CN110382055A - 旋果蚊草根提取制备过程及对化妆品的利用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及旋果蚊草根提取的制备方法，涉及通过该方法直接获取的根部提取物，还涉及化妆品成分物，作为活性剂，至少一种根据本发明的方法获得的旋果蚊草根提取物。本发明的化妆品成分物能够应用于提神或消除疲劳的皮肤护理方法。

Description

旋果蚊草根提取制备过程及对化妆品的利用

技术领域

本发明涉及一种旋果蚊草根提取的制备方法，以及通过该方法直接获取的根部提取物。本发明还涉及一种化妆品成分物，作为活性剂，该组合物包含本发明中至少一种旋果蚊草根提取物和化妆品可接受的赋形剂。活性剂的应用，能通过激活代谢功能，为皮肤细胞带来活力。

背景技术

旋果蚊草(Filipendula ulmaria或Spiraea ulmaria L)，又名绣线菊，隶属蔷薇科草本植物，物种起源于欧洲。旋果蚊草是种植物，以其诸多益于健康的生物特性而为人所知。它的花具有消炎、利尿和发汗的属性，被草药师和消费者们广泛认可，是家庭制备的养生药草("养生茶"便是用此草的干花泡制而成)。

旋果蚊草的花序富含抗氧化合物(如酚类化合物、黄酮类化合物、抗坏血酸)，具有很强的抗氧活性(研究人士莉莉安·巴罗斯Lillian Barros、路易斯·卡布里塔LuisCabrita、米格尔·维拉斯·博阿斯Miguel Vilas Boas、安娜·玛丽亚·卡瓦略Ana MariaCarvalho、伊莎贝尔Isabel C.F.R.Ferreira等对其进行化学、生化和电化学检测，用其评估野生植物的化学物质和抗氧化活性，评估食品化学中的2011、127、1600-1608成分)。作为天然抗氧化剂的来源，该植物已被应用到化妆品成分物中。

US2003/0190300专利的应用，为我们揭示了影响肌肤和头发老化成分，其中就含有旋果蚊草叶、花、种子、茎或细枝的提取物。EP1029531的应用也公开了一种遏制皮肤老化的化妆品成分，其中也含有旋果蚊草种、花瓣或草根、叶茎的提取物。

皮肤是人体的第一道屏障，它保护器官不受温度、湿度和外界环境(如紫外线或污染物)的侵扰。

然而，过度的化学和物理刺激(暴晒、过多暴露在光线或紫外线下、压力和营养不良)会损害皮肤的正常功能，从而导致老化。因此，通过促进皮肤细胞的新陈代谢，尤其是细胞能量代谢来维持皮肤的更新和修复显得攸关重要。事实上，细胞的功能之一，就是将能量用来制造新的蛋白质，进行皮肤自养并排出废细胞物质，从而修复DNA(去氧核醣核酸)的损伤。

细胞中的能量来自基分子(如葡萄糖)，这些基分子通过ATP交织能量的三个生产周期转化而来。第一个周期是糖酵解，它的目的是产生ATP形式的因子能量，糖酵解包括将6碳葡萄糖分子逐渐氧化成两个3碳丙酸酯分子。能量结果如下：

葡萄糖+2ADP+2NAD++2Pi->2丙酮酸酯+2ATP+2NADH+2H++2H₂O。

合成后，1个葡萄糖分子制造2个丙酮酸酯分子、以及2个ATP分子和2个NADH。NADH的氧化也会通过氧化磷酸化而产生ATP分子。

因此，为了给皮肤、特别是紧张和疲惫状态下的皮肤注入活力、恢复弹性或进行排毒，增加生产ATP分子非常重要。

为了实现这一目标，申请人制定了一个能对旋果蚊草根进行提取的方法，根部在提取步骤前进行了激发处理。

根据本发明制备方法所获取的根部提取物，对皮肤细胞的能量代谢具有出乎意料的作用，它有助于防止压力与疲劳出现皮肤老化的迹象。事实上，申请人进行的试验表明，根部提取物对培养人类成纤维细胞中的糖酵解基因表达有所影响。

本发明的提取方法还可在根部不受损或不改变其生存寿命的状况下，对受激发部分进行连续提取，在溶液中最大化地提取有益分子。

发明内容

首先，本发明涉及旋果蚊草根提取的一种制备方法，方法包括下列几个步骤：

a)在离地的环境中培育旋果蚊草，尤其是悬空培育步骤，

b)植物根部激发步骤，

c)将经过b)步骤激发的根部进行浸渍，然后进入固体/液体提取步骤，

d)c)步骤所获提取物的收集步骤，

e)通过连续过滤(特别是通过纳米过滤和/或澄清过滤和/或消毒过滤)，对在d)步骤收集的提取物进行浓缩和/或澄清的步骤。

在本发明的上文中，我们提到"在离地的环境中培养旋果蚊草"，是指植物的根部在非土壤的环境中生长的培育方式。准确地说，离地栽培是植物根部长在与土壤分离的重组环境中，其培养基要定期地用植物专用营养液浇灌。

