CN1104250A

CN1104250A - 高活性的浑球红假单胞菌p4株和沼泽红假单胞菌1号株混合制剂的制备方法

Info

Publication number: CN1104250A
Application number: CN 94111462
Authority: CN
Inventors: 俞吉安; 朱章玉; 王金润
Original assignee: Biological Technology Inst Shanghai Jiaotong University; BIOLOG TECHNOLOGY I SHANGHAI J
Current assignee: Biological Technology Inst Shanghai Jiaotong University; BIOLOG TECHNOLOGY I SHANGHAI J
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 1995-06-28

Abstract

本发明是一种高活性的浑球红假单胞菌(Rhodopseu do monas Sphaero ides)P₄株和沼泽红假单胞菌(Rhodopse udomonas Palustris)1号株混合制剂的制备方法，该方法为：在菌种培养液中接种30％以上的两株菌株的混合菌群，接种后的培养液在温度为26—32℃，光照强度为3000—5000lX、pH为6—8，厌氧条件下培养48—72小时，然后将培养出的菌液在敞开体系中、自然光照下，根据菌液中的碳源残存量适时添加一次以上的碳源，在温度为20—35℃、好氧充气条件下培养72—120小时后，收集菌液分装，制成液体微生物混合制剂。

Description

本发明涉及一种高活性的浑球红假单胞菌P₄株和沼泽红假单胞菌1号株混合制剂的制备方法，属于微生物制品技术领域。

光合细菌（Photosynthetic Bacteria，简称PSB）是一种水生微生物，其广泛存在于海洋、湖泊、河流、水塘和活性污泥中。因它含有光合色素，能利用光能进行不产氧的光合作用而生长繁殖，故称为光合细菌。中国发明专利公报公开了一件发明名称为“沼泽红假单胞菌制剂的制备方法及用途”的发明专利申请（公开号CN1083109A），它所公开的光合细菌沼泽红假单胞菌制剂的制备方法为：“以Van Niel培养液或YP培养基，先经消毒然后再接种沼泽红假单胞菌的原种，接种量一般为2-5%（指该原种在接种后的整个培养液中所占的容积百分比），控制一定的培养温度和光照强度并在厌氧条件下培养48-72小时，然后收集菌液分装，制成液体微生物制剂”。由于该制备方法中，培养液或培养基必须先经消毒然后再接种沼泽红假单胞菌的原种，且原菌种的接种量（容积百分比）一般为2-5%（常规接种量），另外由于原菌种的菌株仅局限于厌氧条件下培养，因此上述制备方法仅适合于在实验室或小规模生产中制备液体微生物制剂时使用，且制得的菌液产量小、活菌浓度较低。如扩大培养规模，除菌种培养液需消毒外，整个培养容器（即发酵罐）也需消毒，另外分装操作等均需保证在无菌状态下进行，这样，设备投资大，消毒、照明等方面的能耗相当高，生产成本增加，操作时的无菌要求相当严格。因此，在培养规模或称发酵规模扩大后，一则由于操作过程中的无菌要求很难保证，二则目前国内外还没有十分理想且容积相当大的光合微生物发酵罐问世，三则由于难以对整个培养液提供良好的光照条件，四则由于菌液中的菌体相互之间存在遮光效应，所以，培养规模扩大后，就很难在易控条件下对菌株进行快速而有效的培养，这样最终制得的菌液，其产量和活菌浓度也就难以得到保证。综上所述，上述制备方法实属一种单一的、适宜在实验室或小规模生产中制备菌液的方法，该方法局限性很大，对培养容器的消毒要求和操作时的无菌要求均相当严格，菌液的产量和活菌浓度难以得到保证，所以这种制备方法不能满足工业化大生产中高产、低耗、优质诸要求，无法在工业化生产中大规模推广使用。

本发明的目的在于提供一种“高活性的浑球红假单胞菌P₄株和沼泽红假单胞菌1号株混合制剂的制备方法”，由于该制备方法中的菌种培养液及培养容器均无须消毒、生产过程中的分装等操作均可在不要求无菌的状态下进行，因此该制备方法非常适宜在工业化生产中大规模推广使用。采用这种方法，可快速制备产量大且活菌浓度高的液体微生物混合制剂，并且混合制剂中的两株光合细菌菌株还具有良好的生物活性。

本发明所提供的高活性的浑球红假单胞菌（Rhodopseudomonas Sphaeroides）P₄株和沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas Palustris）1号株混合制剂的制备方法为：

