CN110423356A - 检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用 - Google Patents

检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用 Download PDF

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罗子伊
傅志宏
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Abstract

本发明公开了检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，包括氨基修饰的2D‑MOF材料的合成和金属有机骨架材料在检测鱼肉中次黄嘌呤的应用，其特征在于：所述氨基修饰的2D‑MOF材料的合成方法，本发明涉及分析化学技术领域。该检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，通过基于NH2‑Cu‑MOF材料的两点特性构建了荧光生物传感器用于检测鱼肉中的次黄嘌呤以衡量鱼肉的新鲜度，传感器的荧光强度与次黄嘌呤浓度在10‑2000M范围内有很好的线性，传感器检测次黄嘌呤的LOD为3.93M(S/N＝3)，同时，该传感器用于腐败鱼肉中次黄嘌呤的检测，所得结果与HPLC得到的结果接近，证明该传感器在实际样测定中的可能性，拓展了2D‑MOF的种类和荧光生物传感器方面的应用。

Description

检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体为检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用。
背景技术
迄今为止，金属有机骨架材料(MOF)以及结晶分子材料因为其优异的物理或化学特性而得到广泛的应用，诸如吸附、分离、催化、传感以及药物装载，但是目前大部分的工作都是聚焦于3D-MOF的合成与应用研究，对于2D-MOF 则相对少得多，同时2D-MOF的潜在应用更为可观，2D-MOF因为其单位面积内相比较于3D-MOF具有更多的活性位点而在催化、传感等方面获得重视。
传统的2D纳米材料，诸如氧化石墨烯、石墨相碳化氮、过渡金属硫化物、氮化硼、硫族化合物、薄层金属氧化物、层状双金属氢氧化物以及黑磷等因为难于进行表面修饰而使得其应用收到限制，2D-MOF因为其组成特殊，具有易于修饰的有机配体作为组成部分而使得这一难题迎刃而解，对通过选择不同的有机配体可以使MOF得到不同的官能团修饰，例如氨基、羟基、巯基、叠氮基亦或是丙二腈修饰的MOF，这使得MOF能够满足于更多方向的应用要求。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，通过合成了一种新型氨基修饰的2D-MOF材料 (NH2-Cu-MOF)，这一材料较之前报道的2D-MOF(如：Zn-TCPP(Fe))相比不仅具有POx模拟酶活性，同时表现出荧光活性，通过研究该材料的基于氨基化有机配体而产生的荧光特性与基于金属中心Cu2+而具有的POx模拟酶活性，利用NH2-Cu-MOF构建了一种检测次黄嘌呤的荧光生物传感器，并在检测鱼肉中次黄嘌呤的应用。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，包括氨基修饰的2D-MOF材料的合成和金属有机骨架材料在检测鱼肉中次黄嘌呤的应用，所述氨基修饰的2D-MOF 材料的合成方法，具体包括以下步骤：
S1、首先将30mg的有机配体氨基对苯二甲酸溶解于6mL的DMF与3mL乙腈的混合溶剂中作为试管的底层；
S2、在底层的上方是用3mL的DMF与3mL的乙腈混合均匀的连接层，而最上层则是溶解有30mg Cu(NO3)2的3mLDMF与6mL乙腈的混合溶剂，因为混合溶剂中DMF的密度较乙腈大，因此三层溶液会出现分层，但是会随着时间而混合均匀；
S3、在三层溶剂混合时，有机配体与金属中心在连接层进行自组装而得到NH2-Cu-MOF材料；
S4、整个合成过程需要在40℃条件下静置24h，最后收集试管中的材料，利用DMF和二氯甲烷分别清洗三次，以除去材料结构中的溶剂分子，最后将材料在80℃真空条件下烘干备用；
