CN110366423A - 再生功能性神经元用于治疗因血流破坏引起的神经损伤 - Google Patents

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Abstract

根据本发明的方面，提供了治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，其包括将治疗有效剂量的外源性NeuroD1给予正常血流已被破坏的区域。提供了组合物，其包含：1)重组腺相关腺病毒表达载体，其包含与编码位点特异性重组酶的核酸操作性地连接的神经胶质细胞特异性启动子和2)重组腺相关腺病毒表达载体，其包括与编码NeuroD1的核酸操作性地连接的遍在启动子，其中编码NeuroD1的核酸被反转并且侧接两组位点特异性重组酶识别位点，使得重组酶的作用不可逆地反转编码NeuroD1的核酸，使得NeuroD1在哺乳动物细胞中表达。

Description

再生功能性神经元用于治疗因血流破坏引起的神经损伤
相关申请的引用
本申请要求于2017年2月28日提交的美国临时专利申请第62/464,469号和2017年6月13日提交的美国临时专利申请第62/518,914号的优先权。各申请的全部内容通过引用纳入本文。
政府支持
本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号AG045656资助完成。政府对本发明享有某些权利。
发明领域
本发明涉及用于治疗个体对象的CNS中正常血流的破坏的影响的组合物和方法。
背景技术
哺乳动物中的中枢神经系统(CNS)在受伤后很大程度上不能自我再生。神经元和其他CNS细胞通常由于疾病或损伤而被杀死或受伤，所述疾病或损伤中断细胞所在区域中的血流。此外，血流中断处附近的病理变化是造成许多不良反应的原因，例如受正常血流破坏影响的中枢神经系统区域中的神经元的破坏或损伤，神经胶质细胞的破坏或损伤，血管的破坏或损伤，以及支持细胞的破坏或损伤。一直需要用于治疗个体对象的CNS中正常血流的破坏的影响的组合物和方法。
发明概述
根据本发明的方面，提供了治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，其包括将治疗有效剂量的外源性NeuroD1给予正常血流已被破坏的区域。任选地，给予外源性NeuroD1包括向该区域递送包含编码NeuroD1的核酸的表达载体。在另一选择中，给予外源性NeuroD1包括向该区域递送包含编码NeuroD1的核酸的重组病毒表达载体。任选地，NeuroD1是递送至该区域的唯一外源表达的转录因子。
根据本发明的方面，提供了治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，其包括将治疗有效剂量的外源性NeuroD1给予正常血流已被破坏的区域，其中外源性NeuroD1的表达包括向该区域递送包含编码NeuroD1的核酸的重组腺相关病毒表达载体。任选地，NeuroD1是递送至该区域的唯一外源表达的转录因子。
根据本发明的方面，编码NeuroD1的核酸序列与神经胶质细胞特异性启动子操作性地连接。根据本发明的方面，神经胶质细胞特异性启动子是GFAP启动子。根据本发明的方面，GFAP启动子是人GFAP启动子。
根据本发明的方面，提供了治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，其包括将治疗有效剂量的外源性NeuroD1给予正常血流已被破坏的区域，其中外源性NeuroD1的表达包括向该区域递送有效“翻转切除(flip-excision)”重组表达载体组合，该组合为1)包含编码NeuroD1的核酸的重组腺相关病毒表达载体和2)包含编码位点特异性重组酶的核酸的重组腺相关病毒表达载体的组合。任选地，NeuroD1是递送至该区域的唯一外源表达的转录因子。
根据本发明的方面，提供了治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，其包括将治疗有效剂量的外源性NeuroD1给予正常血流已被破坏的区域，其中外源性NeuroD1的表达包括向该区域递送以下的有效“翻转切除”重组表达载体组合：1)包含编码NeuroD1的核酸的重组腺相关病毒表达载体，其中编码NeuroD1的核酸序列与遍在启动子操作性地连接。
和2)重组腺相关病毒表达载体，其包含编码位点特异性重组酶的核酸，其中编码位点特异性重组酶的核酸序列与神经胶质细胞特异性启动子操作性地连接。根据本发明的方面，神经胶质细胞特异性启动子是GFAP启动子。根据本发明的方面，GFAP启动子是人GFAP启动子。任选地，NeuroD1是递送至该区域的唯一外源表达的转录因子。
根据本发明的方面，提供了治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，其包括在正常血流已被破坏的区域中以0.1-5μl/分钟的受控流速向对象给予1-500μl含有腺相关病毒颗粒的药学上可接受的运载体，所述腺相关病毒颗粒包含编码NeuroD1的核酸，其浓度为1010-1014个腺相关病毒颗粒/ml运载体。
根据本发明的方面，当存在反应性星形胶质细胞时，在CNS中正常血流被破坏后的一定时间给予外源性NeuroD1。
根据本发明的方面，当存在神经胶质瘢痕时，在CNS中正常血流被破坏后的一定时间给予外源性NeuroD1。
根据本发明的方面，CNS中正常血流的破坏是由于选自下组的紊乱：缺血，血栓形成，栓塞，出血，脑震荡，脑渗透，冲击(blast)，炎症，感染，肿瘤，慢性疾病介导的血管限制及其任何两种或更多种的组合。
根据本发明的各方面，CNS中正常血流的破坏是由于选自下组的紊乱：缺血性中风；出血性中风；脑动脉瘤；创伤性脑损伤；脑震荡；冲击；脑渗透；炎症；感染；肿瘤；创伤性脊髓损伤；缺血性或出血性脊髓病(脊髓梗死)；由心脏骤停或严重低血压(休克)引起的全局缺血；由缺氧，低血糖或贫血引起的缺氧缺血性脑病；由感染性心内膜炎或心房粘液瘤引起的CNS栓塞；纤维软骨栓塞性脊髓病；儿童白血病引起的CNS血栓形成；由肾病综合征(肾病)，慢性炎性疾病，妊娠，使用基于雌激素的避孕药，脑膜炎，脱水引起的脑静脉窦血栓形成；或其任何两种或更多种的组合。
根据本发明的方面，提供了治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，其包括将治疗有效剂量的外源性NeuroD1给予正常血流已被破坏的区域，其中给予治疗有效剂量的NeuroD1包括给予重组表达载体，该表达载体包括编码NeuroD1蛋白的核酸序列，其中编码NeuroD1蛋白的核酸序列包括选自下组的核酸序列：编码SEQ ID NO：2的核酸序列或其功能片段；编码SEQ ID NO：4的核酸序列或其功能片段；SEQ ID NO：1或其功能片段；SEQ ID NO：3或其功能片段；和编码与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性的蛋白质的核酸序列或其功能片段。
任选地，给予治疗有效剂量的NeuroD1包括在神经胶质瘢痕中或附近立体定向注射。
任选地，根据本发明在有需要的个体对象中治疗CNS中正常血流的破坏的影响的方法还包括评估对象中治疗的有效性。任选地，根据本发明在有需要的个体对象中治疗CNS中正常血流的破坏的影响的方法还包括评估对象中治疗的有效性，其中评估治疗的有效性包括选自以下的测定：电生理学测定，血流测定，组织结构测定，功能测定及其任何两种或更多种的组合。
任选地，根据本发明在有需要的个体对象中治疗CNS中正常血流的破坏的影响的方法还包括评估对象中治疗的有效性，其中评估治疗的有效性包括对象的脑电图。
任选地，根据本发明在有需要的个体对象中治疗CNS中正常血流的破坏的影响的方法还包括评估对象中治疗的有效性，其中评估治疗的有效性包括选自以下的血流测定：近红外光谱和fMRI。
任选地，根据本发明在有需要的个体对象中治疗CNS中正常血流的破坏的影响的方法还包括评估对象中治疗的有效性，其中评估治疗的有效性包括选自以下的组织结构测定：MRI，CAT扫描，PET扫描和超声。
任选地，根据本发明在有需要的个体对象中治疗CNS中正常血流的破坏的影响的方法还包括评估对象中治疗的有效性，其中评估治疗的有效性包括行为测定。
任选地，评估对象中治疗的有效性包括在给予治疗有效剂量的外源性NeuroD1之前进行的测定。因此，例如，根据本发明的方面，提供了治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，其包括：1)对对象进行选自以下的第一测定：电生理学测定，血流测定，组织结构测定，功能测定或其任何两种或更多种的组合，其中第一测定在给予治疗有效剂量的外源性NeuroD1之前进行；2)将治疗有效剂量的外源性NeuroD1给予正常血流已被破坏的区域；并且3)对对象进行选自以下的第二测定：电生理学测定，血流测定，组织结构测定，功能测定或其任何两种或更多种的组合，其中第二测定在给予治疗有效剂量的外源性NeuroD1后进行。
根据本发明的方面提供了组合物，其包括：1)重组腺相关腺病毒表达载体，其包含与编码位点特异性重组酶的核酸操作性地连接的神经胶质细胞特异性启动子和2)重组腺相关腺病毒表达载体，其包括与编码NeuroD1的核酸操作性地连接的遍在启动子，其中编码NeuroD1的核酸被反转(inverted)并且侧接两组位点特异性重组酶识别位点，使得重组酶的作用不可逆地反转(invert)编码NeuroD1的核酸，使得NeuroD1在哺乳动物细胞中表达。
根据本发明的方法产生的NeuroD1介导的星形胶质细胞向神经元转化在中风区域中再生100-600个NeuN+新神经元/mm2，其比内部神经再生能力的效率高20-200倍。
伴随神经再生，根据本发明的方面的NeuroD1治疗还在中风后减少反应性星形胶质细胞，减少神经炎症，增强神经元存活，修复血管，并恢复血脑屏障(BBB)。此外，根据本发明的方面的NeuroD1转化的神经元不仅形成局部神经回路，而且还整合到全脑网络中，实现对由缺血性中风诱导的运动缺陷的功能性挽救。因此，根据本发明的治疗方法，NeuroD1介导的体内细胞转化为治疗神经障碍提供了前所未有的神经再生效率。
根据本发明的方面的治疗方法证明，NeuroD1介导的体内神经胶质细胞向神经元转化可以在功能上挽救由缺血性中风诱导的运动缺陷。除了神经胶质细胞转化后的神经再生，在减少反应性星形胶质细胞和减少神经炎症后，许多受损神经元得以保留。本发明的NeuroD1治疗还在中风区域中修复受损血管并恢复BBB完整性，导致从神经抑制向神经允许环境的场景变化。根据本发明的方面的治疗方法在CNS中正常血流的破坏导致的损伤后再生和保留超过50-80％的总神经元。
通过体内细胞转化实现神经再生的高效率
脑功能依赖于神经元与其周围神经胶质细胞之间的微妙平衡。在严重缺血性损伤后，由于继发性损伤，神经元立即或逐渐死亡，但其相邻的神经胶质细胞可被激活并开始增殖，产生神经胶质瘢痕组织，其最终抑制神经再生。本文所述的NeuroD1介导的体内细胞转化技术通过将反应性神经胶质细胞直接转化为功能性神经元而恢复由于CNS中正常血流的破坏所致的受损区域中的神经元功能。与“经典”给予外源性干细胞用于植入和尝试治疗中风相比，本文所述的本发明的体内神经胶质细胞向神经元转化的技术具有许多优点。
一个优点是使用内源性神经胶质细胞代替外部细胞进行神经再生，避免与细胞移植相关的免疫排斥。使用丢失的神经元附近的内源性神经胶质细胞进行再生可能是恢复局部环路中神经元功能的最经济方式。另一个优点是将分裂性的反应性神经胶质细胞向非分裂性神经元的转化不仅减少了反应性神经胶质细胞的数量，而且降低了与分裂性神经胶质细胞相关的潜在肿瘤风险。相反，以给予外源性干细胞为特征的“经典”干细胞疗法与肿瘤风险有着内在的联系。因此，在根据本发明的方面，在有此需要的个体对象中治疗CNS中正常血流的破坏的影响的方法中没有给予外源性干细胞。
此外，本文所述的NeuroD1介导的神经胶质细胞向神经元转化疗法可以在CNS中正常血流的破坏为特征的区域，例如中风区域中再生大量新神经元，平均400NeuN+细胞/mm2，其是在缺血性中风后成体小鼠皮质或纹状体的内部神经发生能力的约100倍。
这种显著的神经再生功效也是外源性干细胞植入后通常较低的神经再生效率所无法比拟的。不受理论束缚，高效的神经再生对于功能性修复至关重要，因为少数新神经元在损伤环境中不能存活或不足以重建神经回路。
与调节内源性神经干细胞相反，本文所述的体内细胞转化方法利用与整个神经系统中的神经损伤密切相关的反应性神经胶质细胞进行原位再生和修复。本文所述的体内细胞转化方法也与目前正在开发的中风治疗的许多其他方法显著不同，后者主要集中于缺血性损伤后即刻的短期治疗，例如去除血液凝块，促进血液流动，抗炎症，抗氧化剂，或降低兴奋性毒性。虽然这些方法对于短期治疗是必要的，但如果中风后大量神经元丢失或功能受损，它们的长期有效性将受到限制。
作为这些短期方法的补充，本文所述的体内细胞转化方法通过转化局部神经胶质细胞并重建已被缺血性损伤破坏的局部神经回路，通过再生大量功能性神经元，提供了长期解决方案。值得注意的是，本文所述的体内细胞转化方法在缺血性中风后具有数天或数周或数月(而不是数小时)的宽时间窗，用于神经再生和组织修复。因此，任选地，根据本发明的方面，除了向正常血流被破坏的区域给予治疗有效剂量的外源性NeuroD1以外，在缺血性损伤后立即给予短期治疗，例如去除血液凝块，促进血液流动，抗炎症，抗氧化剂或降低兴奋性中毒。
根据本发明的治疗方法将反应性神经胶质细胞转化为功能性神经元不同于杀死反应性神经胶质细胞。反应性神经胶质细胞是针对神经损伤的主动防御反应，并且杀死反应性神经胶质细胞可使梗塞区域恶化。另一方面，众所周知，反应性神经胶质细胞释放细胞因子和炎症因子，包括CSPG，LCN2，TNFα，IL-1β等，它们可以抑制轴突再生和神经再生长。
本文所述的NeuroD1介导的体内细胞转化技术不是杀死反应性神经胶质细胞，而是将反应性星形胶质细胞转变为功能性神经元，减少反应性星形胶质细胞的数量以及反应性神经胶质细胞分泌的细胞因子和炎性因子。值得注意的是，在本文所述的星形胶质细胞向神经元转化疗法中，损伤区域中的星形胶质细胞由新产生的星形胶质细胞补充。虽然在损伤后杀死反应性星形胶质细胞导致不利影响，但是根据本发明的治疗方法将反应性星形胶质细胞转化为神经元产生神经修复。
附图说明
图1A，1B，1C，1D，1E，1F，1G，1H和1I显示了局灶性中风模型和NeuroD1介导的神经胶质细胞向神经元转化的建立。
图1A显示将内皮素-1(1-31)注射到小鼠运动皮层中导致从缺血性损伤后一周开始的逐渐组织损失。注射PBS作为模拟对照。虚线表示皮质区域。比例尺：(A)3mm；
图1B是显示中风后1周，4周和10周从中线到3mm外侧区域的皮质大小的定量分析结果的图(每个时间点n＝3只动物)。
图1C和图1D分别显示了在中风后5天(图1C)和10天(dps)(图1D)的NeuN(神经元标志物)和GFAP(星形胶质细胞标志物)的免疫染色结果。注意，NeuN信号在运动皮层中显著受损，并且GFAP信号在5dps时较弱但在10dps时显著增加。虚线表示胼胝体。比例尺：图1C和图1D的左图，200μm，图1C和图1D的右插图，40μm。
图1E显示了在10dps注射携带CAG：：GFP作为对照或CAG：：NeuroD1-IRES-GFP的逆转录病毒，并且在病毒注射后17天(dpi)进行免疫染色的结果。仅表达GFP标记神经胶质细胞，而表达NeuroD1-GFP的细胞显示NeuN的免疫阳性信号。比例尺：20μm。
图1F显示了在10dps注射携带hGFAP：：NeuroD1-P2A-GFP或hGFAP：：GFP作为对照的腺相关病毒(AAV9)并以17dpi免疫染色的结果。GFP对照组主要显示没有NeuN信号的神经胶质细胞，而NeuroD1组显示许多NeuN免疫阳性神经元。比例尺：40μm。
图1G显示在4dpi时，注射AAV9 hGFAP：：Cre和CAG：：FLEX-NeuroD1-P2A-mCherry导致GFAP标记的星形胶质细胞中显著的NeuroD1表达(上排)。有趣的是，一些NeuroD1-mCherry标记的细胞显示出NeuN和GFAP信号(下排)，表明从星形胶质细胞到神经元的过渡阶段。比例尺：(G)40μm(插图20μm)。
图1H是中风诱导，AAV注射和免疫染色程序的实验设计的示意图。该方案中的病毒注射表示在小鼠的其余实验中携带NeuroD1或GFP(mCherry)对照的Cre-FLEX系统。
图1I显示在17dpi时，GFP对照组显示许多GFAP+反应性神经胶质细胞(上排，GFAP)，而大多数NeuroD1-GFP标记的细胞变为NeuN阳性神经元(下排)。比例尺：(I)40μm。
图2A和2B显示了局灶性中风模型和AAV Cre-FLEX系统的建立。
图2A显示了代表性图像，其显示了在FVB小鼠(左)中由ET-1(1-31)诱导的严重缺血性损伤，但是在FVB小鼠由ET-1(1-21)或在B6小鼠中由ET-1(1-31)诱导的轻度损伤。在27dps时的NeuN免疫染色显示，与其他两种条件相比，ET-1(1-31)在FVB动物中诱导更多的NeuN损失和更严重的皮质萎缩。比例尺：(A)400μm。
图2B)根据本发明的方面的Cre-FLEX系统的工作机制的示意图。
图3A，3B，3C，3D，3E和3F显示NeuroD1高效地将反应性星形胶质细胞转化为皮质神经元。
图3A显示在对照和NeuroD1组中在病毒注射后4，7或17天用GFAP免疫染色鉴定星形胶质细胞(dpi)。比例尺：(A)40μm。
图3B显示了在4，7或17dpi时的用NeuN免疫染色的神经元鉴定。箭头指示一些NeuroD1转化的神经元。比例尺：(B)40μm。
图3C是显示所有病毒感染的细胞中GFAP+细胞的定量的图。注意NeuroD1组中星形胶质细胞显著减少。**P＜0.01，双向ANOVA，然后进行Sidak多重比较检验。n＝每组3只小鼠。在病毒感染的皮质区域随机拍摄3张图像。数据表示为平均值±s.e.m.。
图3D是显示所有病毒感染的细胞中NeuN+细胞的定量的图。注意NeuroD1组中神经元显著增加。****P＜0.0001，双向ANOVA，然后进行Sidak多重比较检验。n＝每组3只小鼠。在病毒感染的皮质区域随机拍摄3张图像。数据表示为平均值±s.e.m.。
图3E显示了代表性图像，其显示了在60dpi时表达皮质标志物(Tbr1)的NeuroD1转化的神经元(GFP+)。注意，Tbr1+细胞包括转化的细胞和非转化的细胞。比例尺：(E)40μm。
图3F是显示在NeuroD1介导的体内细胞转化后神经元特征的表征的图。许多NeuroD1转化的神经元对皮质神经元标志物具有免疫阳性，但只有10％是GABA能神经元。n＝每组3只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
图4A，4B和4C显示了用于示踪NeuroD1转化的神经元的Tri-AAV系统。
图4A是说明Tri-AAV示踪系统的机制的示意图：当仅注射AAV-hGFAP：：GFP时，星形胶质细胞仅被标记为绿色。当AAV-hGFAP：：GFP与Cre-FLEX-mCherry对照系统一起注射时，星形胶质细胞将表达GFP和mCherry并显示黄色。当AAV-hGFAP：：GFP与Cre-FLEX-NeuroD1-mCherry转化系统一起注射时，星形胶质细胞将转化为神经元并表达GFP和mCherry，呈现黄色但NeuN+。
图4B是显示在17dpi和60dpi时Tri-AAV示踪系统的转化效率的定量的图。对于hGFAP：：GFP组，定量所有GFP+细胞中GFP+/NeuN+细胞的百分比。对于hGFAP：：GFP加Cre-FLEX-mCherry或Cre-FLEX-NeuroD1-mCherry组，定量所有GFP+/mCherry+中GFP+/mCherry+/NeuN+细胞的百分比；(每组n＝2只动物，且＞150个细胞)。
图4C显示代表性图像，其显示在17和60dpi时三组中GFP，mCherry和NeuN信号的不同水平的共定位。比例尺：(C)40μm。
图5A，5B，5C，5D，5E，5F，5G，5H和5I显示NeuroD1治疗减少了中风区域中的神经炎症。
图5A显示代表性的低放大倍数图像，其说明在17dpi时在对照和NeuroD1组中的中风皮质中的GFAP标记的反应性星形胶质细胞。虚线表示皮质区域。中风损伤核心用星号(□)标记。比例尺：(A)400μm。
图5B显示高放大倍数图像，其显示在GFP对照组(上排)和NeuroD1组(下排)中的中风后梗塞周围区域中GFAP标记的反应性星形胶质细胞(红色)。注意，与对照组相比，NeuroD1组中的星形胶质细胞在形态学上似乎具有较低的反应性。损伤核心用星号标记。比例尺：(B)40μm。
图5C显示来自转基因GFAP-GFP小鼠的图像，进一步说明显著数量的星形胶质细胞在NeuroD1转化区域(下排)中持续存在，表明在细胞转化后星形胶质细胞未耗尽。比例尺：(C)40μm。
图5D显示低放大倍数图像，其显示17dpi时对照组和NeuroD1组中的小胶质细胞标志物Iba1。注意NeuroD1组中Iba1信号的显著减少。比例尺：(D)400μm。
图5E显示高放大倍数图像，其显示在GFP对照组(顶部)中具有变形虫形状的反应性小胶质细胞(Iba1)，但在NeuroD1组(底部)中具有更多的分枝形态。比例尺：(E)40μm。
图5F显示免疫荧光图像显示在17dpi时的梗塞周围区域中，与对照组相比，NeuroD1组中反应性神经胶质细胞释放的重要神经抑制因子CSPG显著减少。比例尺：(F)40μm。
图5G显示免疫荧光图像，其显示在17dpi时与对照组相比，NeuroD1组中反应性神经胶质细胞分泌的炎性因子LCN2显著减少。比例尺＝(G)40μm。
图5H是显示实时定量PCR(RT-PCR)验证NeuroD1感染组织中NeuroD1表达，但显示NeuroD1组中反应性星形胶质细胞标志物GFAP和LCN2的显著降低的结果的图。*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001，单向ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验。n＝每组4只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
图5I是显示RT-PCR的图，其显示中风后促炎因子IL-1β，IFNγ，IL-6和TNFα显著增加，但是在NeuroD1治疗后显著降低。*P＜0.05，**P＜0.01，单向ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验。n＝每组4只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
图6A，6B，6C，6D，6E和6F显示NeuroD1治疗后反应性神经胶质细胞和炎症的减少。
图6A和图6B显示了在7dpi(图6A)和40dpi(图6B)时的梗塞周围区域中星形胶质细胞(GFAP)和小胶质细胞(Iba1)的代表性图像。注意，在40dpi时的NeuroD1组中，与对照组相比，星形胶质细胞和小胶质细胞的数量减少，形态上的反应性也较低。比例尺：40μm。
图6C)在40dpi时的梗塞周围区域中用GFAP和NeuN共染色的GFP(NeuroD1-GFP)的代表性图像。注意，在NeuroD1感染区域，检测到许多星形胶质细胞并且反应性较低，这表明转化后它们没有被耗尽。比例尺：40μm。
图6D，6E和6F是显示小胶质细胞标志物Iba1(图6D)，神经胶质瘢痕抑制因子CSPG(图6E)和星形胶质细胞炎症标志物LCN2(图6F)的信号强度(AU，人工单位)和覆盖面积(％)的定量的图。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。单因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验，每组n＝3只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
图7A，7B，7C，7D，7E，7F，7G，7H和7I显示NeuroD1再生新神经元并保留中风区域中受损的神经元。
