-RT-PCR混合。

图6是将来自至少两种不同的单细胞(靶细胞和诱导细胞)的转录物连接的示意性工作流程。1.诱导克隆细胞。2.靶细胞。3.诱导克隆细胞转录物。4.靶细胞转录物(诱导的表型，或指示诱导的转录变化)。5.诱导克隆细胞转录物cDNA。6.OE-RT-PCR接头序列。7.靶细胞转录物(诱导的表型，或指示诱导的转录变化)cDNA。8.OE-RT-PCR接头序列。9.OE-RT-PCR主要或连锁的扩增子；靶细胞和诱导细胞转录物cDNA的融合产物。10.OE-RT-PCR融合产物扩增子的深度测序分析。11.鉴定或追溯OE-RT-PCR融合产物扩增子序列至原始诱导细胞克隆。

图7是将来自至少三种不同的单细胞(靶细胞、诱导细胞和中间细胞)的转录物连接的示意性工作流程。1.诱导克隆细胞。2.靶细胞。3.中间细胞。4.诱导细胞在中间细胞上的作用(通过分子，例如分泌的抗体)。5.诱导克隆细胞转录物。6.靶细胞转录物(诱导的表型，或指示诱导的转录变化)。7.诱导克隆细胞转录物cDNA。8.OE-RT-PCR接头序列。9.靶细胞转录物(诱导的表型，或指示诱导的转录变化)cDNA。10.OE-RT-PCR接头序列。11.OE-RT-PCR主要或连锁的扩增子；靶细胞和诱导细胞转录物cDNA的融合产物。12.OE-RT-PCR融合产物扩增子的深度测序分析。13.鉴定或追溯OE-RT-PCR融合产物扩增子序列至原始诱导细胞克隆。

具体实施方式

定义

“包含/包括(comprise)”。包含/包括至少一个组分列表，即涵盖列出的所有要素，但也可以包含另外的未命名的要素。

“细胞”。细胞是所有已知生物体的基本结构、功能、以及生物单元。细胞是可以独立复制的最小生命单元。

“转录组”。转录是基因的表达的第一步，其中DNA的特定区段通过酶RNA聚合酶被复制到RNA(尤其是mRNA)中，以产生“转录物”。这些转录物具有多种功能，特别包括提供细胞内蛋白质翻译的基础。“转录组”是一套完整的存在于单细胞或细胞群中的RNA转录物，或基本上包含一套完整的存在于单细胞或细胞群的RNA转录物的转录物的采样。

“转录变化”。在单细胞或细胞群的转录组的组成的变化。所述转录变化可包含1、10、100、1,000、10,000或100,000个转录物的变化。在本发明的一些实施方式中，转录变化导致单细胞或细胞群功能的改变。在本发明的一些实施方式中，响应于外部刺激诱导转录变化。例如，与T细胞的肽:MHC抗原靶标结合的T细胞可以经历转录变化，其产生导致通过诱导细胞的适应性免疫功能的蛋白质。在本发明的一些实施方式中，感兴趣的转录物是上调的或下调的。

“细胞表型”。表型或“细胞类型”，是细胞的可观察到的特征或性状，例如它的形态、发育、生化或生理特性、行为、和行为的产物的复合体。在复杂的多细胞生物中，细胞特化为适应特定表型的不同细胞类型。为避免疑问，表型通常与细胞“功能”同义，尽管细胞功能的改变不一定需要改变表型。在哺乳动物中，主要细胞表型包括皮肤细胞、肌肉细胞、神经元、T细胞、B细胞、浆细胞、浆母细胞、成纤维细胞、干细胞等。细胞类型在外观和功能上可能不同，但可能在遗传上是相同的。细胞能够具有相同的基因型(即，它们是“克隆的”)，但由于它们含有的基因的差异表达而具有不同的细胞类型。细胞表型是涉及导致细胞特定形态和功能的细化的基因和蛋白质表达的多个细胞过程的聚集体。许多种细胞，例如免疫细胞，响应于外部或内部刺激而经历表型(即功能)变化。例如，记忆B细胞在用结合B细胞表面上的B细胞受体的抗原刺激后成熟为浆母细胞。在某些实施方式中，由细胞表达的RNA或蛋白质用作生物标志物以鉴定细胞的表型。

“细胞克隆”。具有独特的基因序列的细胞。例如，共享T细胞受体的两个T细胞包含细胞克隆。在其他实施方式中，共享外源多核酸条形码的两个细胞包含细胞克隆。细胞克隆可以或可以不共享细胞表型。例如，CD4+T细胞可以与CD8+T细胞共享T细胞受体序列。在某些实施方式中，细胞克隆包含相同的细胞类型。

“细胞群”。包含多种或单种细胞表型的一组细胞或细胞克隆。在某些实施方式中，细胞群包含具有一种细胞表型的10,000个细胞克隆。在某些实施方式中，细胞群包含具有一种细胞表型的至少10,000个单细胞，其中存在数千个细胞克隆。在某些实施方式中，细胞群包含具有10、20、50或100种不同细胞类型的10,000个单细胞。例如，肿瘤包含数百万个细胞和数十种细胞类型。细胞群可包含重组细胞或原代细胞。

“功能性分析”。功能性分析涉及通过实验方法例如转录物表达分析(例如，定量PCR、DNA微阵列、RNA测序)、基因组测序或基因分型(例如，免疫谱库测序、定量PCR、全基因组鸟枪测序)、蛋白质表达分析(例如，流式细胞术、ELISA)、聚糖的测量(例如，质谱法)、或测量作为功能标志的任何分子来经典地确定或分类细胞功能(即表型)。因为细胞功能可以是可塑性的，即细胞表型可以响应于外部刺激而改变，所以细胞功能的测量在筛选通过细胞功能变化诱导特定生物功能的药物或分子时特别有用。为避免疑问，功能性分析通常与表型分析同义，尽管细胞功能的改变不一定需要改变表型。

“文库”。至少两个多核酸、细胞克隆、分子或蛋白的库(pool)。在某些实施方式中，文库用于筛选生物活性蛋白质。在其他实施方式中，将细胞克隆的文库与药物混合，然后使用生物学测定法来辨别哪些细胞克隆对药物有响应。在其他实施方式中，将药物文库与单细胞克隆混合，然后使用生物学测定来辨别哪些药物在细胞克隆中引起响应。文库可以包含100、1,000、10,000、100,000或1百万个不同的肽:MHC靶标作为编码肽:MHC靶标的多核苷酸文库或者作为工程化以表达肽:MHC的细胞。在其他实施方式中，文库包含100、1,000、10,000、100,000或1百万个多核酸条形码，或工程化以将多核酸条形码表达为RNA的细胞。

“组合”。涉及细胞、蛋白质、聚核酸、或其它类型的分子的文库的组合。组合功能性分析涉及确定来自这样的文库的组分的随机组合对的功能。因为文库的成分随机配对，可能的组合的数量是第一文库的大小乘以第二文库的大小。例如，针对1,000个克隆的文库组合筛选的100个克隆的文库产生100,000个理论组合。组合功能性分析可用于发现诱导感兴趣的细胞功能的新分子或细胞相互作用。在本发明的某些实施方式中，针对另一细胞克隆的多样性(例如，100、1,000、10,000、100,000、或百万个克隆)文库组合筛选细胞克隆的遗传多样性文库。在本发明的某些实施方式中，针对细胞克隆的寡克隆(例如，少于10个)文库组合筛选细胞克隆的多样性文库。

“多核酸”。多核酸是双链或单链分子的RNA或DNA，典型地包含5、10、20、50、100、1,000、10,000、或更多个碱基对。多核酸可以是合成的即从个体核苷酸化学制造，扩增的即使用聚合酶从模板核酸酶促产生，或从生物系统纯化即从细胞或其他生物材料中提取。衍生自生物细胞或在生物细胞中检测到的多核酸通常用作指示细胞或细胞群之间的功能性差异的“生物标志物”。多核酸具有本领域技术人员熟悉的许多子类别。互补DNA或cDNA是通过使用例如逆转录酶的酶合成的DNA以从RNA模板制备cDNA。“寡核苷酸”是短(6-100个核苷酸)单链DNA或RNA序列，通常由商业提供者例如IDT DNA或ThermoFisher合成制备。

“可变免疫受体”。可变免疫受体是在细胞之间或人与人之间变化的任何糖蛋白或糖蛋白复合物。可变免疫受体包括鉴定侵入性(或病原性)细胞、病毒、细菌或其他生物材料所需的关键固有和适应性免疫多样性。在某些实施方式中，免疫受体包含适应性免疫系统，例如抗体或T细胞受体。大多数成年人在数十亿不同的T细胞或B细胞中表达数十亿这样的可变受体。在其他实施方式中，免疫受体包含在个体之间不同的免疫系统组分，例如MHC或杀伤细胞免疫球蛋白样(KIR)受体。

“T细胞受体”。T细胞受体或TCR是在T细胞或T淋巴细胞表面上发现的分子，其负责识别作为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽的抗原片段。TCR是通常由高度可变的α(α)和β(β)链组成的二硫键连接的膜锚定异二聚体蛋白，其表达为具有不变CD3链分子的复合物的一部分。表达该受体的T细胞被称为α/β(或αβ)T细胞，尽管少数T细胞表达由可变γ(γ)和δ(δ)链形成的替代受体，称为γδT细胞。每条链由两个细胞外结构域组成：可变(V)区和恒定(C)区，两者都是形成反平行β折叠的免疫球蛋白超家族结构域。恒定区靠近细胞膜，接着是跨膜区和短的胞质尾，而可变区与肽:MHC复合物结合。TCRα链和β链的可变结构域各自具有三个高变或互补决定区(CDR)，而β链的可变区具有通常不接触抗原的另外的高变区(HV4)，因此，不被视为CDR。位于TCR的两个区、α链和β链的界面以及β链框架区的残基被认为接近CD3信号转导复合物。CDR3是负责识别加工抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已显示与抗原肽的N末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C末端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC。不认为β链的CDR4参与抗原识别，但已显示其与超级抗原相互作用。TCR结构域的恒定结构域由短连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，其形成两条链之间的连接。每个重组的TCR具有独特的抗原特异性在αβT细胞的情况下由α和β链形成的抗原结合位点的结构决定，或在γδT细胞情况下由γ和δ链形成的抗原结合位点的结构决定。它主要基于个体的体细胞的T细胞中DNA编码区段的遗传重组使用RAG1和RAG2重组酶进行体细胞V(D)J重组或使用胞苷脱氨酶进行基因转化。这些特定区域(α或γ链的V和J；β或δ链的V、D和J)的交叉对应于对肽:MHC识别重要的CDR3区域。为避免疑义，本公开中的术语“TCR”体现了完整的多种可能的重组衍生物形式，并且可以衍生自具有适应性免疫系统的任何动物，例如人、小鼠、骆驼、牛、鸟或鱼。可以将TCR工程化成可溶形式，例如通过用CD3或Fc蛋白结构域工程化嵌合体。然后，这些可溶性TCR通过激活或拮抗与疾病(例如癌症)相关的分子靶标而充当药物。

“T细胞”。T细胞是由胸腺产生或加工并积极参与免疫应答的淋巴细胞类型。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用。通过细胞表面上存在T细胞受体，可以将T细胞与其他淋巴细胞(例如B细胞和天然杀伤细胞)区分开。T细胞的几个子集各自具有不同的功能。T辅助细胞(T_H细胞)协助其他白细胞进行免疫过程，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。这些细胞也称为CD4+ T细胞，因为它们在其表面表达CD4糖蛋白。辅助性T细胞在它们通过在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达的MHC II类分子被呈递肽抗原时被激活。一旦被激活，它们迅速分裂并分泌称为细胞因子的调节或协助主动免疫应答的小蛋白质。这些细胞可以分化成几种亚型中的一种，包括TH1、TH2、TH3、TH17、TH9或TFH，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号指示T细胞进入特定的亚型。细胞毒性T细胞(TC细胞、CTL、T杀伤细胞、杀伤性T细胞)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞也称为CD8+ T细胞，因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。这些细胞通过与存在于所有有核细胞的表面上的MHC I类分子相关的抗原结合来识别它们的靶标。通过IL-10、腺苷和调节性T细胞分泌的其他分子，CD8+细胞可以失活至无反应状态，从而预防自身免疫疾病。记忆T细胞是抗原特异性T细胞的一个子集，在感染消退后长期持续存在。它们在重新暴露于其关联(cognate)抗原后迅速扩增至大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。调节性T细胞(抑制性T细胞)对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制从胸腺的负选择过程逃脱的自身反应性T细胞。由于它们的调节功能，抑制性T细胞和辅助性T细胞可统称为调节性T细胞。已经描述了两类主要的CD4+Treg细胞—FOXP3+Treg细胞和FOXP3-Treg细胞。大多数人类T细胞重排其细胞受体上的α和β链，被称为αβT细胞(ab T细胞)，并且是适应性免疫系统的一部分。专门的γδT细胞(人体中少数T细胞，反刍动物中更常见)具有可有效地将抗原呈递给其他T细胞的具有受限多样性的不变T细胞受体，并被认为是固有免疫系统的一部分。导致TCR表达的遗传重排和突变产生T细胞“克隆”。当TCR与抗原肽和MHC(肽:MHC)结合时，T淋巴细胞通过信号转导激活，即由相关酶、共受体、专门的衔接分子和激活或释放的转录因子介导的一系列生化事件。永生细胞系通常用于实验研究T细胞功能，例如Jurkat细胞系。在本发明的一些实施方式中，Jurkat表达的TCRab被敲除或失活，并且重组TCRab被引入基因组或通过表达构建体瞬时表达。通过引入重组TCR构建体，例如通过慢病毒转导，将T细胞工程化为“细胞治疗剂”。T细胞治疗剂是同种异体或自体的，并且用于治疗癌症和其他类型的严重疾病。因此，工程化的TCR是一种通过T细胞起作用的药物。

“抗原”。抗体或T细胞受体的关联对的另一成员。在某些实施方式中，抗体或T细胞受体特异性结合单个抗原。在其他实施方式中，抗体或T细胞受体结合多种抗原。抗体通常以其天然构象与蛋白质或糖蛋白结合，而T细胞受体需要通过MHC在抗原呈递细胞表面上呈递的加工的肽抗原。在某些实施方式中，抗原是可溶的，而在其他实施方式中，抗原系链(tether)至细胞表面。

“抗原呈递细胞”。抗原呈递细胞(APC)在其细胞膜上展示抗原肽。抗原肽是APC内蛋白水解加工的产物。然后将抗原肽与APC细胞膜上的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白结合。结合的复合物称为肽:MHC复合物。T细胞受体不直接结合抗原肽，而是需要肽:MHC复合物。在一些实施方式中，肽衍生自APC表达的完整蛋白质。在其他实施方式中，肽衍生自病毒蛋白，并且病毒衍生的肽的展示是被病毒感染的细胞的标志。在某些实施方式中，将编码完整蛋白质、部分蛋白质或多肽的至少一种质粒引入细胞中，并且该质粒驱动重组肽:MHC在APC表面上的表达。在某些实施方式中，将APC与肽、肽混合物或蛋白质一起孵育，导致在APC膜表面上产生肽:MHC。在某些实施方式中，用APC进行细胞测定。在某些实施方式中，用为永生细胞系(例如T2细胞)或原代细胞(例如B细胞)的APC进行细胞测定。

“抗体”。抗体(Ab)，也称为免疫球蛋白(Ig)，是主要由浆细胞产生的大的Y形蛋白，其被免疫系统用于中和病原体如细菌和病毒。抗体通过Fab的可变区识别称为抗原的有害物质的独特分子。抗体的“Y”的每个尖端包含对抗原上的一个特定表位(类似于钥匙)特异的互补位(类似于锁)，允许这两个结构精确结合在一起。使用这种结合机制，抗体可以标签化微生物或受感染的细胞以受其他免疫系统的攻击，或者可以直接中和其靶标(例如，通过阻断对其入侵和生存至关重要的微生物的一部分)。取决于抗原，结合可能阻碍引起疾病的生物过程或可能激活巨噬细胞以破坏外来物质。抗体与免疫系统的其他组分通信的能力通过其包含参与这些相互作用的保守糖基化位点的Fc区(位于“Y”的基部)介导。抗体的产生是体液免疫系统的主要功能。抗体可以以两种物理形式存在，从细胞分泌而在血浆中是游离的可溶形式，和附着在B细胞表面而被称为B细胞受体(BCR)的膜结合形式。BCR仅在B细胞表面发现并促进这些细胞的激活及其随后分化为称为浆细胞或记忆B细胞的抗体工厂，所述抗体工厂将在体内存活并记住相同的抗原，因此B细胞可以在未来的暴露后更快地响应。在大多数情况下，B细胞与T辅助细胞的相互作用对于产生B细胞的完全激活是必需的，并因此在抗原结合后产生抗体。可溶性抗体被释放到血液和组织液中，以及许多分泌物以继续调查入侵的微生物。它们通常由基本结构单元制成—各自具有两个大的重链和两个小的轻链。存在几种不同类型的抗体重链，其定义了可以附着于抗原结合片段的五种不同类型的可结晶片段(Fc)。五种不同类型的Fc区允许抗体分为五种同种型。特定抗体同种型的每个Fc区能够结合其特异性Fc受体(除了IgD，其基本上是BCR)，因此允许抗原-抗体复合物根据其结合的FcR介导不同的作用。抗体结合其相应FcR的能力通过其Fc区内保守位点处存在的聚糖的结构进一步调节。抗体与FcR结合的能力有助于针对它们遇到的每种不同类型的外来物引导适当的免疫应答。尽管所有抗体的一般结构非常相似，但蛋白质尖端的小区域变化极大，允许存在数百万个具有略微不同的尖端结构或抗原结合位点的抗体。该区域被称为高变区。这些变体中的每一种都可以结合不同的抗原。抗原结合片段上的抗体互补位的这种巨大差异允许免疫系统识别同样多种类的抗原。通过编码不同抗原结合位点(或互补位)的一组基因区段的随机重组事件产生大量且多样的抗体互补位群，随后在抗体基因的该区域中随机突变，这产生进一步的多样性。这种产生克隆抗体互补位多样性的重组过程称为V(D)J或VJ重组。基本上，抗体互补位是多基因的，由三个基因V、D和J组成。每个互补位基因座也是多态的，使得在抗体产生期间，选择V的一个等位基因、D的一个等位基因和J的一个等位基因。然后使用随机遗传重组将这些基因区段连接在一起以产生互补位。基因随机重组在一起的区域是用于在克隆基础上识别不同抗原的高变区。可溶性抗体通常用作治疗药物，例如利妥昔单抗(rituximab)、阿达木单抗(adalimumab)、pembrolizumab或曲妥珠单抗(trastuzumab)。抗体有时被重新格式化为单链可变片段(scFv)，其包含通过肽接头融合在一起作为单个蛋白质的重链和轻链。在一些情况下，scFv被重新格式化为嵌合抗原受体(CAR)，然后将其工程化到T细胞中以产生称为CAR-T的细胞治疗剂。为避免疑义，本公开内容中的术语“抗体”体现了完整的多种可能的重组衍生物形式，并且可以衍生自具有适应性免疫系统的任何动物，例如人、小鼠、骆驼、牛、鸟或鱼。