先将浑球红假单胞菌P₄株和沼泽红假单胞菌1号株这两个菌株的混合菌群（混合菌群的活菌浓度一般为2×10⁹个/ml，且浑球红假单胞菌P₄株和沼泽红假单胞菌1号株进行混合时各自所占的容积百分比均为50%）接种于菌种培养液中，混合菌群的接种量，按混合菌群的容积计算为接种后整个培养液容积的30%以上，接种后的整个培养液是在温度为26-32℃，光照强度为3000-5000lx、PH为6-8，厌氧条件下培养48-72小时，此时菌液的活菌浓度与接种前混合菌群的活菌浓度相同;然后将厌氧光照条件下培养出的菌液在敞开体系中、自然光照下，每次在每升菌液中按乙酸钠与丙酸钠的重量为10∶1的比例添加碳源，以保证菌液中的碳源含量始终维持在1500ppm以上，在温度为20-35℃、好氧充气（每升菌液中每分钟的充气量为0.02-0.04升）条件下培养72-120小时，此时菌液的活菌浓度可达到5×10⁹个/ml以上，然后收集菌液分装，制成液体微生物混合制剂。

以上所说的菌种培养液有两种，其组成见下，使用时可任选其中的一种：

a、CH₃COONa 6g，C₂H₂COONa 0.6g，（NH₄）₂SO₄1g，K₂HPO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，NaCl 1g，MgSO₄0.5g，生物素 10g，尼克酸 1mg，维生素B₁0.2mg，蛋白栋 0.5g，FeCl₃10mg，MnCl₂2mg，ZnCl₂10ug，NaMoO₄·2H₂O 1mg，EDTA 250mg，清洁水 1000ml;

b、蛋白栋 10g，葡萄糖 5g，MgSO₄0.5g，KH₂PO₄0.8g，FeSO₄10mg，清洁水 1000ml。

以上所说的敞开体系是指敞口的培养容器。

浑球红假单胞菌（Rhodopseudomonas Sphaeroides）P₄株和沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas Palustris）1号株，属原核生物界、细菌门、红螺细菌目（Rhodopsirillales）、红螺菌科（Rhodospirillaceae）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）。两菌株的纯培养菌落的形状均为圆形突起，边缘轮廓光滑、清楚，细菌个体直径0.2-0.4um。在固体培养基上浑球红假单胞菌P₄株的细菌常呈单个排列，二分分裂方式繁殖，革兰氏染色为阴性;沼泽红假单胞菌1号株芽生繁殖，菌体内多含聚烃基丁酸，在老令培养物中呈花簇状聚集生长，革兰氏染色为阴性。

浑球红假单胞菌P₄株和沼泽红假单胞菌1号株的混合菌液呈深红色，不透明，无粘滞性，略有光泽;这两种光合细菌均为兼性光合厌氧细菌，可在以乙酸钠和丙酸钠等低级脂肪酸为碳源的合成培养基中生长繁殖。生产实践和理论研究均表明：这两种光合细菌无论是在厌氧光照还是在好氧光照条件下均能正常生长，也就是说两种光合细菌在上述两种不同生长条件下均可通过光合磷酸化和氧化磷酸化等各种不同代谢方式获取能量而生长繁殖。两种光合细菌最适合的培养条件为：PH6.8-7.0（PH5.0以下不能生长，PH8.5以上生长缓慢）、最适温度为28-30℃、光照强度为3000lx以上。

本发明中，在厌氧光照条件下对混合菌群进行培养时，作为生产菌株使用的、混合菌群中的两株菌株-浑球红假单胞菌P₄株和沼泽红假单胞菌1号株均是指上海交通大学生物技术研究所从土壤和水域环境中取样、分离得到的几十株菌株中，筛选出来的。待这两株菌株生长4天后，将这两株高生物活性的优良菌株分别进行扩大培养，然后将这两株菌株按各自所占的容积百分比均为50%的混合比例加以混合后制成这两株菌株的混合菌群。这两株菌株均为兼性光合厌氧细菌，在适宜两者生长繁殖的菌种培养液中和培养条件下，能很快生长繁殖，且这两株菌株还具有促生长、提高机体免疫功能等多种生理活性。

