CN110412288A - 针对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的SRM/MRM测定 - Google Patents

针对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的SRM/MRM测定 Download PDF

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Abstract

本发明提供了来自丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B‑raf(BRAF)的具体的肽和这些肽的衍生电离特性，其特别有利于通过选择反应监测(SRM)质谱或也可称作多反应监测(MRM)质谱的方法直接定量已经在福尔马林中固定的生物样品中的BRAF蛋白质。这类生物样品是经化学保藏和固定的，该生物样品选自使用含有试剂/固定剂的甲醛处理的组织和细胞，包括福尔马林固定的组织/细胞、福尔马林固定/石蜡包埋(FFPE)的组织/细胞、FFPE组织块和来自那些块的细胞，以及经福尔马林固定和或石蜡包埋的组织培养细胞。使用Liquid Tissue试剂和方案从该生物样品中制备蛋白质样品并通过在蛋白质样品中定量至少一种或多种所描述的肽来使用SRM/MRM质谱的方法在Liquid Tissue样品中定量BRAF蛋白质。这些肽在其以修饰的或未修饰的形式存在时可被定量。BRAF肽的修饰的形式的一个示例是肽序列内酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸和/或其他氨基酸残基的磷酸化。

Description

针对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的SRM/MRM测定
相关申请
本申请是申请号为201580035587.2、申请日为2015年07月13日、享有申请日为2014年07月11日的申请号为US62/023,615的美国在先申请优先权的，发明名称为“针对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的SRM/MRM测定”的中国发明专利申请的分案申请。
引言
提供了来源于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(其也称作原癌基因B-Raf、p94、v-Raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1和BRAF，并在本文中称作“BRAF”)的亚序列的特定肽。各种肽的肽序列和碎片/过渡离子可用于基于质谱的选择性反应监测(SRM)测定中，其也称为多反应监测(MRM)测定，且在本文中称作SRM/MRM。描述了用于BRAF蛋白质的SRM/MRM定量分析的肽的用途。
可使用该SRM/MRM测定来测量来自BRAF蛋白质的一种或多种特异性肽的相对或绝对定量水平，并由此提供通过质谱测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制备物中BRAF蛋白质的总量的方法。
更具体地，该SRM/MRM测定可直接测量由从诸如福尔马林固定的癌症患者组织的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的那些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利第7,473,532号中，其内容通过引用全文纳入本文。该专利描述的方法可使用获自表达病理学公司(ExpressionPathologyInc.)(马里兰州罗克维尔)的试剂和方案方便地进行。
可最广泛且有利地获得的来自癌症患者组织的组织形式是福尔马林固定、石蜡包埋的组织。对手术移出的组织进行甲醛/福尔马林固定是迄今为止世界范围内最常见的保存癌症组织样品的方法且是标准病理学实践中已经接受的常规方法。甲醛水溶液被称作福尔马林。“100％”福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％或37重量％)组成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的稳定剂，通常为甲醇。保藏组织的最常用方式是将整个组织在通常称为10％中性缓冲福尔马林的甲醛水溶液中长时间(8小时至48小时)浸泡，接着在室溫下将固定的整个组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。