“自然杀伤细胞”。自然杀伤细胞(也称为NK细胞、K细胞和杀伤细胞)是淋巴细胞(白血细胞)的一种类型和固有免疫系统的组分。NK细胞在肿瘤和病毒感染细胞两者的宿主排斥中起主要作用。通常，免疫细胞检测感染细胞表面上呈递的主要组织相容性复合物(MHC)、触发细胞因子释放、引起裂解或凋亡。然而，NK细胞是独特的，因为它们具有在不存在抗体和MHC的情况下识别受胁迫细胞的能力，从而允许更快的免疫反应。它们被称为为“自然杀伤”，因为它们最初的概念是它们不需要激活来杀死缺少MHC1类“自身”标志物的细胞。这一作用尤其重要，因为缺少MHC I标志物的有害细胞无法被检测到并被其他免疫细胞破坏，如T淋巴细胞。NK细胞还通过称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的机制杀死细胞，其开始于与靶细胞表面上的抗原结合的可溶性抗体。结合抗原的抗体可被NK细胞上表达的FcgRIII(CD16)受体识别，导致NK激活、细胞溶解颗粒释放和随后的细胞凋亡。这是一些单克隆抗体例如利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumumab)等的主要细胞杀伤机制。在某些实施方式中，使用例如NK-92细胞系的细胞系代替原代NK细胞。

“靶标”。药物结合的生物分子以诱导药理学功能。在某些实施方式中，靶标是由细胞产生并在细胞膜上表达的蛋白质。靶标还包括核酸、脂质、聚糖和糖蛋白。在某些实施方式中，靶标是抗原，例如，被抗体识别的蛋白质或被TCR识别的肽:MHC。

“靶细胞”。表达抗原或靶标的生物细胞。在本发明的某些实施方式中，靶标或抗原与靶细胞的细胞膜结合，因此暴露于细胞外空间。在本发明的某些实施方式中，由于诱导细胞与靶细胞表面上的抗原或靶标相互作用，靶细胞在1、10、100或10,000个mRNA转录物中经历可量化的变化。在本发明的一些实施方式中，靶细胞中的可量化变化是内源转录物。在本发明的一些实施方式中，靶细胞中的可量化变化是由已经引入靶细胞的重组工程化“报告子”构建体产生的转录物。在本发明的一些实施方式中，报告构建体含有在与从诱导细胞接触靶细胞产生的信号接触时诱导转录的启动子、增强子或其他调节元件。在本发明的一些实施方式中，感兴趣的转录物是上调的或下调的。

“诱导细胞”。表达与靶细胞上的抗原或靶标结合的配体或诱导物分子的生物细胞。在本发明的某些实施方式中，诱导细胞分泌随后结合至靶细胞以诱导可量化的转录变化的蛋白质或分子。在本发明的其他实施方式中，诱导细胞表面上的蛋白质或分子与靶细胞结合以诱导可量化的转录变化。在某些实施方式中，诱导蛋白质或分子包含单一种类，而在本发明的其他实施方式中，诱导蛋白质或分子包含2、5、10、100或1,000个个体种类。在本发明的某些实施方式中，由于诱导细胞与靶细胞表面上的抗原或靶标相互作用，诱导细胞经历1、10、100或10,000个mRNA转录物的可量化的变化。

“中间细胞”。功能性地响应于诱导细胞和靶细胞之间的相互作用、或者诱导细胞分泌的蛋白质与靶细胞表达的蛋白质之间的相互作用的生物细胞。在本发明的某些实施方式中，由于诱导细胞与靶细胞表面上的抗原或靶标相互作用，中间细胞经历1、10、100或10,000个mRNA转录物的可量化的变化。在本发明的其他实施方式中，诱导细胞表面分泌的蛋白质或分子与靶细胞结合以在中间细胞中诱导可量化的转录变化。在本发明的一些实施方式中，中间细胞中的可量化变化是由已经引入中间细胞的重组工程化“报告子”构建体产生的转录物。

“合成多核酸”。化学或酶促合成的RNA或DNA。为了合成单链RNA或DNA，或“寡核苷酸”，化学合成过程可以实施为使用亚磷酰胺方法的固相合成和衍生自受保护的2'-脱氧核苷(dA、dC、dG和dT)、核糖核苷(A、C、G和U)、或化学修饰的核苷例如LNA或BNA的亚磷酰胺构建块。为了获得所期望的寡核苷酸，化学结构单元可以按产物序列所需的顺序依次与生长的寡核苷酸链偶联。通常，合成的寡核苷酸是长度约为15-25个碱基的单链DNA或RNA分子。合成多核酸也可以通过酶法产生，例如逆转录(RT)、聚合酶链反应(PCR)、Gibson组装、重叠延伸PCR(OE-PCR)、重叠延伸RT-PCR(OE-RT-PCR)、乳液PCR、乳液RT-PCR、乳液OE-RT-PCR、乳液OE-PCR、连接酶链式反应(LCR)、杂交、体外转录或任何其他利用纯化酶的无细胞分子生物学方法。

“多核酸条形码”。多核酸条形码包含使得实验者能够鉴定细胞克隆的合成多核酸，即独特标识符。在一些实施方式中，包含在表达质粒内或编码成重组或合成的RNA序列的条形码被工程化到细胞的基因组中。在一些实施方式中，条形码附着于固体表面，例如直径为1微米的磁珠。在一些实施方式中，克隆群包含10、100、1,000、10,000、100,000或1百万种不同的条形码。条形码可以通过批量测序进行测序，实现细胞功能的高通量组合分析。

“逆转录”。逆转录酶(RT)酶用于从RNA模板产生互补DNA(cDNA)的过程。逆转录酶通常用于研究中以称为逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的技术将聚合酶链式反应技术应用于RNA。经典PCR技术仅适用于DNA链，但在逆转录酶的帮助下，RNA可以逆转录为DNA，从而可以对RNA分子进行PCR分析。逆转录酶也用于从mRNA产生cDNA文库。

“聚合酶链式反应”。聚合酶链式反应(PCR)是一种用于分子生物学的技术，用于将一种DNA的单拷贝或几拷贝扩增几个数量级，产生数千至数百万个特定DNA序列的拷贝。该方法依赖于热循环，包括用于DNA熔融和DNA酶促复制的反复加热和冷却反应的循环。含有与靶区域互补的序列的引物(短DNA片段)以及DNA聚合酶(该方法以其命名)是能够进行选择性和重复扩增的关键组分。随着PCR的进行，产生的DNA本身用作复制的模板，启动其中DNA模板以指数方式扩增的链式反应。可以对PCR进行广泛修饰以进行多种遗传操作。PCR通常不被认为是重组DNA方法，因为它不涉及切割和粘贴DNA，仅涉及现有序列的扩增。几乎所有的PCR应用都使用热稳定的DNA聚合酶，例如Taq聚合酶(一种最初从细菌Thermusaquaticus中分离的酶)。该DNA聚合酶通过使用DNA合成的起始所必需的作为模板的单链DNA和DNA寡核苷酸(也称为DNA引物)从DNA构建块(核苷酸)酶促组装新的DNA链。绝大多数PCR方法使用热循环，即通过一系列确定的温度步骤交替加热和冷却PCR样品。在第一步中，DNA双螺旋的两条链在高温下在称为DNA熔融的过程中物理分离。在第二步中，降低温度并且两条DNA链成为DNA聚合酶的模板以选择性地扩增靶DNA。PCR的选择性来自于在特定热循环条件下使用与靶向扩增的DNA区域互补的引物。

“杂交”。两种多核酸融合形成单个多核酸分子的任何过程。杂交可以通过任何天然或人工方法发生，其导致两个单链多核酸形成碱基配对，获得至少部分双链的分子。碱基配对通常通过反向互补发生，例如鸟嘌呤-胞嘧啶、腺嘌呤-胸腺嘧啶或腺嘌呤-尿嘧啶。在一些实施方式中，杂交的碱基对是相邻的，例如，各自包含是反向互补序列的20个核苷酸子序列的100个核苷酸的两个单链多核酸。在适当的条件下，两个多核酸将在这些互补核苷酸子序列上杂交，形成杂交分子。称为“重叠延伸PCR”的扩增过程产生多个融合的双链DNA产物，其由包含互补核苷酸子序列的两个多核苷酸之间的初始杂交步骤产生。

“微流体”。微流体是通常在微升(10^-6)至皮升(10^-12)的范围内在最小尺寸从几十微米到几百微米的通道网络中操纵和控制流体的科学和技术。通常，流体被移动、混合、分离或以其他方式处理。许多应用采用被动流体控制技术，如毛细管力。在一些应用中，外部致动装置另外用于介质的定向运输。实例是施加离心力用于无源芯片上的流体传输的旋转驱动器。活性微流体是指通过微泵或微型阀等活性(微)组分对工作流体的限定操作。以连续方式供应流体的微泵可用于定量给料。微型阀可以确定泵送液体的流动方向或运动模式。通常在实验室中进行的过程可以在单个芯片上小型化，以便提高效率和移动性以及减少样品和试剂量。与连续微流体相比，基于液滴的微流体作为微流体的子类别具有以低雷诺数和层流状态操纵不混溶相中的离散体积流体的区别。用于产生液滴的两个不混溶相被称为连续相(产生液滴的介质)和分散相(液滴相)。产生的液滴的大小主要由连续相和分散相的流速、两相之间的界面张力和用于产生液滴的几何形状控制。

“微滴”。通常具有小于1微升的体积的球形、小体积的液体。微滴包含油包水微滴和水包油微滴。油包水微滴群或水包油微滴群包含“乳液”。乳液可以是单分散的，例如，包含基本上相同体积的微滴，例如，直径变化不超过25％，或多分散，例如，包含各种体积的微滴，例如，直径变化>25％。微滴是进行高通量分子、细胞或生物化学实验的手段。微滴用于分隔(partition)液体反应，因此起到与物理容器类似的作用。数百万或数十亿的微滴可以沉积在小的(例如，1毫升)物理容器中，从而能够在单个细胞上进行非常大的组合筛选。在本发明的一些实施方式中，使用微流体产生单分散微滴，即“液滴微流体”。在本发明的其他实施方式中，使用摇动或混合装置产生多分散微滴。

“物理容器”。分子生物学、细胞生物学或生物化学中使用的物理容器是指管、板、盘、小瓶或包括固体塑料、玻璃、聚合物或其他固体材料的其他形式。在一些实施方式中，物理容器是惰性的，即容器仅用于物理上含有用于分子、细胞或生物化学实验的液体。在一些实施方式中，将反应性细胞、分子、蛋白质、药物或生物化学容器粘附到物理容器上。物理容器是进行分子、细胞或生物化学实验的手段。为了提高处理通量，物理容器可以与机器人系统一起使用。在一些实施方式中，通过使用包含物理容器(例如玻璃、塑料或PDMS微流体芯片上的纳升腔室)的微流体芯片来增加通量。

“固体支持物”。分子生物学、细胞生物学或生物化学中使用的固体支持物是指包含固体塑料、玻璃、聚合物或其他固体材料的珠子或其他几何形式。在本发明的一些实施方式中，将反应性细胞、多核酸、蛋白质或其他分子粘附在固体支持物上。然后将固体支持物引入物理容器或微滴中，使得能够实现生物化学、细胞或分子功能。然后可以洗涤或去除固体支持物，从而简化多步实验室过程。在一些实施方式中，固体支持物是一微米、十微米或一百微米的磁珠。在一些实施方式中，将合成的多核酸粘附到磁珠上，使得能够纯化与合成多核酸互补(也称为“探针”)的内源细胞多核酸。在一些实施方式中，固体支持物是用抗体包被的珠子，然后将其用于纯化表达对抗体具有亲和力的抗原的细胞。

“批量测序”。与深度测序、超高通量测序、大规模平行测序和下一代测序同义。批量测序包括并行获得数十万、数百万、数亿或数十亿的DNA序列读取结果。在许多实施方式中，使用例如PCR、RT-PCR或杂交的方法产生多样的DNA文库，然后使用批量测序对多个文库进行测序。方法可包括通过合成测序、纳米孔测序和焦磷酸测序。截至2017年，批量测序的商业供应商包括Illumina、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore和Roche。

发明概述

本发明的一个方面涉及同时测量衍生自至少两种不同细胞类型的多核酸。可以在少量细胞上以大规模平行方式进行测量，或者可以在数百万种不同细胞类型组合上进行组合筛选。在一些实施方式中，将细胞组合分离到反应容器中，孵育以诱导生物反应，并裂解以分离RNA，同时保留组合环境。来自至少两种不同细胞类型的转录物可以通过杂交进行物理连接，然后可以在大规模平行范围上对连接的克隆进行深度测序(图1)。

所述方法可以包括将单细胞或细胞亚群分离成微乳液液滴、凝胶或微流体反应容器。可以以大规模平行的方式分离或区室化数百万个细胞以产生代表遗传上不同的成对组合的细胞混合物(图2)。

细胞混合物可包含一个或多个靶细胞、一个或多个诱导细胞和/或一个或多个中间细胞。靶细胞可包含同质细胞群或遗传上不同的克隆(例如，B细胞、T细胞、用条形码工程化的细胞、工程化以表达肽抗原的细胞、单细胞悬浮液中的原发癌细胞)。诱导细胞可包含同源细胞群或遗传上不同的克隆(例如，B细胞、T细胞、用条形码工程化的细胞、工程化以表达肽抗原的细胞、NK细胞)。在一些实施方式中，使用中间细胞，并且中间细胞可包含同质细胞群或遗传上不同的克隆(例如，NK细胞)。

在一些实施方式中，将靶细胞和诱导细胞与粘附于固体支持物(例如珠子或蛋白质)的多核酸条形码的文库混合。在一些实施方式中，细胞混合物另外地在相同的微乳液液滴、凝胶或反应容器中与刺激物一起孵育，例如，均质细胞群、试剂库或单个试剂。

然后可以通过将试剂引入微乳液液滴、凝胶或微流体反应容器中来裂解细胞混合物。在一些实施方式中，该步骤包括将含有细胞的微乳液液滴与含有裂解试剂的微乳液液滴融合，从而保持细胞混合物的区室化(图3)。裂解后，可以纯化来自细胞混合物的转录物，例如，使用涂有oligo-dT寡核苷酸的珠子。

在一些实施方式中，使两个或更多个多核苷酸靶标杂交，使得分化克隆的多核酸与指示功能变化的RNA转录物连接(图4-5)。关键点是融合衍生自至少两种不同细胞类型的转录物，例如，编码抗体靶标的转录物和衍生自产生抗体的细胞的编码抗体的转录物(其中产生抗体的细胞是诱导细胞)。然后可以通过批量或高通量测序对杂交的多核酸分子进行测序。可以使用本领域已知的任何高通量测序方法。

随后可以通过算法分析批量测序数据以确定来自初始克隆文库的哪些克隆显示响应于一个或多个诱导细胞刺激的功能变化(图6-7)。对来自多种细胞类型的杂交核酸分子的测序使得能够同时测量来自至少两种细胞类型(例如产生抗体靶标的细胞和产生抗体的细胞)中的每一种的至少一种转录物。由于深度测序的极端敏感性，诱导和非诱导细胞之间仅仅2倍、5倍或10倍不同的转录物计数是可检测的。因此，本发明的方法可以提供平行地跨越数百万个单靶细胞和诱导细胞的对暴露于诱导细胞的单靶细胞的功能响应的洞察，并且实现前所未有的组合功能筛选。在一些实施方式中，杂交的多核酸进一步用于制备随后可以进一步筛选结合或功能的重组蛋白的文库。

本文提供了本发明方法的详细描述。本文还提供了本发明实施方式的实例的详细描述，特别是应用于免疫学、药物发现、药物开发和癌症生物学。

其他解释性惯例

本文所述的范围被理解为该范围内的所有值的简写，包括所列举的端点。例如，1至50的范围应理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36，37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50组成的组的任何数字、数字组合或子范围。

