CN110367285A - 一种木霉防控灰霉病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物病害防治的技术领域，特别是涉及一种木霉防控灰霉病的方法。提供一种利用发酵技术诱导木霉产生草酸降解酶系，制备酶制剂，对灰霉病的绿色防控方法。本发明所利用的木霉菌株为可耐受50mM以内的草酸，并同时可降解50mM以内的草酸。本方法可用于对灰霉病的早期防控，有效替代化学农药，是环境友好的病害绿色防控方法。并且该酶制剂在作物灰霉病发病前期或未发病时进行喷施的防控效果优于病情中后期。

Description

一种木霉防控灰霉病的方法
技术领域
本发明涉及植物病害防治的技术领域，特别是涉及一种木霉防控灰霉病的方法。
背景技术
灰霉病是保护地及露地农业生产中的常见、难以防治的真菌性病害，涉及作物类型广，危害程度高。灰霉病由灰霉菌(Botrytis cinerea)侵染植物花、叶、果实、茎等部位引起发病，更可随空气、水流及农事作业传播，在低温高湿的条件下易爆发大规模病害，造成严重减产甚至绝产。对灰霉病的早期防治十分重要，原因是灰霉菌产孢量大、菌丝萌发迅速，一旦到了发病中期，将大面积侵染并产生大量的菌丝和孢子，极难用药控制。目前对灰霉病的早期防控仍以化学农药为主，经常使用的化药包括速克灵、扑海因、百菌清、敌克松、地菌灵、多菌灵等，虽然具有防治效果，但也带来了环境污染和食品安全隐患，与大力发展的绿色农业相悖。
利用木霉(Trichoderma spp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等生防菌株防治灰霉病是一种绿色防控措施，近年来备受市场关注，其生防机制也是科学研究的热点之一。根据研究报道，在灰霉病发病早期，传播至植株侵染部位的灰霉菌向环境中分泌草酸，草酸一方面增强灰霉菌致病酶系的活性，一方面抑制植物保护酶系的活性，并调控气孔保卫细胞关闭、诱导植物细胞程序性死亡，是灰霉菌成功侵染植物的必要条件。木霉生防菌株防治灰霉病时，可利用菌体合成的草酸降解酶、甲酸脱氢酶等酶系，将灰霉菌分泌的致病因子草酸分解为CO2和H2O，阻断灰霉菌重要的致病因子，实现对灰霉病的早期防控。利用生防木霉防治灰霉病目前以活体菌剂为主，然而在应用中还存在着菌体存活时间有限、定殖水平不稳定、喷施设备不配套等未完善的技术问题。而诱导木霉大量合成相关酶系，并制成生防制剂防治灰霉病的思路，则避免了活体菌剂应用中存在的上述问题，并且不会造成环境污染。但目前未见相关生防制剂的报道。
发明内容
本发明针对灰霉病早期防治技术体系的缺陷，提供一种利用发酵技术诱导木霉产生草酸降解酶系，制备酶制剂，对灰霉病的绿色防控方法。
本发明的技术方案为：
一种木霉防控灰霉病的方法，利用发酵技术诱导木霉菌株产生草酸降解酶系来防控灰霉病。
进一步的，本发明所利用的木霉菌株为可耐受50mM以内的草酸，并同时可降解50mM以内的草酸。
本发明所利用的木霉菌株为可耐受50mM以内的草酸，即在草酸终浓度低于50mM的培养条件下，可形成菌丝、分生孢子梗和分生孢子结构的木霉菌株。并且所利用的木霉菌株同时满足可降解50mM以内的草酸，即在草酸终浓度低于50mM的培养条件下，在20天内可完全降解草酸的木霉菌株。
进一步的，本发明的木霉防控灰霉病的方法，采用木霉菌株产生的草酸降解酶系，由该酶系获得的酶制剂，用于灰霉病早期防控。
进一步的，本发明的木霉防控灰霉病的方法，具体为，采用酶制剂用于灰霉病早期防控，在作物苗期、花期和果期进行喷施，喷施部位为作物整个地上部分，尤其是叶部、花部和果实；进一步的该酶制剂在作物灰霉病发病前期或未发病时进行喷施，在作物灰霉病发病前期或未发病时进行喷施的防控效果优于病情中后期。
进一步的，本发明的木霉防控灰霉病的方法，所述的酶制剂包括发酵酶液、酶粉，进一步的该酶制剂为可湿性粉剂、水剂。
进一步的，本发明的木霉防控灰霉病的方法，所述的发酵酶液的制备方法为，
(1)木霉种子液的制备：采用液体发酵培养方法，将木霉菌株接种至培养液I中培养获得种子液，具体步骤如下：
培养液I的制备方法为：马铃薯去皮200g切碎水煮30分钟，8层纱布过滤，滤液中加20g葡萄糖，用水补足1L体积，115℃高压灭菌30分钟得到培养液I；