SRM/MRM测定的结果可用于关联自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如癌症组织样品)内BRAF蛋白质的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断和预后信息，而且容许医师或其它医疗专业人员更精确地确定用于患者的适当疗法。提供关于患病组织或其他患者样品中蛋白质表达水平的诊断、预后和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用于诊断癌症的阶段或程度并确定患者最可能应答的治疗剂。
发明内容
本发明所述的测定测量来自BRAF蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且可测量来自BRAF蛋白质的特定修饰的肽的绝对或相对水平。修饰的示例包括可能在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。
BRAF蛋白质的相对定量水平通过SRM/MRM方法来确定，通过例如比较不同样品中单个BRAF肽的SRM/MRM特征峰面积(signature peak area)(例如，特征峰面积或积分的片段离子强度)来确定。或者，在各种肽具有其自己的特异性SRM/MRM特征峰的情况下，可以比较多种BRAF特征肽的多个SRM/MRM特征峰面积，从而确定一种生物样品中的相对BRAF蛋白质含量并将其与一种或多种额外或不同的生物样品中的BRAF蛋白质含量比较。以此方式，可在相同实验条件下跨越两个或多个生物样品，相对于相同的一种或多种BRAF肽来确定来自BRAF蛋白质的一种或多种特定肽的含量并从而确定BRAF蛋白质的含量。另外，确定单一样品内来自BRAF蛋白质的一种或多种给定肽的相对定量的方法可以是通过SRM/MRM方法比较该肽的特征峰面积与同一来自生物样品的蛋白质制备物中的来自不同的一种或多种蛋白质的其他和不同的一种或多种肽的特征峰面积。以此方式，通过同一样品内相对于一种肽的另一种肽来确定来自BRAF蛋白质的特定肽的含量并从而确定BRAF蛋白质的含量。这些方法能够进行样品之间或样品内单个或多个来自BRAF蛋白质的肽相对于另一个或多个肽的定量，其中通过特征峰测定的含量彼此相对，这与来自生物样品的蛋白质制备物中BRAF肽的绝对重量:体积或重量:重量含量无关。不同样品之间单个特征峰面积的相对定量数据可标准化至每个样品中所分析的蛋白质含量。可跨越来自单个样品中同时存在的BRAF蛋白质和多个蛋白质的许多肽和/或跨越许多样品来进行相对定量，从而了解相对于其他肽/蛋白质的一种肽/蛋白质的相对蛋白质含量。
BRAF蛋白质的绝对定量水平通过例如SRM/MRM方法确定，通过该方法将来自在一种生物样品中的BRAF蛋白质的单个肽的SRM/MRM特征峰面积与掺入的(spiked)内标物的SRM/MRM特征峰面积相比较。在一个实施方式中，该内标物为合成形式的完全相同的BRAF肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成这类同位素标记的内标物，使得通过质谱分析时其产生可预测且一致的SRM/MRM特征峰，其与天然BRAF肽特征峰不同且截然不同并因此可用作比较峰。因此，当内标物以已知含量掺入来自生物样品的蛋白质或肽制剂中并通过质谱分析时，将天然肽的SRM/MRM特征峰面积与内标肽的SRM/MRM特征峰面积相比较，且该数值比较显示来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。片段肽的绝对定量数据根据每种样品中所分析的蛋白质的含量来显示。绝对定量可跨越单个样品中同时存在的许多肽(且因此许多蛋白质)和/或跨越许多样品进行，从而了解单个生物样品中和整个单个样品的组中的绝对蛋白质含量。
该SRM/MRM测定方法可用于辅助诊断例如直接位于患者来源的组织如福尔马林固定的组织中的癌症的阶段和/或患者预后，并辅助确定哪种治疗剂将最有利地用于治疗该患者。对经由手术(如部分或全部肿瘤的治疗性移出)或经由为了确定疑似疾病的存在与否而进行的活检方法从患者移出的癌症组织进行分析以确定该患者组织中是否存在特定的一种或多种蛋白质以及存在何种形式的蛋白质。此外，可确定一种蛋白质或多种蛋白质的表达水平并将其与在健康组织中发现的“正常”或参考水平相比较。在健康组织中发现的蛋白质的正常或参考水平可来源于例如没有癌症的一个或多个个体的相关组织。或者，可通过分析未受癌症影响的相关组织来获得具有癌症的个体的正常或参考水平。