离地栽培技术不尽相同，比如那些需要富氧营养液的无基质环境系统，以及有基质的环境系统。无基质的环境系统，可以指营养液为非循环的、使用培养箱的水产养殖系统，即营养膜技术(N.F.T.)，其营养液在通过与空气交换的过程中充富了溶解氧，植物根部生长在悬空容器中，不与固体甚至不与液体接触，而通过雾气培育(喷雾器)来获取营养，营养溶存放在一个封闭的环境中。基质的环境系统，可以是分灌系统，其营养液渗透到下部的基质中，渗滤作用通过间断性灌溉将营养液分布在系统的表面，然后渗透到基质中。至于基质，可以是矿物或有机基质、中性或是如同砂质的惰性、粘土或是岩棉，也可以来自工业合成的基质。

我们提到的"植物空中培育"是一种离地栽培模式，植物根系生长在不接触固体、甚至不接触液体的环境中。根据一种特殊的操作方法，植物通过喷雾器的雾化方式来汲取营养，而营养液被存放在一个封闭的环境中。

通常，根据本发明的方法可将植物放在一些培育盘中，培育盘上方的植物暴露在空中，根部在培育盘下方，将培育盘放在排列成收集区的桌子上，收集洒在植物上的过剩液体，可将培育盘移到不同点的桌子上。

在a)步骤中，通过根部喷洒必需的矿物盐(氮-N、磷-P、钾-K)营养液来进行空中供给，以实现最大根系发育，获取有益分子的最大的浓度，同时不降低植物的生存寿命。内行人士根据自己的一般常识，懂得如何调整不同矿物盐的比例和浓度来以优化根部的发展，提高有益分子的浓度。这种情况下，营养溶液的矿物盐浓度在0.4至1.6mS/cm之间的低导电范围内，最理想为0.6至0.8mS/cm，这样有利于促进提取时颗粒分子的多样性。

激发植物根部的b)步骤包括如下：

·对植物根部使用溶液的步骤，该溶液中至少含有下列一种选择：盐、活性剂、溶剂、真菌或细菌激发子、茉莉花酸的衍生物，特别是甲基茉莉花酸、水杨酸、乙烯发生器、甲壳素、壳聚糖和/或其混合物，和/或

·对根部使用缺氮液的步骤，即氮含量低于通常被认为最适合植物特别是根部发育的含量，氮含量大大低于15％，不含氮更有利。这两个步骤按顺序进行或同步进行。

根部也可通过让植物吸收缺氮营养液来得到激发。缺氮营养供给的植物会产生"氮荒"，从而诱导植物的抗性反应。具体来看，本发明的缺氮溶液是种氮含量低于15％的溶液，最好能低于10％，低于8％更好，低于6％更有利，而低于5％、4％、3％、2％、1％，甚至含量为0％就更佳。

进行根部激发的b)步骤显著增加了根部的二次代谢物含量，从而有利于根部流出的代谢物流向选用于提取的溶液，而不会使植物完全失去生存力，这样可以重新生长和再次利用。换句话说，植物的激发步骤有助于促进有益分子的产生和分泌。

有利的做法是，b)步骤通过对植物喷洒或浸渍激发了根部，即从甲胺酸的衍生物中选择一种激发子，如甲基茉莉花、水杨酸和壳聚糖或用缺氮的N/P/K营养液，对植物的根部进行喷雾或喷洒。

根据本发明操作的特定模式，步骤b)是通过以下溶液选择对植物进行喷洒或浸渍的：

·甲基茉莉花酸溶液浓度为0.01M至1mM，0.1至200M更佳，

·水杨酸溶液浓度为1M至1mM，10至500M更佳，

·壳聚糖溶液浓度为0.002至1克/升，0.05至0.1克/升更有利，

·氮含量低于6％的N/P/K营养液，此溶液最好在植物根部进行喷洒或喷雾。

另外，用激发子溶液对根部进行激发的b)步骤，操作周期1至21天比较有利，最好是1至7天。

具体地讲，步骤b)通过用缺氮的N/P/K营养液对根部进行喷雾供养激发，此操作期为10天至8周，最好为3周。

b)步骤营养溶液的矿物盐浓度在0.4至1.6mS/cm的有利范围内，最好在0.6至0.8mS/cm之间，这样可促进提取物中有益分子的多样性。

从本发明方法的过程看，步骤b)是在步骤a)步骤之后进行的，但本发明方法的另一种具体做法是，步骤b)与步骤a)同时进行，将激发溶液与任何专业人士认可方法制成的营养液合并。

经过培育和激发的植物，在溶剂、PH值和提取时间的特定要求下，通过对根部浸渍进行c)阶段的固体/液体提取，以获取富含有益分子的提取物。固体/液体提取是种溶剂提取技术，涉及从固体物质中提取一种或多种化学物质，并可溶于溶液。提取是在溶剂中收集根部所含的代谢物，通过溶液与根部的接触(也称为浸泡步骤)并持续适当的时间，然后收集溶液中含有根部释放的有益分子。

在根据本发明的方法，经过b)步骤激发的根部进入固体/液体提取的c)步骤，该步骤也包括根部切割。

b)步骤浸渍激发根之后进行c)步骤的固体/液体提取，该步骤包括切割，即植物的根部被部分切下，收留根部，然后进行浸泡，将根放入含有预定PH值的溶液浸泡盘中，并保证预定的浸泡时间，然后将浸泡盘中的溶液收留起来。

改进的做法是，c)步骤激发根部后，在进入固体/液体提取的c)步骤之前，还有个附加的洗涤步骤，即用清水喷洒到植物上，这样就限制了溶剂浸泡阶段营养液或激发溶液把所含成分带到提取溶剂中。