图7A显示对照(上排)和NeuroD1组(下排)之间的运动皮质(17dpi)的比较。左侧低放大倍率图显示了中风后的整体皮质形态，而右图显示了梗塞周围区域的放大图像。注意，NeuroD1组不仅显示转化的神经元(GFP+)，还显示未转化的神经元(NeuN+但GFP-，箭头)。比例尺：左侧低倍放大皮层图像为500μm；放大插图图像为40μm；
图7B显示在17dpi时NeuroD1组中NeuroD1和NeuN的免疫荧光染色，说明NeuroD1转化的和未转化的神经元混合在一起。箭头指向未转化的神经元(NeuN+但NeuroD1-)。比例尺：(B)40μm。
图7C是显示对照组和NeuroD1组的梗塞周围区域中NeuN+细胞的定量的图，后者包括NeuroD1+和NeuroD1-神经元。注意，NeuroD1组中未转化的神经元的数量比对照组的数量增加了一倍以上，表明NeuroD1转化的神经保护作用。
图7D和图7E显示神经元树突标志物SMI32(图7D)和MAP2(图7E)的免疫荧光图像，其显示与对照组(上排)相比在NeuroD1组(下排)中大大改善的神经元形态。比例尺：40μm。
图7F和图7G显示轴突标志物SMI312(图7F)，NF200(图7G)和轴突髓鞘形成标志物MBP(图7G)的免疫染色，证明与对照组(上排)相比，NeuroD1组(下排)中轴突和轴突髓鞘形成增加。注意NeuroD1组中NF200和MBP的共定位性优于对照组。比例尺：20μm。
图7H是显示RT-PCR结果的图，其显示与对照相比，NeuroD1组的中风区域中神经元因子(包括NeuN，Robo2和Syn1)的表达水平显著增加。*P＜0.05，单向ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验。n＝每组4只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
图7I是显示从中线向外500-2500μm之间的运动皮层区域中NeuN+细胞总数的定量分析的图。注意，60dpi下的对照组和NeuroD1组之间的显著差异。n＝每组3只小鼠。*P＜0.05，**P＜0.01，双向ANOVA，然后进行Sidak多重比较检验。数据表示为平均值±s.e.m.。
图8A，8B，8C，8D和8E显示NeuroD1治疗后的神经再生和神经保护作用。
图8A是显示对照组和NeuroD1组的梗塞周围区域中NeuN阳性细胞的定量的图。在NeuroD1组中，NeuN阳性细胞进一步分为NeuroD1转化的(GFP+/NeuN+双阳性)和未转化的神经元(GFP阴性)。
图8B显示40dpi时的梗塞周围区域中神经元树突状标志物Map2的代表性图像。比例尺：40μm。
图8C，8D和8E是显示树突状标记物Map2(图8C)，轴突标志物SMI312(图8D)和髓鞘形成标志物MBP(图8E)的信号强度(AU，人工单位)和覆盖面积(％)的定量的图。*P＜0.05，**P＜0.01。单因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验，每组n＝3只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
图9A，9B，9C，9D，9E，9F和9G显示了在中风区域通过NeuroD1介导的细胞转化重建神经回路。
图9A显示低放大倍数图像，其说明GFP对照组(上排)中的皮质组织损失，以及通过NeuroD1治疗(下排)挽救组织损失。GFP标记AAV感染的细胞，DAPI标记细胞核。虚线表示皮质区域。比例尺：400μm。
图9B是显示对照组与NeuroD1组在7，17，40和60dpi时皮质区域(从中线向外3mm)的定量分析结果的图。注意，对照组中稳定的组织损失，但在NeuroD1组中有明显的皮质保留。*P＜0.01，**P＜0.01，***P＜0.005，双向ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验。n＝每组3只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
图9C显示了从内侧(左下)到外侧(上)位置的连续矢状切面的代表性图像，显示了从皮质(框1)中的NeuroD1转化的神经元到纹状体(框2)，丘脑(框3)，和下丘脑(方框4)的轴突投影。比例尺：左矢状位图像为1000μm；插图为40μm。
图9D显示荧光(GFP)和亮视野图像，显示脑切片中的NeuroD1感染的神经元(上图)。底部，代表性痕迹显示在NeuroD1转化的神经元(60dpi)中引起的重复动作电位。
图9E显示在全细胞记录期间在记录移液管中输注生物胞素的结果，随后是固定后免疫染色，表明在60dpi时记录的神经元是GFP+和NeuroD1+，具有复杂顶端树突。比例尺：顶部低倍放大图像为200μm；下排的插图为5μm。
图9F显示在NeuroD1-GFP标记的神经元(60dpi)中记录的兴奋性(sEPSC)和抑制性突触事件(sIPSC)的代表性迹线。
图9G是显示无中风(白色条)或中风(黑色条，GFP对照；条纹条，NeuroD1组)的皮质切片中sEPSC和sIPSC的频率的定量的图。注意，中风后，NeuroD1组的sEPSC和sIPSC频率显著高于对照组(EPSC：对照组，4.3±0.6，n＝22；NeuroD1，6.7±0.8，n＝25；p＝0.023，斯氏t检验)(IPSC：对照，8.6±1.3，n＝22；NeuroD1，14.0±2.0，n＝25；p＝0.032，斯氏t检验)。
图10A，10B和10C显示了NeuroD1治疗后的脑组织修复和长程轴突投射。
图10A显示对照组与NeuroD1组的从前(A)到后(P)的连续脑切片。注意对照组的严重组织损伤。ctx，皮质；c.c.，胼胝体。比例尺：400μm。
图10B显示在60dpi时的H&E(苏木精和伊红)染色也显示对照组中的严重组织损伤。注意对照组中肿大的侧脑室，通常与严重的脑损伤有关。比例尺：400μm。
图10C显示NeuroD1病毒注射后9个月的小鼠皮质的冠状切面，显示通过胼胝体向对侧突出的远程轴突投射。下排示出了胼胝体内轴突投影的放大视图(框1和3中显示的同侧，框4中的对侧)和穿过纹状体的皮质下投影(框2)。比例尺：上排：1000μm，下排：40μm。
图11A，11B，11C，11D，11E，11F，11G和11H显示通过NeuroD1治疗修复血管和血脑屏障。
图11A显示由缺血性损伤诱导的血管和血脑屏障(BBB)破坏。上排表明，在非中风脑中，星形胶质细胞末端(由水通道水通道蛋白4，AQP4，红色标记)包裹在血管周围(由单核细胞和内皮细胞标志物Ly6C，青色标记)以形成完整的BBB。箭头表示AQP4与GFAP在血管周围共定位。下排，中风后1周(wps)，AQP4信号从血管中解离，表明BBB破坏。比例尺：40μm。
图11B显示了中风后对照组和NeuroD1组之间的血管和BBB的比较。上排，对照组显示整个中风区域的破裂的血管和弥散的AQP4信号。下排，NeuroD1组显示出大大改善的与AQP4信号关联的血管，表明细胞转化后修复的BBB(17dpi)。比例尺：40μm。
图11C显示与AQP4共染色的另一血管标志物CD31的免疫荧光图像，证实NeuroD1治疗组(17dpi)中血管和BBB的挽救。比例尺：40μm。
图11D显示AQP4和GFAP的共免疫染色，与NeuroD1组(17dpi)中星形胶质细胞的末端中的浓缩AQP4信号相比，其显示对照组中反应性星形胶质细胞中的错误定位的AQP4信号。比例尺：40μm。
图11E显示了高效图像，与星形细胞末梢与NeuroD1组血管(下图)的良好重新关联相比，显示了对照组(上图)中星形胶质细胞末端(GFAP)与血管(CD31)的解离。比例尺：5μm。
图11F和11G是显示非中风，中风对照组和中风NeuroD1组(17dpi)中AQP4信号强度(图11F)和覆盖面积(图11G)的定量的图。NeuroD1组更接近非中风组。**p＜0.01。单因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验，每组n＝3只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
图11H是显示对照组和NeuroD1组的梗塞周围区域中血管(Ly6C信号)的定量的图。NeuroD1组显示出比对照组显著更多的血管。****P＜0.0001。单因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验，每组n＝3只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
图12A，12B，12C，12D，12E，12F，12G，12H和12I显示NeuroD1介导的细胞转化对受损组织的广泛影响，包括突触恢复和激发-抑制的再平衡。
图12A显示了在膜片钳记录期间输注并随后进行固定后染色的生物胞素的图像，显示了在NeuroD1感染的神经元中沿着树突的高密度的棘。比例尺：50μm。
图12B显示在17dpi时的高尔基体浸渍染色的代表性图像，显示与对照相比，NeuroD1组的梗塞周围区域中的神经元过程和树突棘增加。比例尺：20μm。
图12C显示在17dpi时的VGluT1免疫荧光染色的代表性图像，图12D显示对照和NeuroD1组中信号强度的定量。**P＜0.01，单因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验，每组n＝3只动物。数据表示为平均值±s.e.m.。比例尺：40μm。
图12E显示NeuroD1转化的区域中PV标记的中间神经元的代表性图像，图12F是显示NeuroD1转化的区域中PV标记的中间神经元的定量的图像。注意，PV神经元在60dpi时与NeuroD1转化的神经元(NeuroD1-GFP)混合在一起。NeuroD1组中保留的PV中间神经元数量远多于对照组。**p＜0.01。单因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验，每组n＝3只动物。数据表示为平均值±s.e.m.。比例尺：100μm。
图12G是显示在NeuroD1组中AQP4信号与高密度的表达NeuroD1的细胞的区域中的血管显示出明显关联但在具有低密度的表达NeuroD1的细胞的邻近区域中显示处较少关联的说明性图像(由虚线区分)。比例尺：40μm。
图12H显示生物素灌注分析的代表性图像，证明在对照组的损伤区域中，生物素泄漏到血管外部(由虚线描绘，由Ly6C标记)，而在NeuroD1组的损伤区域中，生物素主要保留在血管内。比例尺：5μm。
图12I显示在60dpi时的梗塞周围区域中星形胶质细胞末端标志物AQP4的代表性图像。注意在NeuroD1组中AQP4与血管的显著重新关联。比例尺：40μm。
图13A，13B，13C和13D显示了NeuroD1治疗后的行为改善。
图13A是用于小鼠前肢运动功能测试的实验设计的示意图。在中风后9天(9dps)和病毒注射前一天，进行行为测试以评估注射ET-1(1-31)或PBS作为模拟对照的小鼠的运动功能。在10dps时注射AAV，并在指定的时间点(20，30，50和70dps)进行行为测试以评估功能恢复。
图13B是显示颗粒取回测试结果的图。与对照组相比，NeuroD1组在中风后表现出加速恢复。运动皮层的缺血性损伤严重损害了食物颗粒取回能力，从中风前的5-6颗粒/5分钟下降到9dps时的1颗粒/5分钟。在NeuroD1治疗后，与对照组相比，颗粒取回能力显示出稳定恢复。注意，对于食物颗粒取回试验，只有前肢的优势侧对侧的运动皮层经中风损伤和测试。双因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验。对于ET-1+对照AAV组，n＝12；对于NeuroD1AAV，n＝11；对于ET-1加无病毒组，n＝6；并且对于PBS组，n＝6。**P＜0.01，***P＜0.001。数据表示为平均值±s.e.m.。
图13C是示出网格行走测试的结果的图。与对照组相比，NeuroD1组显示出较低的足部故障率。中风损伤显著增加了足部故障率。NeuroD1治疗降低了足部故障率。双因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验。对于ET-1+对照AAV对侧组，n＝9；对于ET-1+NeuroD1AAV对侧组，n＝11；对于ET-1+NeuroD1同侧组，n＝5；对于ET-1+对照同侧组，n＝5；ET-1加无病毒对侧组，n＝6；并且对于PBS对侧组，n＝6。**P＜0.01，***P＜0.001。数据表示为平均值±s.e.m.。
图13D是显示圆筒测试结果的图。与对照小鼠相比，NeuroD1治疗的小鼠显示出前肢上举和接触侧壁功能的相当大的恢复。中风损害了小鼠在上举和接触圆柱体壁方面的前肢功能。双因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验。对于中风+对照AAV对侧组，n＝9；对于中风+NeuroD1 AAV对侧组，n＝11；对于中风+NeuroD1同侧组，n＝9；对于中风+对照同侧组，n＝7；对于中风+无病毒对侧组，n＝6；对于PBS对侧组，n＝5。**P＜0.01，****P＜0.0001。数据表示为平均值±s.e.m.。
图14A，14B，14C和14D显示了行为测试后组织损伤的评估。
图14A是从阶梯法(staircase)改进的颗粒取回装置的图片。在18小时饥饿后，训练休息室中的小鼠以到达V形孔中的蔗糖颗粒。从这种设计中可以清楚地看出，小鼠必须花费大量精力与运动协调和力量才能成功地取回食物颗粒。
图14B显示完成行为测试(病毒注射后2个月)后小鼠脑的代表性图片。对照组在ET-1(1-31)诱导的局灶性中风后显示中风侧严重的皮质组织损失，而NeuroD1治疗显示对组织损失的显著挽救。
图14C显示了冠状切片中小鼠皮质的代表性图像，说明了ET-1(1-31)诱导的缺血性中风后的严重组织损失。注意，在一侧的运动皮层和感觉皮层中进行两次ET-1(1-31)注射以诱导更严重的损伤以进行持久的行为测试。因此，组织损失也比大多数细胞转化研究中进行的单次注射更严重。尽管如此，NeuroD1修复效果依然显著。比例尺：1000μm。
图14D是显示行为测试后皮质组织损伤的定量的图。在具有两个ET-1(1-31)注射部位的NeuroD1组中，与对侧非中风侧相比，中风侧也显示出组织损伤(P＝0.012)，但是它远比对照组保存得更好(****P＜0.0001)。双因素ANOVA，然后进行Sidak多重比较检验，每组n＝6只小鼠。数据表示为平均值±s.e.m.。
发明详述
根据本发明的方面，提供了用于治疗个体对象的CNS中正常血流的破坏的影响的组合物和方法。
根据本发明的方面，提供了有效逆转由CNS中正常血流的破坏引起的神经元损失的方法。
出乎意料的是，神经转录因子NeuroD1在反应性星形胶质细胞中的表达在有此需要的个体对象中治疗CNS中正常血流的破坏的影响。因此，本发明提供了治疗对象CNS中正常血流的破坏的病理影响的方法，包括向对象给予治疗有效量的NeuroD1。
向受CNS中正常血流的破坏之影响的对象给予治疗有效量的NeuroD1介导：通过将反应性星形胶质细胞转化为谷氨酸能神经元而产生新的谷氨酸能神经元；减少反应性星形胶质细胞的数量；受损神经元的存活，包括GABA能和谷氨酸能神经元；产生新的非反应性星形胶质细胞；降低非转化的反应性星形胶质细胞的反应性；并将血管重新整合到损伤区域。
向受CNS中正常血流的破坏之影响的对象给予治疗有效量的NeuroD1介导：减少损伤部位的炎症；减少损伤部位的神经抑制；在损伤部位重建正常的小胶质细胞形态；在损伤部位重建神经回路，增加损伤部位的血管；在损伤部位重建血脑屏障；在损伤部位重建正常组织结构；并且改善由于正常血流的破坏而产生的运动缺陷。
需要治疗的对象可以是人或非人哺乳动物，但也可以是非哺乳动物。
令人惊讶的是，给予治疗有效量的NeuroD1以改善有此需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响通常在对象的CNS中正常血流的破坏发生后3至60天，5至45天或8至30天给予反应性星形胶质细胞时比给予静止星形胶质细胞有更大的有益效果，不过可以在对象的CNS中血流的破坏发生之前或之后，包括2天至1年或更晚实现某些益处。
向对象给予NeuroD1可用于治疗由于以下因素引起的流向CNS的正常血流的破坏引起的损伤：缺血，血栓形成，栓塞，出血，脑震荡，肿瘤，感染，炎症，创伤性脑和脊髓损伤，或慢性疾病介导的血管限制，其导致神经元细胞死亡和反应性星形胶质细胞的活化。向对象给予NeuroD1可用于治疗由于向CNS的正常血流的破坏而引起的损伤，包括但不限于缺血性中风或出血性中风；脑动脉瘤；肿瘤；感染；炎症；脑震荡；创伤性脑损伤；创伤性脊髓损伤；缺血性或出血性脊髓病(脊髓梗死)；由心脏骤停或严重低血压(休克)引起的全局缺血；由缺氧，低血糖或贫血引起的缺氧缺血性脑病；由感染性心内膜炎或心房粘液瘤引起的CNS栓塞；纤维软骨栓塞性脊髓病；儿童白血病引起的CNS血栓形成；由肾病综合征(肾病)，慢性炎性疾病，妊娠，使用基于雌激素的避孕药，脑膜炎，和脱水引起的脑静脉窦血栓形成。
根据本发明的方面，治疗对象的CNS中正常血流的破坏的病理影响的方法，包括在CNS中正常血流的破坏的区域中向对象给予治疗有效量的NeuroD1。根据本发明的方面，治疗对象的CNS中正常血流的破坏的病理影响的方法，包括在CNS中正常血流的破坏部位处或附近向对象给予治疗有效量的NeuroD1。根据本发明的方面，治疗对象的CNS中正常血流的破坏的病理影响的方法，包括在CNS中正常血流的破坏引起的神经胶质瘢痕处或附近向对象给予治疗有效量的NeuroD1。
通过MRI诊断，可以对损伤区域给予NeuroD1治疗。电生理学可以评估由神经细胞死亡或损伤引起的神经放电的功能变化。用于测定神经损伤的非侵入性方法包括EEG。可以通过近红外光谱法和fMRI非侵入性地测定向损伤点的血流的破坏。如在动脉瘤中所见，该区域内的血流可以增加，或者如缺血中所见，可以减少。由血流的破坏引起的CNS损伤还导致组织结构的短期和长期变化，其可用于诊断损伤点。在短期内，损伤会导致局部肿胀。长远来看，细胞死亡会导致组织丢失。用于测定由组织死亡引起的结构变化的非侵入性方法包括MRI，PET扫描，CAT扫描或超声。这些方法可以单独使用或以任何组合使用，以确定损伤的病灶。
在根据本发明的特定方面，在如果对象未经治疗则将形成神经胶质瘢痕或已经存在神经胶质瘢痕的损伤部位的外周给予NeuroD1。胶质瘢痕位置可以通过测定组织结构或功能来确定。如上所述，用于测定由组织死亡引起的结构变化的非侵入性方法包括MRI，CAT扫描或超声。功能测定可包括EEG记录。
在根据本发明的特定方面，NeuroD1作为含有编码NeuroD1的DNA序列的表达载体给予。
根据本发明的方面，包括编码NeuroD1的核酸的病毒载体通过注射至对象的中枢或外周神经组织，例如通过脑内注射，脊髓注射和/或注射到脑脊液中，或周围神经节来递送。替代病毒递送方法包括但不限于静脉内注射，鼻内输注，肌内注射，鞘内注射和腹膜内注射。
根据本发明的方面，通过立体定位注射将包含编码NeuroD1的核酸的病毒载体递送到对象的脑中。
术语“表达载体”是指用于在体外或体内将编码NeuroD1的核酸导入宿主细胞的重组载体，其中表达核酸以产生NeuroD1。在特定实施方式中，表达包含SEQ ID NO：1或3或基本相同的核酸序列的表达载体以在含有表达载体的细胞中产生NeuroD1。术语“重组”用于表示核酸构建体，其中两个或更多个核酸连接并且在自然界中未发现它们连接。表达载体包括但不限于质粒，病毒，BAC和YAC。具体的病毒表达载体说明性地包括衍生自腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒和慢病毒的载体。
根据本发明的方面，提供了在有此需要的对象中治疗神经病症的方法，其包括提供包含编码NeuroD1的核酸的病毒载体；并且将病毒载体传递至对象的中枢神经系统或外周神经系统，由此病毒载体分别感染中枢神经系统或外周神经系统的神经胶质细胞，产生感染的神经胶质细胞，从而在感染的神经系统中以治疗有效水平表达外源性NeuroD1，其中与具有相同神经病症的未治疗的对象相比，受感染细胞中NeuroD1的表达在对象中产生更多数量的神经元，由此治疗神经病症。除了新神经元的产生，反应性神经胶质细胞的数量也将减少，导致释放的神经抑制因子减少，神经炎症减少，血管也更均匀分布，从而使局部环境更容许神经元生长或轴突渗透，从而缓解神经病症。
腺相关载体在根据本发明方面的方法中特别有用，并且将在注射部位感染分裂性和非分裂性细胞。腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的ssDNA动物病毒的普遍存在，非致病性，无复制能力的成员。根据本发明的方面，可以使用各种重组腺相关病毒，例如血清型1-9。
根据本发明的方面，“FLEX”开关方法用于在感染细胞中表达NeuroD1。术语“FLEX”和“翻转切除”可互换使用以表示这样的方法，其中两对异型，反平行loxP型重组位点设置在倒置的NeuroD1编码序列的任一侧，其首先经历编码的反转，然后切除两个位点，导致每个正交重组位点中的一个相反取向并且不能进一步重组，实现稳定的倒位，参见例如Schnutgen等，Nature Biotechnology 21：562-565，2003；和Atasoy等，J.Neurosci.，28：7025-7030，2008。由于在神经胶质细胞特异性启动子控制下的位点特异性重组酶将在神经胶质细胞(包括反应性星形胶质细胞)中强烈表达，因此NeuroD1也将在神经胶质细胞(包括反应性星形胶质细胞)中表达。然后，当NeuroD1前面的终止密码子从重组中移除时，组成型或神经元特异性启动子将驱动NeuroD1的高表达，从而允许反应性星形胶质细胞转化为功能性神经元。
根据特定方面，通过给予以下物质而将NeuroD1给予于有此需要的对象：1)腺相关病毒表达载体，所述腺相关病毒表达载体包括在星形胶质细胞特异性启动子如GFAP或S100b或Aldh1L1的转录控制下编码位点特异性重组酶的DNA序列；和2)腺相关病毒表达载体，包括在遍在(组成型)启动子或神经元特异性启动子的转录控制下编码NeuroD1的DNA序列，其中编码NeuroD1的DNA序列被反转并且在错误的方向上表达NeuroD1直至位点特异性重组酶反转编码NeuroD1的反转DNA序列，从而允许表达NeuroD1。
位点特异性重组酶及其识别位点包括，例如，Cre重组酶以及识别位点loxP和lox2272位点，或FLP-FRT重组，或它们的组合。
为了实现最佳感染，应以0.1-5μl/分钟的受控流速注射浓度为1010-1014个腺相关病毒颗粒/ml，1-500μl体积。
根据本发明的方面，腺相关病毒载体通过立体定向注射与编码位点特异性重组酶的腺相关病毒一起递送到对象的脑中，该腺相关病毒载体包括在遍在(组成型)启动子或神经元特异性启动子的转录控制下编码NeuroD1的核酸，其中编码NeuroD1的DNA序列被反转并且对于NeuroD1的表达方向错误，并且还包括位点特异性重组酶的重组酶活性位点，直到位点特异性重组酶反转编码NeuroD1的反向DNA序列，从而允许NeuroD1的表达。
根据本发明的方面，腺相关病毒载体在由CNS中正常血流的破坏位点或区域中通过立体定向注射与编码位点特异性重组酶的腺相关病毒一起递送到对象的脑中，该腺相关病毒载体包括在遍在(组成型)启动子或神经元特异性启动子的转录控制下编码NeuroD1的核酸，其中编码NeuroD1的DNA序列被反转并且对于NeuroD1的表达方向错误，并且还包括位点特异性重组酶的重组酶活性位点，直到位点特异性重组酶反转编码NeuroD1的反向DNA序列，从而允许NeuroD1的表达。任选地，立体定向注射位点在CNS中正常血流破坏引起的神经胶质瘢痕处或附近。
根据本发明的方面，位点特异性重组酶是Cre重组酶，并且重组酶活性的位点是识别位点loxP和lox2272位点。
根据本发明的方面，在治疗期间或之后监测对象的NeuroD1治疗，以监测治疗的进展和/或最终结果。通过正常的电生理学，血流，组织结构和功能的恢复或接近恢复来诊断成功的神经细胞整合和组织微环境恢复的治疗后测定。用于测定神经功能的非侵入性方法包括EEG。可以通过近红外光谱法和fMRI非侵入性地测定血流。用于测定组织结构的非侵入性方法包括MRI，CAT扫描，PET扫描或超声。行为测定可用于非侵入性测定CNS功能的恢复。行为测定应与原始CNS损伤引起的功能丧失相匹配。例如，如果伤害导致瘫痪，应测试患者的活动能力和肢体灵活性。如果损伤导致语言丢失或减慢，则应测定患者通过口语进行交流的能力。NeuroD1治疗后恢复正常行为表明有效神经元回路的成功创建和整合。这些方法可以单独使用或以任何组合使用以测定神经功能和组织健康。评估治疗的测定可以在NeuroD1治疗后的任何时间点进行，例如1天，2天，3天，1周，2周，3周，1个月或更晚。可以在NeuroD1治疗之前进行这样的测定，以便在需要时建立基线比较。