本发明还公开了金属有机骨架材料在检测鱼肉中次黄嘌呤的应用，具体包括以下步骤：
T1、首先将合成的金属有机骨架材料构建成传感器，然后选择测定腐败鱼肉中Hx的浓度，从超市中购买鱼肉后，在冰箱中放置1个月后取出进行实验；
T2、首先取鱼肉5.0g加入30mL三氯乙酸超声30min进行提取，然后加入在10000r/min转速下离心10min，取上清液将pH调至7.0后作为样品备用；
T3、将调节pH后的上清液当做Hx直接加入到检测体系中，观测体系荧光发射峰的信号强度，构建传感器检测Hx的工作曲线，根据建立的标准曲线确定鱼肉中Hx的活性，并利用HPLC检测鱼肉中的Hx浓度作为参考值。
优选的，所述合成材料用的玻璃仪器都先在碱缸中浸泡60min，取出后用自来水冲洗干净，再超声清洗10min，然后用二次水冲洗干净以后烘箱85℃烘干备用。
优选的，所述材料的合成在25mL，半径为0.75cm的玻璃试管中进行。
优选的，所述在确定传感器最优的反应条件之后，直接利用所设计的传感器建立一条检测Hx的工作曲线，并用以考察传感器检测Hx的线性区间与检测限。
优选的，所述步骤T3中将上清液当做Hx直接加入到检测体系中进行反应，具体包括以下步骤：
a1、先将不同浓度的Hx与0.1U/mL次黄嘌呤氧化酶在25℃的摇床中反应 40min后加入50L，200g/mL的NH2-Cu-MOF与20L Tris-HCl并继续在25℃的摇床中反应40min后加入邻苯二胺反应15min用Tris-HCl补充体系体积至200L；
a2、测定体系的荧光，在335nm处激发，获得400-600nm区域的发射峰，得到浓度Hx的荧光发射峰强度，由此构建传感器检测Hx的工作曲线。
(三)有益效果
本发明提供了检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用。与现有技术相比具备以下有益效果：该检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，通过一系列形貌表征与成分分析确定了材料结构，得到的NH2-Cu-MOF因为结构中配体的氨基化而使材料在溶液环境中表现出荧光特性(λex＝338nm，λem＝425nm),同时因为材料结构中的金属中心为Cu2+ 而表现出POx模拟酶活性能够催化过氧化氢分解产生强氧化性的羟基自由基，基于NH2-Cu-MOF材料的两点特性构建了荧光生物传感器用于检测鱼肉中的次黄嘌呤以衡量鱼肉的新鲜度，传感器的荧光强度与次黄嘌呤浓度在10-2000M 范围内有很好的线性，传感器检测次黄嘌呤的LOD为3.93M(S/N＝3)，同时，该传感器用于腐败鱼肉中次黄嘌呤的检测，所得结果与HPLC得到的结果接近，证明该传感器在实际样测定中的可能性，拓展了2D-MOF的种类和荧光生物传感器方面的应用。
附图说明
图1为本发明NH2-Cu-MOF的XPS表征图中Cu、O、C、N的精细扫描谱图；
图2为本发明TMB-H2O2混合体系中加入不同体积NH2-Cu-MOF溶液后的紫外吸收光谱图；
图3为本发明传感器可行性分析与原理验证图；
图4为本发明传感器检测Hx的荧光光谱图；
图5为本发明HPLC检测次黄嘌呤的色谱条件图；
图6为本发明鱼肉中Hx浓度的检测图；
图7为本发明利用HPLC建立的鱼肉中次黄嘌呤浓度的工作曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-7，本发明实施例提供一种技术方案：检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，包括氨基修饰的2D-MOF材料的合成和金属有机骨架材料在检测鱼肉中次黄嘌呤的应用，所述氨基修饰的2D-MOF材料的合成方法，具体包括以下步骤：
S1、首先将30mg的有机配体氨基对苯二甲酸溶解于6mL的DMF与3mL乙腈的混合溶剂中作为试管的底层；
S2、在底层的上方是用3mL的DMF与3mL的乙腈混合均匀的连接层，而最上层则是溶解有30mg Cu(NO3)2的3mLDMF与6mL乙腈的混合溶剂，因为混合溶剂中DMF的密度较乙腈大，因此三层溶液会出现分层，但是会随着时间而混合均匀；
S3、在三层溶剂混合时，有机配体与金属中心在连接层进行自组装而得到NH2-Cu-MOF材料；