若木霉菌株为冷冻保藏或以其他方式长期保藏菌种，则需首先活化菌株，挑取菌体，接种于PDA平板上，在25～30℃半光照半黑暗条件下培养3～7天；PDA培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，用水补足1L体积；
木霉菌株活化好后，用无菌水将分生孢子冲洗至无菌试管，用含0.05％吐温80的无菌水将分生孢子悬浮均匀，计数后稀释成浓度为107分生孢子/mL的悬浮液，分生孢子悬浮液中即使存在少量菌丝也无碍，无菌条件下，将木霉分生孢子悬浮液以1:100的体积比加入培养液I中，在25～30℃，在转速160～180r/min条件下震荡暗培养1～2天，即得木霉种子液；
(2)木霉酶液的诱导产生：
采用液体发酵培养方法，将步骤(1)得到的木霉种子液接种至培养液II中培养获得酶液，具体步骤如下：
培养液II的制备：马铃薯滤液，草酸10～50mmol/L，氯化锰0.08～0.26g，二水钼酸钠0.001～0.008g，葡萄糖10～20g/L，用水补足1L体积，115℃高压灭菌30分钟得到培养液II；
步骤(1)得到的木霉种子液接种至培养液II中，25～30℃，在转速160～180r/min条件下震荡暗培养5～20天，从诱导第2～10天补加补料培养基，获得发酵酶液；
马铃薯滤液制备为马铃薯去皮200g切碎水煮30分钟，8层纱布过滤得滤液，即为马铃薯滤液；
补料培养基为除去草酸的培养液II；
草酸的制备为，采用草酸母液浓度为0.5mol/L，容量瓶定容后，经0.22μm水相滤膜在无菌条件下过滤，室温存放，使用时按需取用。
进一步的，酶粉的制备方法，将得到的发酵酶液混合物加入1％～2％海藻糖，经真空冷冻干燥法脱水干燥，采用超微粉碎方法粉碎，获得酶粉。该酶粉在pH2.0～7.0条件下活性稳定。
进一步的，所述的酶粉添加海藻糖蛋白保护剂后单独使用，单独使用时可根据需要制成可湿性粉剂、水剂等常用喷施剂型。
进一步的，所述的酶粉还可添加海藻糖蛋白保护剂后，将其作为一种组分添加至喷施型生物农药制剂中使用，作为组分添加时可配合其他喷施型生物农药制剂的条件配制。
本发明的有益效果为：
(1)本方法可用于对灰霉病的早期防控，有效替代化学农药，是环境友好的病害绿色防控方法。并且该酶制剂在作物灰霉病发病前期或未发病时进行喷施，在作物灰霉病发病前期或未发病时进行喷施的防控效果优于病情中后期。
(2)相比较活体菌剂，本方法中的酶制剂无需考虑不同作物对活菌定殖和扩繁的影响，无作物选择差异性。
(3)相比较活体菌剂，本方法中酶制剂可依照常规方式选择喷施设备和设定喷施参数，对喷施措施的适用范围广。而活体菌剂对助剂的要求更严格，尚未形成完善的喷施技术。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1不同处理对灰霉病的防治效果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
除特别指明以外，所用技术术语均为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料、试剂如无特别说明均为市售购买产品，各种试机及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。
实施例1
以非洲哈茨木霉T.afroharzianum LTR-2、绿色木霉T.viride ACCC31911、绿木霉T.virens ACCC32489、棘孢木霉T.asperellum ACCC30536为待测木霉菌株进行说明，其中菌株LTR-2已在专利ZL200510104385.7中公开，后重新鉴定为非洲哈茨木霉，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCC NO.1498，菌种的拉丁文名称是T.harzianum，参据微生物(株)：LTR-2，保藏日期为2005年1月30日。其余三株木霉菌株在中国农业微生物菌种保藏中心保藏。
实施例2活化步骤
将木霉菌株LTR-2从-80℃取出，接种在PDA平板上，28℃恒温培养箱暗培养3天，对菌株进行活化。