本文使用的科学和技术术语旨在具有本领域普通技术人员通常理解的含义。发现这些术语在各种标准参考文献中被定义和使用，说明性地包括：J.Sambrook和D.W.Russell，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第三版，2001；F.M.Asubel编，《新编分子生物学简明方案》(Short Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols)，第五版，2002；B.Alberts等，《细胞分子生物学》(Molecular Biology of theCell)，第四版，Garland，2002；D.L.Nelson和M.M.Cox，《Lehninger生化原理》(LehningerPrinciples of Biochemistry)，第四版，WHF公司(W.H.Freeman&Company)，2004；Engelke，D.R.，《RNA干扰(RNAi)：RNAi技术的基本要点》(RNA Interference(RNAi)：Nuts and Boltsof RNAi Technology)，DNA Press LLC，Eagleville，PA，2003；Herdewijn，p.(编)，《寡核苷酸合成：方法和应用，分子生物学方法》(Oligonucleotide Synthesis：Methods andApplications，Methods in Molecular Biology)，胡马纳出版社(Humana Press)，2004；A.Nagy，M.Gertsenstein，K.Vintersten，R.Behringer，《小鼠胚胎操作：实验室手册》(Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，第三版，2002年12月15日，ISBN-10：0879695919；Kursad Turksen(编)，《胚胎干细胞：分子生物学方法中的方案和方法》(Embryonic Stem Cells：Methods and Protocols in Methodsin Molecular Biology)，2002；185，胡马纳出版社：《新编干细胞生物学方案》(CurrentProtocols in Stem Cell Biology)，ISBN：9780470151808。
单数术语“一个”、“一种”和“该”并不旨在限定，除非明确声明或语境清楚表明以外，其包括复数形式。
术语“NeuroD1蛋白”是指参与胚胎脑发育和成体神经发生的bHLH原神经转录因子，参见Cho，J.H.等，Mol，Neurobiol.，30：35-47，2004；Kuwabara，T.等，NatureNeurosci.，12：1097-1105，2009；和Gao，Z.等，Nature Neurosci.，12：1090-1092，2009。NeuroD1在发育晚期表达，主要在神经系统中表达，并参与神经元分化，成熟和存活。
术语“NeuroD1蛋白”包括人NeuroD1蛋白，在此标识为SEQ ID NO：2和小鼠NeuroD1蛋白，在此标识为SEQ ID NO：4。除了具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的NeuroD1蛋白，术语“NeuroD1蛋白”包括NeuroD1蛋白的变体，例如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的变体，其可以包括在本发明的方法中。如本文所用，术语“变体”是指天然存在的遗传变异和重组制备的变异，其中与参考NeuroD1蛋白，例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4相比，每个变异在其氨基酸序列中包含一个或多个变化。这种变化包括其中一个或多个氨基酸残基被氨基酸取代，添加或缺失修饰的变化。术语“变体”包括人NeuroD1的直向同源物，包括例如哺乳动物和鸟NeuroD1，例如但不限于来自非人灵长类动物，猫，狗，绵羊，山羊，马，牛，猪，鸟，家禽动物和啮齿动物，例如但不限于小鼠和大鼠的NeuroD1直向同源物。在一个非限制性示例中，本文例示为氨基酸序列SEQ ID NO：4的小鼠NeuroD1是人NeuroD1的直向同源物。
优选的变体与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。
突变可以通过使用标准分子生物学技术引入，如定点诱变和PCR介导的诱变。本领域技术人员将认识到可以引入一个或多个氨基酸突变而不改变NeuroD1蛋白的功能特性。例如，可以在不改变SEQ ID NO：2或4的NeuroD1蛋白的功能特性的情况下进行一个或多个氨基酸取代，添加或缺失。
可以在NeuroD1蛋白中进行保守氨基酸取代以产生NeuroD1蛋白变体。保守氨基酸取代是本领域公认的用具有相似特征的一种氨基酸取代另一种氨基酸。例如，每种氨基酸可描述为具有一种或多种以下特征：正电性，电负性，脂肪族，芳香族，极性，疏水性和亲水性。保守取代是用具有特定结构或功能特征的一种氨基酸取代另一种具有相同特征的氨基酸。酸性氨基酸包括天冬氨酸，谷氨酸；碱性氨基酸包括组氨酸，赖氨酸，精氨酸；脂肪族氨基酸包括异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸，甘氨酸，酪氨酸和色氨酸；极性氨基酸包括天冬氨酸，谷氨酸，组氨酸，赖氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸；疏水性氨基酸包括丙氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，脯氨酸，缬氨酸和色氨酸；并且保守取代包括各组内氨基酸间的取代。氨基酸也可以用相对大小来描述，丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，苏氨酸，丝氨酸，缬氨酸，所有这些通常被认为是小的。
NeuroD1变体可包括合成氨基酸类似物，氨基酸衍生物和/或非标准氨基酸，说明性地包括但不限于α-氨基丁酸，瓜氨酸，刀豆氨酸，氰基丙氨酸，二氨基丁酸，二氨基庚二酸，二羟基苯丙氨酸，二苯甲酸，高精氨酸，羟脯氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，3-磷酸丝氨酸，高丝氨酸，5-羟色氨酸，1-甲基组氨酸，3-甲基组氨酸和鸟氨酸。
为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分数，以最优比较目的进行序列比对(例如，可以在第一氨基酸或核酸的序列中映入间隙，用于与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中某位置上占据的氨基酸残基或核苷酸与第二序列中相应位置上的相同时，则这些分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比相同性是序列所共有的相同位置的数目的函数(即，％相同性＝相同重叠位置数/总位置数×100％)。在一个实施方式中，这两个序列的长度相同。
也可采用数学算法确定两个序列的序列相同性百分数。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性示例是Karlin和Altschul，1990，PNAS 87：2264 2268的算法，如Karlin和Altschul，1993，PNAS.90：5873 5877中的修改。所述算法整合在Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序中。用NBLAST核苷酸程序参数集进行BLAST核苷酸搜索，例如，对于得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。
用XBLAST程序参数集进行BLAST蛋白质搜索，例如，得分50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的带缺口(gapped)比对结果，如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389 3402所述利用缺口BLAST。或者，使用PSI-BLAST以进行迭代搜索，其检测分子之间的远近关系。利用BLAST、带缺口BLAST和PSI-Blast程序时，使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如NCBI网站)。
用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性示例是Myers和Miller，1988，CABIOS 4：11 17的算法。这样的算法被并入ALIGN程序(版本2.0)，其是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，使用PAM120加权残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。
使用与上述类似的技术确定两个序列之间的相同性百分比，允许或不允许间隙。在计算百分比相同性时，通常仅计算完全匹配。
术语“NeuroD1蛋白”包括可在本发明的方法和组合物中操作的NeuroD1蛋白的片段，例如SEQ ID NO：2和4的片段及其变体。
NeuroD1蛋白和核酸可以从天然来源分离，例如生物体的脑或表达NeuroD1的细胞系的细胞。或者，可以重组产生NeuroD1蛋白或核酸，例如通过使用表达构建体在体外或体内表达。NeuroD1蛋白和核酸也可以通过众所周知的方法合成。
包含在本发明的方法和组合物中的NeuroD1优选使用重组核酸技术产生。重组NeuroD1的产生包括将包含编码NeuroD1的DNA序列的重组表达载体导入宿主细胞。
根据本发明的实施方式，被导入宿主细胞以产生NeuroD1的编码NeuroD1的核酸序列编码SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4或其变体。
根据本发明的方面，本文中鉴定为SEQ ID NO：1的核酸序列编码SEQ ID NO：2并包含在表达载体中并表达以产生NeuroD1。根据本发明的方面，本文中鉴定为SEQ ID NO：3的核酸序列编码SEQ ID NO：4并包含在表达载体中并表达以产生NeuroD1。
应理解，由于遗传密码的简并性质，与SEQ ID NO：1和3基本相同的核酸序列编码NeuroD1和NeuroD1的变体，并且这些替代核酸可以包括在表达载体中并表达以产生NeuroD1和NeuroD1的变体。本领域技术人员将理解，编码NeuroD1蛋白的核酸片段可用于产生NeuroD1蛋白的片段。
表达载体含有核酸，所述核酸包括编码目的多肽的区段，所述区段与一个或多个调节元件操作性地连接，所述调节元件提供编码目的多肽的区段的转录。如本文所用的术语“操作性地连接”是指与第二核酸具有功能关系的核酸。术语“操作性地连接”包括两个或更多个核酸分子的功能连接，例如待转录的核酸和调节元件。如本文所用的术语“调节元件”是指控制操作性地连接的核酸的表达的某些方面的核苷酸序列。示例性调节元件包括增强子，例如但不限于：土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)；内部核糖体进入位点(IRES)或2A结构域；内含子；复制起点；多腺苷酸化信号(pA)；启动子；转录终止序列；和上游调节结构域，其有助于操作性地连接的核酸序列的复制，转录，转录后加工。本领域普通技术人员能够在表达载体中选择和使用这些和其他调节元件，而不仅仅是常规实验。
如本文所用的术语“启动子”是指与待转录的核酸序列操作性地连接的DNA序列，例如编码NeuroD1的核酸序列。启动子通常位于待转录的核酸序列的上游，并提供RNA聚合酶和其他转录因子特异性结合的位点。在具体的实施方式中，启动子通常位于转录产生所需分子的核酸序列的上游，并提供RNA聚合酶和其他转录因子特异性结合的位点。
如本领域技术人员将认识到的，可以分离基因的5′非编码区并将其整体用作启动子以驱动操作性地连接的核酸的表达。或者，可以分离5′非编码区的一部分并用于驱动操作性地连接的核酸的表达。通常，基因的5′非编码区的约500-6000bp用于驱动操作性地连接的核酸的表达。任选地，使用基因的5′非编码区的一部分，其含有驱动操作性地连接的核酸表达所需的最小量的5′非编码区。确定基因的5′非编码区的指定部分驱动操作性地连接的核酸表达的能力的测定是本领域熟知的。
用于根据本文所述的方法驱动NeuroD1表达的特定启动子是“遍在”或“组成型”启动子，其驱动表达载体转移到其中的生物体的许多，大多数或所有细胞类型中的表达。可用于表达NeuroD1的遍在启动子的非限制性示例是巨细胞病毒启动子；猿猴病毒40(SV40)早期启动子；劳氏肉瘤病毒启动子；腺病毒主要晚期启动子；β肌动蛋白启动子；甘油醛3-磷酸脱氢酶；葡萄糖调节蛋白78启动子；葡萄糖调节蛋白94启动子；热休克蛋白70启动子；β-驱动蛋白启动子；ROSA促进剂；泛素B启动子；真核起始因子4A1启动子和延伸因子I启动子；所有这些都是本领域公知的，并且可以使用常规方法从主要来源分离或从商业来源获得。启动子可以完全来自单个基因，或者可以是嵌合的，具有衍生自一种以上基因的部分。
调节序列的组合可以包括在表达载体中并用于驱动NeuroD1的表达。包含在驱动NeuroD1表达的表达载体中的非限制性示例是CAG启动子，其结合巨细胞病毒CMV早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子。
根据本文描述的方法用于驱动NeuroD1表达的特定启动子是那些优先在神经胶质细胞，特别是星形胶质细胞和/或NG2细胞中驱动表达的启动子。这种启动子被称为“星形胶质细胞特异性”和/或“NG2细胞特异性”启动子。
星形胶质细胞特异性启动子的非限制性示例是胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子和醛脱氢酶1家族，成员L1(Aldh1L1)启动子。人GFAP启动子在本文中显示为SEQ ID NO：6。小鼠Aldh1L1启动子在本文中显示为SEQ ID NO：7。
NG2细胞特异性启动子的非限制性示例是硫酸软骨素蛋白多糖4基因的启动子，也称为神经胶质细胞抗原2(NG2)。人NG2启动子在本文中显示为SEQ ID NO：8。
根据本文描述的方法用于驱动NeuroD1表达的特定启动子是那些优先在反应性神经胶质细胞，特别是反应性星形胶质细胞和/或反应性NG2细胞中驱动表达的启动子。这种启动子被称为“反应性星形胶质细胞特异性”和/或“反应性NG2细胞特异性”启动子。
“反应性星形胶质细胞特异性”启动子的非限制性示例是脂质运载蛋白2(lcn2)基因的启动子。小鼠lcn2启动子在本文中显示为SEQ ID NO：5。
遍在和细胞类型特异性启动子的同源物和变体可用于表达NeuroD1。
启动子同源物和启动子变体可以包括在用于表达根据本发明的NeuroD1的表达载体中。术语“启动子同源物”和“启动子变体”是指具有基本上相似的功能特性的启动子，与本文公开的那些相比，其在操作性地连接的编码NeuroD1的核酸上赋予所需类型的表达，例如NeuroD1的细胞类型特异性表达或NeuroD1的遍在表达。例如，与GFAP，S100b，Aldh1L1，NG2，lcn2和CAG启动子相比，启动子同源物或变体具有基本上相似的功能特性以在编码NeuroD1的操作性地连接的核酸上赋予细胞类型特异性表达。
本领域技术人员将认识到可以引入一个或多个核酸突变而不改变给定启动子的功能特性。突变可以通过使用标准分子生物学技术引入，如定点诱变和PCR介导的诱变，以产生启动子变体。如本文所用，术语“启动子变体”是指参考启动子的分离的天然存在的或重组制备的变体，所述参考启动子例如但不限于GFAP，S100b，Aldh1L1，NG2，lcn2和pCAG启动子。
本领域已知来自其他物种的启动子是功能性的，例如，小鼠Aldh1L1启动子在人细胞中是功能性的。可以使用本领域已知的生物信息学工具鉴定来自其他物种的同源物和同源启动子，参见例如Xuan等，2005，Genome Biol 6：R72；Zhao等，2005，Nucl Acid Res 33：D103-107；和Halees等，2003，Nucl.Acids.Res.2003 31：3554-3559。
在结构上，NeuroD1或/和/或遍在启动子的细胞类型特异性启动子的同源物和变体与参考发育调节和/或遍在启动子的核酸序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，并且包括用于结合RNA聚合酶的位点和任选地一个或多个转录因子结合位点。
与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3基本相同的核酸序列的特征在于具有能够在高严谨杂交条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3杂交的互补核酸序列。
除了编码NeuroD1的一种或多种核酸外，编码其他蛋白质的一种或多种核酸序列可以包括在表达载体中。例如，此类其他蛋白质包括非NeuroD1蛋白质，例如报告分子，包括但不限于β-半乳糖苷酶，绿色荧光蛋白和抗生素抗性报告分子。
在特定实施方式中，重组表达载体至少编码SEQ ID NO：2的NeuroD1，与SEQ IDNO：2具有至少95％相同性的蛋白质，或由与SEQ ID NO：1基本相同的核酸序列编码的蛋白质。
在特定实施方式中，重组表达载体至少编码SEQ ID NO：4的NeuroD1，与SEQ IDNO：4具有至少95％相同性的蛋白质，或由与SEQ ID NO：2基本相同的核酸序列编码的蛋白质。
SEQ ID NO：9是包含与编码NeuroD1的核酸操作性地连接的CAG启动子的核酸的示例，并且还包括编码EGFP的核酸序列和增强子WPRE。IRES分离编码NeuroD1的核酸和编码EGFP的核酸。将SEQ ID NO：9插入表达载体中以表达NeuroD1和报告基因EGFP。任选地，去除IRES和编码EGFP的核酸，并将剩余的CAG启动子和操作性地连接的编码NeuroD1的核酸插入表达载体中以表达NeuroD1。任选地包括WPRE或另一个增强子。
任选地，报告基因包含在编码NeuroD1的重组表达载体中。可以包括报告基因以产生肽或蛋白质，其用作从重组表达载体表达NeuroD1的替代标志物。如本文所用的术语“报告基因”是指当表达时易于检测的基因，例如通过化学发光，荧光，比色反应，抗体结合，诱导型标志物和/或配体结合测定。示例性报告基因包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，增强型绿色荧光蛋白(eGFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，增强型黄色荧光蛋白(eYFP)，青色荧光蛋白(CFP)，增强型青色荧光蛋白(eCFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)，增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)，MmGFP(Zernicka-Goetz等，Development，124：1133-1137，1997)，dsRed，荧光素酶和β-半乳糖苷酶(lacZ)。
将遗传物质引入受体宿主细胞的过程，例如用于在宿主细胞中瞬时或稳定表达由遗传物质编码的所需蛋白质的过程称为“转染”。转染技术在本领域中是公知的，并且包括但不限于电穿孔，粒子加速转化，也称为“基因枪”技术，脂质体介导的转染，磷酸钙或氯化钙共沉淀介导的转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，显微注射，聚乙二醇介导的转染，热休克介导的转染和病毒介导的转染。如本文所述，病毒介导的转染可以使用病毒载体完成，例如衍生自腺病毒，腺相关病毒和慢病毒的那些载体。
任选地，宿主细胞离体转染，然后重新导入宿主生物体。例如，可以从对象中取出细胞或组织，用编码NeuroD1的表达载体转染，然后返回对象。
在体外或体内将包含编码NeuroD1或其功能片段的核酸的重组表达载体导入宿主神经胶质细胞中以在宿主神经胶质细胞中表达外源性NeuroD1以将神经胶质细胞转化为神经元通过以下多种转染方法中的任一种实现。
外源性NeuroD1在宿主神经胶质细胞中表达以将神经胶质细胞转化为神经元任选地通过在体外或体内将编码NeuroD1或其功能片段的mRNA导入宿主神经胶质细胞来实现。
外源性NeuroD1在宿主神经胶质细胞中表达以将神经胶质细胞转化为神经元任选地通过在体外或体内将编码NeuroD1蛋白导入宿主神经胶质细胞来实现。
这些和其他技术的细节在本领域中是已知的，例如，如J.Sambrook和D.W.Russell，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第三版，2001；F.M.Ausubel编，《新编简明分子生物学方案》(Short Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols)，第五版，2002；和Engelke，D.R.，《RNA干扰(RNAi)：RNAi技术的基本要点》(RNAInterference(RNAi)：Nuts and Bolts of RNAi Technology)，DNA出版社有限责任公司(DNA Press LLC)，宾夕法尼亚州伊格尔维尔(Eagleville)，2003中所述。
包含编码NeuroD1或其功能片段的核酸，编码NeuroD1的mRNA或其功能片段，和/或NeuroD1蛋白、其全长或功能片段的表达载体任选地在体外或体内与运载体一起引入宿主细胞。
在特定方面，运载体是颗粒载体，例如脂质颗粒，包括脂质体，胶束，单层或多层囊泡；聚合物颗粒，如水凝胶颗粒，聚乙醇酸颗粒或聚乳酸颗粒；无机颗粒，如磷酸钙颗粒，如美国专利号5,648,097中所述；和无机/有机颗粒运载体，例如美国专利号6,630,486中所述。
颗粒运载体可选自脂质颗粒；聚合物颗粒；无机颗粒；和无机/有机颗粒。还可以包括颗粒类型的混合物作为颗粒药学上可接受的运载体。
通常配制颗粒运载体使得颗粒的平均粒度为约1nm-10微米。在特定方面，配制颗粒运载体使得颗粒的平均粒度为约1nm-100nm。
脂质体的进一步描述和与其制备和使用有关的方法可以在《脂质体：实践方法》(实践方法系列，264)(Liposomes：A Practical Approach(The Practical ApproachSeries，264))，V.P.Torchilin和V.Weissig(编)，牛津大学出版社(Oxford UniversityPress)，第二版，2003中找到。在S.M.Moghimi等，FASEB J.2005，19，311-30中描述了纳米颗粒的其他方面。
使用重组表达载体表达NeuroD1是通过将表达载体导入真核或原核宿主细胞表达系统如昆虫细胞，哺乳动物细胞，酵母细胞，细菌细胞或本领域公认的任何其他单细胞或多细胞生物体来完成的。宿主细胞任选为原代细胞或永生化衍生细胞。永生化细胞是可以在体外维持至少5次复制传代的细胞。
含有重组表达载体的宿主细胞在产生NeuroD1的条件下维持。可以使用已知的细胞培养技术培养和维持宿主细胞，例如Celis，Julio编，1994，《细胞生物学实验室手册》(Cell Biology Laboratory Handbook)，学术出版社(Academic Press)，纽约。这些细胞的各种培养条件，包括关于特定营养素的培养基配方，氧气，张力，二氧化碳和降低的血清水平可以通过本领域技术人员选择和优化。