S4、整个合成过程需要在40℃条件下静置24h，最后收集试管中的材料，利用DMF和二氯甲烷分别清洗三次，以除去材料结构中的溶剂分子，最后将材料在80℃真空条件下烘干备用。
对本发明合成的NH2-Cu-MOF进行的SEM在TESCAN MAIA3上获得，样品分散在乙醇溶液中超声处理后滴涂到硅片上烘干，在测定之前进行喷金处理以增加材料的导电性，TEM图形则是在JEM-2100F场发射透射电镜上获得的，样品滴加到300目的碳支持膜铜网上，自然挥干后测定。利用Bruker NanoScope 3D，在轻敲模式下测定材料的厚度，对材料的XRD表征则是直接利用材料粉末在Rigaku-mini flex 600上测定获得，对材料的XPS表征则是将5mg/mL的材料溶液滴涂到硅片(1*1cm)上，利用ESCALAB 250测定获得，NH2-Cu-MOF的比表面积、孔体积和孔径分布情况的测定使用物理吸附法测定，本实验中氮气吸附-脱附等温线是由Micromeritics APSP 2020分析仪进行分析的，测试前样品在120℃下真空脱气8h，然后在-78℃条件下进行测定，比表面积和孔径分布数据分别根据Brunauer-Emmett-Teller(BET)理论和Barrett-Joyner-Halanda(BJH)理论计算，孔体积是在相对压力0.995时将吸附的N2量转换为液氮体积计算得到，材料的FT-IR光谱是通过NICOLET 6700 型红外光谱仪测量得到，在进行样品测试前，样品均在60℃真空干燥过夜，将溴化钾和样品用研钵研磨均匀后，使用压片机得到均匀透明的薄片，每个样品仪器扫描32次，扫描的波数范围为400-4000cm。
如图1则是对NH2-Cu-MOF的XPS表征数据图，其中包括全扫面谱以及对各元素的精细谱图，Cu2p3/2、N1s、O1s以及C1s，从全谱中可以得到NH2-Cu-MOF 结构中包含Cu、N、C、O四种元素，并通过对这四种元素的精细分析得到四种元素在材料结构中的主要存在状态，Cu2p谱图中可以看出，Cu2+的结合能在930-965eV范围内，其中935.4和954.4eV的峰是Cu(NO3)2中Cu2+的2P2/3 轨道电子产生的峰，而谱图中940-950eV区域的峰表明结构中的Cu是以Cu2+ 的形式存在，而933.4eV则是因为结构中Cu2+上电子向有机配体转移产生的信号，从C1s谱图中从288.8与284.8eV的峰是因为结构中C存在SP2杂化，主要是因为结构中的O-C＝O以及C＝C的存在引起的，材料结构中O的存在形式则可以通过O1s谱图分析得到，从O1s谱图中可以看出主峰在531.63eV处是因为结构中存在的-C＝O结构，而位于531.5eV处的峰则是由C-OH以及-COOH 中O的电子产生，而533.3eV的峰位则是由C-OH/-COOH/N-O-C中O的电子产生，最后是对材料结构中N的分析，从N1s谱图分析得到，从N1s谱图中可以得到主峰为398.34eV有N1s产生的信号峰与相对微弱的407.23eV处的峰位都证明材料结构中N是以-NO2的形式存在的。通过对XPS的分析可以确定材料的成功合成。
本发明还公开了金属有机骨架材料在检测鱼肉中次黄嘌呤的应用，具体包括以下步骤：
T1、首先将合成的金属有机骨架材料构建成传感器，然后选择测定腐败鱼肉中Hx的浓度，从超市中购买鱼肉后，在冰箱中放置1个月后取出进行实验；
T2、首先取鱼肉5.0g加入30mL三氯乙酸超声30min进行提取，然后加入在10000r/min转速下离心10min，取上清液将pH调至7.0后作为样品备用；
T3、将调节pH后的上清液当做Hx直接加入到检测体系中，观测体系荧光发射峰的信号强度，构建传感器检测Hx的工作曲线，根据建立的标准曲线确定鱼肉中Hx的活性，并利用HPLC检测鱼肉中的Hx浓度作为参考值。
本发明中，合成材料用的玻璃仪器都先在碱缸中浸泡60min，取出后用自来水冲洗干净，再超声清洗10min，然后用二次水冲洗干净以后烘箱85℃烘干备用。
本发明中，材料的合成在25mL，半径为0.75cm的玻璃试管中进行。
本发明中，在确定传感器最优的反应条件之后，直接利用所设计的传感器建立一条检测Hx的工作曲线，并用以考察传感器检测Hx的线性区间与检测限
本发明，步骤T3中将上清液当做Hx直接加入到检测体系中进行反应，具体包括以下步骤：
