CN110402967B - 金龟子绿僵菌菌株在制备防治灰霉病的药剂中的应用 - Google Patents
金龟子绿僵菌菌株在制备防治灰霉病的药剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于含有微生物真菌的杀生剂技术领域，具体涉及一种金龟子绿僵菌菌株在制备防治灰霉病的药剂中的应用。所述菌株具体为金龟子绿僵菌CQMa421菌株，该菌株对灰霉病的致病菌具有显著的抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于含有微生物真菌的杀生剂技术领域，具体涉及一种金龟子绿僵菌菌株在制备防治灰霉病的药剂中的应用。
背景技术
灰霉病是保护地蔬菜常见的病害之一。灰霉病不仅危害茄子，还危害西红柿、辣椒、黄瓜、韭菜、莴笋、生菜、花椰菜等。灰霉病是由一种灰葡萄孢真菌侵染而发病的。病斑上密生菌丝及菌核，菌丝或菌核上形成分生孢子。病菌以分生孢子或菌核在残存的病叶或地表越冬，成为来年的初侵染源。灰霉病主要危害花、果实、叶片，并以果实发病最常见，最严重。叶片染病会导致叶面形成近圆形或不规则圆形轮纹斑，初期为浅黄色或褐色水浸状，在湿度大的条件下病斑处会长出灰色霉状物。茎秆染病也可产生褐色水浸状病斑，发病初期产生水渍状小班，扩展后呈长椭圆形，淡褐色，在湿度大的条件下表面会产生灰白色霉层，有时病原菌会直接浸染茎基部，严重时病斑常常环绕茎部1周，使茎部腐烂、变细、坏死，最后导致整个植株萎蔫、坏死。花朵染病多发生在柱头、花瓣边缘，侵入后形成黄色或褐色病斑，后期向花托蔓延，严重时整朵花萎蔫、腐烂，长出霉层。果实染病症状分为4种类型：在幼果果蒂周围局部产生灰色霉层，进一步发展到果肩和其他部位；通过幼果柱头进行传染，呈浸状褐色病斑，逐渐扩大后呈黄褐色，表面产生灰色霉层，在适宜的条件下向果脐扩散；直接浸染萼片，引起果蒂部腐烂；果面发病，健果因与病果紧贴在一起而染病，产生黑色颗粒状菌核，以后逐步失水、变色、腐烂(“温室茄子灰霉病及防治方法”，刘明旭，现代农业，2013年第10期，第48页第1段第1行至第5段第8行，公开日2013年12月31日；“棚室蔬菜灰霉病的发生特点与防治原则”，薛玉华，山东农药信息，2012年第1期，第47页摘要第1行，公开日2012年12月31日；“蔬菜灰霉病的发生于防治”，罗兰媛，长江蔬菜，1988年第5期，第29页摘要第1行，公开日1988年12月31日)。
灰霉病从苗期至株期均可发生，常造成大面积死苗和大幅度减产(“蔬菜灰霉病的发生于防治”，罗兰媛，长江蔬菜，1988年第5期，第29页摘要第1-2行，公开日1988年12月31日)。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备防治灰霉病的药剂中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备防治灰霉病的药剂中的应用。
所述防治是指物质具有的能够减轻或防止病原微生物危害作物的能力。
所述灰霉病是指由灰葡萄孢真菌(Botrytis spp.)侵染而引发的病害。
发明人在研究过程中意外发现，金龟子绿僵菌CQMa421菌株对灰霉病的致病菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)具有显著的抑制作用。
进一步，所述药剂包括金龟子绿僵菌CQMa421分生孢子、溶剂油、乳化剂和稳定剂。
进一步，所述药剂中金龟子绿僵菌分生孢子含量为69-100亿个孢子/g。
进一步，所述溶剂油包括菜籽油、芝麻油、玉米油或花生油等植物油。
进一步，所述乳化剂包括梨醇酐单油酸脂、失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚、脂肪醇与环氧乙烷缩合物、聚氧乙烯脂肪酸酯、三乙醇胺单油酸脂、蓖麻油和环氧乙烷缩合物中的一种或多种。
进一步，所述乳化剂的用量为药剂总质量的5％-15％。
进一步，所述稳定剂包括2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑和三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯。
进一步，2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑和三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯的质量比为3:1～5:1。
进一步，所述稳定剂的用量为药剂总质量的1％-5％。
进一步，所述稳定剂的用量为药剂总质量的1％-3％。
本发明的目的还在于保护防治灰霉病的药剂，所述药剂包括金龟子绿僵菌CQMa421分生孢子。
进一步，所述药剂还溶剂油、乳化剂和稳定剂。
进一步，所述药剂中金龟子绿僵菌分生孢子含量为69-100亿个孢子/g。
进一步，所述溶剂油包括菜籽油、芝麻油、玉米油或花生油等植物油。
进一步，所述乳化剂包括梨醇酐单油酸脂、失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚、脂肪醇与环氧乙烷缩合物、聚氧乙烯脂肪酸酯、三乙醇胺单油酸脂、蓖麻油和环氧乙烷缩合物中的一种或多种。
进一步，所述乳化剂的用量为药剂总质量的5％-15％。
进一步，所述稳定剂包括2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑和三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯。
进一步，2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑和三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯的质量比为3:1～5:1。
进一步，所述稳定剂的用量为药剂总质量的1％-5％。
进一步，所述稳定剂的用量为药剂总质量的1％-3％。
本发明的有益效果在于：
本发明的菌株对灰霉病的致病菌具有显著的抑制作用。
本发明的制剂对灰霉病具有良好的防效。
本发明的制剂有耐紫外照射、防效好等优点。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
室内离体叶片防效试验：
金龟子绿僵菌CQMa421菌株：由重庆大学基因工程中心分离、鉴定、保存，哈茨木霉菌Cx5(重庆大学基因工程研究中心，哈慈木霉菌对马铃薯晚疫病有较好抑制效果，见专利CN102732434A)。