下面，就本发明中由这两株光合细菌菌株组成的混合菌群，在以上所述的两个不同培养过程中分别进行培养的生长繁殖机理及培养后的效果作进一步阐述：

由于混合菌群是以大大超出常规接种量的接种比例（30%以上，系容积百分比）进行接种，所以对混合菌群生长繁殖非常适宜的菌种培养液及相应的培养容器就能在无需进行消毒的条件下，保证光合细菌的优势生长。另外由于混合菌群在菌种培养液中接种后，再配以适宜混合菌群生长的光照、温度，控制好整个培养液的PH值，所以就又为混合菌群提供了在厌氧光照条件下最适宜它们生长的培养条件。因此，在本发明的厌养光照培养过程中，不但保证了混合菌群的绝对优势生长，而且还抑制了其它杂菌的生长繁殖：在该培养过程中，整个培养液里这两株菌株活菌增殖的速度相当快，培养后菌液的活菌浓度可达到接种前混合菌群的活菌浓度（一般能达到2×10⁹个/ml，相当于660nm波长下的光密度值即OD₆₆₀＝2.0），培养后实际净增加的、达到接种前混合菌群活菌浓度的菌液容积（其值等于整个培养液的容积减去接种的那部分混合菌群的容积，该容积实际上与菌种培养液的容积相同）增加得相当大，一次最高可净增加70%（容积百分比）的菌液。

在本发明的厌氧光照培养过程中，一般培养48-72小时，便可制得大量的（指容积）、活菌浓度较高的菌液，制得的菌液虽可满足农业等一些应用领域中的使用要求（此时亦可分装、出厂销售），但是，由于菌液的活菌浓度总的说来还是较低，还不能满足禽畜饲养、水产养殖等另外一些应用领域中的使用要求;并且，经过此培养过程，菌液中还残留着少量的厌氧性杂菌以及对菌液保存相当不利的某些营养物质（如磷源、氮源）。由于菌液的活菌浓度相对说来还是较低，且存在着上述可造成菌液质量不够稳定的因素，所以通过厌氧光照培养过程得到的菌液，其保存期较短、应用领域较为狭窄，这样给生产厂家和用户均带来诸多不便。

由于混合菌群中的两株菌株具有兼性光合厌氧特点，所以可利用这一特点，通过随后的另一培养过程即好氧充气培养过程，来完全克服厌氧光照培养过程所带来的菌液保存期短、活菌浓度低、应用范围狭窄等缺陷，阐述如下：将厌氧光照条件下培养出的菌液在敞开体系中（即敞口容器中）、自然光照下，适时添加碳源（每次在每升菌液中按乙酸钠与丙酸钠的重量为10∶1的比例添加碳源，以保证菌液中的碳源含量始终维持在1500ppm以上，添加碳源的次数根据培养过程中及培养结束时菌液中的碳源残存量来决定），在温度为20-35℃、好氧充气（每升菌液中每分钟的充气量为0.02-0.04升）条件下，进行菌液的进一步高密度培养，使菌液中的两株菌株得以继续快速生长繁殖，促进菌液的活菌浓度和两株菌株内活性成分（如辅酶Q等）含量的提高：由于该两株菌株能在微好氧条件下继续生长繁殖，而好氧条件对菌液中的少量厌氧性杂菌却能起到抑制其生长繁殖和致死作用，另外，上述的可使光合细菌保持优势生长的微好氧条件，也不利于菌液中的其它好氧杂菌的生长，所以在该培养过程中完全能够保证菌液中两株光合细菌菌株的绝对优势生长，因此，该培养过程中所有的操作过程均可在不要求无菌的状态下进行、使用的所有培养容器均无需进行消毒，加上该培养过程中如上所述的各种培养条件相当容易控制，所以可使菌液中残留的其他营养成分如磷源、氮源较为方便、容易地继续转化为菌体，这样通过该培养过程能有效保证菌液中两株光合细菌菌株的绝对优势生长和进一步成熟。

在本发明的好氧充气培养过程中，一般培养72-120小时，便可制得活菌浓度相当高（一般能达到5×10⁹个/ml以上，相当于660nm波长下的光密度值即OD₆₆₀在3.0以上）的液体微生物混合制剂，从而使厌氧光照条件下培养出的菌液的活菌浓度得以大幅度提高（活菌浓度愈高，液体微生物混合制剂所能发挥的作用愈大，使用后的效果愈好）;另外，在此好氧充气培养过程中还可促进两株菌株内的某些活性代谢物（如嘧啶、脯氨酸、辅酶Q）含量的大幅度提高，这样使得制备的液体微生物混合制剂中的两株菌株还具有良好的生物活性，此时可正式分装、出厂销售。

