JP7364468B2 - 血流の途絶に起因する神経損傷の治療のための機能性ニューロンの再生 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年2月28日に出願した米国仮特許出願第62/464,469号;及び2017年6月13日に出願した米国仮特許出願第62/518,914号に基づく優先権を主張する。各出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所により交付された助成金番号AG045656の下で政府支援を得てなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
本発明は、個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療するための組成物及び方法に関する。
脳機能は、ニューロンとそれらの周囲のグリア細胞との間の微妙なバランスに依存している。重度の虚血性損傷の後、ニューロンは、直ちに又は二次的な損傷により徐々に死滅するが、それらの隣接するグリア細胞は活性化され、増殖が開始され得るため、神経再生を最終的に阻害するグリア性瘢痕組織が生じる。本明細書に記載のNeuroD1介在性in vivo細胞変換技術は、反応性グリア細胞を機能性ニューロンに直接的に変換することによって、CNSにおける正常な血流の途絶から生じた損傷領域における神経機能を回復させる。本明細書に記載された本発明のグリアからニューロンへのin vivo変換技術は、脳卒中を治療するための生着及び試行に関する「古典的な」外因性幹細胞の投与と比較して、多くの利点を有する。
材料及び方法
脳卒中のマウスモデル及びウイルス注射
野生型(WT)FVB/NJ及びGFAP-GFPトランスジェニックマウスを、本研究で記載する実験の大部分に対して用いた。GFAP-GFPトランスジェニックマウスは、Zhuo, L.ら、1997、Dev Biol 187、36~42ページに記載されているJackson Laboratory[FVB/N-Tg(GFAPGFP)14Mes/J]から購入し、FVB/NJマウス(Jackson Laboratory)と交配した。エンドセリン-1(1-31)を、Horie, N.ら、2008、J. Neurosci. Methods 173、286~290ページ;及びRoome, R.B.ら、2014、J. Neurosci. Methods、233、34~44ページに記載されているように、成体WT FVB/NJ又はGFAPA-GFPトランスジェニックマウス(28~40g、5~10ヶ月齢)の運動皮質に注射し、局所的な虚血性損傷を生じさせた。
hGFAPプロモーターはpDRIVE-hGFAPプラスミド(InvivoGen, Inc.)から入手し、pAAV-MCS(Cell Biolab)のMluIとSacIIとの間に挿入し、CMVプロモーターを置き換えた。Cre遺伝子は、PCRによってhGFAP-Cre(Addgene plasmid #40591)から取得し、pAAV MCSのEcoRI部位とSal1部位との間に挿入し、pAAV-hGFAP::Creベクターを作製した。
組換えAAV9は、293AAV細胞(Cell Biolabs)で産生させた。簡単に説明すると、ポリエチレンイミン(PEI、直鎖、分子量25,000)をトリプルプラスミド:pAAV発現ベクター、pAAV9-RC(Cell Biolab)、及びpHelper(Cell Biolab)のトランスフェクションに使用した。
pCAG-NeuroD1-IRES-GFP及びpCAG-GFPは、Guo, Z.ら、2014、Cell Stem Cell 14、188~202ページに記載されている。レトロウイルス粒子をパッケージングするため、gpgヘルパー不含ヒト胎児腎臓(HEK)細胞を、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G)ベクターと一緒に標的プラスミドでトランスフェクトし、NeuroD1又はGFPを発現するレトロウイルスを産生した。レトロウイルス粒子の力価は、HEK細胞の形質導入後に決定して、約107粒子/mlであった。
マウス脳の浮遊凍結切片の免疫組織化学は、Guo, Z.ら、2014、Cell Stem Cell 14、188~202ページに記載されているように実施した。2.5%アベルチンを用いて動物を麻酔し、人工脳脊髄液(ACSF)を経心的に灌流して脳組織中の血液を洗い流した。次いで、脳を解剖し、トリミングし、後固定のために、4℃で一晩、4%パラホルムアルデヒド(PFA)に入れた。固定後、脳組織をビブラトーム(Leica)により40μmの切片に切断した。