将木霉菌株ACCC31911从-80℃取出，接种在PDA平板上，25℃恒温培养箱暗培养3天，对菌株进行活化。
将木霉菌株ACCC32489从-80℃取出，接种在PDA平板上，28℃恒温培养箱暗培养3天，对菌株进行活化。
将木霉菌株ACCC30536从-80℃取出，接种在PDA平板上，30℃恒温培养箱暗培养3天，对菌株进行活化。
PDA培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，用水补足1L体积。
实施例3发酵酶液的制备
待测木霉菌株活化好后，用无菌水将分生孢子冲洗至无菌试管，用含0.05％吐温80的无菌水将分生孢子悬浮均匀，计数后稀释成浓度为107分生孢子/mL的悬浮液，分生孢子悬浮液中即使存在少量菌丝也无碍。无菌条件下，将木霉分生孢子悬浮液以1:100的体积比加入培养液I中，在菌株活化温度下，在转速180r/min条件下震荡暗培养2天，得到木霉种子液。
木霉种子液接种至培养液II(草酸终浓度20mM)中，在菌株活化温度下，在转速180r/min条件下震荡暗培养5天，从诱导第2天补加补料培养基，获得发酵酶液。
培养液I的制备方法为：马铃薯去皮200g切碎水煮30分钟，8层纱布过滤，滤液中加20g葡萄糖，用水补足1L体积，115℃高压灭菌30分钟得到培养液I。
培养液II的制备：马铃薯滤液，草酸20mmol/L，氯化锰0.1g，二水钼酸钠0.005g，葡萄糖15g/L，用水补足1L体积，115℃高压灭菌30分钟得到培养液II。
补料培养基为除去草酸的培养液II。
马铃薯滤液制备为马铃薯去皮200g切碎水煮30分钟，8层纱布过滤得滤液，即为马铃薯滤液。
草酸的制备为，采用草酸母液浓度为0.5mol/L，容量瓶定容后，经0.22μm水相滤膜在无菌条件下过滤，室温存放，使用时按需取用。
实施例4
将实施例3的发酵酶液混合物加入1％的海藻糖，经真空冷冻干燥法脱水干燥，采用超微粉碎方法粉碎，获得酶粉。
制备酶可湿性粉剂，将酶粉、海藻糖、十二烷基苯磺酸钠、NNO、高岭土混合均匀，各组分的质量含量依次为30％、5％、3％、10％、52％。制备方法采用常规方法即可。
实施例5(试验例)
将实施例4酶可湿性粉剂用于黄瓜灰霉病的早期防控，观察对灰霉病的防控效果。采用中华人民共和国国家标准GB/T 17980.28-2000《农药田间药效试验准则(一)杀菌剂防治蔬菜灰霉病》的方法进行黄瓜灰霉病的防效评估。
试验组设置如下：
处理组1，将LTR-2酶可湿性粉剂以1:100用水稀释成悬浊液，在黄瓜育苗期、盛花期、盛瓜期分别对黄瓜地上部位喷雾施用，重点喷施叶、花和果实部位，使药液均匀覆盖即可。
对照组1，将LTR-2活菌可湿性粉剂(有效活菌数为108分生孢子/g)以1:500用水稀释成悬浊液(常规用量)，喷施方法同处理1。
处理组2，将ACCC31911酶可湿性粉剂以1:100用水稀释成悬浊液，喷施方法同处理1。
对照组2，将ACCC31911活菌可湿性粉剂(有效活菌数为108分生孢子/g)以1:500用水稀释成悬浊液(常规用量)，喷施方法同处理1。
处理组3，将ACCC32489酶可湿性粉剂以1:100用水稀释成悬浊液，喷施方法同处理1。
对照组3，将ACCC32489活菌可湿性粉剂(有效活菌数为108分生孢子/g)以1:500用水稀释成悬浊液(常规用量)，喷施方法同处理1。
处理组4，将ACCC30536酶可湿性粉剂以1:100用水稀释成悬浊液，喷施方法同处理1。
对照组4，将ACCC30536活菌可湿性粉剂(有效活菌数为108分生孢子/g)以1:500用水稀释成悬浊液(常规用量)，喷施方法同处理1。
化药组，将速克灵50％可湿性粉剂以1:1000用水稀释成悬浊液(常规用量)，喷施方法同处理1。
清水对照无任何防治措施。
试验结果如图1所示，由图1可以看到，结果表明，本发明的对灰霉病发病早期的绿色防控方法具有良好的防治效果，与活体菌剂无显著差异，与化学农药相当，是一种有效的灰霉病防治方法。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，利用发酵技术诱导木霉菌株产生草酸降解酶系来防控灰霉病。