根据本发明的方面，将包含编码NeuroD1的核酸的重组表达载体引入对象的神经胶质细胞中。神经胶质细胞中外源性NeuroD1的表达将神经胶质细胞“转化”为神经元。
根据本发明的方面，将包含编码NeuroD1的核酸或其功能片段的重组表达载体导入对象的星形胶质细胞中。神经胶质细胞中外源性NeuroD1的表达将星形胶质细胞“转化”为神经元。
根据本发明的方面，将包含编码NeuroD1的核酸或其功能片段的重组表达载体导入对象的反应性星形胶质细胞中。外源性NeuroD1或其功能片段在反应性星形胶质细胞中的表达将反应性星形胶质细胞“转化”为神经元。
根据本发明的方面，将包含编码NeuroD1的核酸或其功能片段的重组表达载体导入对象的NG2细胞中。外源性NeuroD1或其功能片段在NG2细胞中的表达将NG2细胞“转化”为神经元。
在引入包含编码外源性NeuroD1或其功能片段的核酸的重组表达载体后检测外源性NeuroD1的表达使用任何各种标准方法完成，包括但不限于检测NeuroD1的免疫测定，检测NeuroD1核酸的核酸测定和检测与外源性NeuroD1共表达的报告基因。
术语“转化”和“转化的”在本文中用于描述NeuroD1或其功能片段的表达的作用，导致神经胶质细胞，星形胶质细胞或反应性星形胶质细胞表型变为神经元表型。类似地，短语“NeuroD1转化的神经元”和“转化的神经元”在本文中用于表示包含外源性NeuroD1蛋白或其功能片段的细胞，其具有随后的神经元表型。
术语“表型”是指本文提到的细胞的众所周知的可检测特征。神经元表型可以是但不限于以下一种或多种：神经元形态，一种或多种神经元标志物的表达，神经元的电生理学特征，突触形成和神经递质的释放。例如，神经元表型包括但不限于：神经元的特征形态方面，例如树突，轴突和树突棘的存在；特征性神经元蛋白质表达和分布，如突触斑点中突触蛋白的存在，树突中MAP2的存在；和特征性电生理学迹象，如自发性和诱发性突触事件。
在另一个示例中，胶质细胞表型如星形胶质细胞表型和反应性星形胶质细胞表型包括但不限于：星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞的特征形态学方面，例如一般的“星形”形态；和特征性星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞蛋白质表达，如胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的存在。
术语“核酸”是指具有超过一个任何形式的核苷酸的RNA或DNA分子，包括单链，双链，寡核苷酸或多核苷酸。术语“核苷酸序列”是指单链核酸形式的寡核苷酸或多核苷酸中核苷酸的排序。
术语“NeuroD1核酸”是指分离的NeuroD1核酸分子，并且包括与SEQ ID NO：1或SEQID NO：3所示的DNA序列，或其互补序列，或其片段具有至少70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的序列的分离的NeuroD1核酸，或具有在高度严谨杂交条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核酸，其互补物或其片段杂交的序列的分离的DNA分子。
SEQ ID NO：3的核酸是分离的DNA分子的示例，其具有在高度严谨杂交条件下与SEQ ID NO：1所示核酸杂交的序列。NeuroD1核酸的片段是NeuroD1核酸的任何片段，其可在本发明的方面中操作，包括NeuroD1核酸。
能够与靶NeuroD1 mRNA或cDNA杂交的核酸探针或引物可用于检测和/或定量编码NeuroD1蛋白的mRNA或cDNA。核酸探针可以是长度为至少10，15，30，50或100个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严谨条件下与NeuroD1 mRNA或cDNA或其互补序列特异性杂交。核酸引物可以是长度为至少10，15或20个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严谨条件下与mRNA或cDNA或其互补序列特异性杂交。
术语“互补”和“互补的”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，具体是指通过两个氢键与腺嘌呤残基连接的胸腺嘧啶或尿嘧啶残基，以及通过三个氢键连接的胞嘧啶和鸟嘌呤残基之间彼此氢键合的核苷酸。通常，核酸包括描述为与指定的第二核苷酸序列具有“百分比互补性”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％，90％或100％的互补性，表明序列的10个核苷酸中的8个，10个中的9个或10个中的10个与指定的第二个核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3′-TCGA-5′与核苷酸序列5′-AGCT-3′100％互补。此外，核苷酸序列3′-TCGA-与核苷酸序列5′-TTAGCTGG-3′的区域100％互补。
术语“杂交”和“杂合”是指互补核酸的配对和结合。如本领域所熟知的，杂交在两种核酸之间以不同程度发生，这取决于诸如核酸的互补程度，核酸的解链温度，Tm和杂交条件的严谨性等因素。术语“杂交条件的严谨性”是指温度条件，离子强度和杂交介质的组成，相对于特定常见添加剂如甲酰胺和Denhardt溶液。
确定与指定的核酸有关的特定杂交条件是常规的并且是本领域熟知的，例如，如J.Sambrook和D.W.Russell，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；第三版，2001年；和F.M.Ausubel编，《新编简明分子生物学方案》(Short Protocols in MolecularBiology，Current Protocols)；第5版，2002。高严谨杂交条件是仅允许基本上互补的核酸杂交的条件。通常，具有约85-100％互补性的核酸被认为是高度互补的并且在高严谨条件下杂交。中等严谨条件的例子是具有中等互补性，约50-84％互补性的核酸以及具有高度互补性的核酸杂交的条件。相反，低严谨杂交条件是其中具有低互补性的核酸杂交的条件。
术语“特异性杂交”和“特异性杂合”是指特定核酸与靶核酸的杂交，而基本上不与样品中的靶核酸之外的核酸杂交。
杂交和洗涤条件的严谨性取决于若干因素，包括靶标和探针的Tm以及杂交和洗涤条件的离子强度，如本领域技术人员所熟知的。杂交和实现所需杂交严谨性的条件描述于例如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，2001；和Ausubel，F.等(编)，《简明分子生物学方案》(ShortProtocols in Molecular Biology)，威立出版社(Wiley)，2002。
高严谨杂交条件的一个例子是在含有6X SSC，5X Denhardt溶液，30％甲酰胺和100微克/ml变性鲑鱼精子的溶液中在37℃下杂交超过约100个核苷酸长度的核酸，然后在60℃下在0.1X SSC和0.1％SDS的溶液中洗涤15分钟。SSC是0.15M NaCl/0.015M柠檬酸钠。Denhardt溶液是0.02％牛血清白蛋白/0.02％FICOLL/0.02％聚乙烯吡咯烷酮。在高严谨条件下，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3将与基本相同的靶标的互补物杂交，而不与不相关的序列杂交。
根据本发明的方面提供了治疗有需要的对象的神经病症的方法，其包括将治疗有效量的NeuroD1递送至对象的中枢神经系统或外周神经系统的神经胶质细胞，与具有相同神经病症的未治疗对象相比，神经胶质细胞中治疗有效量的NeuroD1导致对象中更多数量的神经元，从而治疗神经病症。
反应性神经胶质细胞向神经元的转化还减少了与反应性神经胶质细胞相关的神经炎症和神经抑制因子，从而使神经胶质瘢痕组织更容许神经元生长，从而减轻神经病症。
如本文所用术语“神经病症”是指对象的中枢神经系统和/或外周神经系统的任何病症，其被额外的神经元减轻，改善或预防。导致神经元丧失或抑制和/或神经元功能丧失或抑制的损伤或疾病是通过根据本发明方面的方法治疗的神经学病症。
导致谷氨酸能神经元丧失或抑制和/或谷氨酸能神经元功能丧失或抑制的损伤或疾病是通过根据本发明方面的方法治疗的神经学病症。可以用类似的方法治疗其他类型的神经元(例如GABA能，胆碱能，多巴胺能，去甲肾上腺素能或5-羟色胺能神经元)的丧失或抑制。
因此，例如，导致神经元丧失或抑制和/或神经元功能丧失或抑制的损伤或疾病，包括但不限于阿尔茨海默病，帕金森病，肌萎缩侧索硬化症(ALS)，中风，癫痫，诸如脑或脊髓损伤和肿瘤的身体损伤是通过根据本发明的方面的方法治疗的神经病症。
如本文所用术语“治疗有效量”指有效减轻，改善或预防待治疗的神经病症的症状或体征的本发明组合物的量。在具体的实施方式中，治疗有效量是在具有神经病症的体征和/或症状的对象中具有有益作用的量。
本文所用的术语“治疗”，“处理”和“NeuroD1治疗”或语法同义词是指减轻，抑制或改善神经病症，神经病症的症状或体征，以及预防神经病症的症状或体征，并且包括但不限于治疗性和/或预防性处理。
神经病症的体征和症状在本领域中是众所周知的，同时还有检测和评估这些体征和症状的方法。
根据本发明方面给予针对对象的神经病症的疗法组合。
根据特定方面，向对象给予另外的药剂或治疗性处理以治疗有此需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响，包括治疗，例如但不限于去除血凝块，促进血液流动，给予一种或多种抗炎剂，给予一种或多种抗氧化剂，和给予一种或多种有效降低兴奋性毒性的药剂。
术语“对象”是指人类以及非人类哺乳动物，例如但不限于非人类灵长类动物，猫，狗，绵羊，山羊，马，牛，猪和啮齿动物，例如但不限于，小鼠和大鼠；以及非哺乳动物，例如但不限于鸟类，家禽，爬行动物，两栖动物。
发明组合物和方法的实施方式在下面实施例中阐述。提供这些实施例是为了说明的目的，并不认为是对本发明组合物和方法范围的限制。
实施例
材料和方法
中风小鼠模型和病毒注射
野生型(WT)FVB/NJ和GFAP-GFP转基因小鼠用于本研究中描述的大多数实验。GFAP-GFP转基因小鼠购自杰克逊实验室公司(Jackson Laboratory)[FVB/N-Tg(GFAPGFP)14Mes/J]，描述于Zhuo，L.等，1997，Dev Biol 187，36-42，并与FVB/NJ小鼠(杰克逊实验室)交配。将内皮素-1(1-31)注射到成年WT FVB/NJ或GFAPA-GFP转基因小鼠(28-40g，5-10个月大)的运动皮质中以产生局灶性缺血性损伤，如Horie，N.等，2008，J.Neurosci.Methods173，286-290；和Roome，R.B.等，2014，J.Neurosci.Methods，233，34-44中所述。
在通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/kg氯胺酮；12mg/kg甲苯噻嗪)麻醉下，将小鼠置于立体定位装置中，通过中线切口暴露颅骨和前囟。在前肢运动皮层(相对于前囟)的坐标处在颅骨上钻出约1mm的小孔：+0.2mm前-后(AP)，±1.5mm内侧-外侧(ML)。将ET-1(1-31)(肽国际公司(Peptide international，Inc.)，PED-4360-s)以2μg/μl溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS；OSM-320，pH约7.3)中。
从-1.6mm背腹轴(DV)开始，将总体积0.5μl(1μg)注射到每个部位。在整个10分钟内通过输注泵进行注射，并以0.1mm/分钟的速度缓慢回退注射针。注射后，将针在1.1mm DV下保持另外3分钟，然后完全取出。
病毒注射遵循类似的程序，除了病毒注射通常在ET-1注射后约10天通过用于ET-1注射的钻出的相同孔来进行。
使用5-10个月大的小鼠。将小鼠圈养在12小时光照/黑暗循环中，并提供足够的食物和水。使用雄性和雌性小鼠，除了在行为实验中仅使用雄性小鼠。
AAV载体构建
从pDRIVE-hGFAP质粒(InvivoGen公司)获得hGFAP启动子，并在MluI和SacII之间将其插入pAAV-MCS(细胞生物实验室公司(Cell Biolab))中以替换CMV启动子。通过PCR从hGFAP-Cre(Addgene质粒#40591)获得Cre基因，并在EcoRI和Sal1位点之间插入pAAV MCS中以产生pAAV-hGFAP：：Cre载体。
为了构建pAAV-FLEX-mCherry-P2A-mCherry(或pAAV-FLEX-GFP-P2A-GFP)和pAAV-FLEX-NeuroD1-P2A-mCherry(或pAAV-FLEX-NeuroD1-P2A-GFP)载体，使用Guo，Z.等，2014，Cell Stem Cell 14，188-202中描述的逆转录病毒构建体通过PCR获得编码NeuroD1，mCherry或GFP的cDNA。
将NeuroD1基因与P2A-mCherry或P2A-GFP融合，并在Kpn1和Xho1位点之间亚克隆到pAAV-FLEX-GFP载体(Addgene质粒#28304)中。对质粒构建体进行测序以进行验证。
AAV病毒生产
在293AAV细胞(细胞生物实验室公司(Cell Biolabs))中产生重组AAV9。简言之，使用聚乙烯亚胺(PEI，线性，MW 25,000)进行三质粒转染：pAAV表达载体、pAAV9-RC(细胞生物实验室公司)和pHelper(细胞生物实验室公司)。
转染后72小时，将细胞在其培养基中从平板上刮下并通过将它们交替置于干冰/乙醇和37℃水浴中离心，冷冻和解冻四次。AAV粗裂解物以Beckman SW55Ti离心机在不连续碘克沙醇梯度中以54,000rpm离心1小时纯化。
提取含病毒层，并且通过密理博公司(Millipore)Amicon Ultra离心过滤器浓缩病毒。通过QuickTiterTM AAV定量试剂盒(细胞生物实验室)测定，对于hGFAP：：Cre，hGFAP：：NeuroD1-GFP和hGFAP：：GFP，病毒滴度为1.2×1012GC/ml，对于CAG：：FLEX-NeuroD1-P2A-GFP和CAG：：FLEX-NeuroD1-P2A-mCherry，病毒滴度为1.4×1012GC/ml，和对于CAG：：FLEX-mCherry-P2A-mCherry和CAG：：FLEX-GFP-P2A-GFP为1.6×1012GC/ml。
生成逆转录病毒
pCAG-NeuroD1-IRES-GFP和pCAG-GFP描述于Guo，Z.等，2014，Cell Stem Cell 14，188-202。为了包装逆转录病毒颗粒，用靶质粒与水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)载体一起转染gpg无辅助人胚胎肾(HEK)细胞，以产生表达NeuroD1或GFP的逆转录病毒。在转导HEK细胞后测定的逆转录病毒颗粒的滴度约为107个颗粒/ml。
免疫组化
如Guo，Z.等，2014，Cell Stem Cell 14，188-202中所述进行对小鼠脑漂浮冷冻切片的免疫组织化学。用2.5％阿佛丁麻醉动物并用人工脑脊液(ACSF)经心灌注以洗掉脑组织中的血液。然后，将脑切开，修剪，并放入4％多聚甲醛(PFA)中，在4℃下固定过夜。固定后，通过振动切片机(徕卡(Leica))将脑组织切成40μm切片。
将脑切片在PBS中的2％曲通X-100中透化1小时，然后在封闭缓冲液(PBS中2.5％正常山羊血清，2.5％正常驴血清和0.1％曲通X-100)中孵育1小时。将一抗与脑切片加入封闭缓冲液中，并在4℃下孵育过夜。
在PBS中洗去一抗后，将脑切片与偶联有不同荧光团的二抗(1∶800，杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))在室温下孵育1小时，在曲通-PBS中洗涤，然后用含有DAPI(英杰公司(Invitrogen))的抗衰减固定溶液固定到载玻片上。用共聚焦显微镜(Olympus FV1000或Zeiss LSM800)和Keyence显微镜获得图像。
为了测试抗体特异性，撤去一抗，并且仅将二抗用于免疫染色，作为所有一抗的并列对照。在这些对照中未检测到特异性信号。
BBB透过测试
如上所述用人工脑脊液灌注深度麻醉的小鼠，然后用PBS中的15ml0.5mg/ml磺基-NHS-LC-生物素灌注。对于免疫组织化学，将脑切片与德克萨斯红链霉亲和素(Vector SA-5006)一起孵育，在室温下在PBS+0.3％曲通+2.5％正常山羊或驴血清中1∶800稀释1小时，然后进行正常的固定操作。
电生理学
脑切片记录的执行类似于Guo，Z.等，2014，Cell Stem Cell 14，188-202；和Wu，Z.等，2014，Nat.Commun.5，4159中所述的方法。AAV注射后2-3个月，用2.5％阿佛丁麻醉小鼠，然后用基于NMDG的切割溶液(以mM计)灌注：93 NMDG，93 HCl，2.5 KCl，1.25 NaH2PO4，30NaHCO3，20 HEPES，15葡萄糖，12 N-乙酰基-L-半胱氨酸，5抗坏血酸钠，2硫脲，3丙酮酸钠，7MgSO4，0.5 CaCl2，pH 7.3-7.4，300 mOsmo，用95％O2/5％CO2鼓泡。
在室温下用振动切片机(VT1200S，徕卡，德国)在AAV注射的皮质区域周围切割300μm厚的冠状切片。收集切片并在含氧NMDG切割溶液中于33.0±1.0℃孵育10-15分钟。然后将切片转移到保持溶液中，连续95％O2/5％CO2鼓泡(以mM计)：92 NaCl，2.5 KCl，1.25NaH2PO4，30 NaHCO3，20 HEPES，15葡萄糖，12N-乙酰基-L-半胱氨酸，5抗坏血酸钠，2硫脲，3丙酮酸钠，2 MgSO4，2 CaCl2。
在保持溶液中在室温下恢复至少0.5小时后，将单个切片转移至记录室，在33.0±1.0℃下用由95％O2/5％CO2饱和的标准aCSF(人工脑脊液)连续灌注。标准aCSF含有(以mM计)：124 NaCl，2.5 KCl，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO3，10葡萄糖，1.3 MgSO4，2.5 CaCl2。
为了检测NeuroD1-GFP感染的神经元中的动作电位发射，用含有以下(以mM计)的移液管溶液进行全细胞记录：135K-葡萄糖酸盐，10 KCl，5Na-磷酸肌酸，10 HEPES，2 EGTA，4 MgATP和0.3 Na2 GTP，pH 7.3用KOH调节，280-290 mOsm。在电流钳模型下注入去极化电流以引发动作电位。
为记录自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)和自发性抑制性突触后电流(sIPSC)，移液管溶液含有(以mM计)：120 Cs-甲磺酸盐，10 KCl，10 Na-磷酸肌酸，10 HEPES，5 QX-314，1 EGTA，4 MgATP和0.3 Na2GTP，用KOH调节pH 7.3，280-290 mOsm。对于标记的记录神经元，将0.5％生物胞素加入移液管溶液中。
对于sEPSC记录，细胞膜电位保持在-70mV(GABAA受体的逆转电位)，对于sIPSC记录，细胞膜电位保持在0mV(离子型谷氨酸受体的逆转电位)。用MultiClamp 700A放大器收集数据，并用pCLAMP10软件(分子装置公司(Molecular Devices))分析。
小鼠行为测试
食物颗粒取回测试
对于小鼠中的所有行为实验，将ET-1(1-31)注射到前肢运动皮质的两个点中以诱导严重的运动缺陷。两点的坐标为：(i)+0.2mm AP，+/-1.35mm ML；(ii)+0.38mm AP，+/-2.45mm ML(+或-ML基于在中风前颗粒取回训练中的优势前肢的相对侧)。
食物颗粒取回室由Baird，A.L.等，2001，Brain Res.Bull.54，243-250；和Roome，R.B.等，2014，J.Neurosci.Methods，233，34-44中描述的用于小鼠的阶梯设备修改。简而言之，阶梯改为一个带有单个V形孔的臂，末端有一个小挡板，以防止在测试过程中食物颗粒落到孔外。孔的长度为33mm，孔的最低部分距离顶板底部16mm，如图14A所示。
在颗粒取回试验之前，令小鼠饥饿18小时以增加其渴求度。在最初的饥饿训练期间，向小鼠在家笼中给予30粒蔗糖颗粒(14mg，TestDiet公司)以进行熟悉。在训练的第一部分，中心底座的顶板被移除以减少难度并鼓励动物尝试到达食物。将五个颗粒置于右侧或左侧的孔中以确定优势前肢。给予小鼠5分钟并在每侧测试两次。在此阶段通过计算取回多少颗粒来确定优势侧。大多数动物可以在一侧，有时在两侧获得约5个颗粒。如果动物未能获得任何颗粒，则将其排除在进一步测试之外。
对于训练的第二部分和随后的所有测试，将顶板放回到中心底座上，并将8个颗粒放置在优势侧的孔中。每天连续3次测试动物，每次给予5分钟以进行颗粒取回。如果连续三个训练日的平均取回超过4个颗粒，则动物将用于进一步的手术和测试。
训练后，在控制优势前肢的对侧运动皮层中诱发缺血性中风。在中风后9天和病毒注射前一天，进行颗粒取回测试以确定它们的功能水平。如果取回的颗粒数量少于其中风前水平的一半，则这些动物将在第二天(中风后10天)用于病毒注射。
在病毒注射后，以20，30，50和70dps进行颗粒取回测试以评估其功能恢复。对于每个时间点，连续两天重复颗粒取回测试，第1天作为训练，第2天作为实际测试。对动物进行编码，并且由不知晓动物特征的第二实验者进行测试和颗粒计数。
网格行走测试
网格行走测试类似于Baskin，Y.K.等，2003，J.Neurosci.Methods 129，87-93；和Clarkson，A.N.等，2010，Nature 468，305-309中所述。
使用长度为24cm，宽度为20cm，高度为24cm的1cm2网格金属丝网。摄像机放置在网格下方，45°角朝上。录制慢动作视频片段以评估动物的足部缺陷。将单独的小鼠置于网格地板的顶部并允许自由行走5分钟。对动物进行编码，并通过由不知晓动物特征视的第二研究人员离线分析录像。
计算优势肢的足部缺陷总数和非足部缺陷总步数。如下计算足部缺陷百分比：足部缺陷数/总步数×100。
圆筒测试
圆筒测试基于Roome，R.B.等，2014，J.Neurosci.Methods，233，34-44中所述的方法。该测试涉及视频记录小鼠用前肢上抬并触摸的透明圆筒的侧壁(直径10cm，高15cm)。将每只动物放入透明板上的圆筒中，并用照相机从下方进行视频记录。小鼠试图上抬并触摸侧壁＞30次后停止实验，通常持续约3-4分钟。
视频由不知晓动物特征的实验者离线分析。分析了30次上抬和触摸壁的尝试。正常的爪子触摸定义为动物在上抬时将两个爪子放在壁上，并且在下降时使用两个爪子推离壁。异常触摸仅涉及使用其中一个爪子触摸壁，或者在触摸后沿着壁拖动一个爪子。
拖动行为被定义为一个爪子，通常是受伤的爪子，沿着侧壁滑动而不会稳固地靠在壁上。非接触行为被定义为小鼠不使用其受伤的爪子，而是仅在上抬和下降时使用未受伤的爪子。由于小鼠完全放弃受伤的爪子，非接触被认为是更严重的损伤表型。正常的上抬和触摸行为被定量为：正常爪子触摸/总尝试×100。
定量实时PCR
在灌注后取出损伤核心周围的皮质组织(约2mm×2mm方形)并在液氮中快速冷冻。使用Macherey-Nagel NucleoSpin RNA试剂盒进行RNA提取，并通过NanoDrop测量RNA浓度。使用Quanta Biosciences qScript cDNA超混物合成cDNA。
将反应混合物在25℃下保温5分钟，42℃保温30分钟，85℃保温5分钟并保持在4℃。然后将混合物用不含RNA酶/DNA酶的水稀释5倍，并取2.5μl进行qRT-PCR。使用AppliedBiosystems Primer Express软件设计用于qRT-PCR的引物。
使用Quanta Biosciences PerfeCTa SYBR Green超混物，ROX进行qRT-PCR。GAPDH用作内部对照，来自健康小鼠的非中风皮质组织用作对照。比较Ct方法用于计算倍数变化，Prism 6用于统计分析和条形图。