深く麻酔したマウスに、上記のように人工脳脊髄液を用いて灌流し、続いてPBS中の0.5mg/mlのスルホ-NHS-LC-ビオチン15mlを灌流した。免疫組織化学検査のために、脳切片を、PBS中1:800に希釈したテキサスレッドストレプトアビジン(Vector SA-5006)+0.3%トリトン+2.5%正常ヤギ又はロバ血清と共に室温で1時間インキュベートし、続いて通常のマウント手順を実施した。
脳切片の記録は、Guo, Z.ら、2014、Cell Stem Cell 14、188~202ページ;及びWu, Z.ら、2014、Nat. Commun. 5, 4159ページに記載されている方法と同様に実施した。AAV注射の2~3か月後、マウスを2.5%アベルチンで麻酔し、次いで、NMDG系の切断溶液(mMで):93 NMDG、93 HC1、2.5 KC1、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、15 グルコース、12 N-アセチル-L-システイン、5 アスコルビン酸ナトリウム、2 チオ尿素、3 ピルビン酸ナトリウム、7 MgSO4、0.5 CaCl2、pH7.3~7.4、300 mOsmo、95%O2/5%CO2で通気、灌流した。
餌ペレット回収試験
マウスにおけるすべての行動実験では、重度の運動障害を誘発するために、ET-1(1-31)を前肢運動皮質の2点に注射した。2点の座標は次のとおりである:(i)+0.2mm AP、+/-1.35mm ML、(ii)+0.38mm AP、+/-2.45mm ML(+ML又は-MLは、脳卒中前のペレット回収トレーニングにおいて優勢な前肢の対側に基づいた)。
グリッド歩行試験は、Baskin, Y.K.ら、2003、J. Neurosci. Methods 129、87~93ページ;及びClarkson, A.N.ら、2010、Nature 468、305~309ページに記載されているのと同様であった。
シリンダー試験は、Roome, R.B.ら、2014、J. Neurosci. Methods、233、34~44ページに記載されている方法に基づいた。この試験には、マウスの立ち上がり、前肢による透明シリンダー(直径10cm、高さ15cm)の側壁へのタッチのビデオ録画を含めた。各動物を透明な板上のシリンダーに入れ、カメラを用いて下からビデオ記録した。マウスが立ち上がり、側壁に30回よりも多くタッチすることを試みた後に実験は停止したが、これは通常約3~4分間続いた。
損傷コア(約2mm×2mmの正方形)の周囲の皮質組織を灌流後に取得し、液体窒素中で瞬間凍結した。RNA抽出は、Macherey-Nagel NucleoSpin RNAキットを使用して実行し、RNA濃度はNanoDropにより測定した。cDNAは、Quanta Biosciences qScript cDNA supermixを使用して合成した。
切片ゴルジキット(Bieoenno Tech、LLC)をゴルジ染色に使用した。簡単に説明すると、マウスをaCSFで灌流し、続いてキットの固定液を灌流した。脳を取り出し、5日間含浸させ、200μmのビブラトームで切片化し、染色し、キットのプロトコールに基づいてマウントし、DPXマウント剤で覆った。4×及び100×の明視野画像を、Keyence BZ-9000螢光顕微鏡を使用して得た。
皮質領域サイズ分析
皮質領域は、Keyence BZ-9000蛍光顕微鏡において4×レンズで得られた画像を使用して定量化した。最も明白な脳卒中損傷を有する注射点(+0.2 AP)の周囲の3つの切片を、画像取得のために選択した。DAPI及びNeuNシグナルを使用して、皮質上方境界と下方界面を帯状皮質と共に特定した。正中線から3mm外側までの皮質領域をImageJで測定した。
GFAP又はNeuNと同時染色したmCherry/GFPの40×共焦点画像を、4、7、及び17dpiでの定量化に使用した。各動物について、4つの画像を脳梗塞付近のウイルス感染領域で動物ごとに得た。GFAP比については、mCherry/GFP及びGFAPに二重陽性であった細胞を、Zeiss共焦点ソフトウェアZenを使用してカウントした。すべてのmCherry又はGFP陽性細胞(すべてのウイルス感染細胞)のうち二重陽性細胞のパーセンテージを計算した。同様の方法をNeuN比に適用した。