a1、先将不同浓度的Hx与0.1U/mL次黄嘌呤氧化酶在25℃的摇床中反应40min后加入50L，200g/mL的NH2-Cu-MOF与20L Tris-HCl并继续在25℃的摇床中反应40min后加入邻苯二胺反应15min用Tris-HCl补充体系体积至200L；
a2、测定体系的荧光，在335nm处激发，获得400-600nm区域的发射峰，得到浓度Hx的荧光发射峰强度，由此构建传感器检测Hx的工作曲线。
利用TMB-H2O2体系测定NH2-Cu-MOF的POx模拟酶活性：辣根过氧化氢酶能够催化底物的氧化并产生颜色变化，在HRP的作用下，H2O2分解生产羟基自由基从而氧化TMB生成TMB+而变色，TMB-H2O2体系在这里也被用于评估 NH2-Cu-MOF的POx模拟酶活性，50L200g·mL-1的NH2-Cu-MOF加入50L 2mM 的H2O2与50L 1.2mM的TMB，加入Tris-HCl(10mM,pH＝6.9)补充体积到 200L反应40min后观察颜色变化，并测定体系的紫外吸收。
NH2-Cu-MOF的POx模拟酶活性探究：NH2-Cu-MOF的POx模拟酶活性通过 TMB-H2O2体系来验证与测定，首先是确定材料具有POx模拟酶活性。如图2 所示，其中由a-c分别为含有100L、50L以及20L的NH2-Cu-MOF溶液，d为不含H2O2的TMB-NH2-Cu-MOF混合溶液，内插图从左到右分别对应曲线a-d，当体系中不存在H2O2时，NH2-Cu-MOF无法使TMB氧化，体系颜色不发生变化，利用酶标仪测定体系在652nm处的紫外为无吸收，当在体系中存在TMB与H2O2时，随着加入到体系中NH2-Cu-MOF体积的增加而产生更深的颜色变化，这是因为体系中的H2O2被加入的NH2-Cu-MOF催化产生羟基自由基，而体系中存在的NH2-Cu-MOF越多，产生羟基自由基的量也就越大，在同一时间内能够氧化TMB产生的TMB+的量也就越多，用肉眼观测到的颜色就越深，利用酶标仪测定时得到的吸光度也就越高，结果表明NH2-Cu-MOF具有POx模拟酶活性能够催化H2O2产生羟基自由基进而氧化底物。
基于NH2-Cu-MOF检测次黄嘌呤的原理：基于NH2-Cu-MOF构建的荧光传感器检测Hx传感器主要是依靠材料的POx模拟酶活性与荧光特性导致传感体系荧光变化的强度对Hx浓度进行测定，Hx在次黄嘌呤氧化酶的酶解作用下生产UA与H2O2，此时加入NH2-Cu-MOF催化H2O2产生羟基自由基从而氧化加入到体系中的邻苯二胺(OPD)生成DAP，产物DAP在材料的荧光发射峰区域具有紫外吸收，当体系在338nm处激发时，由于DAP的存在使得材料的荧光被猝灭而无法被仪器测得，Hx的浓度越高，生成的DAP也就越多，使得体系荧光被猝灭的越强，因此可以根据体系在425nm处的荧光强度对Hx的进行定量，因为不同用量的材料能够产生产出的催化效果不同，但是因为体系中能够产生的H2O2浓度是有限的，同时因为体系的荧光源自NH2-Cu-MOF，所以在尽可能的降低背景信号的同时需要保持最大的催化活性，如图3(A)，当材料体积达到40L时，荧光猝灭效率达到平台期，因此选定NH2-Cu-MOF(200 g/mL)的用量为40L，同时为了降低传感器的成本，还优化了XOD(0.1U·mL-1) 的体积和OPD的浓度，如图3B和C所示，选择20L的XOD(0.1U/mL)和2mM 的OPD，优化H2O2(由Hx与XOD反应产生)和OPD被氧化产生DAP的反应时间，如图3D所示，荧光强度随着时间的延长而降低，并且分别在40min和 15min后达到平台，因此选择40min作为催化H2O2产生羟基自由基的时间，并且选择15min作为氧化OPD的时间，由此，传感器检测Hx浓度的反应条件已经完成，下一步便是利用构建的传感器建立一条检测Hx浓度的工作曲线。
由于鱼肉中的成分比较复杂，欲利用所设计的传感器用于检测鱼肉中的 Hx则需要考察传感器对Hx检测的选择性，以确定传感器是否合适进行这一项工作，我们选择与Hx共存于鱼肉中的葡萄糖(Glu，1mM)、精氨酸(LA，0.5 mM)、抗坏血酸钠(AA，0.5mM)尿酸(UA，5mM)、丙氨酸(Ala，1mM)、色氨酸(Tyr，1mM)、K+(1mM)、Na+(1mM)、Mg2+(1mM)和Zn2+(1mM) 为干扰物质，如图4所示分别是传感器的选择性(A)与抗干扰能力研究(B)，从图中可以得出构建的传感器具有很好的选择性，同时，鱼肉中的共存组分对传感器检测Hx并不会产生多大的影响，传感器具有很好地抗干扰能力，主要是因为传感器在设计上分为两个部分进行，对于目标物端，因为XOD只会将Hx水解产生H2O2，而其他组分则不会发生反应，同时，诸如蛋白与氨基酸等，由于这些组分并不会与NH2-Cu-MOF反应，因此避免了鱼肉中与Hx共存物质对传感器的影响。