本发明的方法

1)DNA文库的生成

本发明的一些实施方式涉及通过从哺乳动物供体分离B细胞，然后使用本领域技术人员公知的例如电融合的技术将原代细胞与骨髓瘤细胞融合来产生抗体克隆的文库(Smith&Crowe,Microbiol Spectr.2015 3(1):AID-0027-2014)。所得到的细胞称为杂交瘤，在培养中比原代细胞更容易。已经使用多种方法使用来自包含小鼠和人的物种的原代细胞来制备T和B细胞杂交瘤。使用这些方法，可以制备各自表达独特TCR或抗体的数万、数十万或数百万个细胞克隆的文库。

本发明的一些实施方式涉及通过从原代细胞(例如肿瘤、肝、脑、血液、骨髓、外周血单核细胞、肌肉组织、脑脊液、肾组织、肺灌洗、肺组织、永生细胞系、皮肤组织或任何其他组织或细胞类型)分离RNA来产生基因的DNA文库的方法。逆转录酶可用于从RNA合成cDNA。例如，将RNA与M-MuLV RT在42℃下与oligo-dT引物一起孵育1小时。在一些实施方式中，将oligo-dT引物与核酸条形码序列融合，侧翼为能够特异性扩增条形码并追溯条形码至cDNA序列的通用扩增引物。这使得能够对复杂的克隆混合物进行去多重(de-multiplexing)。基于RT的方法具有廉价且快速地平行产生由数万、数十万或数百万个DNA克隆组成的DNA文库的优点。为了回收多个感兴趣的cDNA克隆，可以使用包含基因特异性引物、热稳定性聚合酶例如Taq和由变性(95℃持续30秒)、扩增30个循环(95℃15秒、62℃ 60秒、68℃ 3分钟)、然后在68℃最终延伸5分钟组成的热循环的反应对全cDNA文库进行PCR。

本发明的一些实施方式涉及通过DNA合成产生抗体、TCR或任何其他种类的基因序列的DNA文库的方法。在一些实施方式中，使用本领域已知的方法获得关于TCR或抗体库的DNA测序数据，然后从通过批量测序而鉴定的序列来工程化合成的DNA文库。在一些实施方式中，合成的DNA文库包含已知通过包括酵母展示、哺乳动物展示或哺乳动物细胞激活测定的方法结合感兴趣的抗原的TCR或抗体。可以设计DNA寡核苷酸，使得它们包含在一起孵育时杂交的重叠的互补序列的文库。数百、数千、数万或数十万合成寡核苷酸的文库可通过微流体或基于阵列的方法制备，例如，通过商业提供者如Twist Bioscience、AgilentTechnologies或LC Biosciences。然后可以使用5'外切核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶将寡核苷酸文库组装成数百或数千个核苷酸的DNA序列(例如，“Gibson Assembly”,Gibson等Nat Methods.2009May；6(5):343-5)。例如，将T5核酸外切酶、Taq聚合酶和Taq连接酶在包含重叠寡核苷酸、核苷酸、DTT、MgCl₂和缓冲液的反应中混合，然后在50℃孵育60分钟。在一些实施方式中，Gibson Assembly用于合成环状克隆，例如质粒表达构建体。如果合成的DNA是环状的，则DNA可以转化到细菌中以产生纳克或更多量的质粒。产生线性合成DNA的另一种方法包括混合重叠的寡核苷酸并使用热稳定聚合酶进行PCR。为了制备环状DNA，然后可以使用包括限制酶和DNA连接酶、Gibson Assembly或平末端克隆的方法将这些线性PCR产物亚克隆到质粒表达构建体中。这些DNA合成方法中的任何一种都可以通过96孔板、384孔板、微流体或机器人处理系统进行平行化。

还可以通过分离和裂解单细胞，然后进行核酸扩增来产生抗体、TCR或任何其他靶基因的DNA文库。可以将单B细胞分离到96孔板中，然后可以使用本领域已知的方法连接重链和轻链免疫球蛋白转录物，例如，多重“重叠延伸”RT-PCR(Oleksiewicz EP1921144B1)。在重叠延伸RT-PCR或OE-RT-PCR中，对于来自单细胞的免疫球蛋白扩增，可以设计结合并扩增所有可能的重链基因和所有可能的轻链基因的引物库。重链引物还可以包含与轻链引物互补的子序列。在OE-RT-PCR期间，互补子序列可以杂交，并且聚合酶可以从杂交的单链重链和轻链免疫球蛋白产生融合的多核酸。以这种方式，可以维持重链和轻链免疫球蛋白的单细胞环境。

抗体、TCR或任何其他靶基因的DNA文库可以通过其他方法产生，例如涉及来自超过一万个细胞的群的OE-RT-PCR和微流体的那些方法。Johnson EP2652155中公开的一种示例性方法涉及使用液滴微流体装置，其全部内容通过引用并入本文。液滴微流体装置输入油/表面活性剂混合物、裂解和RNA捕获混合物、以及细胞悬浮液、以及将单细胞乳液输出到标准热循环微管中。油/表面活性剂混合物基于矿物油或氟碳油。裂解和RNA捕获混合物包含捕获来自单细胞的信使RNA(mRNA)转录物的oligo-dT包被的磁性1μm珠子。细胞包封装置包括三个压力泵、微流体液滴芯片和成像装置。微流体芯片由玻璃制成，芯片的大部分长度蚀刻至50μm x 150μm，在液滴连接处变窄至55μm。液滴尺寸取决于压力，但通常～40μm的液滴是最佳稳定的并且适合于单细胞乳液的尺寸。液滴产生率也取决于压力，但通常高达3kHz，每小时捕获300万个细胞。细胞裂解方法包括基于表面活性剂的方法，例如Triton X-100、NP-40、Tween 20、Tween 80或SDS。将乳液在50℃下孵育30分钟，然后使用溶剂例如乙酸乙酯从乳液中提取珠子。接着，使用类似于如前所述细胞封装芯片的微流体芯片将mRNA结合的珠子注射回用于OE-RT-PCR的乳液中。例如，为了产生TCRαβ文库，在多重中产生独立的TCRα和TCRβ次要(minor)扩增子；然后将它们融合以产生由TCRα和TCRβ组成的单个主要(major)扩增子。TCRαβ引物库包括β恒定(Cβ)区和α恒定(Cα)区的通用引物。这消除了对大量J区引物库的需要。另外，设计C区引物以捕获内源C区基因型或同种型，或设计引物以忽略内源C区基因型或同种型。TCRαβ引物库还包含与TCRαβ和TCRβ的所有可能的V区段结合的43个引物。因此，引物扩增跨越每个单体的完整可变区以产生450bp的次要扩增子。用于TCRβV基因的示例性引物在本文中作为SEQ ID NO:17-19提供，TCRβC基因的示例性引物在本文中作为SEQ ID NO:20提供，用于TCRαV基因的示例性引物作为SEQ ID NO:21-23提供，和TCRαC基因的示例性引物在本文中以SED ID NO:24提供。然后使用包含RT、基因特异性引物、热稳定聚合酶例如Taq和由逆转录(42℃，60分钟)、变性(95℃，30秒)、30个循环的扩增(95℃15秒、62℃ 60秒、和68℃ 3分钟)、然后在68℃下最后延伸5分钟组成的热循环的反应对珠子乳液进行OE-RT-PCR。因为多个液滴仅含有单个mRNA结合的珠子，所以输入T细胞的天然TCRαβ配对保持在TCRαβ连锁文库中。类似的方法可用于产生连锁的重链和轻链免疫球蛋白DNA文库。例如，可以使用包含SEQ ID NO:1-8中任一个的多核苷酸的免疫球蛋白引物组。SEQ ID NO:1-3提供用于IGG V基因的示例性引物序列，SEQ ID NO:4提供用于IGG C基因的示例性引物序列，SEQ ID NO:5-7提供用于IGK V基因的示例性引物序列，和SEQ ID NO:8提供用于IGK C基因的示例性引物序列。免疫球蛋白C区的引物是同种型特异性的、基因型特异性的、或者是设计扩增任何C区序列的通用引物。在一些实施方式中，TCR或免疫球蛋白亚基与编码猪teschovirus-1(P2A)氨基酸序列的多核酸序列连接。在一些实施方式中，TCR或免疫球蛋白亚基与编码Gly-Ser肽接头的多核酸序列连接。在一些实施方式中，TCR或免疫球蛋白亚基与编码内部核糖体进入位点(IRES)的多核酸序列连接。在其他实施方式中，TCR或免疫球蛋白亚基与和任何已知的内源序列没有显著同源性人工接头序列连接。

可以使用本领域已知的方法将连接的TCRαβ或重链和轻链免疫球蛋白的DNA文库转化为重组表达构建体，例如Johnson US9,422,547B1中描述的方法，其全部内容通过引用并入本文。Johnson US9,422,547B1中描述的示例性方法使用嵌套的外部PCR引物将用于Gibson Assembly的具有突出部分的衔接子添加到扩增子文库的5'和3'末端。用于C区的引物可以是同种型特异性的、基因型特异性的、或者是设计扩增任何C区序列的引物。将T5核酸外切酶和Taq连接酶在包含TCRαβ或免疫球蛋白插入物、具有与插入物互补的子序列的线性化质粒骨架、DTT、MgCl₂和缓冲液的反应中混合，然后在50℃下孵育60分钟。质粒骨架包含启动子、poly(A)信号序列和未通过OE-RT-PCR扩增的C区序列。C区与连接的扩增子的同种型或基因型匹配，或设计为使扩增子与非天然同种型或基因型融合。然后将文库转化到大肠杆菌中并在LB氨苄青霉素平板上铺开。然后用Maxi prep试剂盒纯化质粒文库。纯化的Maxi prep文库包含数万、数十万或数百万个克隆。一些工作流程需要第二轮GibsonAssembly。例如，如果在原始OE-RT-PCR中未扩增完整C区中的一个或两个，则可能需要克隆TCRαβ或重链和轻链免疫球蛋白之间的C区。在一些实施方式中，同时克隆启动子、P2A或IRES序列。通过使用Gibson Assembly或PCR组装寡核苷酸库来合成插入的序列，然后可以使用Gibson Assembly将多核酸插入物插入质粒文库中。该反应可以在数万、数十万或数百万个克隆上平行进行。最终结果是数万、数十万或数百万的TCRαβ或重和轻链免疫球蛋白克隆的文库，其表达保留原始单细胞输入的天然配对的完整功能蛋白。

在一些实施方式中，单细胞扩增方法用于使用各种用于核酸条形码的方法产生用于任何转录物、转录物组或完整单细胞转录组的单细胞cDNA文库，例如，如Johnson US15/159,674中所述，其全部内容通过引用并入本文。

Johnson US 15/159,674中公开的示例性方法包括将具有单细胞的克隆多核酸条形码递送到反应容器、微流体室或乳液微滴中。一种方法是将包含条形码的多核酸固定到包含由磁性材料制成的直径为1μm、5μm或10μm的球形珠子的固体支持物以促进核酸纯化。寡核苷酸用NH2修饰并粘附到环氧硅烷或异硫氰酸酯涂覆的玻璃珠子上，或寡核苷酸经二硫化物修饰并附着到巯基硅烷化玻璃支持物上。对于液滴包封，将珠子溶液与细胞混合，然后稀释使得多个液滴含有单个细胞和单个珠子。因为这样的方法导致多个空的液滴或液滴仅具有单个珠子或仅有单个细胞，所以在一些方法中，细胞和珠子首先被封装成在分开的流或单独的装置中的液滴，然后含有细胞的液滴和含有珠子的液滴融合以产生多个包含单个细胞和单个珠子的液滴。根据应用，可以用多个条形码珠子封装多个单细胞。即使存在用于多个单细胞的多个条形码，这样的方法也能够将单个条形码追溯到单个细胞。其他方法包括生物素-链霉亲和素和共价缀合化学。另一种方法是将包含条形码的多核酸粘附到抗体上，所述抗体在将细胞递送至反应容器、微流体室或乳液微滴之前与细胞结合。可以使用将抗体与本领域可获得的核酸缀合的方法，例如，生物素-链霉亲和素或共价缀合化学。细胞裂解方法可包括基于表面活性剂的方法，例如Triton X-100、NP-40、Tween 20，Tween 80或SDS。在一些实施方式中，将乳液在50℃孵育30分钟，然后使用溶剂例如乙酸乙酯从乳液中提取珠子。接下来，从乳液中回收RNA结合的珠子，然后使用上述方法在液滴或反应容器中扩增，具有对核酸条形码特异的一些修饰。在核酸条形码中，第一链cDNA可以用与转录物特异性第一链引物融合的核酸条形码标记。核酸条形码5'的通用引物可用于PCR以扩增多个条形码化的RT-PCR扩增子。或者，RNA可以与条形码序列分开引发和扩增，然后条形码和cDNA扩增子可以在乳液微滴内部的重叠延伸PCR中融合。或者，第一链cDNA条形码可以在裂解混合物中用RT进行，而不需要注射用于RT-PCR扩增的RNA结合的珠子。在这些方法中，可以从乳液中提取cDNA结合的珠子，并且可以对条形码化的cDNA进行“批量”PCR，即没有乳液的PCR。任何这些方法的最终结果可以是数万、数十万或数百万条条形码化的cDNA克隆的文库，其表达能够将具有相同条形码的cDNA追溯回单个起源细胞的完全功能的蛋白质。cDNA不一定是全长的，例如，肽:MHC复合物不需要完整的cDNA用于功能性分析。在一些实施方式中，靶文库包含NY-ESO-1靶序列(SEQ ID NO:13)或MART-1靶序列(SEQ ID NO:16)，其被工程化为两个不同的哺乳动物克隆。

一旦重新格式化为环状质粒，可以将cDNA文库引入哺乳动物细胞中用于蛋白质生产。例如，可以将TCRαβ表达构建体包装到慢病毒或本领域已知的任何其他载体中，然后用于转导缺乏TCRβ表达因此没有细胞表面TCR的Jurkat J.RT3-T3.5细胞系(ATCC)或其他细胞。在一个特定的实施方式中，首先，从TCRαβ质粒开始，使用第3代ViraSafe慢病毒包装系统(Cell Biolabs)和Lenti-Pac 293Ta细胞(GeneCopoeia)产生水泡性口炎病毒G(VSV-G)假型化慢病毒颗粒。可以使用Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒(Clontech)确定慢病毒拷贝数以标准化转导。在示例性实施方式中，用慢病毒构建体的文库转导10⁵或10⁶个J.RT3-T3.5细胞，然后用嘌呤霉素选择14天。在示例性实施方式中，FACS分析显示15-30％的转导效率。在其他特定的实施方式中，转染CHO Flp-In(由Life Technologies商业提供)细胞用于重链和轻链免疫球蛋白文库的靶向基因组整合。尽管慢病毒随机整合到哺乳动物基因组中，但针对Flp-In工程化的质粒将仅整合到细胞基因组中的FRT位点。CHO Flp-In细胞先前已被工程化为在基因组中的单个位置含有FRT位点。为了工程化表达抗体的细胞的文库，使用2：1比率的Flp重组酶载体与抗体质粒文库在Ingenio缓冲液(Mirus Bio)中电穿孔400万个CHO Flp-In细胞。在没有选择的生长培养基中两天后，向生长培养基中补充600g/mL潮霉素，其选择缺乏稳定整合体的细胞。三周后，对集落计数，使得在成功的实验中，约1％的电穿孔细胞产生稳定的整合体。根据下游实验的要求，CHO Flp-In细胞用分泌的或膜结合的抗体工程化。本领域已知的其他方法可用于将蛋白质表达构建体工程化到哺乳动物细胞的基因组中，例如，逆转录病毒的随机整合、CRISPR/Cas9、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶。可以使用任何方法来获得表达数千、数万、数十万、数百万或数亿个不同的感兴趣的转录物和蛋白质序列的细胞克隆的文库。在一些实施方式中，示例性靶标文库包含工程化为两种不同哺乳动物克隆的NY-ESO-1靶序列(SEQ ID NO:13)或MART-1靶序列(SEQ ID NO:16)。

2)用于功能测定的靶细胞、中间细胞和诱导细胞的制备

本发明的一些方面涉及分隔具有靶细胞的单克隆细胞或具有中间细胞和靶细胞的单克隆细胞的方法。为了促进高通量分析，可以通过使用液滴微流体芯片封装成油包水液滴来实现细胞的分隔。可以使用本领域已知的任何微流体芯片。例如，可用于本发明的各种实施方式的微流体芯片包括但不限于由玻璃、塑料、PDMS或其他聚合物制成的那些。一个特定的实施方式采用由玻璃制成的微流体芯片，在芯片的大部分长度上蚀刻50μm×150μm的通道，并且在液滴生成结处变窄至55μm。使用压力泵或注射泵将流体泵送通过微流体芯片。将细胞以两股流注入液滴中。例如，将APC注入一个流中，并将表达TCR的细胞注入第二个流中。通常，以每微升10,000-20,000个细胞注射表达TCR的细胞，并以略低的浓度注射APC，例如每微升2,000-5,000个细胞，使得含有APC的大多数液滴仅含有单个APC。含有细胞混合物的液滴在20-200μm的范围内。诱导细胞与靶细胞的比例因应用而异，但是希望对于分区含有单个诱导细胞，使得能够检测克隆细胞与其靶标之间的功能相互作用。在一些实施方式中，将细胞包封在凝胶中而不是水溶液中。例如，琼脂糖凝胶用于嵌入和包封感兴趣的细胞。如果克隆文库的大小不超过10,000个遗传上不同的克隆，则可以使用反应容器，例如96孔板、384孔板或微流体室芯片。可以使用流式细胞术或手动移液将细胞分配到96孔板中。可以使用压力泵或注射泵将细胞分配到微流体容器芯片(例如，来自例如Fluidigm的供应商)中，并且使用微流体微孔阀将细胞捕获到微流体室中。无论液滴或反应容器是否用于分隔细胞混合物，细胞混合物都可以以使得诱导细胞诱导靶细胞和/或中间细胞的转录变化的方式孵育，例如在组织培养箱中于37℃补充10％胎牛血清(FCS)的RPMI、DMEM、或IMDM。