皮質ニューロンマーカー(Tbr1、Emx1、Satb2、PV、GABA)と同時染色したGFP(NeuroD1-GFP)の40×共焦点画像を、60dpiでの定量化に使用した。各動物について、3つの画像を、GFPシグナルを示すウイルス感染領域で得た。すべてのGFP陽性細胞(NeuroD1-GFP感染細胞)のうちのGFP、及び個々のマーカーについての二重陽性細胞のパーセンテージをそれぞれ計算した。
グリアマーカー(LCN2、CSPG、AQP4及びIba1)及びニューロン突起マーカー(Map2、SMI312、VGluT1及びMBP)の単層共焦点画像を、17dpiでの定量化に使用した。63×レンズを使用したSMI312を除き、40×レンズをほとんどのマーカーに使用した。3つの画像を、脳卒中梗塞に近いウイルス感染領域(脳卒中コアボーダーから500μm以内)及び皮質厚全体の中間で得た。1つの画像は、正規化のために比較的健全な領域で得た。健全な領域のバックグラウンドに基づいて閾値を設定した後、ImageJを使用して、画像領域全体の強度とカバー領域を定量化した。3つの画像の結果を使用して、各動物についての平均データを取得した。
NeuN及びPVの細胞数は、正中線の外側500μm~2500μmの皮質領域内で、Zeiss LSM800共焦点顕微鏡のタイル機能によって得られたNeuN又はPV免疫染色の画像でカウントした。共焦点ソフトウェアZenを細胞カウントに使用した。最も明白な脳卒中損傷を有する注射点の周囲の切片(+0.2 AP)を得られた画像に使用した。
NeuN免疫染色の40×共焦点画像を17dpiでの定量化に使用した。図4Aに示したように、3つの画像を、脳卒中梗塞に近いウイルス感染領域(脳卒中コアボーダーから500μm以内)で得た。1μm間隔で10個の切片でZスタック機能を使用した。共焦点ソフトウェアZenを細胞カウントに使用した。NeuroD1群においては、GFP(NeuroD1-GFP)及びNeuN(変換されたニューロン)の両方についての陽性細胞又はNeuN陽性GFP陰性(既存のニューロン)をカウントした。GFP対照群については、NeuN陽性細胞の総数をカウントした。
sEPSC及びsIPSCは、Mini Analysis Program(Synaptosoft、New Jersey、USA)を使用して分析した。大きな事象の複数の検出を回避するため、分析結果を自動検出後、更に視覚的にチェックした。異なる群の間のsEPSCとsIPSCの周波数を比較するため、平均値を取得する前に、各細胞について200を超える事象又は少なくとも3分の記録期間をサンプリングした。
Ly6C数の定量化については、単層40×画像をZeiss共焦点により得た。Ly6Cの強度をImageJで測定し、バックグラウンドよりも3倍高い強度を有する血管を陽性シグナルとして同定した。梗塞周辺領域の3つの画像におけるLy6C+血管の数を定量化し、各マウスについて平均化した。
統計分析は、Prism 6(GraphPad)ソフトウェアを使用して実施した。示したすべての実験は、少なくとも3匹の動物において繰り返し、代表的なデータを示している。群間の有意性を決定するため、比較は、示したように、対応のある両側スチューデントt検定、又は反復測定ANOVA試験を使用して行った。ウイルス注射前に重度の脳卒中について第一次スクリーニングをした後、動物を、欠損レベルが一致する群に無作為に割り当てた。定量化用のすべての画像は、1人の研究者によって取得し、動物の状態及びアイデンティティーを知らない別の研究者によって定量化された。上述のように、マウス行動試験は盲検様式で実施した。
NeuroD1は脳卒中誘発反応性星状細胞をニューロンに変換する
この実施例において、in vivoでの細胞変換が虚血性脳卒中後の機能的な脳修復を達成できるかどうかについて調査した。血管収縮ペプチドのエンドセリン-1(ET-1)によって誘発した局所脳卒中モデルを使用し、げっ歯動物において一貫した局所虚血性損傷を生じさせた(Fuxeら、1997; Hughesら、2003; Roomeら、2014; Windleら、2006)。
細胞変換後の神経炎症の低減
脳卒中領域におけるNeuroD1感染後の星状細胞からニューロンへの変換に伴って、脳卒中領域におけるGFAPシグナルの有意な低減が観察された(図5Aを参照)。NeuroD1感染反応性星状細胞の>70%がニューロンに変換され、GFAPシグナルがそれに応じて減少するので、このことは予測される。しかし、またこれによって、変換された領域で星状細胞が枯渇されるのではないかという疑問が生じる。これに答えるため、星状細胞からニューロンへの変換がほとんど終了した際、ウイルス注射後17日目(dpi; 27dps)に、NeuroD1 AAVに高度に感染された梗塞に近い脳卒中領域(*)を試験した。