蛋白质水平(例如BRAF水平)的测定还可用于通过BRAF水平诊断具有癌症的患者或受试者中癌症的阶段和提供相关预后信息。单个BRAF肽的水平定义为单位的所分析蛋白质裂解物总量中通过SRM/MRM测定确定的肽的摩尔含量。可通过关联BRAF蛋白质(或BRAF蛋白质的片段肽)的水平与正常组织中观察到的水平来使用BRAF相关的信息帮助确定癌症的阶段或等级和/或患者预后。一旦确定了癌症的阶段和/或等级和/或BRAF蛋白质表达特性，则可将该信息与经开发以特异性治疗癌症组织的治疗剂(化学和生物的)的列表相匹配，该癌症组织的特征是例如所测定的一种或多种蛋白质(例如BRAF)的异常表达。治疗剂维罗非尼(Vemurafenib)和索拉非尼(Sorafenib)可具体用于靶向表达BRAF的癌细胞。其他BRAF抑制剂包括GDC-0879、PLX-4720、达拉菲尼(dabrafenib)和LGX818。匹配来自BRAF蛋白质测定的信息与特异性靶向例如BRAF蛋白质或表达该蛋白质的细胞/组织的治疗剂列表定义了治疗疾病的所谓个性化用药方法。本发明所述的测定方法使用来自患者自身组织的蛋白质的分析作为诊断和治疗决定的来源，从而形成个性化用药方法的基础。
附图简要说明
图1(A至C部分)显示来自BRAF蛋白质的单个肽的SRM/MRM测定的示例，其在来自福尔马林固定的生物样品的Liquid Tissue裂解物上进行，且BRAF肽的定量在三重四极质谱上进行。显示了如何测量已在福尔马林中固定的生物样品中该肽的具体特性。
发明详述
原则上，例如通过使用特异性已知的蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化来制备的来源于BRAF蛋白质的任何预测的肽均可用作替代性报告子以使用基于质谱的SRM/MRM测定确定样品中BRAF蛋白质的丰度。类似地，也可潜在地使用已知在BRAF蛋白质中潜在被修饰的位点处含有一个氨基酸残基的任何预测的肽序列来测定样品中BRAF蛋白质的修饰程度。
BRAF片段肽可通过多种方法来产生，包括使用在美国专利7,473,532中提供的LiquidTissue方案。LiquidTissue方案和试剂能够通过对组织/生物样品中的蛋白质进行蛋白水解消化来由福尔马林固定的石蜡包埋组织生成适用于质谱分析的肽样品。在LiquidTissue方案中，将组织/生物制备物在缓冲液中加热延长的一段时间(例如，约80℃至约100℃，持续约10分钟至约4小时的时间)以逆转或释放蛋白质交联。所采用的缓冲液为中性缓冲液(例如，基于Tris的缓冲液或含有去垢剂的缓冲液)。热处理后，将组织/生物样品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞内蛋白酶Lys-C的一种或多种蛋白酶处理足以破坏所述生物样品的组织和细胞结构并使该样品液化的时间(例如，在37℃至65℃的溫度下持续30分钟至24小时的时间)。加热和蛋白水解的结果为液态可溶性可稀释的生物分子裂解物。
令人惊讶的是，发现来自BRAF蛋白质的许多潜在肽序列并不适合在基于质谱的SRM/MRM测定中使用或者在基于质谱的SRM/MRM测定中使用时是失效的，其原因目前不明。对于来源于福尔马林固定的组织的肽而言尤其如此。由于不可能预测最适合MRM/SRM测定的肽，因此必须通过实验在实际的LiquidTissue裂解物中鉴定修饰的和未修饰的肽以开发针对BRAF蛋白质的可靠且准确的SRM/MRM测定。不希望受任何理论约束，但认为一些肽可能例如难以通过质谱检测，因为它们不会良好地电离或生成与其它蛋白质不同的片段。肽也可能无法在分离(例如，液相色谱)中良好地解析，或者附着到玻璃或塑料器具上。
在本发明的多个实施方式中发现的BRAF肽(例如，表1和/或表2)通过蛋白酶消化复杂的LiquidTissue裂解物内的所有蛋白质而来源于BRAF蛋白质，该裂解物由从福尔马林固定的癌症组织中取得的细胞制备。除非另外指出，否则在各种情况下，该蛋白酶都为胰蛋白酶。LiquidTissue裂解物随后通过质谱分析以确定通过质谱检测并分析的来源于BRAF蛋白质的那些肽。用于质谱分析的具体优选的肽亚组的鉴定基于：1)在LiquidTissue裂解物的质谱分析中电离的来自蛋白质的一种或多种肽的实验确定，和2)肽在制备LiquidTissue裂解物中使用的方案和实验条件下继续存在的能力。后一性质的范围不仅是肽的氨基酸序列，而且是肽内的修饰的氨基酸残基在样品制备期间以修饰的形式继续存在的能力。