在一些实施方式中，使用玻璃微流体芯片将CHO细胞注入在含有10％FCS的RPMI中的35μm半径液滴中，其中油相包含氟烃油和表面活性剂。Sytox Orange和Calcein-AM(ThermoFisher)分别包含在培养基中用于染色死细胞和活细胞。然后，我们用一层矿物油覆盖乳液以防止氟烃油蒸发，但能够进行气体交换。然后将乳液在常规组织培养箱中的微量离心管中于37℃、5％CO₂孵育。然后我们使用荧光显微镜评估活/死染色。在典型的实验中，16小时后49/50细胞仍然存活，24小时后45/50细胞仍然存活。72小时后，>85％的细胞仍然完整，但不再发出足够的荧光以进行活/死确定。

可以裂解在乳液微滴中孵育的靶细胞和诱导细胞以产生融合来自诱导细胞的克隆序列与来自靶细胞的诱导转录物的多个多核酸。这样的方案可以保持诱导克隆和靶细胞之间的适当配对。对于功能研究而言最佳的细胞培养基不一定是细胞裂解和酶促多核酸扩增的最佳选择。为了解决这个问题，可以使用融合含有细胞的液滴与裂解/珠子混合物的液滴微流体芯片设计。

在一些实施方式中，液滴融合由界面力驱动，其中两个液滴具有比相同体积的单个液滴更大的界面面积。为了实现这种情况，可以去除分离两个液滴的连续相。例如，当两个液滴彼此紧密接触时，由于液滴之间的分子吸引力，在两个液滴之间形成薄液桥。在桥周围形成的曲率弯月面产生表面张力的不平衡，其迅速地将两个液滴合并。乳液微滴的融合是被动的(即不需要外部能量)或主动的(即需要外部能量)(例如，在Xu Micro和Nanosystems 2011 3：131-136中总结)。被动方法可以依赖于微通道的结构或微通道的表面特性。另一方面，主动液滴聚结可以使用由外部源提供的能量，例如，通过施加磁场、电场或温度场。

在一个示例性实施例中，在PDMS中制造的一种芯片设计包括两个水性输入通道和两个油性输入通道。水性/油性输入为两对，即一个进水口与一个进油口配对。一个进水口/进油口对的宽度或直径约为100μm，另一个的宽度或直径约为50μm。使用设定在约100mbar的压力泵将～40μm乳液微滴中的细胞混合物注入50μm通道中。使用设定在约100mbar的压力泵将～80μm液滴中的在水性结合缓冲液中的oligo-dT磁珠和Tween-20表面活性剂的混合物注入100μm通道中。液滴流合并成单个通道，使得它们以由入口管线的压力或流速控制的周期性共流。两个入油口管线用于实现液滴周期性，使得每个细胞混合物液滴与单个裂解和珠子混合液滴配对。使用电源(Mastech)和逆变器(TDK)，将7V AC电流施加到160μm宽的液滴共流通道。通过将1M NaCl溶液注入未连接到液滴共流通道但足够接近的通道中来施加电流，以使AC电流传导到160μm的加宽共流通道中。～80μm裂解/珠子混合液滴略微减慢并在加宽的通道中变形。～40μm细胞混合物液滴在加宽的通道中不会减慢，确保每个细胞液滴与裂解/珠子液滴接触。同时施加电流产生融合的稀释液滴，然后将其在芯片外孵育以将poly(A)RNA结合至oligo-dT珠子。该设置中的典型实验在每秒约500个液滴的通量下实现>98％的液滴融合，具有100％的细胞裂解。

TCR与其关联肽:MHC靶标之间的相互作用可以在表达TCR的细胞(例如，原代T细胞或TCR工程化的Jurkat细胞)和表达肽:MHC的细胞(例如，初级APC或工程APC)两者中诱导转录响应。根据感兴趣的功能性细胞相互作用，可设计引物组以将肽:MHC序列与T细胞转录响应或具有APC转录响应的TCR序列连接。在一些实施方式中，期望全面地研究相互作用，例如，连接肽:MHC、TCR、T细胞响应和APC响应。为了将肽:MHC序列与T细胞转录响应连接，可以使用如上所述的分隔方法在组合筛选中在乳液微滴中将APC与表达TCR的细胞一起孵育。可以将重组APC工程化以表达肽:MHC靶标的文库，其中特定条形码指示文库中的各个肽:MHC靶标。在乳液微滴中孵育6、12、18、24、36小时或更长时间后，可以使用如上所述的方法将细胞混合物乳液微滴与裂解/珠子乳液微滴融合。然后可以将RNA结合的珠子注射到用于多重OE-RT-PCR的乳液微滴中。可以将引物引入到乳液微滴中，其扩增至少一种T细胞激活标志物，例如干扰素γ(IFNg)、CD69或白细胞介素-2(IL-2)。引物可以被设计跨越内含子，使得不发生来自背景基因组DNA的扩增，并且扩增子的大小为100bp-300bp。在一些实施方式中，每个T细胞激活引物对的一个引物具有多核酸子序列，其与条形码扩增引物对的一个引物互补。互补子序列在OE-RT-PCR期间杂交，从而产生多个连接的扩增子。以这种方式，肽:MHC靶序列与T细胞中的功能响应相关。在一个示例性实施方式中，靶文库包含用NY-ESO-1靶序列的多核苷酸(SEQ ID NO:13)和MART-1靶序列的多核苷酸(SEQ ID NO:16)工程化的克隆，和包含靶标条形码引物(例如，SEQ ID NO 14-15)、用于IFNG的引物(SEQ ID NO:25-26)和用于IL-2的引物(SEQ ID NO:27-28)的引物组。如上所述，可以使用嵌套的尾端PCR将测序衔接子(例如，Illumina测序衔接子)添加到连接扩增子的文库中。肽:MHC和T细胞激活标志物配对可以通过对连接的扩增子进行深度测序来鉴定和定量，例如，从连接的肽:MHC和T细胞激活标志物复合物的文库中获得100,000、一百万或一千万个序列。然后可以使用生物信息学通过搜索使用上述任何方法产生的肽:MHC条形码的数据库来使测序的条形码与肽:MHC匹配。在一些实施方式中，平行产生将TCR序列与肽:MHC序列连接、TCR序列与T细胞激活标志物连接的杂交扩增子是有益的。对于这样的实施方式，OE-RT-PCR扩增混合物还可包含将TCRβ多核酸与肽:MHC条形码和/或T细胞激活标志物连接的引物。TCR引物组可以从TCRβV区的最5'末端扩增到位于Cβ区的通用引物。Cβ引物可以具有多核酸子序列，其与来自条形码扩增引物对的一个引物和来自各个T细胞激活标志物引物对的一个引物互补。TCRβ扩增子的大小可以是～400-500bp。包含用于肽:MHC条形码、T细胞激活标志物和TCRβ的引物的引物组可产生以下扩增子：与T细胞激活标志物连接的肽:MHC、与肽:MHC连接的TCRβ、和/或与T细胞激活标志物连接的TCRβ。如上所述，可以使用嵌套的尾端PCR将测序衔接子(例如，Illumina衔接子)添加到这些扩增子中。然后可以对文库(例如，Illumina文库)进行深度测序以获得100,000、一百万或一千万个序列。然后可以使用生物信息学处理原始序列，然后将肽:MHC与TCRβ、TCRβ与T细胞激活标志物、和/或肽:MHC与T细胞激活标志物匹配。以这种方式，组合筛选产生肽:MHC和结合并激活感兴趣的细胞表型的TCR的关联对的列表。更全面的混合物也可以产生TCRαβ连接扩增子，使得APC和T细胞之间的相互作用可以用于鉴定感兴趣的连接的TCRαβ，然后将其表达为全长重组TCRαβ，并进一步分析体外和体内功能。

如果感兴趣的是其他T细胞功能响应，则可以使用其他引物混合。例如，所谓的免疫“检查点”基因充当T细胞活性的共刺激或共抑制调节子。检查点分子通常在T细胞或T细胞靶细胞的表面上表达，并与相同细胞或另一细胞表面上的其他共刺激或共抑制分子相互作用。检查点分子和癌症疗法中“检查点抑制”的效用是本领域已知的(例如，Shin CurrentOpinion in Immunology 2015,33：23-35)。这些共刺激或共抑制分子网络被多种分子包括单克隆抗体激活或拮抗，并且这样的调节分子影响T细胞表型的变化。可以对激活或拮抗分子或功能未知的分子的各种组合进行组合筛选，以诱导靶T细胞的转录变化。例如，这可以通过用表达检查点的细胞(靶细胞，例如T细胞)分隔分泌抗体的CHO细胞(诱导细胞)的文库来实现。在一些实施方式中，表达检查点的细胞是非工程化的原代T细胞，或转导以表达检查点受体蛋白的原代T细胞。分泌抗体的CHO细胞可包含具有针对检查点分子的已知活性的抗体文库，或具有未知功能的抗体文库，例如，从用检查点蛋白免疫的小鼠分离的表达抗体的细胞产生的文库。在任何情况下，可以将表达抗体的细胞分离到具有表达检查点的靶细胞的乳液微滴分隔中。在该设置中表达抗体的细胞与靶细胞的比率可以是1：1、1：2或1：5，或者如果抗体的功能未知则为其之间的任何比例。如果目标是鉴定诱导检查点分子表达的抗体组合，则在该设置中表达抗体的细胞与靶细胞的最佳比率为1：1、2：1或5：1。在乳液微滴中孵育6、12、18、24、36或更多小时后，可以使用上述方法将细胞混合物乳液微滴与裂解/珠子乳液微滴融合。然后可以将RNA结合的珠子注射到用于多重OE-RT-PCR的乳液微滴中。在本申请中，用于OE-RT-PCR的引物可包含抗体特异性引物和检查点分子特异性引物。抗体引物库可包含用于重链恒定(C)区的通用引物。这消除了对大量J区引物的需要。引物库还可以包含与IgG的所有可能V区段结合的引物。引物可以扩增跨越各个Ig单体的完整可变区，即重链和轻链Ig的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。抗体重链扩增子可以是400-450bp。可以包含至少一个检查点转录物引物对，例如，用于LAG-3、PD-1、TIM-3、CEACAM-1、CD200R、CTLA-4、TIGIT或BTLA的引物对。还可以包含一般增殖或激活标志物，例如IFNg或IL-2。一些引物库包含所有这些转录物的引物，或列表的子集。引物库还可以包含T细胞的完整转录组。可以设计引物跨越内含子，使得背景基因组DNA不污染扩增信号。这些转录物的扩增子可以在100-300bp、200-500bp、300-600bp或小于1000bp之间。抗体C区引物可以包含与用于各个检查点转录物的引物对的一个成员的子序列反向互补的子序列。互补多核酸子序列使得OE-RT-PCR能够产生将来自CHO细胞的抗体序列与来自靶细胞的检查点序列连接的主要扩增子。如上所述，可以使用嵌套的尾端PCR将测序衔接子(例如，Illumina测序衔接子)添加到连接的扩增子文库中。可以通过对连接的扩增子进行深度测序来鉴定和定量抗体和T细胞检查点标志物配对，例如，从连接的复合物文库中获得100,000、一百万或一千万个序列。然后可以使用生物信息学来量化与感兴趣的每种抗体连接的检查点转录物。在一些实施方式中，鉴定反应性T细胞克隆的克隆性是有益的。例如，如果将多个表达抗体的CHO细胞分离到具有靶细胞的乳液微滴中，则抗体的功能组合是感兴趣的。在这种情况下，可以通过在OE-RT-PCR混合物中包含TCRβ引物来鉴定T细胞克隆。在一些实施方式中，可以工程化T细胞以表达具有条形码的转录物，使得条形码用于鉴定对抗体组合具有反应性的T细胞克隆。在任何实验设计中，批量测序数据可用于鉴定共刺激和共抑制检查点分子之间的功能关系。例如，OX40的激活可导致PD-1或CTLA4的下调，PD-1的抑制可导致OX40的激活，等等。在另一个实例中，两种抗体的混合物比任何其他混合物更有效地激活T细胞，如连接抗体序列与IFNg和IL-2增殖和激活标志物的大量测序数据所证明。在本发明的一些实施方式中，感兴趣的转录物是上调的或下调的。

在一些实施方式中，可以使用将NK细胞活性(中间细胞)与表达抗体的细胞(诱导细胞)连接起来的引物组。例如，将CHO细胞群工程化以表达分泌抗体的文库。将另一群CHO细胞工程化以表达感兴趣的抗原。或者，肿瘤细胞用作表达抗原的细胞。在典型的组合筛选中，来自数十、数百、数千、数十万或数百万表达抗体的CHO克隆的文库的多个单细胞用表达抗原的细胞分隔。如果表达抗原的细胞包含不同的克隆群，则表达抗体的细胞与表达抗原的细胞的比率可以是1：2、1：1、2：1，或其间的任何比率。如果表达抗原的细胞包含癌细胞，则表达抗体的细胞与癌细胞的比率可以是1：1、1：5、1：10、1：100，或其间的任何比率。可以将表达抗体的细胞和表达抗原的细胞的混合物分隔到具有NK细胞的乳液微滴中。我们将NK细胞称为中间细胞，因为表达抗体的细胞通过分泌的抗体与靶细胞的结合诱导NK细胞表达的改变，而不是通过表达抗体的细胞与靶细胞之间的直接细胞-细胞间相互作用。在乳液微滴中孵育6、12、18、24、36或更多小时后，可以使用上述方法将细胞混合物乳液微滴与裂解/珠子乳液微滴融合。然后可以将RNA结合的珠子注射到用于多重OE-RT-PCR的乳液微滴中。在本申请中，用于OE-RT-PCR的引物可包含抗体特异性引物和NK激活引物。抗体特异性OE-RT-PCR引物如上所述。在激活时上调的NK转录物可包括效应子(IFNg；TNFα)、蛋白酶(粒酶A[Gzma]；粒酶B[Gzmb])、转录因子(T盒转录因子21[Tbx21/T-bet]；Eomesodermin[Eomes]；PU盒转录因子[PU.1]；DNA结合2的抑制子[Id2])、和信号转导蛋白(DAP12；脾相关酪氨酸激酶[Syk]；Zeta链相关蛋白激酶70[Zap70])。感兴趣的转录物还可以包括在NK细胞激活上下调的靶标。NK细胞激活引物组可包含至少一种NK细胞激活转录物靶标，例如，它们可包含2、5、10、100或1,000个靶标，或NK细胞的完整转录组。可以设计引物跨越内含子，使得背景基因组DNA不污染扩增信号。用于NK激活转录物的扩增子可以是100-300bp、200-500bp或小于1000bp。抗体C区引物可以包含与用于各个NK细胞激活转录物的引物对的一个成员的子序列反向互补的子序列。互补多核酸子序列使得OE-RT-PCR能够产生连接来自CHO细胞的抗体序列与NK细胞激活序列的主要扩增子。在一些实施方式中，示例性引物组包含用于IGG V基因的引物(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)、用于GZMB的引物(例如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)、和用于TBX21的引物(例如SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12)。如上所述，可以使用嵌套的尾端PCR将测序衔接子(例如，Illumina测序衔接子)添加到连接的扩增子的文库中。可以通过对连接的扩增子进行深度测序来鉴定和定量抗体和NK细胞激活标志物配对，例如，通过从连接的复合物的文库中获得100,000、一百万或一千万个序列。然后可以使用生物信息学来量化与各个感兴趣的抗体连接的NK激活转录物。以这种方式，可以通过涉及三种细胞类型(NK细胞(中间细胞)、表达抗原的细胞(靶细胞)和表达抗体的细胞(诱导细胞))的功能测定来鉴定诱导NK细胞的抗体。

在一些实施方式中，在靶细胞中诱导的转录物是未表征的，或靶标响应的转录特征是复杂的，需要定量数百或数千个转录物。在那些情况下，可以使用量化基因靶标的完整转录组的方法。例如，使用上述方法将独特的多核酸条形码粘附到固体支持物上，例如珠子，并用细胞混合物递送到乳液微滴中。来自珠子的条形码多核酸(也包含寡-dT子序列)可用于条形码化靶细胞的完整转录组。这可以通过OE-RT-PCR或通过第一链标记来实现。然后，OE-RT-PCR或OE-PCR可用于产生包含指示诱导克隆的多核酸序列的主要扩增子。例如，肽:MHC可以与表达TCR的细胞的完整转录组连接，或者来自表达抗体的细胞的抗体序列可以与T细胞的完整转录组连接。如上所述，这样的方法也是可能的，其中诱导克隆不直接与靶细胞相互作用，例如，通过与肿瘤细胞结合的抗体激活的NK细胞。嵌套的尾端PCR可用于将测序衔接子(例如Illumina测序衔接子)连接到多个主要扩增子上。然后，可以执行批量测序以获得数十万、数百万、数亿或数十亿的序列。生物信息学算法可用于鉴定响应于诱导细胞在靶细胞或中间细胞中上调或下调的转录物。这样的方法可用于发现用于功能性细胞相互作用的新型生物标志物。