另一个优先的做法是，将刚切割下的鲜根进行浸渍，即切割后不超过24小时，最好在切割后尽早浸渍，切下便浸渍最为理想。尤其是可使用含有适当PH值的溶液来浸渍新切下的根部，并持续适当的时间。还有一个优先可取的做法是，浸渍刚切下的根，可能是干根。另一个特别的做法是，根浸渍后再切、然后干燥，最后切碎。根的干燥可通过专业人士认可的任何适当办法进行，特别是通过将根部放在30°至60°的温度下烘烤4至48小时，而且最好在干燥的条件下进行。根的干燥操作可通过通风烤箱进行，根的研磨可用专业人士认可的任何适当办法进行，特别是使用球磨机或刀磨机进行切割研磨。

还有具体的一点，本发明的方法包括切根，将切下的根进行干燥，这些均在上述的根浸渍阶段前进行，根浸渍是通过干根和溶液来实现的。

根据完善的做法，本发明的c)阶段是将根部与二醇溶液接触(即浸泡)，特别是选自丙烯乙二醇、丙烷1.3二醇的二醇，即从生物源中获取丙烷1.3二醇、以及丙烷1.2二醇和丁二醇，形态为纯溶液或水性乙二醇，溶液中乙二醇含量占10％至99.9％，或占40％至90％，60％至85％为更好。

更具体地说，在根据本发明的方法中，固体/液体提取的c)步骤包含根部与丙烷1.2二醇或丙烷1.3二醇、即生物源中获取的丙烷1.3二醇的接触(浸泡)。

丙烷1.3二醇或三乙二醇的程式如下(I)：

上述的丙烷1.3二醇或三乙二醇，可通过专用人士熟知的化学合成技术制备，其制备方法在文献中有所描述，在市场上也可找到。

上述丙烷1.3二醇也可从植物源的原材料制成，例如，此类产品已作为生物丙二醇产品(ConnectChemicalsGmbH公司)在市场上销售。另一例子，丙烷1.3二醇也可通过将生物体在适当条件下通过发酵产生，尤其是大肠杆菌的转基因菌株。此类产品是产出的产品，然后按WO 2004/101479国际专利申请中描述的那样进行净化，并在品牌名下销售。

上述丙烷1.3二醇也可进行有机认证，比如COSMOS型。从植物原材料和/或将微生物进行生物发酵而获取的丙烷1.3二醇，被称之为"生物源丙烷1.3二醇"。

丙烷1.2二醇"或丙二醇程式如下(I I)：

根据本发明具体地讲，乙二醇具有酸性pH值特征，尤其是在固体/液体提取阶段使用时。具体说来，固体/液体提取阶段使用的上述乙二醇，其参数是pH值介于2和5之间，在2.5和5之间更好，介于2.5和4.5之间更佳，在3和4之间更理想。另一具体点，本发明的植物提取物的特点是pH值介于2.5和5之间，在3.5至4.5之间更佳，介于3.9和4.1之间更为理想。

使用具有酸性pH值的乙二醇，可促进上述乙二醇中有益化合物的溶解，并限制二次代谢物在提取过程中的化学作用或酶的降解。用于调节乙二醇或提取物pH值的酸物质，优先选项为磷酸、柠檬酸或盐酸。

具体说来，本发明方法的c)步骤包含根部与乙二醇的接触(浸泡)，时长在12至72小时之间，可以是24至72小时，更可以是24至48小时。

根浸渍所选的持续时间，是为了便于进行大量有益化合物的提取，同时不影响植物生存，也不会导致资源枯竭。因此，植物在切根步骤后，根据a)和b)步骤说明重新放回盘中培育，以便重新开始根部发展，通过二次代谢根系进行生产。

对于鲜根浸渍，鲜根重量与溶液量之比为每升溶液浸渍0.2kg根，以及每升溶液浸渍1kg根不等。

根据首选方法，本发明的旋果蚊草根提取制备法包括以下连续步骤:

a)旋果蚊草空中培育步骤，

b)激发植物根步骤，

c)b)阶段将激发过的鲜根切下并进行干燥后，在乙二醇中进行根浸渍和固体/液体提取的步骤，

d)收集在c)阶段获取的提取物，

e)可选的做法是，通过连续过滤(特别是通过纳米过滤和/或澄清过滤和/或消毒过滤)，对d)步骤收集的提取物进行浓缩和/或澄清。

在本发明的上下文中，"乙二醇根浸渍"所指的是上述定义的根浸渍，根部接触的溶液是从二丙二醇、丙烷1.3二醇、丙烷1,2二醇和丁二醇中选出的乙二醇。

根据更优先的方法，本发明制备旋果蚊草根提取物包括以下连续步骤:

a)旋果蚊草空中培育步骤,

b)激发植物根步骤，

c)通过用丙烷1.3二醇(特别是生物源丙烷1.3二醇)，将b)阶段经过激发和切下的鲜根进行浸渍，进行固体/液体提取步骤，

d)收集在c)阶段获取的提取物，

e)可选做法，通过连续过滤(特别是通过纳米过滤和/或澄清过滤和/或消毒过滤)对d)步骤收集的提取物进行浓缩和/或澄清。

本发明的方法包括一个附加的f)步骤，用以重新调整提取物溶剂含量，以达到含量至少60％，和/或调整提取物的pH值，使之达到2.5和5，介于3.5和4.5更有利，最好介于3.9和4.1。