从福尔马林(甲醛)固定的组织中直接取得的细胞的蛋白质裂解物使用LiquidTissue试剂和方案制备，LiquidTissue试剂和方案要求经由组织显微解剖将细胞收集到样品管中，接着在LiquidTissue缓冲液中对细胞加热延长的一段时间。一旦负面地影响到福尔马林诱导的交联，则使用蛋白酶(例如胰蛋白酶，但也可使用其他蛋白酶)以可预测的形式消化组织/细胞至完全消化。通过用蛋白酶消化完整的多肽将各蛋白质裂解物而转化成肽的集合。分析(例如，通过离子阱质谱)各LiquidTissue裂解物以对肽进行多重全局性蛋白组学研究，其中数据表示为来自各蛋白质裂解物中存在的所有细胞蛋白质的可通过质谱鉴定的尽可能多的肽的鉴定结果。通常采用离子阱质谱或能够进行全局性概要分析的另一形式的质谱来鉴定来自单一复杂蛋白质/肽裂解物的尽可能多的肽。但可优选使用离子阱质谱对肽进行全局性概要分析(global profiling)的最佳的质谱形式。尽管可在包括MALDI、离子阱或三重四极质谱的任何类型的质谱上开发并进行SRM/MRM测定，但优选使用三重四极仪器平台进行SRM/MRM测定。该类型的质谱是用于分析非常复杂的蛋白质裂解物中单个分离的靶标肽的合适仪器，上述非常复杂的蛋白质裂解物由来自一个细胞内含有的所有蛋白质的数十万至数百万种单个肽组成。
一旦在所采用的条件下在单一裂解物的单一MS分析中鉴定出尽可能多的肽，则整理肽的列表并将其用于确定在该裂解物中检测到的蛋白质。对于多种Liquid Tissue裂解物重复该过程，并将非常大的肽列表整理成单一数据集。可将该类型的数据集视为代表可在分析的生物样品类型中(蛋白酶消化之后)、特别是在生物样品的LiquidTissue裂解物中检测到的肽，且因此包括诸如BRAF蛋白质的具体蛋白质的肽。
在一个实施方式中，鉴定为可用于确定BRAF蛋白质的绝对或相对含量的BRAF胰蛋白酶肽包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，其全部列于表1。那些肽各自在由福尔马林固定的石蜡包埋组织制备的LiquidTissue裂解物中通过质谱检测。因此，各肽均为用于开发人生物样品中BRAF蛋白质的定量SRM/MRM测定的候选物，该BRAF蛋白质包括直接在福尔马林中固定的患者组织中的BRAF蛋白质。
表1
表1中列出的BRAF胰蛋白酶肽是从包括前列腺、结肠和乳腺的不同人类器官的多种不同福尔马林固定的组织的多种LiquidTissue裂解物中检测到的。那些肽各自被视为可用于福尔马林固定的组织中的BRAF蛋白质的定量SRM/MRM测定。这些实验的进一步数据分析表明，并没有优先观察到来自任何特定器官位点的任何特定肽。因此，这些肽可用于对来自来源于任何生物样品或体内的任何器官位点的任何福尔马林固定的组织的LiquidTissue裂解物进行BRAF蛋白质的SRM/MRM测定。
为了对来源于BRAF蛋白质的各种肽最有效地实施SRM/MRM测定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。该额外信息可用于引导并指导质谱(例如，三重四极质谱)对特异性靶标肽进行正确且集中的分析，从而可有效地进行测定。
关于靶标肽总体和关于特定BRAF肽的额外信息可包括该肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种或更种。表2显示对于表1中列举的两(2)种BRAF肽而言可用于开发针对BRAF蛋白质的SRM/MRM测定的额外肽信息。可制备、获得针对表2中作为示例显示的两(2)种BRAF肽进行描述的类似额外信息并将其应用到表1中包含的其它肽的分析中。
表2
下文所述的方法用于：1)鉴定可用于BRAF蛋白质的基于质谱的SRM/MRM测定的来自BRAF蛋白质的候选肽，2)针对来自BRAF蛋白质的靶标肽开发单个SRM/MRM测定或多种SRM/MRM测定以进行匹配，和3)将定量测定应用于癌症诊断和/或最佳疗法的选择。
测定方法
1.BRAF蛋白质的SRM/MRM候选片段肽的鉴定：
a.使用一种或多种蛋白酶(可能包括或可能不包括胰蛋白酶)消化蛋白质，从而由福尔马林固定的生物样品制备LiquidTissue蛋白质裂解物
b.在离子阱串联质谱上分析LiquidTissue裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自BRAF蛋白质的所有片段肽，其中单个片段肽不含任何诸如磷酸化或糖基化的肽修饰
c.在离子阱串联质谱上分析LiquidTissue裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自带有诸如磷酸化或糖基化残基的肽修饰的BRAF蛋白质的所有片段肽
d.可测量由完整的全长BRAF蛋白质通过具体消化方法可能产生的所有肽，但用于开发SRM/MRM测定的优选肽为在由福尔马林固定的生物样品制备的复杂LiquidTissue蛋白质裂解物中通过质谱直接鉴定的那些