提供上述方法作为实例，并且可以采用其任何变体来实现类似的效用。例如，核酸扩增可以通过锁式探针或连接酶链式反应来实现。尽管上述大多数方案使用RNA序列进行克隆鉴定，但也可以使用基因组DNA序列进行克隆鉴定。例如，诱导克隆的文库可以通过定向CRISPR/Cas9基因组编辑、或将感兴趣的多核酸随机插入到诱导克隆的文库中来制备。在这样的情况下，可以扩增感兴趣的基因组DNA序列并将其与靶细胞中的转录物连接。在一些应用中，可以在靶细胞中诱导除转录变化之外的变化。例如，诱导细胞可以诱导靶细胞基因组中的表观遗传变化。在一些应用中，诱导细胞可以改变靶细胞的蛋白质谱(profile)。这样的变化可以通过将核酸条形码化的抗体与靶细胞结合来量化，使得条形码化的抗体可以被扩增并连接到多核酸序列以在诱导细胞中进行克隆鉴定。

在本发明的一些实施方式中，将多核酸条形码递送至含有包含靶细胞和诱导细胞的混合物的液滴或容器。该多核酸条形码可以粘附在固体支持物上，例如珠子、抗体或细胞。可裂解细胞，并将来自细胞混合物的RNA与多核酸条形码融合。然后可以对来自靶细胞和诱导细胞的转录物cDNA进行测序，并使用多核酸条形码追溯回液滴或容器中。因此，在一些实施方式中，来自靶细胞和诱导细胞的转录物cDNA从不直接融合，而是组合通过多核酸条形码生物信息学地连接。

在本发明的一些实施方式中，细胞、细胞混合物或乳液微滴用RFID、电子索引固体支持物、光触发微转发器(例如，Mandecki US 20160175801)、量子点、比色指数、荧光标志物或不基于多核酸的其他识别“条形码”标记。这些标识符可用于鉴定克隆、记录用于处理细胞混合物的实验室方案、或指示生物测定的结果。这样的识别条形码可以粘附到或包含固体支持物，例如在最宽维度上小于50微米的微芯片或珠子，固定到蛋白质上，或作为响应于刺激的表达构建体工程化到细胞中。在一些实施方式中，一个表达TCR的克隆群，例如CD4+T细胞，用相同的RFID条形码标记。表达TCR的克隆的第二群，例如CD8+T细胞，用第二RFID条形码标记。然后，将这两个细胞群混合。在本发明的一些实施方式中，如上所述，将RFID标签化的表达TCR的克隆群包封在具有表达肽:MHC细胞的文库的乳液微滴中。然后可以使用RFID标签将微滴分选为CD4+和CD8+乳液。以这种方式，RFID条形码使得能够进一步在核酸条形码或TCR克隆之外去多重。可以使用两个、十个、100个、1,000个、100,000个或数百万个不同的RFID颗粒。在一些实施方式中，鉴定指数是荧光标志物，并且含有细胞的液滴用流式细胞术或FACS分选。在一些实施方式中，在乳液微滴内发生的生物测定导致产生荧光标志物，然后用流式细胞术分选含有细胞的液滴。在一些实施方式中，使用单一荧光波长，并且基于指示生物测定中的阳性读取数据的荧光阈值将含有细胞的液滴分选为阳性或阴性。多核酸条形码也可以用RFID粘附到颗粒上，例如，以将RFID与深度测序数据关联起来。具有RFID的颗粒也可以浸泡在药物中，或涂覆有抗体或蛋白质，其然后可以用于功能测定和用RFID读数器去多重(de-multiplex)。在一些实施方式中，RFID、电子索引的固体支持物、量子点、比色指数、荧光标志物或不基于多核酸的其他识别“条形码”用于追踪孵育方案。例如，有兴趣将表达TCR的细胞与表达肽:MHC的细胞一起孵育2小时、6小时、10小时或更长时间。RFID标签化的固体支持物与细胞混合物一起递送至乳液微滴。然后，将乳液微滴分选成三个不同的孵育容器。将容器孵育2小时、6小时或10小时。在分选期间，RFID由RFID读数器读取，并且计算机用于记录与每个方案相关联的RFID。该方法使得具有多个方案的组合筛选能够同时运行。不同的方案可包括不同的培养基、孵育温度、相互作用的细胞、药物、蛋白质或分子、温度或孵育时间。

在本发明的一些实施方式中，细胞用于诱导其他细胞中的应答并区分克隆特有的多核酸，例如多核酸条形码或可变免疫受体。在一些实施方式中，细胞响应由粘附在固体支持物(例如珠子或微流体室)上的分子试剂诱导。在一些实施方式中，分子试剂和固体支持物充当诱导物而不是细胞。在一些实施方式中，分子试剂由丝状噬菌体或其他种类的病毒或病毒样颗粒表达，而不是细胞或固体支持物。在一些实施方式中，颗粒充当诱导物而不是细胞。在某些实施方式中，所述分子试剂是蛋白质，例如细胞因子，或有机药物物质。

在一些实施方式中，微生物细胞，例如重组工程化酵母用作诱导细胞。例如，酵母展示方法可用于快速且廉价地表达TCR和抗体片段(scFv)。在一些实施方式中，尾端PCR用于向重链和轻链连接扩增子添加多核酸“衔接子”，用于体内同源重组。然后可以用含有GAL1/10启动子和Aga2细胞壁系链的线性化载体(pYD)将修饰的DNA文库电穿孔到酿酒酵母细胞中。GAL1/10启动子诱导scFv蛋白在含有半乳糖的培养基中表达。Aga2细胞壁系链可用于将scFv穿梭至酵母细胞表面并将scFv系链至细胞外空间。然后可以扩增转化的细胞并用半乳糖诱导。然后将表达scFv的酵母文库用作诱导克隆的文库。

3)高通量功能性分析

通过任何上述方法制备的克隆细胞的文库可以通过批量测序来表征和定量。在进行任何类型的功能测定之前，表征和量化克隆群的内容可能是有用的。例如，产生克隆群的方法可以包括可以不时产生不充分的结果若干技术步骤，因此可以进行深度测序作为质量控制。可以从克隆细胞群中分离RNA，然后进行RT-PCR以制备用于批量测序的DNA文库。如果文库包含抗体或TCR，则可以使用转录物5'末端上的V基因引物库和转录物3'末端上的C基因引物进行RT-PCR。除了转录物特异性序列之外，RT-PCR引物可以具有包含能够进行批量测序(例如，Illumina测序)的多核酸序列的子序列。这些多核酸序列，称为测序衔接子(例如，Illumina测序衔接子)，使得文库与批量测序流动细胞杂交，从而发生桥式扩增和通过合成的测序。类似的方法可用于条形码化的cDNA文库，或能够追溯回单细胞克隆的任何其他RNA。商业提供者如Pacific Biosciences、Oxford Nanopore和Roche提供的测序方法具有与Illumina提供的方法类似的效用。

在批量测序中，读取错误可能难以与生物学变异区分开，这使得克隆的鉴定复杂化。为了降低碱基调用错误的频率，可以使用本领域已知的预期错误过滤方法，例如Edgar和Flyvbjerg(Bioinformatics2015Nov 1；31(21)：3476-82)的方法。例如，可以根据其Phred分数计算读取的预期错误数(E)。可以丢弃E>1的读取结果，留下最可能的基本调用错误数为零的读取结果。当需要对稀有变体更高的灵敏度时，可以使用更大的E值。作为另外的质量过滤器，可以丢弃单个读取结果(即，具有仅发现一次的序列的读取结果)，注意不可能偶然再现测序错误，使得发现两次或更多次的序列具有高概率的正确性。

上述方法可互换地用于测量激活或失活的生物测定，以及用于测量转录物的上调或下调的生物测定。生物测定可用于同时测量转录物的上调和下调。

实施例

实施例1：Fc变体或突变体的功能性分析

治疗性抗体药物通过多种机制起作用。治疗性抗体药物功能的两种常见机制是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。ADCC和CDC两者是由抗体的可结晶片段(Fc)区介导。在ADCC中，抗体的可变结构域与暴露于细胞表面的抗原结合。如果足够的抗体分子与抗原结合，则NK细胞通过CD16(也称为Fc受体(FcR))与Fc结构域结合。在CDC的经典途径中，抗体结合靶细胞表面上的抗原。然后，补体级联的C1复合物结合抗体的Fc结构域。通常，C1结合需要至少六个抗体分子。然后C1与Fc的结合招募经典补体途径的其余组分，其形成功能为破裂靶细胞的细胞膜的膜攻击复合物。四种主要的IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)在介导ADCC和CDC的能力方面不同。IgG3、IgG1和IgG2分别具有最高至最低的激活补体的能力。IgG4不激活补体。IgG1、IgG3、IgG4和IgG2分别具有最高至最低的结合FcR的能力。因此，药物开发者有兴趣找到抗体候选物的最佳Fc。在某些情况下，药物开发者将高亲和力可变结构域融合至最佳野生型Fc序列。在其他情况下，药物开发者突变野生型Fc序列以产生Fc变体或Fc突变体的文库。常规地，药物开发者通过高通量筛选FcR或C1的结合物来选择最佳Fc变体，然后在96孔板中进行功能性分析。本领域存在对消除对96孔板功能性分析的要求而直接筛选功能性Fc变体的高通量方法的需求。

为了筛选功能性Fc变体，通过本领域中已知的方法(例如，随后被再组装成蛋白质编码多核酸的合成代(generation)多核酸、位点定向诱变、或错误倾向PCR)产生Fc突变体的文库。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达Fc突变体的文库。Fc突变体融合到膜系链(tether)蛋白结构域。以这种方式，Fc突变体能够直接结合FcR或C1，并诱导细胞功能，同时仍然结合至细胞膜。所得到的Fc突变体文库包括克隆群，其中多个所述克隆表达单个Fc变体。

用NK细胞从表达变体Fc的CHO细胞分离多个克隆。表达Fc的CHO细胞和NK细胞的比率的范围在1:10、和1:20之间。NK-92细胞或原代NK细胞用于实验。被工程化以表达CD16受体的其他类型的哺乳动物细胞系，例如CHO、HEK293、或Jurkat，也被测试，替代NK细胞。

表达Fc的CHO细胞和NK细胞被分隔(partition)成油包水液滴，然后在37℃组织培养箱中再孵育2、4、6、12、18、或24小时，使得CHO克隆表达的功能性Fc变体结合NK细胞的CD16分子，激活NK细胞。这些液滴的直径为20-200μm。然后将液滴注射入第二微流芯片，该芯片将含有细胞的液滴与含有裂解混合物和oligo-dT微珠的液滴融合。裂解混合物含有表面活性剂例如SDS，并且poly(A)RNA转录物与oligo-dT微珠结合。使用对免疫球蛋白和NK细胞激活标志物(例如TNFα或IFNg)特异的引物重叠延伸液滴PCR，使得编码激活标志物的多核苷酸通过与编码Fc变体的多核苷酸杂交而连接。也加入通用引物以在工程化的CHO的文库中扩增任何Fc变体。通过在油包水的反应器中注射入珠子来进行液滴重叠延伸RT-PCR，并在常规热循环仪中在管中孵育。然后对通过重叠延伸RT-PCR产生的多个多核酸进行大量测序以鉴定和定量与NK细胞激活标志物连接的Fc序列。

用于这些实验的NK细胞激活标志物是由NK细胞表达的内源性转录物或工程化到NK细胞的转录报告子。从该实验中，鉴定了在NK细胞中诱导功能性应答的CHO细胞表达的Fc变体。用嗜中性粒细胞或吞噬细胞包被在补体中的其他细胞与Fc变体文库孵育进行类似的实验。与细胞封装的培养基包含C1和补体的其他组分。通过液滴重叠延伸RT-PCR将嗜中性粒细胞激活转录物与Fc变体序列连接。然后所得的连接的多核酸分子的文库可以进行批量(bulk)测序以鉴定和定量连接到嗜中性粒细胞激活标志物的Fc序列。

还用工程化以表达CD16或其他受体的重组细胞与Fc变体文库孵育进行类似的实验。

然后将显示最佳ADCC或CDC功能的变异Fc受体融合到具有与朝向感兴趣的治疗靶标的亲和力的抗体可变结构域。用于克隆和纯化单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的。然后通过常规孔板测定对这些单克隆抗体进一步验证ADCC或CDC。对Fc变体的药代动力学性能进行了研究。在许多治疗方式中，期望增加抗体半衰期并且通过Fc结构域中的突变而增加。使用用于癌症的小鼠模型对Fc变体融合的抗体进行功效分析，功效分析使用调理素作用研究和其他类型的功效分析。该实验提供了高效的Fc变体融合抗体。

实施例2：记忆B细胞的功能性分析

许多患者从严重的疾病恢复的原因目前科学上未知。例如，某些癌症患者比其他患者对药物治疗的反应更好。在另一个实例中，某些患者比其他患者更好地响应于病毒病原体(例如，埃博拉病毒、寨卡病毒或甲型流感病毒)。其他实例包括细菌病原体和自身免疫疾病。在某些情况下，患者成功地从严重疾病中恢复，因为他们成功地发起了针对该疾病的免疫应答，例如，在良好的应答患者中存在并且具有活性但在应答不良的患者中不存在的T细胞受体或免疫球蛋白可能通过与相关疾病靶标结合起作用。

记忆B细胞、或Bmem对发现帮助个体从严重的疾病中恢复的抗体是特别有用的。在抗原的初始刺激下，幼稚的滤泡B细胞分化成浆细胞和Bmem。浆细胞对抗原产生初级体液免疫应答。持久Bmem在亲和力成熟(用抗原突变和选择)后在生发中心出现。患者可以具有百万到十亿个不同的Bmem克隆，从其中药物开发者可能希望发现对从严重疾病恢复有贡献的抗体。常规地，筛选反应性Bmem涉及将Bmem群与荧光标记的感兴趣的靶标一起孵育，然后对结合物进行流动分选。用于流动分选的方法对于本领域技术人员来说是熟悉的，并且通常使用由供应商(例如BD、Sony或Beckman Coulter)商业制造的装置来进行。然而，这样的方法不考虑Bmem细胞功能。另外，对于可溶性靶标，流动分选是最容易的，而许多靶标最好作为嵌入细胞膜中的重组蛋白质来研究。因此，本领域需要可以在暴露于感兴趣的抗原时区分反应性和非反应性Bmem的高通量细胞方法。

为了鉴定反应性Bmem，通过流式细胞术或抗体包被的磁珠从已经从埃博拉感染恢复的患者的外周血中提取Bmem。然后将Bmem与感兴趣的抗原(例如，表达包含埃博拉病毒脂质包膜的表面突起的糖蛋白(GP)的结构域的文库的重组诱导细胞)离体孵育。孵育发生在微流体装置的油包水微滴或纳升孔。对B细胞进行乳液重叠延伸RT-PCR以产生将重链免疫球蛋白序列与指示Bmem细胞激活的转录物连接的多核酸文库。激活转录物可以是Bmem细胞的内源性转录物，例如Ki-67或工程化到Bmem的报告子的转录物。从该实验中，通过激活生物标志物鉴定由响应于抗原的Bmem细胞表达的抗体，并且这些生物标志物转录物另外地与区分与靶Bmem共同包封的细胞上GP结构域的存在的转录物杂交。

然后连接至Bmem激活标志物的抗体序列被克隆并纯化为单克隆抗体蛋白。该方法在单抗体序列上或在抗体序列的文库上进行。如果在克隆和纯化的序列的文库上进行，则进一步筛选从文库表达的重组蛋白的体外结合或功能。用于克隆、纯化和筛选重组抗体的方法是本领域技术人员公知的。然后通过常规的孔板测定或小鼠模型验证分离的单克隆抗体的结合和功能。该实验允许鉴定帮助个体从埃博拉感染中恢复的抗体。

Bmem对抗原的响应作为用于鉴定合适的多肽序列以发展广泛有效的疫苗的方法也在许多个体中比较。例如，与从感染中恢复的患者的良好后果相关的埃博拉GP的免疫原性结构域被发现，然后这些结构域形成为接受疫苗但还未暴露于埃博拉病毒的个体产生保护性抗体应答和Bmem群的疫苗的基础。

类似方法进一步用于寻找T细胞的抗原肽。

实施例3：用于发现抗体靶标的功能性分析

许多患者从严重的疾病恢复的原因目前科学上未知。例如，某些癌症患者比其他患者对药物治疗的响应更好。在另一个实例中，某些患者比其他患者更好地响应于病毒病原体(例如，埃博拉病毒、寨卡病毒或甲型流感病毒)。其他实例包括细菌病原体和自身免疫疾病。在某些情况下，患者成功地从严重疾病中恢复，因为他们成功地发起了针对该疾病的免疫应答，例如，在良好的应答患者中存在并且具有活性但在应答不良的患者中不存在的T细胞受体或免疫球蛋白可能通过与相关疾病靶标结合起作用。