高尔基浸渍染色
切片高尔基试剂盒(Bieoenno技术有限公司(Bieoenno Tech，LLC))用于高尔基染色。简言之，用aCSF灌注小鼠，然后用试剂盒灌注固定剂。取出脑并浸渍5天，通过振动切片机以200μm切片，基于试剂盒方案染色并固定，用DPX封固剂盖上盖玻片。使用Keyence BZ-9000荧光显微镜拍摄4x和100x的明场图像。
定量和统计学分析
皮质区域大小分析
在Keyence BZ-9000荧光显微镜中使用4x镜片拍摄的图像定量皮质区域。选择注射点(+0.2AP)周围三个切片，选择最明显的中风损伤进行图像采集。DAPI和NeuN信号用于识别扣带皮质的皮层上边界和下界面。通过ImageJ测量从中线到3mm侧面的皮层区域。
GFAP+和NeuN+比率用于转化效率分析
将用GFAP或NeuN共染色的mCherry/GFP的40x共聚焦图像用于在4，7和17dpi的定量。每只动物在每只动物的中风梗塞附近的病毒感染区域拍摄四张图像。对于GFAP比率，使用Zeiss共聚焦软件Zen计数mCherry/GFP和GFAP双阳性的细胞。计算所有mCherry或GFP阳性细胞(所有病毒感染细胞)中双阳性细胞的百分比。类似的方法应用于NeuN比率。
用于转化的细胞特征分析的皮质神经元标志物
将用皮质神经元标志物(Tbr1，Emx1，Satb2，PV，GABA)共染色的GFP(NeuroD1-GFP)的40x共聚焦图像用于在60dpi的定量。在病毒感染区域拍摄三张图像，显示每只动物的GFP信号。分别计算所有GFP阳性细胞(NeuroD1-GFP感染细胞)中GFP和各个体标志物双阳性的细胞的百分比。
神经胶质细胞和神经元标志物强度和覆盖区域分析
胶质细胞标志物(LCN2，CSPG，AQP4和Iba1)和神经元过程标志物(Map2，SMI312，VGluT1和MBP)的单层共聚焦图像用于在17dpi的定量。除SMI312外，大多数标志物使用40x镜头，其中使用63x镜头。在接近中风梗塞的病毒感染区域(距离中风核心边界500μm内)和整个皮质厚度的中间拍摄三张图像。在相对健康的区域拍摄一张图像以进行标准化。在基于健康区域中的背景设置阈值之后，使用ImageJ来定量整个图像区域的强度和覆盖区域。使用来自三个图像的结果来获得每只动物的平均数据。
总体NeuN和PV细胞数分析
NeuN和PV细胞数在NeuN或PV免疫染色的图像上计数，所述图像通过Zeiss LSM800共聚焦显微镜的平铺功能在中线外侧500μm至2500μm的皮质区域内获得。共聚焦软件Zen用于细胞计数。具有最明显的中风损伤的注射点(+0.2AP)周围的切片用于拍摄图像。
局部NeuN数分析
NeuD免疫染色的40x共聚焦图像用于在17dpi的定量。在靠近中风梗塞的病毒感染区域(距离中风核心边界500μm内)拍摄三张图像，如图4A所示。Z堆叠功能与以1μm间隔的10个切片一起使用。共聚焦软件Zen用于细胞计数。对于NeuroD1组，对GFP(NeuroD1-GFP)和NeuN(转化的神经元)阳性的细胞或NeuN阳性GFP阴性(预先存在的神经元)的细胞进行计数。对于GFP对照组，对NeuN阳性细胞的总数进行计数。
电生理学分析
使用Mini Analysis Program(Synaptosoft公司，美国新泽西州)分析sEPSC和sIPSC。为了避免多重检测大事件，在自动检测后进一步目测检查分析结果。为了比较不同组之间的sEPSC和sIPSC频率，在获得平均值之前，对每个细胞采样超过200个事件或至少3分钟的记录周期。
血管数分析
对于Ly6C数量定量，单层40x图像由Zeiss共聚焦拍摄。通过ImageJ测量Ly6C强度，并且将强度比背景强三倍的血管鉴定为阳性信号。对梗塞周围区域中的三个图像中的Ly6C+血管数进行定量并对每只小鼠取平均值。
统计学和盲分析
使用Prism 6(GraphPad)软件进行统计学分析。在至少三只动物中重复所示的所有实验，并显示代表性数据。为了确定组间的显著性，使用配对的双尾斯氏t检验或所示的重复测量ANOVA检验进行比较。在病毒注射前进行严重中风的率先筛查后，将动物随机分配到具有匹配的缺陷水平的组中。所有用于定量的图像均由一名研究人员拍摄，并由不知晓动物状况和特征的不同研究人员定量。如上所述，小鼠行为测试以盲方式进行。
实施例1：NeuroD1将中风诱导的反应性星形胶质细胞转化为神经元
在该实施例中，研究了体内细胞转化是否可以在缺血性中风后实现功能性脑修复。由血管收缩肽内皮素-1(ET-1)诱导的局灶性中风模型用于在啮齿动物中产生一致的局部缺血性损伤(Fuxe等，1997；Hughes等，2003；Roome等，2014；Windle等，2006)。
当两种不同的ET-1肽(一种含有21个氨基酸(ET-1(1-21))和另一种含有31个氨基酸(ET-1(1-31))进行比较时，发现了ET-1(1-31)比ET-1(1-21)产生更严重和更长时间的脑损伤(参见图2A)。具有FVB背景的小鼠的遗传品系比常用的B6/C57小鼠产生更严重的中风损伤(参见图2A)。值得注意的是，通过将ET-1(1-31)注射到FVB小鼠的运动皮层中观察到显著的皮质组织损失(参见图1A和图1B)-建立严重的局灶性中风模型，在2个月的一段时间内具有一致的组织损伤。
确定了中风后NeuroD1病毒注射的合适时间窗。因为NeuroD1可以将反应性星形胶质细胞转化为神经元，所以在不同时间点调查中风区域以检查星形胶质细胞何时变得有反应性。
中风后5天(dps)，神经元信号NeuN显著丧失，如预期的那样(参见图1C)。有趣的是，GFAP信号，一种常用的反应性星形胶质细胞标志物，也非常低，表明星形胶质细胞在这个早期阶段尚未被激活。然而，在10dps时，GFAP信号显著上调(参见图1D)，表明星形胶质细胞在此时间内变得具有反应性。
然后确定缺血性中风诱导的这些反应性星形胶质细胞是否可以转化为神经元。被NeuroD1逆转录病毒感染的反应性神经胶质细胞成功转化为NeuN阳性神经元(参见图1E；病毒注射后17天，中风后27天)。
虽然逆转录病毒具有主要靶向损伤后分裂性反应性神经胶质细胞的优点，但它们不能产生大量神经元用于神经修复，因为分裂性的神经胶质细胞的数量相当有限。为了在中风后产生足够数量的神经元用于功能修复，使用腺相关病毒(AAV)来感染分裂性和非分裂性的神经胶质细胞。AAV具有人体感染率高，致病性低的优点，已被FDA批准用于治疗CNS疾病的临床试验。
为了特异性地感染星形胶质细胞，构建了在人GFAP启动子(hGFAP：：NeuroD1-P2A-GFP)控制下表达NeuroD1的AAV载体(重组血清型AAV9)。感染两周后，许多NeuroD1感染的细胞也转化为NeuN阳性神经元(参见图1F)。然而，GFAP启动子驱动的表达的一个警告是GFAP启动子将在星形胶质细胞向神经元转化后被沉默，使得难以区分转化的和未转化的神经元。
为了克服这种限制，通过使用Cre-FLEX(翻转切除)同源重组系统将GFAP启动子和NeuroD1分入两种不同的AAV9载体(参见Atasoy等，2008)。然后使用人GFAP启动子驱动在单独载体中的CAG启动子控制下的Cre重组酶(hGFAP：：Cre)的表达，然后该重组酶可作用于位于NeuroD1-P2A-GFP(或NeuroD1-P2A-mCherry)的反向序列的侧翼的两对异型，反平行的loxP型重组位点(CAG：：FLEX-NeuroD1-P2A-GFP/mCherry)(参见图2B)。该系统的优点是在Cre介导的反转后，NeuroD1表达将由强启动子CAG驱动，以显著增加其表达水平。通过病毒(AAV9 hGFAP：：Cre和CAG：：FLEX-NeuroD1-P2A-mCherry)注射后4天的观察确认了这一点，许多感染的星形胶质细胞已表达高水平的NeuroD1(参见图1G，上排)。
有趣的是，一些GFAP阳性星形胶质细胞明显地在向NeuN阳性神经元的过渡阶段被捕获(参见图1G，下排)。病毒注射后两周，许多NeuroD1感染的细胞失去GFAP信号并成为NeuN阳性神经元(参见图1I，下排)，而对照AAV FLEX-GFP感染的细胞在很大程度上保留了神经胶质形态(参见图1I，上排)。因此，使用Cre-FLEX系统，证明NeuroD1可以在缺血性中风后将许多反应性星形胶质细胞转化为神经元。
然后评估转化效率以及在中风区域中产生的神经元的类型。为了检查NeuroD1介导的转化效率，检查了病毒注射后4，7和17天时中风区域中AAV感染细胞中星形胶质细胞和神经元的数量(参见图3A-3D)。使用GFAP免疫染色鉴定星形胶质细胞，发现在对照病毒mCherry/GFP感染的细胞中，大多数从4至17dpi与GFAP共定位(参见图3A，上排)。
然而，在AAV-NeuroD1-mCherry感染的细胞中，GFAP信号显示从4到17dpi显著降低(参见图3A，下排)，表明许多AAV-NeuroD1感染的细胞丧失了星形胶质细胞特性。与GFAP相反，NeuN染色显示mCherry感染的对照组中的神经元非常少，但表达NeuroD1-mCherry的细胞与NeuN共定位变得越来越多(参见图3B)。
定量分析显示约70％的mCherry感染的细胞在4-17dpi期间保持其星形胶质细胞特性(参见图3C)，但是＞70％的NeuroD1感染的细胞在17dpi前接受了神经元特征(参见图3D)。
为了进一步研究转化效率和特异性，开发了Tri-AAV跟踪系统以跟踪星形胶质细胞转化的神经元，其包括在星形胶质细胞中表达GFP的病毒(AAV9 hGFAP：：GFP)以及本发明的Cre-FLEX系统(参见图4A-4C)。在mCherry对照组中，只有10％的GFP+细胞在60dpi前显示出的NeuN+信号；但是在NeuroD1-mCherry组中，95％的GFP+细胞也在60dpi前是NeuN+(在图4B中定量)，进一步证实了在星形胶质细胞中表达时NeuroD1的高转化效率。这些结果表明，本发明的NeuroD1 AAV可以高效地在中风区域中将星形胶质细胞转化为神经元。
然后评估中风区域中从星形胶质细胞转化的神经元的特征。发现运动皮层中星形胶质细胞转化的神经元对包括Emx1，Tbr1和Satb2的皮质锥体神经元标志物是免疫阳性的(参见图3E和图3F)。只有约10％对包括小白蛋白和GABA的GABA能神经元标志物是免疫阳性的(参见图3F)。因此，在中风区域中异位表达NeuroD1后，星形胶质细胞转化的神经元显示出与其相邻皮质神经元相似的神经元特征。
实施例2：细胞转化后减少神经炎症
伴随中风区域NeuroD1感染后的星形胶质细胞向神经元转化，观察到中风区域中GFAP信号的显著减少(参见图5A)。这是预期的，因为＞70％的NeuroD1感染的反应性星形胶质细胞已经转化为神经元，从而GFAP信号将相应地降低。然而，这也提出了一个问题，即星形胶质细胞是否可能在转化的区域中耗尽。为了解决这个问题，当星形胶质细胞向神经元转化基本上完成时，检查靠近在病毒注射后17天(dpi；27dps)被NeuroD1AAV高度感染的梗塞(*)的中风区域。
虽然星形胶质细胞确实显示出NeuroD1感染区域的减少，但仍然存在大量的星形胶质细胞(参见图5B)。令人惊讶的是，不仅星形胶质细胞数量减少，而且星形胶质细胞形态在NeuroD1转化的区域中显著改变。在对照组中，星形胶质细胞在损伤核心周围的区域中是肥大的并且密集地混合在一起(参见图5B，上排)；而在NeuroD1组中，大多数星形胶质细胞具有伸长的过程，只有少数显示出肥大的形态(参见图5B，下排；和图6A-C)，表明剩余的星形胶质细胞在NeuroD1转化的区域中变得不太活跃。
因为GFAP仅标记了星形胶质细胞的主要过程，所以使用GFAP-GFP转基因小鼠来照亮整个星形胶质细胞形态。与GFAP免疫染色相似，GFAP-GFP小鼠的使用也显示NeuroD1组中的肥大星形胶质细胞较少(参见图5C)。值得注意的是，在NeuroD1-mCherry表达区域中观察到大量GFP标记的星形胶质细胞(参见图5C，下排)，表明转化后星形胶质细胞未耗尽。这与星形胶质细胞杀伤方法明显不同。具有体内细胞转化的星形胶质细胞的持续存在可能是由于星形胶质细胞具有分裂和自身再生的内在能力。
当70-95％的NeuroD1感染的反应性星形胶质细胞在中风部位转化为神经元时，可以预期，由于星形胶质细胞和神经元，以及星形胶质细胞和小胶质细胞之间的密切关系，反应性星形胶质细胞的这种显著减少会对局部环境产生重大影响。实际上，小胶质细胞介导的神经炎症与中风损伤后的反应性星形胶质细胞密切相关。
在对照组中，观察到在17dpi时的损伤核心中的大量小胶质细胞(由Iba1标记)(参见图5D，顶部)；但是在NeuroD1组中，小胶质细胞显示出显著减少(参见图5D，底部)-支持小胶质细胞和星形胶质细胞之间的相互作用。形态学上，对照组中的小胶质细胞多为变形虫型(见5E，上图)；但是在NeuroD1组中，小胶质细胞主要显示具有清晰过程的分枝形状(参见图5E，底部；在图6D中定量；还参见图6A-B，分别针对7dpi和40dpi信号)。
伴随神经胶质形态变化，与对照组相比，NeuroD1组中胶质细胞分泌的蛋白质如硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)和脂质运载蛋白-2(LCN2)显著减少(参见图5F和图5G；在图6E-F中定量)。CSPG是胶质瘢痕形成过程中的重要参与者，其抑制轴突再生，并且LCN2在反应性神经胶质细胞中高度表达并且与神经炎症相关。
为了验证免疫染色结果，在17dpi时进行RT-PCR实验以定量分析对照或NeuroD1感染的皮质组织中的神经胶质标志物和细胞因子。首先证实NeuroD1在NeuroD1注射的样品中确实高度表达(参见图5H)。中风后GFAP转录水平增加约50倍，但在NeuroD1治疗后显著降低(参见图5H)。神经炎症相关因子LCN2在中风后急剧增加约1600倍，但在NeuroD1治疗组中减少至仅15倍(参见图5G)。
类似地，包括干扰素γ，TNFα，白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)在内的促炎因子在中风后均显示出增加，但在NeuroD1治疗后下调(参见图5I)。NeuroD1治疗后神经炎症的意外减少表明，将反应性星形胶质细胞转化为神经元比仅仅产生新神经元具有广泛得多的影响。
实施例3：神经再生导致神经保护
与神经炎症减少相符，在NeuroD1感染区域中NeuN阳性神经元的数量似乎显著增加(参见图7A)。令人惊讶的是，在靠近损伤核心的中风区域，不仅检测到NeuroD1-GFP标记的神经元，而且还检测到许多未转化的神经元，这些神经元既不是GFP阳性(参见图7A，箭头)，也不是NeuroD1阳性(参见图7B，箭头)。
定量分析显示梗塞周围区域内约40％的NeuN+神经元为NeuroD1阳性，约60％的神经元为NeuroD1阴性(见图7C；对照组NeuN+，27.1+8.1/0.1mm2；NeuroD1组：NeuroD1-/NeuN+，64.9，+7.9/0.1mm2；NeuroD1+/NeuN+，39.9，+2.4/0.1mm2；每组n＝3只小鼠)。
当定量NeuroD1-NeuroD1-GFP感染的神经元中的GFP+/NeuN+神经元时获得了类似的结果(参见图8A)。此外，NeuroD1治疗的区域中未转化的神经元也使对照GFP感染区域中的神经元数量增加一倍以上(参见图7C)，表明NeuroD1介导的神经胶质细胞向神经元转化显著增强神经元存活。
总体而言，NeuroD1感染区域中的NeuN+神经元比对照组的神经元增加了两倍多。根据NeuroD1治疗后神经元数量的显著增加，神经元树突状标志物(包括微管相关蛋白2(Map2)和SMI32)的免疫染色在NeuroD1组中显示出明显的树突形态，但在GFP对照组中没有(参见图7D和图7E；图8C中定量的Map2；参见图8B中40dpi时的Map2染色)。
类似地，使用轴突标志物SMI312和NF200以及髓鞘标志物MBP，在NeuroD1组中观察到中风区域中更多的轴突(参见图7F；在图8D中定量)，其与高水平的髓鞘形成相关(参见图7G；在图8E中定量)。为了验证免疫染色结果，进行了RT-PCR实验以检查神经元基因表达水平。包括NeuN，Robo2和Syn1在内的神经元基因在中风后均显示出显著降低，但是通过NeuroD1治疗获得挽救(参见图7H)。
最后，定量了病毒感染后2周至2个月中风损伤的皮质区域(距中线500μm至2500μm，距中线1500μm的注射部位)内NeuN阳性神经元的总数。中风后对照组中NeuN阳性神经元的总数仅为非中风大脑的约20％，表明在严重局灶性中风模型中80％的神经元丢失。然而，NeuroD1组中的神经元数量在两个月内显著增加，挽救了中风区域中总神经元的约70％(参见图7I)。
体内细胞转化后皮质神经元数量的这种显著增加，包括转化和受保护的神经元，形成功能恢复的坚实基础。
实施例4：中风后功能性神经回路的重建
关于体内细胞转化的一个关键问题是胶质细胞转化的神经元是否可以形成功能性神经回路。为了回答这个问题，检查了NeuroD1介导的细胞转化后中风区域的形态结构。在中风和病毒注射后，检查对照和NeuroD1治疗的小鼠中7，17，40和60dpi时的缺血性损伤的运动皮质(参见图9A)。
在两个月的时间过程中，观察到注射GFP对照病毒的组中逐渐的皮质组织损失，但是NeuroD1治疗组显示出显著的组织保留(参见图9A)。对运动皮层组织的分析显示，对照组在2个月内损失了70％的受伤组织，而NeuroD1治疗组保留了大部分受损组织，仅有20％的组织损失(参见图9B；另见图10A的连续切片)。
值得注意的是，在NeuroD1感染60天后，在所有治疗的动物中观察到清晰的皮质层结构(参见图9A，60dpi，NeuroD1图像)，表明NeuroD1治疗不仅产生新的神经元，而且还可以重建/保留皮层。
还在60dpi时进行了的H&E(苏木精和伊红)染色(参见图10B)。在对照组中，除了组织损伤外，许多神经元出现嗜酸性细胞质和固缩核缩小；而在NeuroD1组中，神经元表现出更健康的形态。此外，在冠状切片中，检测到源自中风区域中的NeuroD1转化的神经元的纹状体中的轴突束。为了跟踪体内细胞转化后中风区域中的NeuroD1感染的神经元所投射到的位置，通过矢状切片分析，确定由NeuroD1转化的皮质神经元可以将轴突发送到同侧的纹状体，丘脑和下丘脑(参见图9C)。对侧，NeuroD1转化的神经元通过胼胝体将其轴突穿过中线投射到对侧皮质区域(参见图10C)。因此，NeuroD1转化的神经元可以整合到全脑回路中。
还研究了在NeuroD1介导的细胞转化后中风区域中的神经元功能。在病毒注射后2个月，在皮质切片中对AAV-NeuroD1-GFP感染的神经元进行全细胞膜片钳记录(参见，9D)。将去极化电流注入神经元引发重复动作电位(参见图9D)。
记录中风后表达NeuroD1的神经元中的强烈自发突触事件(兴奋性和抑制性)(参见图9F)-表明这些神经元通过与其他神经元的突触连接而整合到大脑回路中。对照组和NeuroD1组之间的定量比较表明，NeuroD1组中EPSC和IPSC的频率显著高于对照组(参见图9G)。
为了确认记录的神经元是NeuroD1转化的而不是预先存在的神经元，将生物胞素包括在记录移液管中，并在电生理记录后进行免疫染色。图9E表明记录的神经元(生物胞素阳性)确实是NeuroD1阳性。生物胞素免疫染色还照亮了运动皮层中NeuroD1转化的神经元的复杂树突结构(参见图9E)。
观察到在中风区域由NeuroD1转化的生物胞素标记的神经元中的清晰的树突棘(参见图12A)，其通过高尔基染色证实(参见图12B)。用谷氨酸能突触标志物VGluT1(囊泡谷氨酸转运蛋白1)进一步免疫染色显示，与对照组相比，NeuroD1组中的突触密度显著增加(参见图12C-D)。
此外，通过小球蛋白(PV，GABA能神经元亚型的特异性标志物)的免疫染色观察GABA能神经元。缺血性中风引起PV神经元的显著损失(参见图12F)，但是在NeuroD1治疗组中，检测到中风区域中的许多PV神经元(参见图12E；在图12F中定量)。虽然PV神经元通常不与NeuroD1-GFP细胞共定位，但它们与表达NeuroD1-GFP的神经元混合(参见图12E)-表明GABA能神经元可能受到NeuroD1治疗的保护。
总之，这些数据表明NeuroD1介导的细胞转化可以通过再生和保留兴奋性和抑制性神经元来重建中风区域中的功能性神经回路。
实施例5：细胞转化后挽救血管和血脑屏障
如果NeuroD1治疗可以挽救脑组织损失并在中风区域形成神经回路，那么细胞转化后血管和血脑屏障能够恢复吗？
为了回答这个问题，检查了在中风区域接触血管以形成血脑屏障的血管和星形胶质细胞末梢(参见图11A-11H)。在没有中风的正常大脑中，星形细胞末梢标志物水通道蛋白4(AQP4，水通道)缠绕在血管周围(由Ly6C，内皮细胞和单核细胞标志物标记)，显示出完整的血脑屏障(BBB)(参见图11A，上排)。相反，在ET-1(1-31)诱导的局灶性中风后一周，观察到血管和星形胶质细胞末梢的显著破坏(参见图11A，下排)。
AQP4标记的星形胶质细胞末梢从血管剥离并与GFAP共定位(参见图11A，下排)-表明AQP4从星形胶质细胞的末梢到其他区域的错误定位。在NeuroD1治疗后，观察到在中风区域中血管的显著恢复以及AQP4标记的星形胶质细胞末梢的重新结合(参见图11B-C；17dpi，27dps)。
AQP4与GFAP的共免疫染色显示，在中风后对照组中，AQP4在整个星形细胞过程中弥散分布；但是在NeuroD1治疗组中，AQP4主要集中在包裹血管周围的末梢(参见图11D)。通过CD31(血管)和GFAP的共免疫染色也清楚地说明了NeuroD1组中星形胶质细胞末梢在血管上的重新排列(参见图11C-E)。
定量分析显示，与GFP对照组相比，NeuroD1治疗组中AQP4强度(参见图11F)和AQP4覆盖区域(参见图11G)显著降低。即使在NeuroD1组中，AQP4信号与NeuroD1高表达的区域中的血管关联性似乎高于具有较少NeuroD1信号的区域(参见图12G)。
与对照组相比，NeuroD1组的血管显示出显著增加(参见图11H)。为了研究BBB(血脑屏障)的完整性，使用生物素灌注测试来检测BBB渗漏。在梗塞周围区域，生物素在对照组中在血管外部(由Ly6C标记)显示强信号，表明BBB渗漏(参见图12H)。
在NeuroD1组中，生物素信号主要保留在血管内(参见图12H)。即使在病毒注射2个月后，对照组和NeuroD1组之间AQP4和Ly6C信号的差异仍然非常显著(参见图12I)。总之，这表明NeuroD1介导的细胞转化在中风损伤后促进中风区域的血管生成并恢复BBB。
实施例6：运动和记忆缺陷的功能性挽救
鉴于在NeuroD1治疗后中风区域中显著水平的神经再生，进行实验以确定该治疗是否可以挽救由中风引起的功能缺陷。在对各种动物行为测试进行初步研究后，使用三个测试进行了对小鼠前肢功能的详细分析：食物颗粒取回，网格行走和圆筒测试(参见图13A，行为测试范例)。
根据食物颗粒取回试验，对于所有的行为测试，ET-1(1-31)在一个皮质侧的两个点注射(一个在前肢运动皮层，一个在前肢感觉皮层)，以在优势侧产生严重的单侧中风。为了测试食物颗粒取回，在测试之前使小鼠饥饿以增加它们对食物的渴求度。在中风前，训练正常动物以在5分钟内从总共8个中取回平均5-6个颗粒(参见图14A，针对颗粒取回装置)。
在中风后9天，它们的颗粒取回能力严重受损(在5分钟内降至平均约1个颗粒)(见13B)。然后将中风的动物随机分成具有相似缺陷的两组，用于注射表达单独的GFP或NeuroD1-GFP的AAV9，以监测它们在2个月内的功能恢复。病毒注射后10天(中风后20天)，两组之间无显著差异；但在病毒注射20后天，NeuroD1组开始出现改善。在病毒注射后60天前，NeuroD1组达到约4个颗粒/5分钟，而GFP对照组保持＜2个颗粒/5分钟(参见图13B)。
同样，对于网格行走测试，中风前正常动物的足部缺陷率较低，通常在网格上自由行走的5分钟内约为5％，但中风后足部缺陷率增加至＞10％(见图13C)。病毒注射后，NeuroD1组在治疗后20天和40天表现出持续改善，足部缺陷率降低至约7％，而GFP对照组仍保持＞9％的高足缺陷率(见图13C)。
还进行了评估当动物上抬并接触圆筒侧壁时的前肢功能的圆筒试验。正常动物通常使用两个前肢接触并稳定地推靠侧壁，并且正常接触率为约85％。在前肢运动皮层单侧中风后，对侧前肢的功能明显减弱，受损的肢体经常在短暂触碰后未能触及侧壁或沿着壁拖动(见图13D，正常接触率降至约35％)。