e.在分析来自福尔马林固定的生物样品的LiquidTissue裂解物时将在患者组织中特异性修饰(磷酸化、糖基化等)并在质谱中电离化且因此被检测的肽鉴定为用于测定BRAF蛋白质的肽修饰的候选肽
2.来自BRAF蛋白质的片段肽的质谱测定
a.将针对LiquidTissue裂解物中鉴定的单个片段肽的三重四极质谱上的SRM/MRM测定应用于来自BRAF蛋白质的肽
i.针对包括但不限于以下实验的最佳色谱条件确定片段肽的最佳保留时间：凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反向液相色谱、高效液相色谱或反向高效液相色谱
ii.确定肽的单同位素质量、各肽的前体电荷状态、各肽的前体m/z值、各肽的m/z过渡离子和各片段肽的各过渡离子的离子类型以开发用于各肽的SRM/MRM测定。
iii.随后可使用来自(i)和(ii)的信息在三重四极质谱上进行SRM/MRM测定，其中各肽均具有特征性且独特的SRM/MRM特征峰，该特征峰精确地限定在三重四极质谱上进行的独特的SRM/MRM测定
b.进行SRM/MRM分析使得来自SRM/MRM质谱分析的独特SRM/MRM特征峰面积的函数形式的所检测的BRAF蛋白质的片段肽的含量可指示特定蛋白质裂解物中BRAF蛋白质的相对含量和绝对含量。
i.相对定量可通过以下实现：
1.通过比较以下数值来确定BRAF蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的LiquidTissue裂解物中检测到的给定BRAF肽的SRM/MRM特征峰面积与来自至少第二、第三、第四或更多的福尔马林固定的生物样品的至少第二、第三、第四或更多的Liquid Tissue裂解物中相同BRAF片段肽的相同SRM/MRM特征峰面积
2.通过比较以下数值来确定BRAF蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的LiquidTissue裂解物中检测到的给定BRAF肽的SRM/MRM特征峰面积与由来源于不同且单独的生物来源的其它样品中的其它蛋白质的片段肽发展的SRM/MRM特征峰面积，其中针对肽片段的两种样品之间的SRM/MRM特征峰面积的比较标准化至各样品中分析的蛋白质的含量。
3.通过比较以下数值来确定BRAF蛋白质的增加或减少的存在量：给定BRAF肽的SRM/MRM特征峰面积与来自福尔马林固定的生物样品的相同LiquidTissue裂解物内的不同蛋白质来源的其它片段肽的SRM/MRM特征峰面积，从而将BRAF蛋白质的变化水平标准化至多种细胞条件下都不改变其表达水平的其它蛋白质的水平。
4.这些测定可应用于BRAF蛋白质的未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中以与确定未修饰的肽的相对含量相同的方式确定修饰的肽的相对水平。
ii.给定肽的绝对定量可通过比较以下数值来实现：来自单个生物样品中的BRAF蛋白质的给定片段肽的SRM/MRM特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白质裂解物中的内部片段肽标准物的SRM/MRM特征峰面积
1.内标物为测量中的BRAF蛋白质的片段肽的经标记的合成形式。将该标准物以已知量掺入样品中，并可单独地确定生物样品中的天然肽片段和内部片段肽标准物的SRM/MRM特征峰面积，接着比较两个峰面积
2.这可应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中这些修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以与确定未修饰的肽的绝对水平相同的方式来确定修饰的肽的绝对水平。
3.将片段肽定量应用于癌症诊断和治疗
a.进行BRAF蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明证实了患者肿瘤组织中的BRAF蛋白质表达与阶段/等级/状况的先前确定的关联性，如同在癌症领域中充分理解的那样
b.进行BRAF蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明与来自不同治疗策略的临床结果的关联性，其中该关联性已经在该领域中说明或可在将来说明(通过针对患者群或来自那些患者的组织的关联性研究)。一旦通过该测定证实了先前确立的关联性或将来得出的关联性，则该测定方法可用于确定最佳治疗策略