然而，由于许多疾病的复杂性和免疫系统的复杂性，仍然难以发现免疫球蛋白和它们各自的靶标。这些知识对研究疾病机制、疾病应答机制和疾病治疗方法的研究人员非常有用。例如，由癌症患者产生的抗体通过对由肿瘤表达且科学上未知的糖蛋白靶标的特异性与肿瘤结合。然后该抗体与肿瘤的结合诱导ADCC和CDC，这导致癌症的完全缓解。然而，难以找到功能性抗体的序列以及功能性抗体的靶标。药物开发者可以使用抗体作为药物，或者一旦内源性序列已知就开发密切相关的序列。药物开发者还可以使用新发现的靶标来免疫小鼠或筛选噬菌体展示文库，并开发对新发现的靶标具有亲和力的新型抗体。通常，获得肿瘤中存在的糖蛋白靶标的完整补体是困难和昂贵的。因此，使用由肿瘤表达的糖蛋白靶标和患者表达的免疫库序列，该领域将受益于鉴定抗体及其靶标的高通量方法。该方法不局限于癌症，并且可以被应用于涉及免疫系统的任何疾病。

为了使用由肿瘤表达的糖蛋白靶标和由患者表达的免疫库的序列来鉴定抗体与其靶标，从癌症患者分离B细胞，例如，外周血、骨髓、或肿瘤浸润淋巴细胞。最近从癌症恢复的癌症患者目前正在与癌症抗争，或者正在与癌症抗争并接受免疫调节疗法。将B细胞与非B细胞分离的方法包括流式细胞术和抗体包被的磁珠。与抗原、抗原库、细胞或感兴趣的组织(例如，肿瘤或肿瘤细胞)一起孵育的B细胞用于激活或扩增研究中感兴趣的B细胞的目的。对B细胞进行乳液重叠延伸RT-PCR以产生具有天然连接的重链和轻链免疫球蛋白配对的多核酸文库。然后将这些免疫球蛋白文库用于改造重组抗体分泌细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞。用于工程化细胞的方法是本领域技术人员熟悉的，并且可以包括质粒的电穿孔、慢病毒转导、基于脂质的转染或质粒的瞬时转染。原代B细胞用于产生分泌抗体的杂交瘤。

针对表达推定抗体靶标的细胞克隆的文库筛选分泌抗体的细胞克隆的文库。抗体靶标由克隆到表达质粒中的互补DNA编码。cDNA衍生自从肿瘤中分离的RNA，例如，从提供B细胞样品的患者或来自不同的一个或多个患者手术切除的肿瘤。肿瘤与来自提供B细胞样品的患者的肿瘤具有相同的组织来源，或与来自提供B细胞样品的患者的肿瘤来自不同的组织来源。使用从与肿瘤无关的组织或没有癌症的人类供体衍生的cDNA。对于一些实验，使用由具有克隆到表达载体的合成DNA的工程化重组细胞产生的推定抗体靶标的文库。

然后用表达来自匹配肿瘤的cDNA的细胞(“靶克隆”)分离来自分泌抗体的CHO细胞的文库的多个克隆。还用表达抗体的克隆和表达cDNA的克隆分离多个NK细胞(中间细胞)。表达抗体的细胞与表达cDNA的细胞与NK细胞的典型比例为1:1:10、或1:1:20。NK细胞包括NK-92细胞或原代NK细胞。将细胞分配成油包水液滴，然后在37℃组织培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时，使得分泌自CHO克隆的抗体与表达cDNA的细胞结合，激活NK细胞。这些液滴的直径为20-200μm。然后将液滴注射入将含有细胞的液滴与含有裂解混合物和oligo-dT微珠的液滴融合的第二微流体芯片。细胞用表面活性剂例如SDS裂解，聚(A)RNA转录物结合到oligo-dT微珠。使用对免疫球蛋白和NK细胞激活标志物(例如，NK细胞的内源性转录物，例如TNFα或IFNg，或工程化到NK细胞中的报告子的转录物)特异的引物重叠延伸液滴PCR，使得编码激活标志物的多核苷酸通过与编码免疫球蛋白的多核苷酸杂交而连接。免疫球蛋白还通过与推定的靶cDNA转录物中的特异性鉴定序列杂交而连接。例如，推定靶标的cDNA转录物可含有合成的多核酸条形码或独特的非合成序列。通过将珠子注射入油包水反应器中，并在常规热循环仪中的管子中孵育来进行液滴重叠延伸RT-PCR。然后对通过重叠延伸RT-PCR产生的多个多核酸进行批量测序以鉴定和定量与NK细胞激活标志物连接的抗体序列，然后将这些抗体序列与推定的cDNA靶转录物连接。重链免疫球蛋白与激活标志物和轻链免疫球蛋白连接以形成三个、四个、或更多个转录物的融合复合物，使得产生足以产生抗体蛋白质的多核酸序列。重链免疫球蛋白与激活标志物和轻链免疫球蛋白连接，使得只有两个转录物被连接，例如，重链免疫球蛋白和TNFα。从该实验中，鉴定了在NK细胞中诱导功能性应答的分泌抗体的CHO细胞所分泌的抗体，并且这些抗体与推定的靶cDNA转录物平行连接。通过这种方式，抗体通过高通量功能性分析与其靶标配对。

类似的实验用不是衍生自人类库的抗体的文库进行。例如，使用随机地或合成产生的抗体序列。表达这样的文库的细胞包含用合成产生的抗体工程化的重组中国仓鼠卵巢细胞。然后针对表达肿瘤cDNA的重组细胞的文库筛选抗体文库。针对表达肿瘤cDNA的重组细胞的文库筛选单个单克隆抗体。

类似的实验用重组CD16工程化细胞而不是NK细胞进行。重组CD16工程化细胞还表达被用作激活生物标志物的报告转录物。类似地，使用对结合至细胞表面的抗体有反应的任何细胞代替NK细胞。

然后连接到NK细胞激活标志物的抗体序列被克隆并纯化为单克隆抗体蛋白。然后使用与NK细胞激活相关的cDNA靶标和来自免疫库的至少一种抗体序列来发现针对cDNA靶标的新抗体，例如，通过小鼠免疫、噬菌体展示或酵母展示。用于克隆和纯化单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的。平行地，相关的靶cDNA被克隆并用于通过常规孔板测定或用于癌症的小鼠模型验证单克隆抗体。

实施例4：治疗性抗体候选物的功能筛选

治疗性抗体的药物通过多种机制起作用，但抗体药物开发领域的技术人员将理解的是，抗体结合至给定靶标的能力不一定保证抗体诱导所期望的生物学功能。例如，在调节癌症的免疫细胞的表面上表达的蛋白质(例如，PD-1、OX-40或LAG3)可以是免疫激活子或免疫抑制子。药物开发者寻找激动或拮抗免疫激活子或免疫抑制子的药物。例如，抗OX40抗体的推定治疗机制是作为激动剂。OX40在T细胞的表面上表达，OX40L的结合激活T细胞。然后，激活的T细胞可以产生针对肿瘤的免疫应答，这改善了患者的状况。在某些治疗方式中，通过交联几个OX40分子发生激活OX40，然后诱导细胞内部的信号转导级联。例如，当OX40L与表达OX40的T细胞结合时，TRAF2、3和5以及PI3K被激活。某些与OX40结合的抗体模拟OX40L的功能效应，然而，与OX40结合的其他抗体不能模拟OX40L的功能效应。尽管本领域技术人员使用很多高通量方法以鉴定感兴趣的靶标(例如，噬菌体展示、酵母展示、杂交瘤筛选等)的结合物，鉴定诱导特异性生物功能的抗体的方法仍然是低通量的，例如，实际上限制为每周每个实验室技术人员不超过10-100个测定。因此，需要高通量方法来鉴定诱导特定生物学功能的结合物。例如，本文提供的高通量方法用于识别免疫激动剂或拮抗剂，或以鉴定信号转导级联的激活。

为了鉴定诱导特异性的生物功能的结合物，用在癌症生物学领域感兴趣的靶蛋白对小鼠进行免疫。靶标是在肿瘤细胞的表面上过表达的蛋白(例如，CD20、HER2、或EGFR)，或在调节癌细胞的免疫细胞的表面上表达的蛋白(例如，PD-1、OX40、或LAG-3)。典型的野生型小鼠品系包括BL/6、SJ/L和Balb/c。小鼠的基因组已经进行工程化以充分表达人或嵌合抗体，例如，Medarex或Trianni小鼠。在处死动物之前，取出血清并评估针对感兴趣的靶标的滴度。然后从小鼠中移除淋巴结。从小鼠取出脾脏和骨髓。然后从器官产生单细胞悬浮液，并将B细胞与非B细胞分离。从小鼠器官产生单细胞悬浮液的方法包括酶消化和物理解聚。将B细胞与非B细胞分离的方法包括流式细胞术和包被抗体的磁珠。

具体地，OX40作为用于小鼠免疫的免疫原。小鼠免疫、重叠延伸RT-PCR、和CHO细胞工程被用于产生分泌抗OX40的抗体候选物的CHO细胞的文库。这些抗体被预富集以获得抗OX40的结合物，例如通过scFv酵母或噬菌体展示。然后用表达OX40的细胞分离来自分泌抗体的CHO细胞的文库的多个克隆，例如用OX40工程化的原代T细胞或Jurkat细胞。将细胞分隔成油包水液滴，然后在37℃组织培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时。这些液滴的直径为20-200μm。然后将液滴注射入将含有细胞的液滴与含有裂解混合物和oligo-dT微珠的液滴融合的第二微流体芯片。所述细胞用表面活性剂例如SDS裂解，聚(A)RNA转录物结合到oligo-dT微珠。使用对免疫球蛋白和T细胞激活标志物(例如，T细胞的内源性转录物，例如CD69和IFNg或工程化到靶细胞的报告子的转录物)特异的引物重叠延伸液滴PCR，使得编码激活标志物的多核苷酸通过与编码免疫球蛋白的多核苷酸杂交而连接。通过将珠子注射入油包水反应器中，并在常规热循环仪中的管子中孵育来进行液滴重叠延伸RT-PCR。然后对通过重叠延伸RT-PCR产生的多个多核酸进行批量测序以鉴定和定量与T细胞激活标志物连接的抗体序列。重链免疫球蛋白与激活标志物和轻链免疫球蛋白连接以形成三个、四个、或更多个转录物的融合复合物，使得产生足以产生抗体蛋白质的多核酸序列。重链免疫球蛋白与激活标志物和轻链免疫球蛋白连接，使得只有两个转录物被连接，例如，重链免疫球蛋白和CD69。将抗体序列与全转录组连接，然后生物信息学上分析转录组以检测指示细胞功能变化的序列变化。从该实验中，鉴定了在T细胞中诱导功能性应答的分泌抗体的CHO细胞所分泌的抗体。

然后连接到T细胞激活标志物的抗体序列被克隆并纯化为单克隆抗体蛋白。用于克隆和纯化单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的。然后这些单克隆抗体通过常规孔板测定或用于癌症的小鼠模型验证T细胞的激活。例如，NOD SCIDγ(NSG)小鼠用在小鼠中产生分化的人T细胞的人免疫细胞祖细胞移植。NSG小鼠由商业供应商例如Jackson Labs提供。然后小鼠用肿瘤细胞移植，并提供候选单克隆抗体。然后将这些条件下T细胞的应答与各种对照进行比较，例如，具有分化的人T细胞和肿瘤细胞但没有抗体的NSG小鼠。

实施例5：使用大规模平行功能性分析的表位表征

可通过筛选获得针对完整的蛋白质或包含至少100个氨基酸的蛋白质的结构域的结合物来发现抗体，例如，通过小鼠的免疫或用噬菌体展示文库淘选(panning)。药物开发者通常对表征感兴趣的抗体的特异性结合表位感兴趣。该信息对于政府监管文件有用，但也可用于选择具有期望的功能特征(profile)的抗体，例如蛋白质或通路的拮抗作用或激动作用。然而，表位表征通常是缓慢且昂贵的过程。另外，用于表位表征的常规方法不考虑细胞功能，相反，常规方法仅考虑结合亲和力。该领域将受益于基于功能性分析的高通量表位筛选方法。

对于高通量的表位筛选，通过用Her2的可溶性、完整的细胞外结构域免疫小鼠来产生抗Her2抗体，通过具有通过跨膜结构域系链到细胞膜的来自Her2的代表10、50、100、150、200或250个氨基酸的肽或结构域的工程化重组细胞产生推定Her2表位的文库。Her2表位的文库包括平铺(tile)跨越Her2蛋白的完整胞外结构域的重叠肽或结构域的组。编码表位靶标的mRNA转录物还包含通过通用引物(priming)位点侧接的核酸条形码序列。通用引物位点用于扩增用于鉴定特定的Her2表位克隆的核酸条形码。将来自5、10、50、100、150、200或1000个表位表达克隆的文库的多个单细胞分隔到具有NK细胞和分泌感兴趣的抗Her2抗体的CHO细胞的油包水液滴中，然后将细胞混合物在37℃组织培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时。如果抗体结合给定的表位，则包被表达表位的细胞的抗体结合NK细胞的CD16分子，其激活NK细胞。这些液滴的直径为20-200μm。然后将液滴注射入将含有细胞的液滴与含有裂解混合物和oligo-dT微珠的液滴融合的第二微流体芯片。细胞用表面活性剂例如SDS裂解，聚(A)RNA转录物结合到oligo-dT微珠。使用对表位克隆和NK细胞激活标志物(例如，TNFα或IFNg)特异的引物重叠延伸液滴PCR，使得编码激活标志物的多核苷酸通过与编码Her2表位的多核苷酸杂交而连接。NK细胞可以是工程化以表达CD16受体的NK-92细胞或原代NK细胞或其他种哺乳动物细胞系，例如CHO、HEK293、或Jurkat，其中人工报告子代替内源性NK激活标志物。通用引物还用于在工程化的表达表位靶标的细胞的文库中扩增表位。通过将珠子注射入油包水反应器中，并在常规热循环仪中的管子中孵育来进行液滴重叠延伸RT-PCR。然后对通过重叠延伸RT-PCR产生的多个多核酸进行批量测序以鉴定和定量与细胞激活标志物连接的Her2表位克隆序列。从该实验中，鉴定了诱导NK细胞中功能性响应的Her2表位。该方法可用于通过ADCC起作用的任何抗体。

OX40的胞外结构域的可溶形式也作为用于小鼠免疫的免疫原。CHO细胞工程用于产生分泌针对OX40的抗体的CHO克隆。通过具有通过跨膜结构域系链到细胞膜的来自OX40的代表10、50、100、150、200或250个氨基酸的肽或结构域的工程化原代T细胞或Jukat细胞产生表达推定Her2表位的细胞的文库。OX40表位的文库包括平铺(tile)跨越OX40蛋白的完整胞外结构域的重叠肽或结构域的组。编码表位靶标的mRNA转录物还包含通过通用引物位点侧接的核酸条形码序列。通用引物位点用于扩增用于鉴定OX40表位克隆的核酸条形码。将来自5、10、50、100、150、200或1000个表位表达克隆的文库的多个单细胞分隔到具有NK细胞和分泌感兴趣的抗OX40抗体的CHO细胞的油包水液滴中，然后将细胞混合物在37℃组织培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时。这些液滴的直径为20-200μm。然后将液滴注射入将含有细胞的液滴与含有裂解混合物和oligo-dT微珠的液滴融合的第二微流体芯片。细胞用表面活性剂例如SDS裂解，聚(A)RNA转录物结合到oligo-dT微珠。使用对OX40表位和T细胞激活标志物(例如，CD69或IFNg)特异的引物重叠延伸液滴PCR，使得编码激活标志物的多核苷酸通过与编码XO40表位的多核苷酸杂交而连接。当通过引入质粒或基因组工程将靶细胞工程化以包含报告基因时，报告转录物作为激活标志物。通过将珠子注射入油包水反应器中，并在常规热循环仪中的管子中孵育来进行液滴重叠延伸RT-PCR。然后对通过重叠延伸RT-PCR产生的多个多核酸进行批量测序以鉴定和定量与T细胞激活标志物连接的抗体序列。以这种方式，发现了OX40激活所必需和/或足够的表位。表位序列连接到全转录组，然后生物信息学上分析转录组以检测指示细胞功能变化的序列变化。从该实验中，鉴定了在感兴趣的抗OX40抗体存在下在T细胞中诱导功能性响应的OX40表位。该方法可用于通过检查点抑制起作用的任何抗体药物。

使用相似的方法以表征已知在另一细胞类型中诱导功能性转录变化的抗体的功能性结合表位。候选抗体被克隆并纯化为单克隆抗体蛋白。用于克隆和纯化单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的。然后这些单克隆抗体通过常规孔板测定或用于癌症的小鼠模型验证细胞激活。例如，NOD SCIDγ(NSG)小鼠用在小鼠中产生分化的人T细胞的人免疫细胞祖细胞移植。NSG小鼠由商业供应商例如Jackson Labs提供。然后小鼠用肿瘤细胞移植，并提供候选单克隆抗体。然后将这些条件下T细胞的应答与各种对照进行比较，例如，具有分化的人T细胞和肿瘤细胞但没有抗体的NSG小鼠。

然后诱导细胞功能所必需且足够的新发现的表位当与给定的抗体配对时被用于发现包含相似或更好的功能的新抗体。

实施例6：发现双特异性药物

在许多治疗性情况下，单分子结合两种不同的靶标由此独立地诱导两种不同的治疗机制是期望的。例如，药物的一种组分是结合一种靶标的抗体片段，而药物的另一组分是结合第二靶标的抗体片段。这样的双特异性药物有许多形式，例如“bis-scFv”，其中具有两种不同特异性的两个不同scFv序列通过肽接头融合在一起。例如，一个scFv结合并激动CD3，并且第二scFv结合通常在某些肿瘤的表面上过表达的EGFR。CD3的激动作用激活T细胞，然后T细胞具有肿瘤杀伤活性。双特异性药物不限于抗体，例如，两个TCR可以融合以产生双特异性TCR，抗体可以与TCR融合，或者重组配体可以与抗体片段融合(例如，OX40L与抗CD3抗体融合)。当各个部分融合时，其各个部分产生个体活性的融合分子可能不一定产生活性两者。通常，以每个实验室技术人员每周不超过10-100个候选者的通量筛选双特异性活性。因此，本领域需要同时筛选多种生物学功能的高通量方法。