由上面所阐述的本发明在好氧充气条件下的培养过程可以推知，本培养过程还可在液体微生物混合制剂的连续制备过程中起到下述的另外两种作用：一、由于通过本培养过程，提高了菌液的活菌浓度和菌体活性代谢物的含量，使好氧充气条件下培养出的液体微生物混合制剂可留作连续培养（或称发酵）的菌种，能为以后连续制备液体微生物混合制剂源源不断地提供优质菌种（即：可从最终制备的液体微生物混合制剂中留下一部分作为以后连续生产时的生产用菌种，当连续培养时可供厌氧光照培养过程中接种时使用，而无须再使用上海交通大学生物技术研究所分离、制得并储存的上述两株菌种的纯培养原液）;二、由于通过本培养过程，可使厌氧光照条件下培养出的菌液中对其保存不利的某些营养物质（如磷源、氮源），在此培养过程中被消耗殆尽而转化为菌体，故本培养过程属一种优化培养过程（可使厌氧光照条件下培养出的菌液在动态的连续培养过程中，得以进一步提高活菌浓度、降低杂菌数），所以厌氧光照条件下培养出的菌液，可通过本好氧充气培养过程大大提高质量，使其不易发生变质，且保存期得以延长。

根据两株菌株在厌氧光照条件下和好氧充气条件下的上述两个培养过程，可以得到以下结论：本发明中的两株菌株在厌氧光照条件下和好氧充气条件下分别进行培养的上述两个培养过程，在制备液体微生物混合制剂的方法中，是互为依赖、互为支持、缺一不可的。这两个培养过程在本发明中各自所起的作用及带来的培养效果均有所不同，但是，这两个培养过程对于快速制备高产量、高活菌浓度的液体微生物混合制剂来说，所起的作用都是非常重要的，其中：厌氧光照培养过程所起的作用主要是对整个培养液中的两株菌株进行快速增殖培养，培养后可使得实际净增的并达到接种前混合菌群的活菌浓度（一般为2×10⁹个/ml）的菌液量（指容积）增加得相当大，但菌液易发生变质，保存期较短，应用领域狭窄;好氧充气培养过程所起的作用则主要是对厌氧光照条件下培养出的菌液中的两株菌株进行高密度培养，使两菌株得以继续生长繁殖，促进菌液的活菌浓度和两株菌株内的活性成分含量的提高（其中：活菌浓度可达到5×10⁹个/ml以上），这样制得的液体微生物混合制剂，其保存期较长，应用领域广泛。因此，本发明通过在厌氧光照条件下和好氧充气条件下的这两个不同培养过程，使得最终制备的液体微生物混合制剂，其保存期较长、应用领域广泛、使用效果相当好。

综上所述，在本发明中，由于将上述的两个不同培养过程有机地结合起来同时用于制备液体微生物混合制剂的工业化大生产中，并取得了上述相当好的培养效果，所以它是一种可用来快速制备液体微生物混合制剂的方法，由于该制备方法完全能够满足工业化大生产中高产、低耗、优质诸要求，故可在工业化生产中加以大规模推广使用。采用本发明所述的制备方法，仅需较低的成本，经120-192小时，即可生产出产量大、活菌浓度高（活菌浓度可达到5×10⁹个/ml以上）的液体微生物混合制剂。

下面通过实施例更好地说明本发明：

以下的三个实施例中所涉及的液体微生物混合制剂均是采用本发明所提供的上述制备方法制成的，制备过程中每个具体工艺步骤及其内的具体工艺数据及有关情况见表1、表2。

由表1和表2可知，两表相结合很清楚地给出了本发明的三个实施例，其中实施例一为本发明的最佳实施例。由于这三个实施例中制备相应的液体微生物混合制剂的工艺步骤均完全相同（可详见发明内容部分），仅是在每个具体工艺步骤中的具体工艺条件（如温度、光照强度等）有所不同而已，故这里对三个实施例中在制备相应的液体微生物混合制剂过程中的工艺步骤不再作详细的文字性描述。

注：

1、三个实施例中在厌氧光照条件下对整个培养液进行培养时，整个培养液内混合菌群中的两株菌株分别是指浑球红假单胞菌P₄株和沼泽红假单胞菌1号株。

2、三个实施例中分别在菌种培养液（a液或b液）里进行接种的混合菌群，均是由上海交通大学生物技术研究所提供。混合菌群是由上述两株菌株按各自所占的容积百分比均为50%的混合比例加以混合而成且其活菌浓度均为2×10⁹个/ml。三个实施例中、由混合菌群分别在菌种培养液（a液或b液）里进行接种后所得到的三个不同的整个培养液的容积均为100升。菌种培养液（a液或b液）的组成详见发明内容部分。