图1显示在来自福尔马林固定的生物样品的Liquid Tissue裂解物上进行的单一SRM/MRM测定的示例。开发针对单一肽的SRM/MRM测定以进行三重四极质谱上BRAF蛋白质的定量。通过在离子阱和三重四极质谱上分析所有BRAF肽来开发该BRAF肽(序列LLFQGFR)相关的特定且独特的特性并示于图1A。信息包括该肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、该前体的过渡m/z值和各鉴定的过渡离子的离子类型。该信息必须针对在来自福尔马林固定的样品/组织的Liquid Tissue裂解物中直接存在的每个和每一个候选SRM/MRM肽通过实验进行测定；原因在于，有趣的是，并非所有来自BRAF蛋白质的肽都可使用本发明所述的SRM/MRM在这里裂解物中检测，表明未被检测到的BRAF肽无法被视为开发用于定量来自福尔马林固定的样品/组织的Liquid Tissue裂解物中直接存在的肽/蛋白质的SRM/MRM测定的候选肽。
如图1B所示，在三重四极质谱上进行这一具体的SRM/MRM测定。该实验中的实验样品是从经福尔马林固定和石蜡包埋以作为组织替代品的细胞系中制备的Liquid Tissue蛋白质裂解物。来自该测定的数据显示存在针对福尔马林固定的样品中该BRAF肽的独特SRM/MRM特征峰。
图1C显示针对该肽的特定的过渡离子特性，其用于定量测量福尔马林固定的生物样品中的上述肽。这些数据显示该BRAF肽的绝对含量，其是每毫克分析的蛋白质裂解物中该肽摩尔含量的函数形式。基于福尔马林固定的患者来源的组织的分析对组织中BRAF蛋白质水平的评价可提供关于各特定患者的诊断、预后和治疗有关的信息。在一个实施方式中，本发明描述了一种测量生物样品中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)蛋白质水平的方法，其包括使用质谱检测和/或定量由所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种修饰和/或未修饰的BRAF片段肽的含量；和计算所述样品中修饰的或未修饰的BRAF蛋白质的水平；且其中该水平为相对水平或绝对水平。在一个相关实施方式中，定量一种或多种BRAF片段肽包括通过与添加的已知含量的内标肽比较来确定生物样品中各BRAF片段肽的含量，其中该生物样品中的各BRAF片段肽均与添加的具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。在一些实施方式中，该内标物为同位素标记的内标肽，其包含选自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合的一种或多种重稳定同位素。
本发明所述的测量生物样品中BRAF蛋白质(或作为其替代的片段肽)的水平的方法可用作患者或受试者中癌症的诊断和/或预后指标。在一个实施方式中，可通过关联(例如比较)组织中发现的BRAF蛋白质的水平与正常和/或癌性或癌前期组织中发现的BRAF蛋白质的水平来将该蛋白质水平的测量结果用于确定癌症的诊断阶段/等级/状况和/或预后状态。
因为核酸和蛋白质两者都可由相同的LiquidTissueTM生物分子制备物分析，所以可以由用于蛋白质分析的相同样品中的核酸生成关于疾病诊断和药物治疗判断的额外信息。例如，如果BRAF蛋白质由某些细胞以增加的水平表达，当通过SRM测定时，数据可提供关于细胞的状态及其不受控制地生长的潜在性、潜在的抗药性和癌症发展的信息。同时，可从相同的Liquid TissueTM生物分子制备物中存在的核酸中获得关于BRAF基因和/或核酸及其编码的蛋白质的状况的信息(例如，mRNA分子及其表达水平或剪接变化)，可在BRAF蛋白质的SRM分析的同时对其进行评价。可在BRAF蛋白质的SRM分析的同时对不来自BRAF且存在于相同生物分子制备物中的任何基因和/或核酸进行评价。在一个实施方式中，关于BRAF蛋白质和/或一种、两种、三种、四种或更多种额外的蛋白质的信息可通过检查编码那些蛋白质的核酸来评价。那些核酸可例如通过以下方法中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种检查：测序方法、聚合酶链式反应方法、限制性片段多态性分析、插入、缺失的鉴定，和/或是否存在突变的确定，包括但不限于单碱基对多态性、转换、颠换或其组合。
序列表
<110> 爱科谱迅病理研究公司 (Expression Pathology Inc)
<120> 针对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf (BRAF) 的SRM/MRM测定
<130> I58257LRH-43162
<150> 62/023,615