为了同时筛选多种生物学功能，双特异性药物候选物的文库经过本发明的筛选程序。具体地，用平行的两种不同抗体靶标(例如，CD3和EpCAM)进行NK细胞激活筛选。进一步，NK细胞激活筛选与TCR激活筛选相连地进行。利用本发明的方法组合筛选各种组合是可能的。

实施例7：治疗性T细胞受体候选物的功能筛选

治疗性TCR药物发现包括挖掘合成的TCR库、免疫和来自小鼠的TCR恢复，或挖掘人淋巴细胞群。治疗性T细胞受体药物通过多种机制起作用，但TCR结合给定靶标的能力不一定能保证TCR诱导所必需的生物学功能。

然而，仍然难以表征已知结合至感兴趣的靶标的T细胞受体的功能活性。例如，使用MHC多聚体(例如，MHC四聚体或MHC dextramers)从文库中发现TCR。当该TCR在T细胞中重组表达时，所期望的治疗作用机制是TCR工程化的T细胞与例如疾病状态的靶细胞上(例如，癌细胞或感染病毒的细胞)的肽:MHC靶标结合。然而，TCR与关联的肽:MHC的适当结合不一定保证T细胞将被激活。因此，该领域将受益于在感兴趣的靶肽:MHC的背景下筛选TCR文库的功能活性的方法。一旦功能性序列是已知的，药物开发人员可以使用TCR作为可溶性药物或TCR工程化的T细胞，或开发密切相关的、更高的亲合性，或更高的活性。

为了筛选TCR文库的功能活性，从癌症患者分离T细胞，例如，外周血、骨髓或肿瘤浸润淋巴细胞。最近从癌症中恢复的癌症患者目前正在与癌症抗争，或者正在与癌症抗争并接受免疫调节疗法。使用本领域已知的方法，例如流式细胞术和抗体包被的磁珠，将T细胞与非T细胞分离。出于激活或扩增本研究感兴趣的T细胞的目的，将T细胞与在APC中表达的抗原孵育。对原代T细胞进行乳液重叠延伸RT-PCR以产生具有天然连接的TCRαβ配对的多核酸文库。然后将TCR文库用于工程化表达重组TCR的细胞，例如Jurkat细胞。可替代地，使用分子生物学合成产生TCRαβ，而不是从由原代T细胞表达的天然TCRαβ序列衍生。用于工程化重组细胞的方法可包括质粒的电穿孔、慢病毒转导和基于脂质的转染。使用瞬时转染表达TCR的质粒或编码感兴趣的TCR的mRNA的细胞、表达TCR的原代T细胞或工程化以表达重组TCR的原代T细胞作为TCR表达细胞。

用表达cDNA的细胞、或来自感兴趣的组织的细胞、或表达串联小基因(“靶表达克隆”)的细胞从TCR工程化细胞的文库中分离多个克隆。将cDNA克隆到包含编码MHC表达(例如HLA A*02:01、HLA A*24:02或HLA DPB*04:01)的多核苷酸序列的表达载体中。这使得能够在不表达感兴趣的MHC的人抗原呈递细胞或非人抗原呈递细胞中呈递肽靶标。APC是细胞系，例如HEK293或CHO细胞，或原代细胞，例如树突状细胞或B细胞。

然后用表达靶标的克隆从TCR工程化细胞的文库中分离多个克隆。表达TCR的细胞与表达靶标的细胞的比率为1:1、10:1或1:10。将细胞分隔到油包水液滴中，然后在37℃组织培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时，使得表达TCR的克隆与表达cDNA的细胞结合，激活T细胞。这些液滴的直径为20-200μm。然后将液滴注射入将含有细胞的液滴与含有裂解混合物和oligo-dT微珠的液滴融合的第二微流体芯片。细胞用表面活性剂例如SDS裂解，聚(A)RNA转录物结合到oligo-dT微珠。使用对靶条形码或靶序列和T细胞激活标志物(例如，CD69或IFNg)特异的引物重叠延伸液滴PCR，使得编码激活标志物的多核苷酸通过与鉴定靶克隆的多核苷酸杂交而连接。来自T细胞的TCR序列也通过与靶cDNA转录物中的特异性鉴定序列杂交而连接。推定靶标的cDNA转录物可以含有合成的多核酸条形码或独特的非合成的序列。通过将RNA结合的珠子注射入油包水反应器中，并在常规热循环仪中的管子中孵育来进行液滴重叠延伸RT-PCR。T细胞激活标志物是由T细胞表达的内源性转录物或工程化到T细胞的转录报告子。然后对通过重叠延伸RT-PCR产生的多个多核酸进行批量测序以鉴定和定量与T细胞激活标志物连接的TCR序列，然后将这些TCRβ与推定的cDNA靶转录物连接。TCRβ与T细胞激活标志物和TCRα连接以形成三个、四个、或更多个转录物的融合复合物，使得产生足以产生TCR蛋白质的多核酸序列。TCRβ与T细胞激活标志物和TCRα连接，使得只有两个转录物在单分子中连接，例如，TCRβ和CD69。如果激活生物标志物未被激活，则将产生更少的重叠延伸RT-PCR产物，或者将不产生任何产物，这取决于激活生物标志物的背景表达水平。从这个实验中，鉴定了感兴趣的肽:MHC和来自诱导T细胞的功能性应答的TCR文库的TCR之间的关联配对。以这种方式，通过高通量功能性分析发现了数千、数万、数十万或百万的TCR。将包含肽:MHC靶标的多核酸与T细胞的全转录组连接，然后生物信息学分析转录组以检测指示细胞功能变化的序列变化。

然后与T细胞激活标志物连接的TCR序列重新工程化为可溶形式并纯化为蛋白。用于克隆和纯化单克隆TCR的方法是本领域技术人员公知的。平行地，克隆相关的靶cDNA并用于通过常规孔板测定或用于癌症的小鼠模型验证TCR。TCR被工程化到T细胞并用作疗法，例如，过继性T细胞的癌症疗法。使用体外方法例如细胞的杀伤测定，例如通过在体外定量被TCR工程化T细胞杀伤的肿瘤细胞在非临床上验证TCR工程化T细胞。用小鼠模型，例如移植人淋巴细胞、TCR工程化T细胞和肿瘤细胞的NSG小鼠来进一步验证TCR工程化T细胞，其中在体内测量肿瘤细胞杀伤。

可以使用不是衍生自人的库或随机或合成产生的TCR的文库。当将靶序列连接到全转录组时，生物信息学上分析转录组以检测指示细胞功能的变化的序列变化。

实施例8：用于发现T细胞受体靶标的功能性分析

由于许多疾病的复杂性和免疫系统的复杂性，仍然难以发现天然T细胞受体及其各自的靶标。这些知识对研究疾病机制、疾病响应机制和疾病治疗方法的研究人员非常有用。例如，由癌症患者产生的TCR通过对肿瘤表达且科学上未知的肽:MHC靶标的特异性与肿瘤结合。然后TCR与肿瘤的结合诱导细胞毒性、克隆繁殖和其他免疫细胞的刺激，这导致癌症的完全缓解。本领域技术人员可以理解难以找到功能性TCR的序列以及功能性TCR的肽:MHC靶标。药物开发者可以使用TCR作为可溶性药物或TCR工程化的T细胞，或者一旦内源性序列已知就开发密切相关的序列。常规地，获得肿瘤中存在的肽:MHC靶标的完整补体是困难且昂贵的。因此，使用由肿瘤表达的糖蛋白靶标和患者表达的免疫库序列，该领域将受益于鉴定TCR及其肽:MHC靶标的高通量方法。该方法不限于癌症，并且可以被应用于涉及免疫系统的任何疾病。

为了鉴定TCR及其肽:MHC靶标，从癌症患者分离T细胞，例如，外周血、骨髓或肿瘤浸润淋巴细胞。在本发明的一些实施方式中，最近从癌症恢复的癌症患者目前正在与癌症抗争，或者正在与癌症抗争并接受免疫调节疗法。通过例如流式细胞术和抗体包被的磁珠的方法将T细胞与非T细胞分离。出于激活或扩增本研究感兴趣的T细胞的目的，将T细胞与在APC中表达的抗原、表达为APC克隆的文库、细胞系或感兴趣的原代组织(例如，肿瘤或肿瘤细胞)的抗原库孵育。对T细胞进行乳液重叠延伸RT-PCR以产生具有天然连接的TCRab配对的多核酸文库。然后将这些TCR文库用于工程化表达TCR的重组细胞，例如Jurkat细胞。使用本领域已知的方法，例如质粒的电穿孔、慢病毒转导和基于脂质的转染工程化细胞。用表达TCR的质粒或编码感兴趣的TCR的mRNA瞬时转染重组细胞。表达TCR的细胞是表达TCR的原代T细胞，或工程化以表达重组TCR的原代T细胞。

针对表达推定的TCR靶标的细胞克隆的文库筛选工程化以表达表面TCR的细胞克隆的文库。靶标由克隆到表达质粒或慢病毒中的互补DNA编码。cDNA衍生自从肿瘤中分离的RNA，例如，从提供T细胞样品的患者或来自不同的一个或多个患者手术切除的肿瘤。将cDNA克隆到包含编码MHC表达(例如HLA A*02:01、HLA A*24:02或HLA DPB*04:01)的多核苷酸序列的表达载体中。这使得能够在不表达感兴趣的MHC的人抗原呈递细胞或非人抗原呈递细胞中呈递肽靶标。APC是细胞系，例如HEK293或CHO细胞或原代细胞，例如树突细胞或B细胞。MHC和靶cDNA在单个mRNA分子上编码，其也包含由通用引物位点侧接的核酸条形码序列。通用引物位点用于扩增用于鉴定cDNA克隆的核酸条形码。肿瘤与来自提供T细胞的样品的患者的肿瘤具有相同的组织来源，或与来自提供T细胞的样品的患者的肿瘤来自不同的组织来源。从与肿瘤无关的组织或没有癌症的人类供体衍生cDNA。通过具有克隆到表达载体的合成DNA的工程化重组细胞产生推定TCR靶标的文库。

然后用表达cDNA(“靶表达克隆”)的文库从TCR工程化细胞的文库中分离多个克隆。表达TCR的细胞与表达靶标的细胞的典型比率为1:1、10:1或1:10。将细胞分隔到油包水液滴中，然后在37℃组织培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时，使得表达TCR的克隆与表达cDNA的细胞结合，激活T细胞。这些液滴的直径为20-200μm。然后将液滴注射入将含有细胞的液滴与含有裂解混合物和oligo-dT微珠的液滴融合的第二微流体芯片。细胞用表面活性剂例如SDS裂解，聚(A)RNA转录物结合到oligo-dT微珠。使用对靶条形码或靶序列和T细胞激活标志物(例如，CD69或IFNg)特异的引物重叠延伸液滴PCR，使得编码激活标志物的多核苷酸通过与鉴定靶克隆的多核苷酸杂交而连接。来自T细胞的TCR序列也通过与推定靶cDNA转录物中的特异性鉴定序列杂交而连接。推定靶标的cDNA转录物包含合成的多核酸条形码或独特的非合成的序列。通过将RNA结合的珠子注射入油包水反应器中，并在常规热循环仪中的管子中孵育来进行液滴重叠延伸RT-PCR。在这些实验中使用的T细胞激活标志物是由T细胞表达的内源性转录物或工程化到T细胞的转录报告子。然后对通过重叠延伸RT-PCR产生的多个多核酸进行批量测序以鉴定和定量与T细胞激活标志物连接的TCR序列，然后将这些TCRβ与推定的cDNA靶转录物连接。TCRβ与T细胞激活标志物和TCRα连接以形成三个、四个、或更多个转录物的融合复合物，使得产生足以产生TCR蛋白质的多核酸序列。TCRβ与T细胞激活标志物和TCRα连接，使得只有两个转录物在单分子中连接，例如，TCRβ和CD69。从这个实验中，鉴定了感兴趣的肽:MHC和诱导T细胞的功能性应答的TCR之间的关联配对，并且这些TCR平行地连接至推定靶cDNA转录物。以这种方式，通过高通量功能性分析发现了数千、数万、数十万或百万的TCR。当将包含肽:MHC靶标的多核酸与T细胞的全转录组连接时，生物信息学上分析转录组以检测指示细胞功能变化的序列变化。

可以使用不是衍生自人的库或随机或合成产生的TCR序列的TCR文库。针对表达肿瘤cDNA的重组细胞文库筛选TCR文库。还针对表达肿瘤cDNA的重组细胞的文库筛选单个单克隆T细胞群。

然后与T细胞激活标志物连接的TCR序列重新工程化为可溶形式并纯化为蛋白。然后使用与T细胞激活连接的cDNA靶标和来自免疫库的至少一个TCR序列来发现针对cDNA靶标的新型TCR，例如，通过小鼠免疫、噬菌体展示或酵母展示。用于克隆和纯化单克隆TCR的方法是本领域技术人员公知的。平行地，克隆相关的靶cDNA并用于通过常规孔板测定或用于癌症的小鼠模型验证TCR。TCR被工程化到自体T细胞并用作疗法，例如，过继性T细胞的癌症疗法。使用体外方法例如细胞的杀伤测定，例如通过在体外定量被TCR工程化T细胞杀伤的肿瘤细胞在非临床上验证TCR工程化T细胞。用小鼠模型，例如移植人淋巴细胞、TCR工程化T细胞和肿瘤细胞的NSG小鼠来进一步验证TCR工程化T细胞，其中在体内测量肿瘤细胞杀伤。

实施例9：肿瘤浸润淋巴细胞的功能性分析

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是已浸润原位肿瘤的T细胞，并因此被认为是肿瘤抗原反应性T细胞的丰富来源。TIL从离体的肿瘤样品中扩增，以在培养中产生数十亿的TIL。然后将TIL作为用于对抗癌症的细胞疗法输注回到患者体内。扩增方案涉及用生长因子和细胞因子培养数月，这有时会获得有功效的细胞，但有时会获得没有功效的细胞。因此，在输注到患者体内之前测试TIL的功效将是有用的。

为了测试TIL的功效，将TIL作为靶细胞与作为诱导细胞的表达临床相关的肽:MHC的细胞共培养。针对表达感兴趣的肿瘤抗原的细胞克隆的文库筛选TIL用于质量控制。靶细胞包含肽:MHC序列，所述肽:MHC序列与治疗相关的肽:MHC靶标或克隆到表达质粒或慢病毒中的互补DNA具有相似性。cDNA衍生自从肿瘤中分离的RNA，例如，从提供T细胞样品的患者或来自不同的一个或多个患者手术切除的肿瘤。将cDNA克隆到包含编码MHC表达(例如HLAA*02:01、HLA A*24:02或HLA DPB*04:01)的多核苷酸序列的表达载体中。这使得能够在不表达感兴趣的MHC的人抗原呈递细胞或非人抗原呈递细胞中呈递肽靶标。细胞系，例如HEK293或CHO细胞或原代细胞，例如树突细胞或B细胞被用作APC。MHC和靶cDNA在单个mRNA分子编码，其也包含由通用引物位点侧接的核酸条形码序列。通用引物位点用于扩增用于鉴定cDNA克隆的核酸条形码。然后通过OE-RT-PCR将条形码扩增子连接到诱导的转录物或TCR。

未能证实功效的TIL培养物不输注回患者。在可能的情况下，TIL培养物可以在不同条件下进一步培养，例如，在与患者临床相关的刺激性抗原存在下。

实施例10：响应于药物的T细胞的功能性分析

T细胞免疫失调是多种人类疾病，包括癌症和自身免疫的标志。T细胞免疫的刺激和抑制涉及多种蛋白质之间的复杂相互作用，例如LAG-3、OX40、OX40L、PD1、PDL1、TIM3、CTLA4、CD47、4-1BB、GITR、ICOS等。本领域技术人员可以理解，免疫学领域可能尚未完全理解导致刺激和抑制T细胞免疫的复杂相互作用。这种复杂的相互作用的很多组分很可能是科学上未知的。因此，仍然需要高通量单细胞方法来进一步表征刺激和抑制T细胞免疫的分子机制。

为了表征刺激和抑制T细胞免疫的分子机制，重组DNA技术被用于工程化表达已知调节免疫调节通路的分子的细胞的文库，例如，通过拮抗分子例如PD-1作为检查点抑制剂的抗体，或在免疫调节通路中的内源性配体例如PD-L1，或分泌的或膜结合的免疫调节分子。免疫调节性细胞的文库包括CHO、HEK293、或原代细胞。用于工程化细胞以表达重组蛋白的方法是本领域技术人员公知的，例如，定向基因组整合、通过质粒或慢病毒的瞬时表达。免疫调节性细胞的文库可以包括微生物，例如工程化细菌、酵母或丝状噬菌体，而不是哺乳动物细胞。编码免疫调节子的mRNA转录物还包含由通用引物位点侧接的核酸条形码序列。通用引物位点用于扩增用于鉴定免疫调节子克隆的核酸条形码。