3、三个实施例中的菌种培养液（a液或b液），其组成成分之一的清洁水采用净清河水、井水、自来水中任意一种均可（但净清河水和井水中诸如悬浮物含量、BOD值、大肠杆菌数等各项指标，均需符合出厂自来水的标准），由三者中的任意一种配成的菌种培养液（a液或b液）都可以很好地满足两株菌株在厌氧光照和好氧充气这两个不同培养过程中的生长繁殖要求;另外，三个实施例中的好氧充气培养过程结束时，最终制得的液体微生物混合制剂中的碳源含量亦为1500PPM。

4、液体微生物混合制剂制成后，分装时还可出料一部分，剩下的一部分可在厌氧光照培养过程中作为生产菌种使用，这样在以后的连续培养过程中就不需再使用上海交通大学生物技术研究所分离、制得并储存的上述两株光合细菌菌种的纯培养原液。

通过上海交通大学生物技术研究所大量试验和鉴定的结论以及国内外文献介绍可知：光合细菌菌体不仅有丰富的蛋白质与维生素，而且含有多种促进生长和抗病的活性因子，以及辅酶Q等生理活性物质，类胡罗卜素、蕃茄红等天然色素，这些都是生物体生命活动所必需的物质，所以它具有提高机体抗病能力、促进生长、增加营养、改良品质、净化环境等多种功能。

本发明中所述的两株光合细菌菌株与土壤中的固氮菌具有共生能力，可有效吸收根际周围的有机酸等营养物质，抑制有害丝状菌、病原菌繁殖，作为叶肥能有效增强叶面光合作用，改善着果、结实率。本发明所制备的液体微生物混合制剂除了在农业上、林业上作为土壤改良剂、花芽形成促进剂外，还广泛被用作叶面肥及饲料、饵料添加剂，这种多功能高效添加剂具有促进生长、提高饲料报酬、提高机体对疾病的抵抗能力、改善内在品质等作用。另外，由于光合细菌能利用水中的H₂S、酚类、胺类等化合物和吸收重金属离子等功能，因此在水产养殖中还兼有净化水质、提高鱼虾成活率的作用。

本发明所制备的液体微生物混合制剂，在农业、林业、鱼业上使用，具有明显的增产效果，同时它还具有治理污染、净化环境等优点。

Claims

1、高活性的浑球红假单胞菌(Rhodopseudomonas Sphaero ides)P₄株和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas Palustris)1号株混合制剂的制备方法，先将浑球红假单胞菌P₄株和沼泽红假单胞菌1号株这两个菌株的混合菌群(浑球红假单胞菌P₄株和沼泽红假单胞菌1号株进行混合时各自所占的容积百分比均为50%)接种于菌种培养液中，在光照条件下进行培养，其特征在于：

(1)、混合菌群的接种量，按混合菌群的容积计算为接种后整个培养液容积的30%以上，且接种后的整个培养液是在温度为26-32℃，光照强度为3000-5000Lx、PH为6-8，厌氧条件下培养48-72小时，此时菌液的活菌浓度与接种前混合菌群的活菌浓度相同，菌种培养液分两种，其组成见下，使用时可选用其中的一种：

a、CH₃COONa 6g，C₂H₂COONa 0.6g，(NH₄)₂SO₄1g，K₂HPO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，NaCl 1g，MgSO₄0.5g，生物素10ug，尼克酸 1mg，维生素B₁0.2mg，蛋白栋 0.5g，FeCl₃10mg，MnCl₂2mg，ZnCl₂10ug，NaMoO₄·2H₂O 1mg，EDTA 250mg，清洁水 1000ml；

b、蛋白栋10g，葡萄糖 5g，MgSO₄0.5g，KH₂PO₄0.8g，FeSO₄10mg，清洁水 1000ml，

(2)、将(1)中培养出的菌液在敞开体系中、自然光照下，每次在每升菌液中按乙酸钠与丙酸钠的重量为10∶1的比例添加碳源，以保证菌液中的碳源含量始终维持在1500ppm以上，在温度为20-35℃、好氧充气(每升菌液中每分钟的充气量为0.02-0.04升)条件下培养72-120小时，此时菌液的活菌浓度可达到5×10⁹ml以上，然后收集菌液分装，制成液体微生物混合制剂。

2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：混合菌群的最佳接种量为30-50%。

3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：整个培养液在厌氧光照条件下进行培养时的最佳PH为6.8-7.0。

4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：整个培养液在厌氧光照及好氧充气条件下分别进行培养时的最佳培养温度均为28-30℃。