在病毒感染后40-60天，NeuroD1组在用前肢接触侧壁时显示出显著的恢复(约65％)，而大多数GFP对照小鼠仍然很弱并且无法使用受伤的前肢(见图13D)。在所有三个测试中，注射PBS作为ET-1(1-31)的模拟对照没有导致任何行为缺陷，并且注射ET-1(1-31)而没有病毒注射产生与GFP对照病毒注射相似的缺陷。
对于网格行走和圆筒测试，与没有中风的对照动物相比，非中风侧前肢没有显示出显著的缺陷。对于食物颗粒取回试验，只有在训练期间优先用于获取食物颗粒的前肢受到中风伤害并进行测试。在病毒注射后约两个月完成行为测试后，处死小鼠并进行解剖学和免疫细胞化学分析。与行为缺陷相符，GFP对照组的大脑在中风区域显示出显著空腔，而NeuroD1组在中风部位显示出小得多的损伤(参见图14B)。
行为测试后的免疫染色结果也显示对照组中大的组织损失，但NeuroD1组中保存较好的皮质(参见图14C；在图14D中定量)。因此，使用三种不同的小鼠行为模型，证明NeuroD1治疗不仅可以再生新神经元并减少脑组织损失，还可以挽救由缺血性中风引起的运动功能缺陷。
NeuroD1介导的体内细胞转化的广泛影响
在NeuroD1介导的体内神经胶质细胞向神经元转化后的中风区域中，NeuroD1感染的区域的神经胶质形态和功能都得到显著改善。神经转化后显著数量的星形胶质细胞与反应性星形胶质细胞的增殖能力相符。星形神经胶质在表达NeuroD1的区域中从肥大到正常分支的形态改善表明反应性神经胶质细胞暴露于较少的损伤信号，新产生的星形胶质细胞反应性较低，或两者。
在NeuroD1治疗后，中风区域中小胶质细胞形态从变形虫形状变为更加分枝的形状与神经炎症的减少相符-由TNFα和IL-1β的炎性因子的减少证实。之前的研究报道了中风区域中CSPG和LCN2的显著上调。如本文所证明的，NeuroD1治疗可显著降低中风区域中CSPG和LCN2的水平，这与转化后反应性神经胶质细胞的显著减少相符。
在神经再生之后，NeuroD1治疗导致中风区域的血管修复和BBB恢复。这种类型的神经再生后修复与脑发育和神经修复期间的神经血管相互作用一致。值得注意的是，NeuroD1介导的体内细胞转化对局部神经元-胶质细胞回路有广泛影响，包括产生大量新神经元，减少相同数量的反应性星形胶质细胞，减少神经炎症，修复血管和恢复BBB。整个神经元-神经胶质细胞回路的这种场景变化是前所未有的。
功能挽救的结构支持
体内神经胶质细胞向神经元转化也可以在功能上挽救啮齿动物模型中由缺血性中风引起的运动缺陷。这种功能挽救基于结构变化，包括NeuroD1治疗后的细胞转化和回路重建。观察到NeuroD1治疗后NeuroD1-GFP标记的神经元与中风区域中未标记的神经元的混合。这表明修复的大脑回路是新生成的神经元和老的成熟神经元的整合。
虽然NeuroD1转化的神经元主要是谷氨酸能神经，但是观察到大量未被NeuroD1-GFP标记的GABA能神经元-表明GABA能神经元是由NeuroD1治疗挽救的神经元之一。GABA能神经元的保存表明NeuroD1治疗可以在体内细胞转化后保持激发-抑制平衡，这对于实现正常脑功能是重要的。由于NeuroD1治疗可以挽救中风损伤的运动皮层中超过70％的神经元，因此也实现了功能恢复。
项目
项目1.一种治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，包括：
将治疗有效剂量的外源性NeuroD1给予正常血流已被破坏的区域。
项目2.如项目1所述的方法，其中给予外源性NeuroD1包括向该区域递送包含编码NeuroD1的核酸的表达载体。
项目3.如项目1或2所述的方法，其中给予外源性NeuroD1包括向该区域递送包含编码NeuroD1的核酸的重组病毒表达载体。
项目4.如项目1-3中任一项所述的方法，其中表达外源性NeuroD1包括向该区域递送包含编码NeuroD1的核酸的重组腺相关病毒表达载体。
项目5.如项目1-4中任一项所述的方法，其中表达外源NeuroD1包括向该区域递送以下的有效“翻转切除”重组表达载体组合：1)重组腺相关病毒表达载体，其包含编码NeuroD1的核酸，和2)重组腺相关病毒表达载体，其包含编码位点特异性重组酶的核酸。
项目6.如项目1-5中任一项所述的方法，其中NeuroD1是递送至该区域的唯一外源表达的转录因子。
项目7.如项目1-6中任一项所述的方法，其中当存在反应性星形胶质细胞时，在CNS中正常血流破坏后的一定时间给予外源性NeuroD1。
项目8.如项目1-7中任一项所述的方法，其中当存在神经胶质瘢痕时，在CNS中正常血流破坏后的一定时间给予外源性NeuroD1。
项目9.如项目1-8中任一项所述的方法，其中CNS中正常血流的破坏是由于选自下组的紊乱：缺血，血栓形成，栓塞，出血，慢性疾病介导的血管限制及其任何两种或更多种的组合。
项目10.如项目1-9中任一项所述的方法，其中CNS中正常血流的破坏是由于选自下组的紊乱：缺血性中风；出血性中风；脑动脉瘤；脑震荡；肿瘤；感染；炎症；创伤性脑损伤；创伤性脊髓损伤；缺血性或出血性脊髓病(脊髓梗死)；由心脏骤停或严重低血压(休克)引起的全局缺血；由缺氧，低血糖或贫血引起的缺氧缺血性脑病；由感染性心内膜炎或心房粘液瘤引起的CNS栓塞；纤维软骨栓塞性脊髓病；儿童白血病引起的CNS血栓形成；由肾病综合征(肾病)，慢性炎性疾病，妊娠，使用基于雌激素的避孕药，脑膜炎，脱水引起的脑静脉窦血栓形成；或其任何两种或更多种的组合。
项目11.如项目1-10中任一项所述的方法，其中给予治疗有效剂量的NeuroD1包括给予包含编码NeuroD1蛋白的核酸序列的重组表达载体，其中编码NeuroD1蛋白的核酸序列包括选自下组的核酸序列：编码SEQ ID NO：2的核酸序列或其功能片段；编码SEQ ID NO：4的核酸序列或其功能片段；SEQ ID NO：1或其功能片段；SEQ ID NO：3或其功能片段；和编码与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性的蛋白质的核酸序列或其功能片段。
项目12.如项目1-11中任一项所述的方法，其中给予治疗有效剂量的NeuroD1包括在损伤部位中或附近立体定向注射。
项目13.如项目1-12中任一项所述的方法，其中编码NeuroD1的核酸序列与遍在启动子操作性地连接。
项目14.如项目5-12中任一项所述的方法，其中编码位点特异性重组酶的核酸序列与神经胶质细胞特异性启动子操作性地连接。
项目15.如项目14所述的方法，其中所述神经胶质细胞特异性启动子是GFAP启动子。
项目16.如项目15所述的方法，其中所述GFAP启动子是人GFAP启动子。
项目17.如项目1-16中任一项所述的方法，还包括评估对象中治疗的有效性。
项目18.如项目17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括选自以下的测定：电生理学测定，血流测定，组织结构测定，功能测定及其任何两种或更多种的组合。
项目19.如项目17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括脑电图。
项目20.如项目17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括选自下组的血流测定：近红外光谱和fMRI。
项目21.如项目17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括选自下组的组织结构的测定：MRI，PET扫描，CAT扫描和超声。
项目22.如项目17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括行为测定。
项目23.如项目17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括在给予治疗有效剂量的外源性NeuroD1之前进行的测定。
项目24.如项目1-23中任一项所述的方法，其中以0.1-5μl/分钟的受控流速，将1-500μl含有包含编码NeuroD1的核酸的腺相关病毒颗粒的药学上可接受的运载体注射到对象体内正常血流被破坏的区域中，其浓度为1010-1014个腺相关病毒颗粒/ml运载体。
项目25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，还包括选自下组的治疗：去除血凝块，促进血液流动，给予抗炎剂，给予抗氧化剂，降低兴奋性毒性，和其两种或更多种。
项目26.一种组合物，其包含：1)重组腺相关腺病毒表达载体，其包含与编码位点特异性重组酶的核酸操作性地连接的神经胶质细胞特异性启动子和2)重组腺相关腺病毒表达载体，其包括与编码NeuroD1的核酸操作性地连接的遍在启动子，其中编码NeuroD1的核酸被反转并且侧接两组位点特异性重组酶识别位点，使得重组酶的作用不可逆地反转编码NeuroD1的核酸，使得NeuroD1在哺乳动物细胞中表达。
项目27.一种基本上如本文所述治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流破坏的影响的方法。
项目28.一种基本上如本文所述的翻转切除表达载体组合。
序列
SEQ ID NO：1-编码人NeuroD1蛋白的人NeuroD1核酸序列-1071个核苷酸，包括终止密码子
SEQ ID NO：2-人NeuroD1氨基酸序列-356个氨基酸-由SEQ ID NO：1编码
SEQ ID NO：3-编码小鼠NeuroD1蛋白的小鼠NeuroD1核酸序列-1074个核苷酸，包括终止密码子
SEQ ID NO：4-小鼠NeuroD1氨基酸序列-357个氨基酸-由SEQ ID NO：3编码
小鼠LCN2启动子-SEQ ID NO：5
人GFAP启动子-SEQ ID NO：6
小鼠Aldh1L1启动子-SEQ ID NO：7
人NG2启动子-SEQ ID NO：8
CAG：：NeuroD1-IRES-GFP-SEQ ID NO：9
本说明书中提及的任何专利或公开通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开被具体和单独地指出通过引用并入。
本文所述的组合物和方法目前是优选实施方式的代表，是示例性的，而非旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到其中的变化和其他用途。在不脱离权利要求书所述的本发明的范围的情况下，可以进行这些改变和其他用途。
序列表
<110> 宾州研究基金会（The Penn State Research Foundation）
<120> 再生功能性神经元用于治疗因血流破坏引起的神经损伤
<130> 36PST85952WO
<150> 62/464,469
<151> 2017-02-28
<150> 62/518,914
<151> 2017-06-13
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1071
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
atgaccaaat cgtacagcga gagtgggctg atgggcgagc ctcagcccca aggtcctcca 60
agctggacag acgagtgtct cagttctcag gacgaggagc acgaggcaga caagaaggag 120
gacgacctcg aagccatgaa cgcagaggag gactcactga ggaacggggg agaggaggag 180
gacgaagatg aggacctgga agaggaggaa gaagaggaag aggaggatga cgatcaaaag 240
cccaagagac gcggccccaa aaagaagaag atgactaagg ctcgcctgga gcgttttaaa 300
ttgagacgca tgaaggctaa cgcccgggag cggaaccgca tgcacggact gaacgcggcg 360
ctagacaacc tgcgcaaggt ggtgccttgc tattctaaga cgcagaagct gtccaaaatc 420
gagactctgc gcttggccaa gaactacatc tgggctctgt cggagatcct gcgctcaggc 480
aaaagcccag acctggtctc cttcgttcag acgctttgca agggcttatc ccaacccacc 540
accaacctgg ttgcgggctg cctgcaactc aatcctcgga cttttctgcc tgagcagaac 600
caggacatgc ccccccacct gccgacggcc agcgcttcct tccctgtaca cccctactcc 660
taccagtcgc ctgggctgcc cagtccgcct tacggtacca tggacagctc ccatgtcttc 720
cacgttaagc ctccgccgca cgcctacagc gcagcgctgg agcccttctt tgaaagccct 780
ctgactgatt gcaccagccc ttcctttgat ggacccctca gcccgccgct cagcatcaat 840
ggcaacttct ctttcaaaca cgaaccgtcc gccgagtttg agaaaaatta tgcctttacc 900
atgcactatc ctgcagcgac actggcaggg gcccaaagcc acggatcaat cttctcaggc 960
accgctgccc ctcgctgcga gatccccata gacaatatta tgtccttcga tagccattca 1020
catcatgagc gagtcatgag tgcccagctc aatgccatat ttcatgatta g 1071
<210> 2
<211> 356
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Thr Lys Ser Tyr Ser Glu Ser Gly Leu Met Gly Glu Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Gly Pro Pro Ser Trp Thr Asp Glu Cys Leu Ser Ser Gln Asp Glu
20 25 30
Glu His Glu Ala Asp Lys Lys Glu Asp Asp Leu Glu Ala Met Asn Ala
35 40 45
Glu Glu Asp Ser Leu Arg Asn Gly Gly Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu
50 55 60
Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys
65 70 75 80
Pro Lys Arg Arg Gly Pro Lys Lys Lys Lys Met Thr Lys Ala Arg Leu
85 90 95
Glu Arg Phe Lys Leu Arg Arg Met Lys Ala Asn Ala Arg Glu Arg Asn
100 105 110
Arg Met His Gly Leu Asn Ala Ala Leu Asp Asn Leu Arg Lys Val Val
115 120 125
Pro Cys Tyr Ser Lys Thr Gln Lys Leu Ser Lys Ile Glu Thr Leu Arg
130 135 140
Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Ser Glu Ile Leu Arg Ser Gly
145 150 155 160
Lys Ser Pro Asp Leu Val Ser Phe Val Gln Thr Leu Cys Lys Gly Leu
165 170 175
Ser Gln Pro Thr Thr Asn Leu Val Ala Gly Cys Leu Gln Leu Asn Pro
180 185 190
Arg Thr Phe Leu Pro Glu Gln Asn Gln Asp Met Pro Pro His Leu Pro
195 200 205
Thr Ala Ser Ala Ser Phe Pro Val His Pro Tyr Ser Tyr Gln Ser Pro
210 215 220
Gly Leu Pro Ser Pro Pro Tyr Gly Thr Met Asp Ser Ser His Val Phe
225 230 235 240
His Val Lys Pro Pro Pro His Ala Tyr Ser Ala Ala Leu Glu Pro Phe
245 250 255
Phe Glu Ser Pro Leu Thr Asp Cys Thr Ser Pro Ser Phe Asp Gly Pro
260 265 270
Leu Ser Pro Pro Leu Ser Ile Asn Gly Asn Phe Ser Phe Lys His Glu
275 280 285
Pro Ser Ala Glu Phe Glu Lys Asn Tyr Ala Phe Thr Met His Tyr Pro
290 295 300
Ala Ala Thr Leu Ala Gly Ala Gln Ser His Gly Ser Ile Phe Ser Gly
305 310 315 320
Thr Ala Ala Pro Arg Cys Glu Ile Pro Ile Asp Asn Ile Met Ser Phe
325 330 335
Asp Ser His Ser His His Glu Arg Val Met Ser Ala Gln Leu Asn Ala
340 345 350
Ile Phe His Asp
355
<210> 3
<211> 1074
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 3
atgaccaaat catacagcga gagcgggctg atgggcgagc ctcagcccca aggtccccca 60
agctggacag atgagtgtct cagttctcag gacgaggaac acgaggcaga caagaaagag 120
gacgagcttg aagccatgaa tgcagaggag gactctctga gaaacggggg agaggaggag 180
gaggaagatg aggatctaga ggaagaggag gaagaagaag aggaggagga ggatcaaaag 240
cccaagagac ggggtcccaa aaagaaaaag atgaccaagg cgcgcctaga acgttttaaa 300
ttaaggcgca tgaaggccaa cgcccgcgag cggaaccgca tgcacgggct gaacgcggcg 360
ctggacaacc tgcgcaaggt ggtaccttgc tactccaaga cccagaaact gtctaaaata 420
gagacactgc gcttggccaa gaactacatc tgggctctgt cagagatcct gcgctcaggc 480
aaaagccctg atctggtctc cttcgtacag acgctctgca aaggtttgtc ccagcccact 540
accaatttgg tcgccggctg cctgcagctc aaccctcgga ctttcttgcc tgagcagaac 600
ccggacatgc ccccgcatct gccaaccgcc agcgcttcct tcccggtgca tccctactcc 660
taccagtccc ctggactgcc cagcccgccc tacggcacca tggacagctc ccacgtcttc 720
cacgtcaagc cgccgccaca cgcctacagc gcagctctgg agcccttctt tgaaagcccc 780
ctaactgact gcaccagccc ttcctttgac ggacccctca gcccgccgct cagcatcaat 840
ggcaacttct ctttcaaaca cgaaccatcc gccgagtttg aaaaaaatta tgcctttacc 900
atgcactacc ctgcagcgac gctggcaggg ccccaaagcc acggatcaat cttctcttcc 960
ggtgccgctg cccctcgctg cgagatcccc atagacaaca ttatgtcttt cgatagccat 1020
tcgcatcatg agcgagtcat gagtgcccag cttaatgcca tctttcacga ttag 1074
<210> 4
<211> 357
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 4
Met Thr Lys Ser Tyr Ser Glu Ser Gly Leu Met Gly Glu Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Gly Pro Pro Ser Trp Thr Asp Glu Cys Leu Ser Ser Gln Asp Glu
20 25 30
Glu His Glu Ala Asp Lys Lys Glu Asp Glu Leu Glu Ala Met Asn Ala
35 40 45
Glu Glu Asp Ser Leu Arg Asn Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu
50 55 60
Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Gln Lys
65 70 75 80
Pro Lys Arg Arg Gly Pro Lys Lys Lys Lys Met Thr Lys Ala Arg Leu
85 90 95
Glu Arg Phe Lys Leu Arg Arg Met Lys Ala Asn Ala Arg Glu Arg Asn
100 105 110
Arg Met His Gly Leu Asn Ala Ala Leu Asp Asn Leu Arg Lys Val Val
115 120 125
Pro Cys Tyr Ser Lys Thr Gln Lys Leu Ser Lys Ile Glu Thr Leu Arg
130 135 140
Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Ser Glu Ile Leu Arg Ser Gly
145 150 155 160
Lys Ser Pro Asp Leu Val Ser Phe Val Gln Thr Leu Cys Lys Gly Leu
165 170 175
Ser Gln Pro Thr Thr Asn Leu Val Ala Gly Cys Leu Gln Leu Asn Pro
180 185 190
Arg Thr Phe Leu Pro Glu Gln Asn Pro Asp Met Pro Pro His Leu Pro
195 200 205
Thr Ala Ser Ala Ser Phe Pro Val His Pro Tyr Ser Tyr Gln Ser Pro
210 215 220
Gly Leu Pro Ser Pro Pro Tyr Gly Thr Met Asp Ser Ser His Val Phe
225 230 235 240
His Val Lys Pro Pro Pro His Ala Tyr Ser Ala Ala Leu Glu Pro Phe