将表达重组免疫调节子的细胞文库分隔成含有T细胞、表达检查点分子的细胞、或工程化以表达检查点分子的T细胞的油包水液滴，然后将细胞混合物乳液在37℃组织培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时。这些液滴的直径为20-200μm。然后将液滴注射入将含有细胞的液滴与含有裂解混合物和oligo-dT微珠的液滴融合的第二微流体芯片。细胞用表面活性剂例如SDS裂解，聚(A)RNA转录物结合到oligo-dT微珠。使用对免疫调节子克隆和T细胞激活标志物(例如TNFα或IFNg)特异的引物使用上文所述的方法重叠延伸液滴PCR。T细胞激活标志物包括共刺激或共抑制检查点分子，例如LAG-3、OX40、OX40L、PD1、PDL1、TIM3、CTLA4、CD47、4-1BB、GITR或ICOS。对免疫调节子克隆特异的引物与将全靶细胞转录组扩增为cDNA的引物连接。然后使用生物信息学来发现先前未涉及免疫共刺激或共抑制通路的基因，或者进一步阐明先前表征的免疫共刺激或共抑制通路的功能。生物信息学可用于处理全转录组数据以产生作为共刺激或共抑制通路的一部分被上调或下调的10、100或1,000个基因的转录物表达组。这些转录物表达组用于测试非临床候选检查点抑制剂药物是否对T细胞或其他靶细胞具有期望的作用。转录物表达组还用于测试给定的癌症患者是否响应于临床阶段检查点分子。

将乳液液滴筛选进一步与FACS组合。例如，T细胞被工程化以表达在与共刺激或共抑制药物孵育时被诱导的荧光报告分子。使用FACS对含有激活的报告分子并因此发荧光的液滴进行分选。然后使用前文所述的方法处理含有报告子阳性细胞混合物的分选的乳液液滴。在一些实验中，T细胞被工程化以分泌与连接至固体表面的靶蛋白结合的分子。然后通过例如荧光共振能量转移(FRET)的方法检测所述结合。因此，与靶蛋白结合的液滴是荧光的，并使用FACS分选。然后使用前文所述的方法处理含有FRET阳性细胞混合物的分选的乳液液滴。对于该实验，使用由商业供应商例如BD或Beckman Coulter提供的整合到微流体芯片的FACS机器或常规FACS机器。将类似的方法用于鉴定液滴，所述液滴含有与靶蛋白结合的分泌抗体的细胞或分泌与靶蛋白结合的蛋白质的任何其他种类细胞。这提供了分泌与靶蛋白结合的蛋白质的液滴群。该方法增加了测定的特异性并且能够进行大的组合筛选。

筛选受益于平行进行多种孵育方案。例如，将细胞混合物在37℃组织培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时，然后在20℃、25℃、30℃、35℃或40℃下孵育2小时，其均为单次实验。使用前文所述的方法将与T细胞混合的表达重组免疫调节子的细胞的混合物分配到乳液微滴中。本领域已知的光触发微转发器(例如，Mandecki US20160175801)与细胞混合物一起递送至微滴。使用由RFID、量子点、比色或其他物理手段编码的“条形码”采用类似的方法。然后使用光触发的微转发器跟踪细胞混合物向六个室的递送，然后将其在37℃培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时。在孵育后，然后将每种乳液送回微转发器读数器，该读数器跟踪细胞混合物在20℃，25℃，30℃，35℃或40℃下输送到五个室。微计算机用于生成微转发器条形码的数据库及其相关方案。以这种方式，将六个不同的第一孵育方案与五个不同的第二孵育方案进行组合测试，总共30个不同的组合。该方法可用于任何类型的组合筛选。

实施例11：工程化过继细胞疗法的功能验证

TCR工程化T细胞和CAR-T细胞是主要用于癌症和传染病的新型疗法。工程化细胞是自体的(即，衍生自患者)或同种异体的(即，衍生自自患者以外的个体)。所有过继细胞疗法必须在输注入患者之前在功能上进行表征。通常，这样的测定限于体外肿瘤细胞杀伤测定。然而，常规测定不能清楚地鉴定表达治疗性靶标的细胞的特异性杀伤，以及任何脱靶效应，即杀死不应被杀死的细胞。用于过继性细胞疗法的功能质量控制的方法使得这样的疗法更安全和更有效，例如，通过证实特定T细胞转导方法的优越性，或显示TCR或CAR-T在用于植入的不同类型细胞或不同细胞供体的背景下的特异性。

本发明的方法用于筛选经工程化以表达针对表达感兴趣的TCR靶标的细胞克隆文库的治疗性TCR的细胞用于质量控制。这样的靶标包括例如已知具有肽:MHC序列的靶标，所述肽:MHC序列与治疗相关肽:MHC靶标具有相似性。靶标由克隆到表达质粒或慢病毒中的互补DNA编码。cDNA衍生自从肿瘤中分离的RNA，例如，从提供T细胞样品的患者或来自不同的一个或多个患者手术切除的肿瘤。将cDNA克隆到包含编码MHC表达(例如HLA A*02:01、HLAA*24:02或HLA DPB*04:01)的多核苷酸序列的表达载体中。这使得能够在不表达感兴趣的MHC的人抗原呈递细胞或非人抗原呈递细胞中呈递肽靶标。细胞系，例如HEK293或CHO细胞或原代细胞，例如树突细胞或B细胞被用作APC。MHC和靶cDNA在单个mRNA分子编码，其也包含由通用引物位点侧接的核酸条形码序列。通用引物位点用于扩增用于鉴定cDNA克隆的核酸条形码。

针对表达感兴趣的抗体靶标的细胞克隆的文库筛选表达治疗性CAR-T的细胞用于质量控制。这些靶标包括例如已知与治疗相关的表面蛋白质靶标具有序列相似性的表面蛋白质靶标。靶标由克隆到表达质粒或慢病毒中的互补DNA编码。cDNA衍生自从肿瘤中分离的RNA，例如，从提供T细胞样品的患者或来自不同的一个或多个患者手术切除的肿瘤。细胞系，例如HEK293或CHO细胞或原代细胞，例如树突细胞或B细胞被用作APC。MHC和靶cDNA在单个mRNA分子编码，其也包含由通用引物位点侧接的核酸条形码序列。通用引物位点用于扩增用于鉴定cDNA克隆的核酸条形码。

表达TCR的细胞与表达靶标的细胞的比率为1:1、10:1或1:10。将细胞分隔到油包水液滴中，然后在37℃组织培养箱中孵育2、4、6、12、18或24小时，使得表达TCR或CAR-T细胞与表达cDNA的细胞结合，激活T细胞。这些液滴的直径为20-200μm。然后将液滴注射入将含有细胞的液滴与含有裂解混合物和oligo-dT微珠的液滴融合的第二微流体芯片。细胞用表面活性剂例如SDS裂解，聚(A)RNA转录物结合到oligo-dT微珠。使用对靶条形码或靶序列和T细胞激活标志物(例如，CD69或IFNg)特异的引物重叠延伸液滴PCR，使得编码激活标志物的多核苷酸通过与鉴定靶克隆的多核苷酸杂交而连接。来自T细胞的TCR或CAR-T序列也通过与推定靶cDNA转录物中的特异性鉴定序列杂交而连接。推定靶标的cDNA转录物可以包含合成的多核酸条形码或独特的非合成的序列。通过将RNA结合的珠子注射入油包水反应器中，并在常规热循环仪中的管子中孵育。T细胞激活标志物是由T细胞表达的内源性转录物。然后对通过重叠延伸RT-PCR产生的多个多核酸进行批量测序以鉴定和定量与T细胞激活标志物连接的TCR序列或CAR-T序列，然后将这些TCRβ与推定的cDNA靶转录物连接。TCRβ与T细胞激活标志物和TCRα连接以形成三个、四个、或更多个转录物的融合复合物，使得产生足以产生抗体蛋白质的多核酸序列。TCRβ与T细胞激活标志物和TCRα连接，使得只有两个转录物在单分子中连接，例如，TCRβ和CD69。从这个实验中，鉴定了诱导T细胞的功能性应答的肽:MHC和TCR、或CAR-T和表面靶标之间的关联配对，并且这些TCR或CAR-T平行地连接至推定靶cDNA转录物。靶序列与全转录组连接，然后生物信息学上分析转录组以检测指示细胞功能变化的序列变化。

过继TCR工程化或CAR-T细胞疗法的功效和特异性通过分别对中靶和脱靶激活标志物的序列计数进行基准测定来估计。工程化T细胞激活测定用于产生用于制造临床治疗剂的对照范围。该测定在CAR-T或TCR工程化过继T细胞疗法的非临床开发期间使用。转录组范围内的激活测定可用于发现包含用于工程化T细胞安全性或功效的新型生物标志物的转录物。

Claims (62)

1.一种用于生物细胞的功能性分析的方法，其包括：

将来自第一细胞类型的多个靶细胞克隆的单个靶细胞和来自第二细胞类型的多个诱导细胞克隆的一个或多个诱导细胞分离成单分散乳液微滴；

在所述单分散乳液微滴中孵育分离细胞，其中所述分离细胞包含所述单个靶细胞和所述一个或多个诱导细胞；

将含有裂解试剂的水溶液引入到所述单分散乳液微滴中，从而诱导所述分离细胞的裂解；

捕获从固体表面上的所述分离细胞释放的RNA；和

产生包含来自所述分离细胞的转录物的杂交多核酸的文库，其中所述杂交多核酸指示在孵育所述分离细胞的步骤后所述单个靶细胞的转录变化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述杂交多核酸进一步指示在孵育所述分离细胞的步骤后所述一个或多个诱导细胞的转录变化。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一个或多个诱导细胞的所述转录变化包括基因的转录物的增加小于10倍。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个靶细胞克隆包含超过10,000个独特的细胞克隆，其中所述多个靶细胞克隆的各个靶细胞克隆在遗传上彼此不同。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个诱导细胞克隆包含超过10,000个独特的细胞克隆，其中所述多个诱导细胞克隆的各个诱导细胞克隆在遗传上彼此不同。

6.根据权利要求4所述的方法，其中通过将核酸序列的文库引入到至少100,000个细胞的群中来创造所述靶细胞克隆的遗传多样性。

7.根据权利要求5所述的方法，其中通过将核酸序列的文库引入到至少100,000个细胞的群中来创造所述诱导细胞克隆的遗传多样性。

8.根据权利要求1所述的方法，其中使用粘附至珠子的寡核苷酸进行RNA捕获，其中各个珠子的直径为小于10μm。

9.根据权利要求1所述的方法，其中通过重叠延伸聚合酶链式反应产生所述杂交多核酸。

10.根据权利要求1所述的方法，其中通过第一链合成产生所述杂交多核酸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞类型是表达T细胞受体的细胞的文库。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞类型是表达抗体的细胞的文库。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞类型是表达肽:MHC的细胞的文库。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞类型是表达多核酸条形码的细胞的文库。

15.根据权利要求1所述的方法，其中使用微流体将细胞分离成乳液。

16.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的杂交多核酸的文库。

17.根据权利要求16所述的组合物，其包含具有至少10,000个独特序列的杂交多核酸。

18.根据权利要求17所述的组合物，其包含具有至少1,000,000个独特序列的杂交多核酸。

19.一种用于细胞群的功能性分析的方法，其包括深度测序根据权利要求1所述的杂交多核酸的文库。

20.一种组合物，其包含从根据权利要求16所述的组合物产生的重组蛋白的文库。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述重组蛋白的文库包含T细胞受体。

22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述重组蛋白的文库包含肽:MHC。

23.根据权利要求20所述的组合物，其中所述重组蛋白的文库包含抗体。

24.一种组合物，其包含第一探针和第二探针，其中：

所述第一探针包含与第一细胞类型的诱导细胞的转录物互补的第一子序列和与所述第二探针的至少一部分互补的第二子序列，其中所述转录物对于所述第一细胞类型是独特的；和

所述第二探针包含与第二细胞类型的靶细胞的不同转录物互补的第三子序列和与所述第一探针的至少一部分互补的第四子序列，其中当所述靶细胞与所述诱导细胞一起孵育时所述不同转录物的量变化。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码T细胞受体。

26.根据权利要求24所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码抗体。

27.根据权利要求24所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码肽:MHC。

28.根据权利要求24所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码多核酸条形码。

29.根据权利要求24所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码重组蛋白。

30.一种用于生物细胞的功能性分析的方法，其包括：

将来自第一细胞类型的多个靶细胞克隆的靶细胞和来自第二细胞类型的多个诱导细胞克隆的一个或多个诱导细胞分离成单分散乳液微滴；

在所述单分散乳液微滴中孵育分离细胞，其中所述分离细胞包含所述单个靶细胞和所述一个或多个诱导细胞；

从所述分离细胞中分离RNA；

使用根据权利要求24所述的组合物产生杂交多核酸的文库；和

深度测序所述杂交多核酸的文库。

31.一种用于生物细胞的功能性分析的方法，其包括：

将来自第一细胞类型的多个靶细胞克隆的单个靶细胞、来自第二细胞类型的多个诱导细胞克隆的一个或多个诱导细胞和来自第三细胞类型的多个中间细胞克隆的一个或多个中间细胞分离成单分散乳液微滴；

在所述单分散乳液微滴中孵育分离细胞，其中所述分离细胞包含所述单个靶细胞、所述一个或多个诱导细胞和所述一个或多个中间细胞；

将含有裂解试剂的水溶液引入到所述单分散乳液微滴中，从而诱导所述分离细胞的裂解；

捕获从固体表面上的所述分离细胞释放的RNA；和

产生包含来自所述分离细胞的转录物的杂交多核酸的文库，其中所述杂交多核酸指示在孵育所述分离细胞的步骤后所述单个中间细胞的转录变化。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述杂交多核酸指示在孵育所述分离细胞的步骤后所述一个或多个中间细胞的转录变化。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述一个或多个中间细胞的所述转录变化包括基因的转录物的增加小于10倍。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述多个靶细胞克隆包含超过10,000个独特的细胞克隆，其中所述多个靶细胞克隆的各个靶细胞克隆在遗传学上彼此不同。

35.根据权利要求31所述的方法，其中所述多个诱导细胞克隆包含超过10,000个独特的细胞克隆，其中所述多个细胞克隆的各个诱导细胞克隆在遗传上彼此不同。

36.根据权利要求34所述的方法，其中通过将核酸序列的文库引入到至少100,000个细胞的群中来创造所述靶细胞克隆的遗传多样性。

37.根据权利要求35所述的方法，其中通过将核酸序列的文库引入到至少100,000个细胞的群来创造所述诱导细胞克隆的遗传多样性。

38.根据权利要求31所述的方法，其中使用粘附至珠子的寡核苷酸进行RNA捕获，其中各个珠子的直径为小于10μm。

39.根据权利要求31所述的方法，其中通过重叠延伸聚合酶链式反应产生所述杂交多核酸。

40.根据权利要求31所述的方法，其中通过第一链合成产生所述杂交多核酸。

41.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一细胞类型是表达T细胞受体的细胞的文库。

42.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一细胞类型是表达抗体的细胞的文库。

43.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一细胞类型是表达肽:MHC的细胞的文库。

44.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一细胞类型是表达多核酸条形码的细胞的文库。

45.根据权利要求31所述的方法，其中使用微流体将细胞分离成乳液。

46.一种组合物，其包含根据权利要求31所述的杂交多核酸的文库。

47.根据权利要求46所述的组合物，其包含具有至少1,000个独特序列的杂交多核酸。

48.根据权利要求47所述的组合物，其包含具有至少10,000个独特序列的杂交多核酸。

49.根据权利要求48所述的组合物，其包含具有至少100,000个独特序列的杂交多核酸。

50.根据权利要求49所述的组合物，其包含具有至少1,000,000个独特序列的杂交多核酸。

51.一种用于细胞群的功能性分析的方法，其包括深度测序根据权利要求31所述的杂交多核酸的文库。

52.一种组合物，其包含从根据权利要求46所述的组合物产生的重组蛋白的文库。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述重组蛋白的文库包含T细胞受体。

54.根据权利要求52所述的组合物，其中所述重组蛋白的文库包含肽:MHC。

55.根据权利要求52所述的组合物，其中所述重组蛋白的文库包含抗体。

56.一种组合物，其包含第一探针和第二探针，其中：

所述第一探针包含与第一细胞类型的诱导细胞的转录物互补的第一子序列和与所述第二探针的至少一部分互补的第二子序列，其中所述转录物对于所述第一细胞类型是独特的；和

所述第二探针包含与第二细胞类型的中间细胞的不同转录物互补的第三子序列和与所述第一探针的至少一部分互补的第四子序列，其中当所述中间细胞与所述诱导细胞和靶细胞一起孵育时所述不同转录物的量变化。

57.根据权利要求56所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码T细胞受体。

58.根据权利要求56所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码抗体。

59.根据权利要求56所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码肽:MHC。

60.根据权利要求56所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码多核酸条形码。

61.根据权利要求56所述的组合物，其中对所述第一细胞类型独特的所述转录物编码重组蛋白。

62.一种用于生物细胞的功能性分析的方法，其包括：

将来自第一细胞类型的多个靶细胞克隆的靶细胞、来自第二细胞类型的多个诱导细胞克隆的一个或多个诱导细胞和来自第三细胞类型的多个中间细胞克隆的一个或多个中间细胞分离成单分散乳液微滴；

在所述单分散乳液微滴中孵育分离细胞，其中所述分离细胞包含所述单个靶细胞、所述一个或多个诱导细胞和所述一个或多个中间细胞；

从所述分离细胞分离RNA；

使用根据权利要求56所述的组合物产生杂交多核酸的文库；和

深度测序所述杂交多核酸的文库。