病原菌株：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，从茄子灰霉病病茄上分离得到。将菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上(PDA)，28℃培养3天后备用。
供试植物：供试茄子品种为崖城红茄，易感灰霉病，取长势一致的相同部位茄叶，从茎基部剪下，洗净晾干，作为接种材料。
保护作用测定：将金龟子绿僵菌CQMa421和哈茨木霉菌Cx5分别挑接至1/4SDAY培养基平板上，28℃培养14天后收集分生孢子，利用灭菌0.1％wt吐温80溶液悬浮各分生孢子，通过镜检及稀释，将各菌株配制成1×107、2×107、4×107及8×107孢子/mL的孢悬液；将孢悬液分别随机喷洒在茄子叶片上，空白对照组喷施相同体积的无菌水，24h后用接种针在叶片相同部位制造相同的伤口。取直径7mm的菌碟接种于伤口处，菌丝面紧贴叶片，每处理6片茄叶，3次重复。离体叶片茎基部用无菌水浸湿的脱脂棉保湿，置于26℃、相对湿度大于90％的培养箱内培养5d后，测量叶片病斑长度和宽度，计算病斑面积。
治疗作用测定：将菌碟接种于叶片伤口处24h后，再均匀喷洒上述孢悬液，每处理6片茄叶，3次重复。离体叶片茎基部用无菌水浸湿的脱脂棉保湿，置于26℃、相对湿度大于90％的培养箱内培养5d后，测量叶片病斑长度和宽度，计算病斑面积。
防治效果(％)＝(空白对照组病斑总面积-处理组病斑总面积)/空白对照组病斑总面积×100％；
以上各组别除药剂不同外，其他处理方式相同。
表1对离体叶片上茄子灰霉病的保护作用及治疗作用防效测试结果
备注：表中数据为平均值±标准差(n＝3)，字母不同表示差异显著(p<0.05。
由表1可知，金龟子绿僵菌CQMa421菌株对离体叶片上灰霉病的保护作用及治疗作用防效突出，明显优于哈茨木霉菌Cx5。由此证明，本发明的菌株对灰霉病的致病菌的抑制作用显著。
实施例1
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯组成，两者重量比为9:1)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％wt。
所述油悬浮剂的制备方法具体为：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵干孢子粉干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例2
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯组成，两者重量比为7:1)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％。
所述油悬浮剂的制备方法具体为：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例3
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯组成，两者重量比为5:1)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％wt。
所述油悬浮剂的制备方法具体为：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例4
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯组成，两者重量比为3:1)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％wt。
所述油悬浮剂的制备方法具体为：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例5
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯组成，两者重量比为1:1)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％wt。
所述油悬浮剂的制备方法具体为：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例6
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯组成，两者重量比为1:3)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％wt。
所述油悬浮剂的制备方法具体为：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例7
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯组成，两者重量比为1:5)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，色拉油补足100％。
所述油悬浮剂的制备方法具体为：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例8
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯组成，两者重量比为1:7)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％wt。
制作方法：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例9
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯组成，两者重量比为1:9)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％。
制作方法：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例10
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂为2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％wt。
所述油悬浮剂的制备方法具体为：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
实施例11