具体地说，本发明的植物提取物特点是pH值介于2.5和5，优先值为3.5至4.5，更优先值为3.9至4.1。

优选做法是将提取物pH调至4，通过添加柠檬酸、将溶液中的丙烷1.3二醇含量、特别是生物源丙烷1.3二醇含量调至100％，直至v/v百分比为70±5％。pH和溶液含量的调整可在浓缩和澄清步骤前后进行。

本发明的方法，包括在植物提取处理过程中至少有个附加步骤，其选择如下：

·至少一次过滤，特别是纳米过滤和/或澄清过滤和/或消毒过滤，

·液体或固体提取，

·提纯，

·浓缩，

·根提取物去色。

这些处理方法均为行业人士熟知，这一步骤可获取旋果蚊草的最终提取物。

再则，本发明的目的是提取旋果蚊草根，即通过上述发明方法可能获取的根部提取物。

"干提取"是指将本发明实施过程所获提取物、通过将溶液完全蒸发进行干燥处理的步骤，干燥处理可根据行业人士已知的任何方法进行，尤其是在炎热和干燥的环境中进行。

本发明方法获取的旋果蚊草根干提取物，每升或每公斤提取出的重量为4至12克。

"仙鹤草素(Agrimoniin)"是指一种化合物，其分子量为1871,282克/摩尔，一般方程式是C₈₂H₅₄O₅₂，其结构可见纽约科学院年鉴第1401(2017)166-180期Grochowski的《对仙鹤草素(Agrimoniin)的全面回顾》一文中的图1。

本发明方法获取的旋果蚊草根提取物，所含的仙鹤草素浓度是根据用色谱液分析出的色谱图仙鹤草素峰值区测量而确定的，上述根部提取物的测定使用的是质谱测定法。在由100mg/L水合儿茶素组成的标准溶液UPLC-MS分析的色谱图上，仙鹤草素浓度峰值区与该分析图的峰值相近。因此，在"水合儿茶素当量"中，仙鹤草素的定量等于：

本发明方法获取的旋果蚊草根提取物含有仙鹤草素，其含量至少相当于水合儿茶素重量的6％，优先含量至少8％、10％、12％或15％，达到20％更好，视干提取物的总重量而定。

本发明的第三个用途是化妆品成分物。作为活性剂，组合物包含至少一种本发明的旋果蚊草根提取物，以及至少一种化妆品可接受的赋形剂。

根据本发明，化妆品成分物最佳的下草药模式、植物制剂形态及使用剂量，可根据某化妆品科目处理机构通常使用的标准来确定，比如皮肤的类型。

本发明的化妆品成分物大多适于局部使用，组合物化妆品形式有奶霜、乳液、化妆水、胶质啫喱、精华素、喷雾、泡沫摩丝、溶液、软膏、乳剂、贴片或面膜。

本发明的化妆品成分，包括至少一种根据草药类所需而选用的化妆品可接受的赋形剂。本发明的化妆品成分物还可包括至少一种业内人士熟知的添加剂，如增稠剂、防腐剂、香水、染料、化学或矿物过滤、润肤剂、温泉水等。

化妆品可接受的赋形剂选择有聚合物、硅化合物、表面活性剂、流变剂、保湿剂、渗透剂、油性成分、蜡、乳化剂、成膜剂、香水、电解质、pH调节剂、抗氧化剂、防腐剂、染料、珍珠母、颜料及其混合物。

本发明的化妆品成分还可包括至少一种其他化妆品活性剂，如抗衰老剂、保湿剂、具有活性镇静、舒缓或放松的制剂、刺激皮肤微循环制剂，用于护理油性皮肤的皮脂调节剂、清洁或净化剂、抗基剂、抗炎剂、化学或矿物防晒霜等。

有利的是，化妆品成分包括本发明获取的至少一个旋果蚊草根提取物，其含量在0.01至10％，特别是0.05至5％，更具体地说是0.1至2％，视化妆品成分总重量而定。

本发明的第四个用途，是根据本发明方法获取的旋果蚊草根提取物，或根据本发明激活代谢途径的化妆品成分，将能量带给皮肤细胞，为皮肤带来活力、增加弹性或甚至排毒。

我们所指的皮肤细胞、角质形成细胞、成纤维细胞和黑色素细胞，其实最好是指成纤维细胞，为皮肤细胞带来能量代谢的最好途径就是糖酵解。

换个具体的说法，通过本发明涉及的方法获取的旋果蚊草根提取物，或根据本发明获取的化妆品成分，是为了激活紧张或疲惫的皮肤，使它增加弹性甚至解毒。

本发明的化妆品成分可用于暗肤提光(增加ATP合成，从而调节肤质水平的能量过程)，使皮肤焕发活力。

因此，本发明还旨在采用一种美容护肤法来激活代谢途径，为皮肤细胞注入能量，重新激发皮肤的活力，使皮肤增加弹性甚至解毒。本发明上述方法的特点，就是在身体或面部至少某个部位应用一种化妆品成分。