<151> 2014-07-11
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 1
Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu Leu Asp Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Thr Val Val Pro Ala Arg
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ile Gln Asp Gly Glu Lys
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Leu Leu Phe Gln Gly Phe Arg
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Asn Gln Phe Gly Gln Arg
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Asn Glu Val Gly Val Leu Arg
1 5
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ser Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asn Arg
1 5
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu Ala Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Thr Ser Lys
20
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Arg
1 5
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Thr Pro Ile Gln Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Val His
1 5 10

Claims (13)

1.一种用于检测和定量蛋白质消化物中的BRAF片段肽的含量的试剂在制备用于测量福尔马林固定组织的生物样品中BRAF酪氨酸激酶受体蛋白质BRAF水平的试剂中的应用，其中所述片段肽为如选自以下组成的组中的一种氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11所示的肽，且
其中所述BRAF片段肽的含量使用质谱进行检测和定量；且
其中所述水平是相对水平或绝对水平。
2.权利要求1所述的应用，其中，在检测和定量所述BRAF片段肽的含量之前对所述蛋白质消化物进行分级。
3.权利要求2所述的应用，其中所述分级的步骤选自液相色谱、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱。
4.权利要求1-3中任一项所述的应用，其中所述蛋白质消化物包括蛋白酶消化物。
5.权利要求4所述的应用，其中所述蛋白质消化物包括胰蛋白酶消化物。
6.权利要求1-3中任一项所述的应用，其中所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。
7.权利要求6所述的应用，其中使用的质谱模式是选择反应监测SRM、多反应监测MRM和/或多选择反应监测mSRM。
8.权利要求1-3中任一项所述的应用，其中所述组织是石蜡包埋的组织。
9.权利要求1-3中任一项所述的应用，其中所述组织获自肿瘤。
10.权利要求1-3中任一项所述的应用，其中定量所述BRAF片段肽水平包括比较一种生物样品中BRAF片段肽的含量与不同且单独的生物样品中相同BRAF片段肽的含量。
11.权利要求1-3中任一项所述的应用，其中定量BRAF片段肽水平包括通过与已知含量的添加的内标肽相比较来确定生物样品中所述BRAF片段肽的含量，其中所述生物样品中所述BRAF片段肽的含量与具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。
12.权利要求11所述的应用，其中所述内标肽是同位素标记的肽。
13.权利要求12所述的应用，其中所述同位素标记的内标肽包含选自18O、17O、34S、15N、13C、2H和其组合的一种或多种重稳定同位素。
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