245 250 255
Phe Glu Ser Pro Leu Thr Asp Cys Thr Ser Pro Ser Phe Asp Gly Pro
260 265 270
Leu Ser Pro Pro Leu Ser Ile Asn Gly Asn Phe Ser Phe Lys His Glu
275 280 285
Pro Ser Ala Glu Phe Glu Lys Asn Tyr Ala Phe Thr Met His Tyr Pro
290 295 300
Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Gln Ser His Gly Ser Ile Phe Ser Ser
305 310 315 320
Gly Ala Ala Ala Pro Arg Cys Glu Ile Pro Ile Asp Asn Ile Met Ser
325 330 335
Phe Asp Ser His Ser His His Glu Arg Val Met Ser Ala Gln Leu Asn
340 345 350
Ala Ile Phe His Asp
355
<210> 5
<211> 1053
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 5
gcagtgtgga gacacaccca ctttccccaa gggctcctgc tcccccaagt gatcccctta 60
tcctccgtgc taagatgaca ccgaggttgc agtccttacc tttgaaagca gccacaaggg 120
cgtgggggtg cacaccttta atcccagcac tcgggaggca gaggcaggca gatttctgag 180
ttcgagacca gcctggtcta caaagtgaat tccaggacag ccagggctat acagagaaac 240
cctgtcttga aaaaaaaaga gaaagaaaaa agaaaaaaaa aaatgaaagc agccacatct 300
aaggactacg tggcacagga gagggtgagt ccctgagagt tcagctgctg ccctgtctgt 360
tcctgtaaat ggcagtgggg tcatgggaaa gtgaaggggc tcaaggtatt ggacacttcc 420
aggataatct tttggacgcc tcaccctgtg ccaggaccaa ggctgagctt ggcaggctca 480
gaacagggtg tcctgttctt ccctgtctaa aacattcact ctcagcttgc tcacccttcc 540
ccagacaagg aagctgcaca gggtctggtg ttcagatggc tttggcttac agcaggtgtg 600
ggtgtggggt aggaggcagg gggtaggggt gggggaagcc tgtactatac tcactatcct 660
gtttctgacc ctctaggact cctacagggt tatgggagtg gacaggcagt ccagatctga 720
gctgctgacc cacaagcagt gccctgtgcc tgccagaatc caaagccctg ggaatgtccc 780
tctggtcccc ctctgtcccc tgcagccctt cctgttgctc aaccttgcac agttccgacc 840
tgggggagag agggacagaa atcttgccaa gtatttcaac agaatgtact ggcaattact 900
tcatggcttc ctggacttgg taaaggatgg actaccccgc ccaacagggg ggctggcagc 960
caggtaggcc cataaaaagc ccgctgggga gtcctcctca ctctctgctc ttcctcctcc 1020
agcacacatc agacctagta gctgtggaaa cca 1053
<210> 6
<211> 1672
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
gtctgcaagc agacctggca gcattgggct ggccgccccc cagggcctcc tcttcatgcc 60
cagtgaatga ctcaccttgg cacagacaca atgttcgggg tgggcacagt gcctgcttcc 120
cgccgcaccc cagcccccct caaatgcctt ccgagaagcc cattgagtag ggggcttgca 180
ttgcacccca gcctgacagc ctggcatctt gggataaaag cagcacagcc ccctaggggc 240
tgcccttgct gtgtggcgcc accggcggtg gagaacaagg ctctattcag cctgtgccca 300
ggaaagggga tcaggggatg cccaggcatg gacagtgggt ggcagggggg gagaggaggg 360
ctgtctgctt cccagaagtc caaggacaca aatgggtgag gggactgggc agggttctga 420
ccctgtggga ccagagtgga gggcgtagat ggacctgaag tctccaggga caacagggcc 480
caggtctcag gctcctagtt gggcccagtg gctccagcgt ttccaaaccc atccatcccc 540
agaggttctt cccatctctc caggctgatg tgtgggaact cgaggaaata aatctccagt 600
gggagacgga ggggtggcca gggaaacggg gcgctgcagg aataaagacg agccagcaca 660
gccagctcat gcgtaacggc tttgtggagc tgtcaaggcc tggtctctgg gagagaggca 720
cagggaggcc agacaaggaa ggggtgacct ggagggacag atccaggggc taaagtcctg 780
ataaggcaag agagtgccgg ccccctcttg ccctatcagg acctccactg ccacatagag 840
gccatgattg acccttagac aaagggctgg tgtccaatcc cagcccccag ccccagaact 900
ccagggaatg aatgggcaga gagcaggaat gtgggacatc tgtgttcaag ggaaggactc 960
caggagtctg ctgggaatga ggcctagtag gaaatgaggt ggcccttgag ggtacagaac 1020
aggttcattc ttcgccaaat tcccagcacc ttgcaggcac ttacagctga gtgagataat 1080
gcctgggtta tgaaatcaaa aagttggaaa gcaggtcaga ggtcatctgg tacagccctt 1140
ccttcccttt tttttttttt ttttttgtga gacaaggtct ctctctgttg cccaggctgg 1200
agtggcgcaa acacagctca ctgcagcctc aacctactgg gctcaagcaa tcctccagcc 1260
tcagcctccc aaagtgctgg gattacaagc atgagccacc ccactcagcc ctttccttcc 1320
tttttaattg atgcataata attgtaagta ttcatcatgg tccaaccaac cctttcttga 1380
cccaccttcc tagagagagg gtcctcttga ttcagcggtc agggccccag acccatggtc 1440
tggctccagg taccacctgc ctcatgcagg agttggcgtg cccaggaagc tctgcctctg 1500
ggcacagtga cctcagtggg gtgaggggag ctctccccat agctgggctg cggcccaacc 1560
ccaccccctc aggctatgcc agggggtgtt gccaggggca cccgggcatc gccagtctag 1620
cccactcctt cataaagccc tcgcatccca ggagcgagca gagccagagc at 1672
<210> 7
<211> 1610
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 7
aactgagagt ggaggggcac agaagagccc aagaggctcc ttaggttgtg tggagggtac 60
aatatgtttg ggctgagcaa cccagagcca gactttgtct ggctggtaag agacagaggt 120
gcctgctatc acaatccaag ggtctgcttg aggcagagcc agtgcaaagg atgtggttag 180
agccagcctg gtgtactgaa gaggggcgaa gagcttgagt aaggagtctc agcggtggtt 240
tgagaggcag ggtggttaat ggagtagctg caggggagaa tccttgggag ggagcctgca 300
ggacagagct ttggtcagga agtgatgggc atgtcactgg accctgtatt gtctctgact 360
tttctcaagt aggacaatga ctctgcccag ggagggggtc tgtgacaagg tggaagggcc 420
agaggagaac ttctgagaag aaaaccagag gccgtgaaga ggtgggaagg gcatgggatt 480
cagaacctca ggcccaccag gacacaaccc caggtccaca gcagatgggt gaccttgcat 540
gtctcagtca ccagcattgt gctccttgct tatcacgctt gggtgaagga aatgacccaa 600
atagcataaa gcctgaaggc cgggactagg ccagctaggg cttgcccttc ccttcccagc 660
tgcactttcc ataggtccca ccttcagcag attagacccg cctcctgctt cctgcctcct 720
tgcctcctca ctcatgggtc tatgcccacc tccagtctcg ggactgaggc tcactgaagt 780
cccatcgagg tctggtctgg tgaatcagcg gctggctctg ggccctgggc gaccagttag 840
gttccgggca tgctaggcaa tgaactctac ccggaattgg gggtgcgggg aggcggggag 900
gtctccaacc cagccttttg aggacgtgcc tgtcgctgca cggtgctttt tatagacgat 960
ggtggcccat tttgcagaag ggaaagccgg agccctctgg ggagcaaggt ccccgcaaat 1020
ggacggatga cctgagcttg gttctgccag tccacttccc aaatccctca ccccattcta 1080
gggactaggg aaagatctcc tgattggtca tatctggggg cctggccgga gggcctccta 1140
tgattggaga gatctaggct gggcgggccc tagagcccgc ctcttctctg cctggaggag 1200
gagcactgac cctaaccctc tctgcacaag acccgagctt gtgcgccctt ctgggagctt 1260
gctgcccctg tgctgactgc tgacagctga ctgacgctcg cagctagcag gtacttctgg 1320
gttgctagcc cagagccctg ggccggtgac cctgttttcc ctacttcccg tctttgacct 1380
tgggtaagtt tctttttctt ttgtttttga gagaggcacc cagatcctct ccactacagg 1440
cagccgctga accttggatc ctcagctcct gccctgggaa ctacagttcc tgcccttttt 1500
ttcccacctt gagggaggtt ttccctgagt agcttcgact atcctggaac aagctttgta 1560
gaccagcctg ggtctccgga gagttgggat taaaggcgtg caccaccacc 1610
<210> 8
<211> 1387
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
ctctggtttc aagaccaata ctcataaccc ccacatggac caggcaccat cacacctgag 60
cactgcactt agggtcaaag acctggcccc acatctcagc agctatgtag actagctcca 120
gtcccttaat ctctctcagc ctcagtttct tcatctgcaa aacaggtctc agtttcgttg 180
caaagtatga agtgctgggc tgttactggt caaagggaag agctgggaag agggtgcaag 240
gtggggttgg gctggagatg ggctggagca gatagatgga gggacctgaa tggaggaagt 300
aaaccaaggc ccggtaacat tgggactgga cagagaacac gcagatcctc taggcaccgg 360
aagctaagta acattgccct ttctcctcct gtttgggact aggctgatgt tgctgcctgg 420
aagggagcca gcagaagggc cccagcctga agctgttagg tagaagccaa atccagggcc 480
agatttccag gaggcagcct cgggaagttg aaacacccgg attcaggggt caggaggcct 540
gggcttctgg caccaaacgg ccagggacct actttccacc tggagtcttg taagagccac 600
tttcagcttg agctgcactt tcgtcctcca tgaaatgggg gaggggatgc tcctcaccca 660
ccttgcaagg ttattttgag gcaaatgtca tggcgggact gagaattctt ctgccctgcg 720
aggaaatcca gacatctctc ccttacagac agggagactg aggtgaggcc cttccaggca 780
gagaaggtca ctgttgcagc catgggcagt gccccacagg acctcgggtg gtgcctctgg 840
agtctggaga agttcctagg ggacctccga ggcaaagcag cccaaaagcc gcctgtgagg 900
gtggctggtg tctgtccttc ctcctaaggc tggagtgtgc ctgtggaggg gtctcctgaa 960
ctcccgcaaa ggcagaaagg agggaagtag gggctgggac agttcatgcc tcctccctga 1020
gggggtctcc cgggctcggc tcttggggcc agagttcagg gtgtctgggc ctctctatga 1080
ctttgttcta agtctttagg gtggggctgg ggtctggccc agctgcaagg gccccctcac 1140
ccctgcccca gagaggaaca gccccgcacg ggccctttaa gaaggttgag ggtgggggca 1200
ggtgggggag tccaagcctg aaacccgagc gggcgcgcgg gtctgcgcct gccccgcccc 1260
cggagttaag tgcgcggaca cccggagccg gcccgcgccc aggagcagag ccgcgctcgc 1320
tccactcagc tcccagctcc caggactccg ctggctcctc gcaagtcctg ccgcccagcc 1380
cgccggg 1387
<210> 9
<211> 9232
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CAG启动子并编码由IRES隔开的NeuroD1和绿色荧光蛋白的构建体
<400> 9
gatccggcca ttagccatat tattcattgg ttatatagca taaatcaata ttggctattg 60
gccattgcat acgttgtatc catatcataa tatgtacatt tatattggct catgtccaac 120
attaccgcca tgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 180
attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 240
tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 300
aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 360
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 420
taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 480
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa 540
tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa 600
tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc 660
cccattgacg caaatgggcg gtaggcatgt acggtgggag gtctatataa gcagagctca 720
ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 780
ggtacccgta ttcccaataa agcctcttgc tgtttgcatc cgaatcgtgg tctcgctgtt 840
ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccacgac gggggtcttt catttggggg 900
ctcgtccggg atttggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 960
tggccagcaa cttatctgtg tctgtccgat tgtctagtgt ctatgtttga tgttatgcgc 1020
ctgcgtctgt actagttagc taactagctc tgtatctggc ggacccgtgg tggaactgac 1080
gagttctgaa cacccggccg caaccctggg agacgtccca gggactttgg gggccgtttt 1140
tgtggcccga cctgaggaag ggagtcgatg tggaatccga ccccgtcagg atatgtggtt 1200
ctggtaggag acgagaacct aaaacagttc ccgcctccgt ctgaattttt gctttcggtt 1260
tggaaccgaa gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcgctgca gcatcgttct gtgttgtctc 1320
tgtctgactg tgtttctgta tttgtctgaa aattagggcc agactgttac cactccctta 1380
agtttgacct taggtcactg gaaagatgtc gagcggatcg ctcacaacca gtcggtagat 1440
gtcaagaaga gacgttgggt taccttctgc tctgcagaat ggccaacctt taacgtcgga 1500
tggccgcgag acggcacctt taaccgagac ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt 1560
tcacctggcc cgcatggaca cccagaccag gtcccctaca tcgtgacctg ggaagccttg 1620
gcttttgacc cccctccctg ggtcaagccc tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt 1680
cctccatccg ccccgtctct cccccttgaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgatcctcc 1740
ctttatccag ccctcactcc ttctctaggc gccggaattc gatgtcgaca ttgattattg 1800
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 1860
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 1920
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 1980
caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 2040
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 2100
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 2160
accatgggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 2220
acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 2280
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 2340
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 2400
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgttgc 2460
cttcgccccg tgccccgctc cgcgccgcct cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg 2520
cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct 2580
tggtttaatg acggctcgtt tcttttctgt ggctgcgtga aagccttaaa gggctccggg 2640
agggcccttt gtgcgggggg gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg 2700
agcgccgcgt gcggcccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc ggcgcggggc 2760
tttgtgcgct ccgcgtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg 2820
gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg gtgagcaggg 2880
ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga 2940
gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc 3000
gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga 3060
gggctcgggg gaggggcgcg gcggccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc 3120
cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc tttgtcccaa 3180
atctggcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcgggcgaa 3240
gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt cgccgcgccg 3300
ccgtcccctt ctccatctcc agcctcgggg ctgccgcagg gggacggctg ccttcggggg 3360
ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct 3420
aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttgttgtg 3480
ctgtctcatc attttggcaa agaattcgct agcggatccg gccgcctcgg ccaccggtcg 3540
ccaccatcgc caccatgacc aaatcataca gcgagagcgg gctgatgggc gagcctcagc 3600
cccaaggtcc cccaagctgg acagatgagt gtctcagttc tcaggacgag gaacacgagg 3660
cagacaagaa agaggacgag cttgaagcca tgaatgcaga ggaggactct ctgagaaacg 3720
ggggagagga ggaggaggaa gatgaggatc tagaggaaga ggaggaagaa gaagaggagg 3780
aggaggatca aaagcccaag agacggggtc ccaaaaagaa aaagatgacc aaggcgcgcc 3840
tagaacgttt taaattaagg cgcatgaagg ccaacgcccg cgagcggaac cgcatgcacg 3900
ggctgaacgc ggcgctggac aacctgcgca aggtggtacc ttgctactcc aagacccaga 3960
aactgtctaa aatagagaca ctgcgcttgg ccaagaacta catctgggct ctgtcagaga 4020
tcctgcgctc aggcaaaagc cctgatctgg tctccttcgt acagacgctc tgcaaaggtt 4080
tgtcccagcc cactaccaat ttggtcgccg gctgcctgca gctcaaccct cggactttct 4140
tgcctgagca gaacccggac atgcccccgc atctgccaac cgccagcgct tccttcccgg 4200
tgcatcccta ctcctaccag tcccctggac tgcccagccc gccctacggc accatggaca 4260
gctcccacgt cttccacgtc aagccgccgc cacacgccta cagcgcagct ctggagccct 4320
tctttgaaag ccccctaact gactgcacca gcccttcctt tgacggaccc ctcagcccgc 4380
cgctcagcat caatggcaac ttctctttca aacacgaacc atccgccgag tttgaaaaaa 4440
attatgcctt taccatgcac taccctgcag cgacgctggc agggccccaa agccacggat 4500
caatcttctc ttccggtgcc gctgcccctc gctgcgagat ccccatagac aacattatgt 4560
ctttcgatag ccattcgcat catgagcgag tcatgagtgc ccagcttaat gccatctttc 4620
acgattaggt ttaaacgcgg ccgcgcccct ctccctcccc cccccctaac gttactggcc 4680
gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc accatattgc 4740
cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta 4800
ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag 4860
ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga 4920
accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg 4980
caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat 5040
ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta 5100
tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa 5160
aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat 5220
atggccacaa ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 5280
gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 5340
gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 5400
ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 5460
gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 5520
cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 5580
ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 5640
atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 5700
aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 5760
gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 5820
cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 5880
gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 5940
ctgtacaagt aagtcgacaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt 6000
attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat 6060
catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg 6120
tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt 6180
gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact 6240
ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc 6300
tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg 6360
tcctttccat ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc 6420
tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg 6480
cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc 6540
tccccgcctg gaattcgagc tcgagcttgt taacatcgat aaaataaaag attttattta 6600
gtctccagaa aaagggggga atgaaagacc ccacctgtag gtttggcaag ctagcttaag 6660
taacgccatt ttgcaaggca tggaaaaata cataactgag aatagagaag ttcagatcaa 6720
ggtcaggaac agatggaaca gctgaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt 6780
cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg gaacagctga atatgggcca aacaggatat 6840
ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt 6900
ccagccctca gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga 6960
aatgaccctg tgccttattt gaactaacca atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg 7020
cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc cacaacccct cactcggggc gccagtcctc 7080
cgattgactg agtcgcccgg gtacccgtgt atccaataaa ccctcttgca gttgcatccg 7140
acttgtggtc tcgctgttcc ttgggagggt ctcctctgag tgattgacta cccgtcagcg 7200
ggggtctttc atttccgact tgtggtctcg ctgccttggg agggtctcct ctgagtgatt 7260
gactacccgt cagcgggggt cttcacatgc agcatgtatc aaaattaatt tggttttttt 7320
tcttaagtat ttacattaaa tggccatagt tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 7380
gaggcggttt gcgtattggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 7440
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 7500
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 7560
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 7620
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 7680
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 7740
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 7800
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 7860
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 7920
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 7980
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 8040
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 8100
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 8160
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 8220
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 8280
tttaaattaa aaatgaagtt tgcggccggc cgcaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 8340
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 8400
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 8460
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 8520
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 8580
tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 8640
aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 8700
ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 8760
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 8820
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 8880
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 8940
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga 9000
actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 9060
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 9120
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 9180
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca at 9232

Claims (28)

1.一种治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法，包括：
将治疗有效剂量的外源性NeuroD1给予正常血流已被破坏的区域。
2.如权利要求1所述的方法，其中给予外源性NeuroD1包括向该区域递送包含编码NeuroD1的核酸的表达载体。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中给予外源性NeuroD1包括向该区域递送包含编码NeuroD1的核酸的重组病毒表达载体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中表达外源性NeuroD1包括向该区域递送包含编码NeuroD1的核酸的重组腺相关病毒表达载体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中表达外源NeuroD1包括向该区域递送以下的有效“翻转切除”重组表达载体组合：1)重组腺相关病毒表达载体，其包含编码NeuroD1的核酸，和2)重组腺相关病毒表达载体，其包含编码位点特异性重组酶的核酸。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中NeuroD1是递送至该区域的唯一外源表达的转录因子。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在CNS中正常血流被破坏后的一定时间给予外源性NeuroD1，此时存在反应性星形胶质细胞。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在CNS中正常血流被破坏后的一定时间给予外源性NeuroD1，此时神经胶质细胞是反应性的。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中CNS中正常血流的破坏是由于选自下组的紊乱：缺血，血栓形成，栓塞，出血，脑震荡，冲击，渗透，肿瘤，炎症，感染，慢性疾病介导的血管限制及其任何两种或更多种的组合。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中CNS中正常血流的破坏是由于选自下组的紊乱：缺血性中风；出血性中风；脑动脉瘤；创伤性脑损伤；脑震荡；冲击；渗透；肿瘤；炎症；感染；创伤性脊髓损伤；缺血性或出血性脊髓病(脊髓梗死)；由心脏骤停或严重低血压(休克)引起的全局缺血；由缺氧，低血糖或贫血引起的缺氧缺血性脑病；由感染性心内膜炎或心房粘液瘤引起的CNS栓塞；纤维软骨栓塞性脊髓病；儿童白血病引起的CNS血栓形成；由肾病综合征(肾病)，慢性炎性疾病，妊娠，使用基于雌激素的避孕药，脑膜炎，脱水引起的脑静脉窦血栓形成；或其任何两种或更多种的组合。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中给予治疗有效剂量的NeuroD1包括给予包含编码NeuroD1蛋白的核酸序列的重组表达载体，其中编码NeuroD1蛋白的核酸序列包括选自下组的核酸序列：编码SEQ ID NO：2的核酸序列或其功能片段；编码SEQ ID NO：4的核酸序列或其功能片段；SEQ ID NO：1或其功能片段；SEQ ID NO：3或其功能片段；和编码与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性的蛋白质的核酸序列，或其功能片段。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中给予治疗有效剂量的NeuroD1包括在损伤区域中或附近立体定向注射。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中编码NeuroD1的核酸序列与遍在启动子操作性地连接。
14.如权利要求5-12中任一项所述的方法，其中编码位点特异性重组酶的核酸序列与神经胶质细胞特异性启动子操作性地连接。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述神经胶质细胞特异性启动子是GFAP启动子。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述GFAP启动子是人GFAP启动子。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，还包括评估对象中治疗的有效性。
18.如权利要求17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括选自以下的测定：电生理学测定，血流测定，组织结构测定，功能测定及其任何两种或更多种的组合。
19.如权利要求17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括脑电图。
20.如权利要求17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括选自下组的血流测定：近红外光谱和fMRI。
21.如权利要求17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括选自下组的组织结构的测定：MRI，PET扫描，CAT扫描和超声。
22.如权利要求17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括行为测定。
23.如权利要求17所述的方法，其中评估对象中治疗的有效性包括在给予治疗有效剂量的外源性NeuroD1之前进行的测定。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中以0.1-5μl/分钟的受控流速，将1-500μl含有包含编码NeuroD1的核酸的腺相关病毒颗粒的药学上可接受的运载体注射到对象体内正常血流被破坏的区域中，其浓度为1010-1014个腺相关病毒颗粒/ml运载体。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，还包括选自下组的治疗：去除血凝块，促进血液流动，给予抗炎剂，给予抗氧化剂，降低兴奋性毒性，和其两种或更多种。
26.一种组合物，其包含：1)重组腺相关腺病毒表达载体，其包含与编码位点特异性重组酶的核酸操作性地连接的神经胶质细胞特异性启动子和2)重组腺相关腺病毒表达载体，其包括与编码NeuroD1的核酸操作性地连接的遍在启动子，其中编码NeuroD1的核酸被反转并且侧接两组位点特异性重组酶识别位点，使得重组酶的作用不可逆地反转编码NeuroD1的核酸，使得NeuroD1在哺乳动物细胞中表达。
27.一种基本上如本文所述治疗有需要的个体对象中CNS中正常血流的破坏的影响的方法。
28.一种基本上如本文所述的翻转切除表达载体组合。
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