以下的示例旨在说明本发明，但不限制其说明范围。

具体实施方式

示例1：根据本发明方法法制备旋果蚊草提取物，并获得本萃取方法特征的提取物

旋果蚊草根提取物来自德国草种的植物提取，供应商是《Jelitto StaudensamenGmbH》公司。

旋果蚊草根提取物通过下列方法获取:

a)旋果蚊草在空中用营养液进行培育，营养液由氮/磷/钾(N/P/K)组成，相应的成分含量分别为15/10/30，其导电值为0.4至1.6mS/cm，持续时间为1至6周，

b)植物培育使用营养液并对植物进行导电，缺氮的营养液造成植物氮紧张，以此方式激发植物2至6周，营养液成分含有低于6％的氮、15％的磷和40％的钾，导电值在0.6至0.8mS/cm之间。在b’)步骤用清水冲洗激发过的根部并将以沥干。

c)进行固体/液体提取，是将刚切下的旋果蚊草根浸泡在生物源丙烷1.3二醇溶液中，比如市场销售的品牌产品，或有机丙二醇bio-Propanediol品牌产品(Connect Chemicals GmbH公司)，水与溶液的v/v比率介于85/15和70/30之间，在室温下持续48至72小时，pH值为4(品牌溶液)，或pH值为4至5(Connect Chemicals GmbH公司的有机丙二醇bio-Propanediol产品)。

d)在c)步骤收集获取的提取物。

e)通过澄清过滤的方法对d)步骤收集的提取物进行澄清，并通过添加100％的纯生物源丙烷1.3二醇将提取物溶液中的含量调至70±5％，提取物的pH值(约4)也通过添加柠檬酸来作相应调整。

获取的旋果蚊草根提取物具有以下特点：

·干提取:每升或每公斤提取10±2g干提取物

·溶剂含量：生物源丙烷1.3二醇调整为70±5％

·pH值:4±1

根据示例1制备的根提取物，其仙鹤草素含量的量化是采用液相色谱法和质谱法来实现的。

分析步骤使用的是Shimadzu Nexera X2 UPLC装置(LC-30AD泵、SIL-30AC样品分析设备、CT0-20A烤箱、SPD-M20A二极管棒探测器；日本京都设备)，与规格为250mmx4.6 mm，5μm的RP18色谱柱逆向运行(法国基扬库尔市Waters公司产品)。可流动方面，包括溶液A(Mili-Q超纯水，Merck Millipore公司的甲酸+0.1％，法国瓦勒德勒伊市CarloErba公司产品)和溶液B(乙腈，德国施泰因海姆市Sigma-Aldrich Chemie GmbH公司产品)，其梯度计算是(按％计):B阶段5-37.5％(0-32.5分钟)；37.5-90％(32.5-33分钟)；90％(33-39分钟)，90-5％(39-39.5分钟)，5％(39.5-45分钟)。分析扫描速率为1.6ml/min，烤箱温度为40℃。退出色谱柱时，二极管杆探测器转录组的UV光谱为200至600nm。该设备与质谱仪(Shimadzu LCMS-2020)配合使用，在负极模式下进行电喷雾电离(4.5kV)，扫描范围为m/z 100-1000，LabSolutions软件(版本5.60SP2)用来操作系统。

在DMSO/水混合物中，根据70/30的比例，以100mg/L的浓度制备水合儿茶素标准，仙鹤草素含量的量化就是借助对该标准的峰值区测量而确定的(水合儿茶素(+)-98％；注册号225937-10-0,供应商为Sigma-Aldrich公司,订单号:C125)。

仙鹤草素含量以mg表示，相当于每升提取物的水分儿茶素含量，其计算公式如下：

示例1由此获取旋果蚊草根提取物，其仙鹤草素含量(以mg表示，相当于每升提取出的水合儿茶素)在1500mg/L至2800mg/L之间(相当于10克/升干提取，干提取比例15％至28％)。

示例2:生物源丙烷1.3二醇制备的旋果蚊草根提取物对人类成纤维细胞影响的转录组–基因芯片研究

为了分析本发明的旋果蚊草根提取物含有对皮肤有益功效的可能性，从人类成纤维细胞中进行了基因芯片转录组研究，该研究对旋果蚊草根提取物进行了24小时的处理。基因的变异表达通过StratiCELL皮肤知识数据库作了背景介绍和生物学的解释。

材料与方法

提取

根据示例1，在空中培育的旋果蚊草，将新切下的根部通过生物源丙烷1.3二醇溶液浸泡来提取根部提取物。溶液含量(生物源丙烷1.3二醇)的v/v的比例为70±5％，提取物的pH值为4.0±0.1。干提取物含量为每升提取操作获取10±2g。

细胞培养

该研究是针对人类真皮成纤维细胞NHDFs的研究(人类正常皮肤纤维细胞，皮肤来源：包皮)，是在大约有40％的增殖潜力的体外进行的。这些细胞在DMEM环境中单层培养(Invitrogen公司，专利号31885-049)，并添加了抗生素(青霉素/链霉素，Invitrogen公司，专利号15140-122)。这些细胞被保存在37度的潮湿环境中，含有5％的Co2。