2.根据权利要求1所述的木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，所利用的木霉菌株为可耐受50mM以内的草酸，并同时可降解50mM以内的草酸。
3.根据权利要求1所述的木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，采用木霉菌株产生的草酸降解酶系，由该酶系获得的酶制剂，用于灰霉病早期防控。
4.根据权利要求1所述的木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，采用酶制剂用于灰霉病早期防控，在作物苗期、花期和果期进行喷施，喷施部位为作物整个地上部分，尤其是叶部、花部和果实。
5.根据权利要求1所述的木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，该酶制剂在作物灰霉病发病前期或未发病时进行喷施。
6.根据权利要求1所述的木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，所述的酶制剂包括发酵酶液、酶粉。
7.根据权利要求6所述的木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，该酶制剂为可湿性粉剂、水剂。
8.根据权利要求1所述的木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，所述的发酵酶液的制备方法为，
(1)木霉种子液的制备：采用液体发酵培养方法，将木霉菌株接种至培养液I中培养获得种子液，具体步骤如下：
培养液I的制备方法为：马铃薯去皮200g切碎水煮30分钟，8层纱布过滤，滤液中加20g葡萄糖，用水补足1L体积，115℃高压灭菌30分钟得到培养液I；
若木霉菌株为冷冻保藏或以其他方式长期保藏菌种，则需首先活化菌株，挑取菌体，接种于PDA平板上，在25～30℃半光照半黑暗条件下培养3～7天；PDA培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，用水补足1L体积；
木霉菌株活化好后，用无菌水将分生孢子冲洗至无菌试管，用含0.05％吐温80的无菌水将分生孢子悬浮均匀，计数后稀释成浓度为107分生孢子/mL的悬浮液，分生孢子悬浮液中即使存在少量菌丝也无碍，无菌条件下，将木霉分生孢子悬浮液以1:100的体积比加入培养液I中，在25～30℃，在转速160～180r/min条件下震荡暗培养1～2天，即得木霉种子液；
(2)木霉酶液的诱导产生：
采用液体发酵培养方法，将步骤(1)得到的木霉种子液接种至培养液II中培养获得酶液，具体步骤如下：
培养液II的制备：马铃薯滤液，草酸10～50mmol/L，氯化锰0.08～0.26g，二水钼酸钠0.001～0.008g，葡萄糖10～20g/L，用水补足1L体积，115℃高压灭菌30分钟得到培养液II；
步骤(1)得到的木霉种子液接种至培养液II中，25～30℃，在转速160～180r/min条件下震荡暗培养5～20天，从诱导第2～10天补加补料培养基，获得发酵酶液；
马铃薯滤液制备为马铃薯去皮200g切碎水煮30分钟，8层纱布过滤得滤液，即为马铃薯滤液；
补料培养基为除去草酸的培养液II；
草酸的制备为，采用草酸母液浓度为0.5mol/L，容量瓶定容后，经0.22μm水相滤膜在无菌条件下过滤，室温存放，使用时按需取用。
9.根据权利要求8所述的木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，酶粉的制备方法，将得到的发酵酶液混合物加入1％～2％海藻糖，经真空冷冻干燥法脱水干燥，采用超微粉碎方法粉碎，获得酶粉。
10.根据权利要求8所述的木霉防控灰霉病的方法，其特征在于，所述的酶粉添加海藻糖蛋白保护剂后单独使用，单独使用时可根据需要制成可湿性粉剂、水剂喷施剂型；进一步的，所述的酶粉还可添加海藻糖蛋白保护剂后，将其作为一种组分添加至喷施型生物农药制剂中使用，作为组分添加时可配合其他喷施型生物农药制剂的条件配制。
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