神経再生は神経保護に結びつく
神経炎症の低減と一致して、NeuN陽性ニューロンの数は、NeuroD1感染領域において有意に増加するようであった(図7Aを参照)。驚くべきことに、損傷コアに近い脳卒中領域においては、NeuroD1-GFP標識ニューロンが検出されただけでなく、GFP陽性(図7A、矢印を参照)でもNeuroD1-陽性でもない(図7B、矢印を参照)、多数の非変換ニューロンも検出された。
脳卒中後の機能的神経回路の再構成
in vivoでの細胞変換に関する極めて重要な問題の1つは、グリア変換ニューロンが機能的神経回路を形成することができる否かである。この質問に答えるため、NeuroD1介在性の細胞変換後の脳卒中領域における形態学的構造を試験した。脳卒中及びウイルス注射の後、対照及びNeuroD1治療マウスの両方において、7、17、40、及び60dpiでの虚血損傷運動皮質を試験した(図9Aを参照)。
細胞変換後の血管及び血液脳関門のレスキュー
NeuroD1治療が脳卒中領域において脳組織の喪失をレスキューし神経回路を形成することができる場合、細胞変換後に血管及び血液脳関門を回復させることができるであろうか?
この質問に答えるため、脳卒中領域における血管及び血管に接触して血液脳関門を形成する星状細胞エンドフィートを試験した(図11A~図11Hを参照)。脳卒中のない正常脳においては、血管(Ly6C、内皮細胞及び単球マーカーによって標識)の周囲を包む星状細胞エンドフィートのマーカーアクアポリン4(AQP4、水チャネル)は、無傷の血液脳関門(BBB)を示した(図11A、上段を参照)。反対に、ET-1(1-31)誘発性局所脳卒中の1週間後、血管と星状細胞エンドフィートの両方で有意な破壊が観察された(図11A、下段を参照)。
運動障害及び記憶障害の機能的なレスキュー
NeuroD1治療後の脳卒中領域における有意水準の神経再生を考慮して、この治療が脳卒中によって引き起こされた機能障害をレスキューすることができるかどうかを判定する実験を実施した。様々な動物行動試験に関する予備試験の後に、マウスの前肢機能に対する詳細な分析を、以下の3つの試験を使用して実施した:餌ペレット回収試験、グリッド歩行試験、及びシリンダー試験(図13A、行動試験パラダイムを参照)。
NeuroD1介在性のin vivoでのグリアからニューロンへの変換後の脳卒中領域においては、グリアの形態と機能の両方がNeuroD1感染領域で顕著に改善された。ニューロン変換後のかなりの数の星状細胞は、反応性星状細胞の増殖能力と一致している。NeuroD1発現領域における肥大性から通常の分岐したアストログリア細胞形態への改善は、反応性グリア細胞がより少ない損傷シグナルに暴露されること、新しく生成された星状細胞の反応性が低いこと、又はその両方を示唆している。
in vivoでのグリアからニューロンへの変換はまた、げっ歯類モデルにおける虚血性脳卒中によって引き起こされた運動障害を機能的にレスキューすることもできる。この機能レスキューは、NeuroD1治療後の細胞変換及び回路再構築の両方を含む構造変化に基づく。NeuroD1-GFP標識ニューロンと非標識ニューロンとの混合物がNeuroD1治療後の脳卒中領域において観察された。これは、修復された脳回路が、新しく生成されたニューロンと古い成熟ニューロンの両方の統合であることを示唆している。
項目1。それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域に治療有効用量の外因性NeuroD1を投与することを含む、方法。
本明細書に記載した組成物及び方法は、好ましい実施形態の現在の代表的なものであり、本発明の範囲に対する制限を意図するものではない。変更及び他の使用が、当業者には想定されるであろう。そのような変更及び他の使用は、特許請求の範囲に示された本発明の範囲から逸脱することなく実施することができる。
Claims (18)
- それを必要とする個々の対象の中枢神経系(CNS)における正常な血流の途絶と関連する神経炎症の低減及び/又は血管の修復のための医薬の製造における、外因性NeuroD1をコードする核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)発現ベクターを含有する組成物の使用であって、CNSにおける正常な血流の途絶が血栓症、塞栓症、出血、脳震盪、炎症、感染症、血管の慢性疾患媒介による制限、及び任意のそれらの2つ以上の組合せ、からなる群から選択される障害によるものであり、治療有効量の組成物が正常な血流が途絶された個々の対象の領域に投与されるものである、上記使用。