通过初步细胞毒性研究，确定旋果蚊草根提取物的研究范围。

为了确定提取物的最佳分析浓度，对NHDF成纤维细胞进行了初步实验，同时对提取物制备中使用的溶液效果也进行研究。

NHDF成纤维细胞在提取和溶液浸泡(生物源丙烷1.3二醇/水的v/v比例为70/30，pH值为4)测试前的24小时播种在24个培养井板上。

本研究内容包括评估在添加提取物和溶剂24小时后，NHDF成纤维细胞在5个浓度和3次重复(n-3)后其细胞在MTS试验中的生存力(3-(4.5-dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)，(Promega公司,G3581)。

SDS(硫酸二钠)对细胞有毒，用作积极的细胞毒性控制来验证实验。

实验结束时，对无细胞毒性的浓度进行确定，以用于转录组分析。

接下来，对五个浓度经过百分比v/v测试，分别为3％，1％，0.3％，0.1％和0.03％。

细胞处理

提取物和溶液按选定的浓度应用于NHDF成纤维细胞培养基中，每种环境都制作了四倍(n＝4)的培养。经过24小时NHDF成纤维细胞的培养，将RNA全部种群提取出来。RNA通过分光光度测定(n＝4)来进行量化，其完整性通过毛细管电泳法(每种环境3次，n＝3)进行分析。

提取完整RNA

使用RNeasy(Qiagen)试剂盒提取了完整的RNA，细胞用PBS冲洗，并溶解在特定的棉布中。

RNA的提取和纯化是按照供应商的指示进行的。然后将完整的RNA在-80度以下进行保存，以用于转录组分析。

通过分光光度测定和毛细管电泳法对RNA进行量化

完整RNA的浓度使用分光光度测量确定，然后，通过毛细管电泳法验证RNA的质量和完整性(安捷伦生物分析仪2100-安捷伦RNA 6000Nano工具，5067-1511)。

-通过分光光度测量对RNA进行定量：在无RNAse-free成分的水中稀释每个RNA的等分，并使用Ultrospec 1100Pro(Amersham设备)分光光度来测定其浓度。

-通过安捷伦生物分析仪使用毛细管电泳法测试RNA的完整性：通过核糖RNA对应的可视化峰值来评估RNA的完整性。对上真核细胞的RNA总量，RNA18S的核糖体条带大小必须为1.9kb，RNA28S的核糖体条带大小必须为4.7kb，对应于28S-RNA的核糖体条带密集度必须大于18S-RNA相应的密集度，代表低分子量RNA散出的小糖体条带可能出现(RNAt和ARNr5S)。当RNA降解时，核糖体的RNA条带被弥散，并观察到更高分子量的RNA底部噪声。

人类全转录组芯片(GeneChip Human Gene 2.0 ST(Affymetrix)杂交步骤

RNA按50ng/μI比例和每个样本(n＝3)50μI比例进行稀释，第四个副本用作备份。

RNA(50ng)样品使用Ribo-SPIA技术进行放大，其操作根据3个步骤(Ovation PicoWTA系统V2，NuGEN，3302-12)，并用Agencourt RNA Clean up XP Beads套件进行纯化(Agencourt工具由Beckam Coulter Genomics公司提供，参号A29168)。借助NuGEN EncoreBiotin Module生物素模块(NuGEN，4200-12)，每个样品4,5μg都分成小块，并标有生物素，在人类基因芯片模型上进行杂交(Affymetrix，902112)。在芯片上洗涤和固定的混合步骤，是按照Affymetrix定义的协议执行的。杂交方案的准备使用了Affymetrix基因芯片表达3'扩增试剂杂交控制(Affymetrix，900454)套件、和基因芯片杂交模块、洗涤和染色套件(Affymetrix，900720)，并与前步骤中扩增补充的DNA(cDNA)混合，杂交在芯片杂交烤箱640(Affymetrix，800139)中进行了18小时。清洗和显影使用了芯片洗涤工作站450(GeneChipFluidics Station 450，Affymetrix，00-0079)，强度测量用芯片扫描仪3000(GeneChipScanner 3000，Affymetrix)进行了扫描。

杂交数据的预处理

原始数据的处理使用了R软件(v3.2.3；Ihaka R和Gentleman T，数据分析和图形语言，计算和图形统计杂志(1996年第5卷3号，第299-314页)，以及Oligo芯片处理工具包(vl.34.2；Benilton S Carvalho和Rafael A Irizarry，生物数据处理开源工具包的寡核苷酸微阵列预处理框架(生物信息学2010年，26:19，2363-7)，工具包是计算生物学和生物信息学基因组生物学发展开源软件(2004年第5卷，编号R80；v3.2；Gentleman R，Carey VJ,Bates DM,Bolstad B,Dettling M,Dudoit S,Ellis B,Gautier L,Ge Y)。由Affymetrix出版的最新版本，是基于人类基因组19(UCSC人类基因组19)和Irizarri与al.编写的RMA法编写的(编写人Irizarry RA，Ooi SL，Wu Z，Boeke JD。资料:在微阵列为基础的筛选中使用混合物模型检测酵母突变体存在的差异,Epub.2003年3月18日的遗传学和分子的统计应用(2003a,2)，编写人Irizarry RA、Hobbs B,Collin F,Beazer-Barclay YD,Antonellis KJ,Scherf U,Speed TP。高密度寡核苷酸阵列探测水平数据的探索、规范划及总结，使用了生物统计学，2003年，4(2)，249-64)以便指导序列聚类，并进行基因预测和功能注释。