一种含金龟子绿僵菌CQMa421的油悬浮剂，其中绿僵菌的含量为80亿分生孢子/克，添加6％wt失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚，1.5％wt稳定剂(稳定剂为三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯)，1％wt膨润土，0.8％wt白炭黑，用色拉油补足100％wt。
所述油悬浮剂的制备方法具体为：
将除绿僵菌孢子外的所有成分混合，经高速剪切混合均匀，再通过砂磨机砂磨2-3小时，使平均粒径达到1-5微米，加入绿僵菌干孢子粉，混匀后得到油悬浮剂。
制剂耐紫外照射能力测试试验：
将实施例1-11所制制剂用无菌水稀释800倍，至金龟子绿僵菌CQMa421孢子浓度为1×107孢子/毫升，取50uL孢悬液均匀涂布于1/4SDAY固体培养基上，分别于置于距40w的UVB紫外灯50cm的地方垂直照射1小时、2小时、3小时、4小时后，取出放入26℃恒温培养箱中培养16h，显微镜下统计萌发与未萌发孢子数，计算萌发率，每处理三个重复，结果如表2所示；
以上各处理组除药剂不同外，其他处理方式相同。
表2紫外照射不同时间后的萌发率结果
注：不同小写字母表示处理间差异显著(p<0.05)
由表2可知，实施例1-9的萌发率明显高于实施例10及实施例11。由此证明，在油悬浮剂加入2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯两种成分后的孢子耐紫外照射能力明显优于添加等量的单成分的油悬浮剂。且实施例4的萌发率明显优于实施例1-2和5-9。由此证明，2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯按照重量比3:1复配能够显著增强金龟子绿僵菌421孢子的抗紫外能力。
茄子灰霉病防治田间试验(重庆璧山)：
用实施例1-11的制剂及化学对照药剂开展茄子灰霉病田间试验，具体为：
于病害发生初期用药，每小区20平米，每处理4次重复。于药前、药后7天、14天及21天调查发病情况，计算发病叶片和病级，最终计算病级指数及防治效果，结果如表3所示；
以上各处理组除药剂不同外，其他处理方式相同。
病级指数＝[∑(各级病叶数×相对级数)÷(调查总叶数×9)]×100
校正防效＝[1-(空白区药前病级指数×处理区药后病级指数)÷(空白区药后病级指数×处理区药前病级指数]×100％。
表3田间防治茄子灰霉病防效
| 药剂 | 药后7d防效％ | 药后14d防效％ | 药后21d防效％ |
| 实施例1 | 48.26d | 52.22c | 39.20d |
| 实施例2 | 50.37d | 52.19c | 40.27d |
| 实施例3 | 65.30c | 70.21b | 59.31b |
| 实施例4 | 72.67b | 75.59b | 68.24a |
| 实施例5 | 70.15b | 65.23bc | 59.88b |
| 实施例6 | 61.28c | 59.99c | 60.81b |
| 实施例7 | 59.22c | 53.81bc | 35.21d |
| 实施例8 | 49.66d | 48.67c | 39.31d |
| 实施例9 | 47.20d | 53.59bc | 48.55c |
| 实施例10 | 28.88e | 34.82d | 19.97e |
| 实施例11 | 26.31e | 21.27d | 18.33e |
| 42.4％唑醚·氟酰胺SC | 81.25a | 86.24a | 73.19a |
备注：小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。
由表3可知，各实施例中实施例4的防效最高，实施例10和11的防效最低。由此证明，稳定剂由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑与三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯共同组成的制剂对茄子灰霉病的防效要明显优于单用某种稳定剂的制剂，且比例在3：1时效果最优。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.金龟子绿僵菌CQMa421菌株在制备防治灰霉病的药剂中的应用，所述药剂包括金龟子绿僵菌CQMa421分生孢子、溶剂油、乳化剂和稳定剂，所述稳定剂为由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑和三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯按照质量比3:1-5:1组成的组合物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药剂中金龟子绿僵菌分生孢子含量为69-100亿个孢子/g。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述乳化剂包括梨醇酐单油酸脂、失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚、脂肪醇-环氧乙烷缩合物、聚氧乙烯脂肪酸酯、三乙醇胺单油酸脂、蓖麻油和环氧乙烷缩合物中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述乳化剂的用量为药剂总质量的5%-15%。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乳化剂的用量为药剂总质量的5%-15%。
6.根据权利要求1、2或5所述的应用，其特征在于，所述稳定剂的用量为药剂总质量的1%-5%。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述稳定剂的用量为药剂总质量的1%-5%。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述稳定剂的用量为药剂总质量的1%-5%。
9.防治灰霉病的药剂，其特征在于，包括金龟子绿僵菌CQMa421分生孢子、溶剂油、乳化剂和稳定剂，所述稳定剂为由2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑和三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯按照质量比3:1-5:1组成的组合物。
10.根据权利要求9所述的防治灰霉病的药剂，其特征在于，金龟子绿僵菌分生孢子含量为69-100亿个孢子/g。
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