- 組成物が、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターを含有する、請求項1に記載の使用。
- NeuroD1が、送達される唯一の外因的に発現される転写因子である、請求項1又は2に記載の使用。
- 医薬が、反応性星状細胞が存在する場合、CNSにおける正常な血流が途絶された後にそれを必要とする個々の対象に提供される、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
- CNSにおける正常な血流の途絶が、虚血性脳卒中;出血性脳卒中;脳動脈瘤;外傷性脳損傷;腫瘍;外傷性脊髄損傷;虚血性若しくは出血性の脊髄症(脊髄梗塞);心拍停止若しくは重度の低血圧(ショック)によって引き起こされる全脳虚血;低酸素、低血糖症若しくは貧血によって引き起こされる低酸素性虚血性脳症;感染性心内膜炎若しくは心房粘液腫によって引き起こされるCNS塞栓症;線維軟骨性塞栓性脊髄症;小児白血病によって引き起こされるCNS血栓症;ネフローゼ症候群(腎臓病)、慢性炎症性疾患、妊娠、エストロゲン系避妊薬の使用、脳膜炎、脱水によって引き起こされる脳静脈洞血栓症;又は任意のそれらの2つ以上の組合せからなる群から選択される更なる障害によるものである、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
- 核酸配列が、i) 配列番号1、ii)配列番号3、iii)配列番号2をコードする核酸配列、iv)配列番号4をコードする核酸配列、及びv)配列番号2又は配列番号4と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列、からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。
- 医薬が、それを必要とする個々の対象にグリア性瘢痕内又はその付近における定位注入を介して提供される、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。
- 外因性NeuroD1をコードする核酸配列がユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用。
- 部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列がグリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項2に記載の使用。
- グリア細胞特異的プロモーターがGFAPプロモーターである、請求項9に記載の使用。
- GFAPプロモーターがヒトGFAPプロモーターである、請求項10に記載の使用。
- 個々の対象が、血栓の除去、血流の促進、抗炎症剤の投与、酸化防止剤の投与、及び興奮毒性の低減からなる群から選択される1以上の治療を受ける、請求項1から11のいずれか一項に記載の使用。
- 医薬が、正常な血流が損なわれた領域に注入を介して個々の対象に提供される、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用。
- 外因性NeuroD1をコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス粒子を1010~1014個の粒子/mlの濃度で含有する1~500μlの薬学的に許容される担体が0.1~5μl/分の制御された流速で注入される、請求項1から13のいずれか一項に記載の使用。
- CNSにおける正常な血流の途絶が更に虚血性脳卒中によるものである、請求項1から14のいずれか一項に記載の使用。
- 外因性NeuroD1をコードする核酸配列がグリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1から15のいずれか一項に記載の使用。
- 外因性NeuroD1をコードする核酸配列がGFAPプロモーターに作動可能に連結されている、請求項1から16のいずれか一項に記載の使用。
- 障害が、ブラスト(blast)又は脳侵入(brain penetration)から生じる、請求項1から16のいずれか一項に記載の使用。
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