数据分析、注释和专题分析

基因/转录基因的单个数据分析使用了"Moderated t"和"Moderated"法，该方法安装在R Limma 3.26.8数据处理工具包里(Smyth GK，评估微阵列实验中的差异表达的线性模型和经验拟合的贝叶斯方法，在遗传学和分子生物学中的统计应用，2004年，3(3))。

用来分析基因过表达的基因注释和基因群定义，是根据"皮肤细胞知识数据库"的内部数据进行的(Salmon M和Berger F；从基因表达到引证；化妆品表达2014，90，91-94)。

分析基因过表达使用的是超几何测试法，其目的是根据检测目标与不同表达的比例来对各主题和皮肤化妆品相关人群进行特征描述。基因过表达分析是根据p值为0.05、表达水平差异(变率或倍性变化FC)高于1.5(双边)的已测基因清单进行的。

成就

通过细胞毒性初步研究确定提取物的分析浓度

对基于5个浓度的NHDF成纤维细胞进行了细胞毒性研究，培育载体里已放进了制备所需的提取物和溶液(n＝3)，NHDF纤维细胞培养24小时。无处理控制(无提取物或溶剂)任意设为存活率100％，细胞毒性基值按惯例设为存活率80％，SDS条件构成验证试验的正向控制。

根据细胞毒性初步研究的结果(未显示数据)，提取物和溶液选择的最佳浓度(百分比v/v)为3％。

通过分光光度测定量化RNA

通过260nm和280nm的吸收比来评估RNA的纯度，比例接近2，且无蛋白质污染，该样品可视为无蛋白质污染的纯洁品，260/230比率作为样品纯度的二次测定，260/230比值要高于260/280比值，预计约为2.2。本研究中所有样本获取的比值令人满意(未显示数据)，因此，通过毛细管电泳鉴定为合格。

通过毛细管电泳进行RNA合格鉴定

NAR的不同种群清楚地显示出几个窄峰的存在，与核糖体RNA18S和28S比例相对应，没有中间峰型和扩散峰型，这是NAS降解产物的特征，证明了不同种群的完整性(未显示数据)。

提取RNA的质量和完整性得到了证明，这些已被跟踪记录，并用在扩增、纯化、生物标记的反应中，然后在ADN芯片上进行杂交。

旋果蚊草根提取物导致的基因表达变化分析

在浓度为3％v/v的NHDF成纤维细胞培养基(n＝4)中加进了提取物，仅在控制提取物的载体溶剂上进行了分析(生物源丙烷1.3二醇/按70/30比例的水、pH＝4、v/v比例浓度3％、n＝4)。经过24小时NHDF成纤维细胞的培养，通过在DNA芯片上的杂交来分析基因表达差异。

旋果蚊草根提取物协调地刺激所有参与葡萄糖转化为丙酸或糖酵解的基因，通过皮肤相关数据库对不同组进行了分析，分析突出显示出与葡萄糖代谢相关的基因组，并且p值极低(3.8x 10-9)。

其结果汇总见下表(表1)：

表1：葡萄糖载体和糖酵解基因在根部提取物(3％)施用在人类真皮成纤维细胞NHDF24小时后差异很大，p值(p-值)、倍性变化(FC)与70％的生物源丙烷1.3二醇载体(3％)的变差(FC>1：增加)、基因符号以及基因名称均在表中呈现。

由于提取物的存在，糖酵解中涉及的所有酶都出现过度表达。此外，主要葡萄糖载体GLUT-1的基因编码也大大过度表达(x 3.26)，GLUT-1载体促进葡萄糖通过血浆膜进入，因此，它通过现有的培养基在糖酵解反应启动时起着至关重要的作用。

糖酵解发生有10个连续步骤，每个步骤都由一种特定的酶进行催化，其中三个步骤具有不可逆转的作用，因此限制了糖酵解的进展。

以下是10个不同步骤以及旋果蚊草根提取物对所相关酶水平表达的影响。

·葡萄糖活化

葡萄糖进入细胞质后，原酒精功能被己糖激酶HK1(x 1.27)和HK2(x2.98)磷酸化，转变为葡萄糖-6-磷酸，消耗ATP。这一步骤是不可逆转的，因此受到限制。葡萄糖-6-磷酸异位化。

·葡萄糖-6-磷酸盐通过葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI，x 1.62)异构为果糖-6-磷酸盐。这种可逆反应可以在1碳上产生磷酸化酶聚合物。

·果糖6-磷酸盐的磷酸化作用

磷酸果糖激酶(PFKL，x 1.55)通过消耗ATP，在果糖-6-磷酸盐的1碳上加入磷酸盐，这种限制性的不可逆反应导致结果为果糖-1.6-双磷酸盐。

因此，前3个步骤通过两个原醇功能消耗了2分子ATP，磷酸化酶"激活"了六角细胞。

·果糖-1.6-磷酸盐裂解

醛缩酶(ALDOA，x 1.44和ALDOC，x 2.61)将果糖-1.6-磷酸盐裂解为两个活性3碳糖(磷酸丙糖),即甘油醛3-磷酸和二羥丙酮磷酸，这两种丙糖通过三磷酸盐异体酶(TPI1,x2.76)的作用可互相转化。

·NADH的释放和1.3双磷酸甘油酸盐的形成

甘油醛经过了基本的糖酵解(但不是调节或限制)步骤，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，x 1.37)可形成第一种富含能量的化合物，即1.3-双磷酸甘油，并形成NADH形式的能量减少的同等物。