为了探究所构建的传感器在鱼肉中Hx检测的实际应用价值，提取了鱼肉中Hx后，先用HPLC对鱼肉中的Hx进行测定，利用HPLC建立的检测Hx的标准曲线，测得如图5所示结果，实验用鱼肉样品中Hx的浓度为803μM，从鱼肉中提取到Hx后直接将样品替代Hx加入到检测体系中测定鱼肉中Hx的浓度，并与HPLC测定的数值进行比较，同时，通过加标方式进一步确认传感器对于实际样中Hx的加标回收率，如图6所示，从表中得到传感器Hx的回收率在97.28-103.18％之间，结果表明该传感器适用于鱼肉样品中Hx活性的检测。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，包括氨基修饰的2D-MOF材料的合成和金属有机骨架材料在检测鱼肉中次黄嘌呤的应用，其特征在于：所述氨基修饰的2D-MOF材料的合成方法，具体包括以下步骤：
S1、首先将30mg的有机配体氨基对苯二甲酸溶解于6mL的DMF与3mL乙腈的混合溶剂中作为试管的底层；
S2、在底层的上方是用3mL的DMF与3mL的乙腈混合均匀的连接层，而最上层则是溶解有30mg Cu(NO3)2的3mLDMF与6mL乙腈的混合溶剂，因为混合溶剂中DMF的密度较乙腈大，因此三层溶液会出现分层，但是会随着时间而混合均匀；
S3、在三层溶剂混合时，有机配体与金属中心在连接层进行自组装而得到NH2-Cu-MOF材料；
S4、整个合成过程需要在40℃条件下静置24h，最后收集试管中的材料，利用DMF和二氯甲烷分别清洗三次，以除去材料结构中的溶剂分子，最后将材料在80℃真空条件下烘干备用。
2.金属有机骨架材料在检测鱼肉中次黄嘌呤的应用，其特征在于：具体包括以下步骤：
T1、首先将合成的金属有机骨架材料构建成传感器，然后选择测定腐败鱼肉中Hx的浓度，从超市中购买鱼肉后，在冰箱中放置1个月后取出进行实验；
T2、首先取鱼肉5.0g加入30mL三氯乙酸超声30min进行提取，然后加入在10000r/min转速下离心10min，取上清液将pH调至7.0后作为样品备用；
T3、将调节pH后的上清液当做Hx直接加入到检测体系中，观测体系荧光发射峰的信号强度，构建传感器检测Hx的工作曲线，根据建立的标准曲线确定鱼肉中Hx的活性，并利用HPLC检测鱼肉中的Hx浓度作为参考值。
3.根据权利要求1所述的检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，其特征在于：所述合成材料用的玻璃仪器都先在碱缸中浸泡60min，取出后用自来水冲洗干净，再超声清洗10min，然后用二次水冲洗干净以后烘箱85℃烘干备用。
4.根据权利要求1所述的检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，其特征在于：所述材料的合成在25mL，半径为0.75cm的玻璃试管中进行。
5.根据权利要求2所述的检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，其特征在于：所述在确定传感器最优的反应条件之后，直接利用所设计的传感器建立一条检测Hx的工作曲线，并用以考察传感器检测Hx的线性区间与检测限。
6.根据权利要求1所述的检测鱼肉中次黄嘌呤的金属有机骨架材料的合成及应用，其特征在于：所述步骤T3中将上清液当做Hx直接加入到检测体系中进行反应，具体包括以下步骤：
a1、先将不同浓度的Hx与0.1U/mL次黄嘌呤氧化酶在25℃的摇床中反应40min后加入50L，200g/mL的NH2-Cu-MOF与20L Tris-HCl并继续在25℃的摇床中反应40min后加入邻苯二胺反应15min用Tris-HCl补充体系体积至200L；
a2、测定体系的荧光，在335nm处激发，获得400-600nm区域的发射峰，得到浓度Hx的荧光发射峰强度，由此构建传感器检测Hx的工作曲线。
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