·ADP转化成ATP的氧化磷酸化

1.3-双磷酸甘油酸将其磷酸盐聚合物转到ADP，产生ATP分子。这种反应经磷酸甘油激酶(PGK1x 2.71)催化，产生3磷甘油酸盐。

·3磷酸甘油转化为2磷甘油酸盐

然后开始合成一种新的富含能量的化合物，即磷脂素。3磷酸甘油的磷酸盐聚合物首先转移到2碳以包养2磷甘油酸盐，这是一种由磷甘油酸突变酶催化的反应(PGAM1，x2.77，PGAM2 x 1.4和PGAM4，x 1.5)。

·2磷甘油酸盐脱水

这种反应产生于电热酶(ENO1x 2.4和ENO2，x 2.96)的催化，生成磷醇硫化物充满能量的新分子键。

·ADP转化成ATP的氧化磷酸化和丙酮合成

丙酸酯激酶(PKM，x 1.14)不可逆转地将磷酸烯醇丙酮酸的磷酸盐聚合物转移到ADP，形成丙酮酸，这是糖酵解的最终产物。然后，丙酮酸将进入线粒体，在转化为乙酰CoA之后跟随三羧酸循环。

结论:

值得注意的是，旋果蚊草根提取物以协调的方式刺激糖酵解所有的酶，特别是不可逆转的酶催化作用，从而限制反应，如己糖激酶，磷酸果糖激酶和在较小程度上的丙酮酸激酶。再补充一点，旋果蚊草根提取物大大刺激了葡萄糖载体GLUT-1的基因编码表现，促进其进入细胞。糖酵解可生成2个丙酸酯分子，2个ATP分子和2个NADH1葡萄糖分子，所以这些数据构成了一组证据，有利于对细胞的能量代谢产生显著影响，并增加ATP和NADH的产出，从而有利于证明旋果蚊草根提取物能够提供能量。

因此，根据本发明的旋果蚊草根提取物的属性，它作为一种有用的化妆品活性成分应运而生，用以增加皮肤细胞的糖酵解，特别是成纤维细胞的富集，从而调节ATP分子的合成。

Claims (12)

1.旋果蚊草根提取物的制备过程，包括以下连续步骤：

a)离地环境中培育，特别是空中器具中的培养步骤，

b)激发植物根步骤，

c)对b)步骤激发的根部进行浸渍，并进行固体/液体萃取步骤

d)收集在c)阶段获取的提取物。

2.根据权利要求1所述的制备过程，其中，b)步骤的植物根激发具有如下特点：

·植物根使用激发溶液的步骤，溶液含有至少下列选择之一：盐、表面活性剂、溶剂、真菌或细菌激发子，茉莉花酸的衍生物，特别是甲基茉莉花、水杨酸、乙烯发生器、甲壳素、壳聚糖和/或其混合物，和/或

·植物根使用缺氮液的步骤，缺氮液的氮含量低于通常被认为最适合植物尤其根部发育的含量，含碳低于15％较为有利，最好是不含氮，这两个步骤按顺序进行或同步进行。

3.根据权利要求1或2所述的制备过程，其中，c)步骤的特点是将b)步骤受激发的根部浸泡后进行固体/液体提取，在此之前有个附加的清洗步骤，清洗的液体为清水，洒到植物上。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的制备过程，其中，确定b)步骤植物根激发后进行固体/液体提取的c)步骤，其特点是将此根与二醇溶液接触，二醇选自丙烯乙二醇、丙烷1.3二醇、特别是生物源丙烷1.3二醇、以及丙烷1.2二醇和丁二醇，形态为纯溶液或水性乙二醇，溶液中乙二醇含量占10％至99.9％，尤其是在40％至90％，更具体地说是在60％和85％之间。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的制备过程，其中，确定c)步骤使用二醇对b)步骤激发根进行固体/液体提取，其特点是该二醇的pH值为2至5，优先值为2.5至5，更优先为2.5至4.5，最为优先是3至4。

6.根据权利要求4或5所述的制备过程，其中，确定c)步骤对b)步骤激发根进行固体/液体提取，包括激发根与二醇接触的周期，周期为12至72小时，尤其是24至72小时，更好是24至48小时。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的制备过程，其中，确定对d)收集的提取物通过连续过滤进行浓缩和/或澄清的步骤，特别是纳米过滤和/或澄清过滤和/或消毒过滤。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的制备过程获取的旋果蚊草根提取物。

9.化妆品成分包含作为活性剂的成分，成分中至少含有权利要求1-7中任意一项所述的制备过程获取的提取物，并且至少含有一种化妆品可接受的赋形剂。

10.根据权利要求1-7中任意一项所述的制备过程获取的旋果蚊草根提取物，用于激活代谢途径，为皮肤细胞提供能量，为皮肤注入活力，甚至能为皮肤排毒。

11.根据权利要求9所述的化妆品成分，化妆品成分用于激活代谢途径，为皮肤细胞提供能量、为皮肤注入活力，给皮肤增加弹性甚至排毒。

12.化妆品护肤方法的目的是激活代谢途径，为皮肤细胞提供能量，激发皮肤活力，增加皮肤弹性甚至解毒，该方法确定的特点包括在身体或面部皮肤某部分应用权利要求9所述的化妆品成分。