CN110358731A - 从外周血中直接分离目标细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从外周血中直接分离目标细胞的方法。包括步骤：将外周血置于试管内，添加用生物素标记的目标细胞特异性抗体，混匀，孵育，使目标细胞被特异性抗体标记；添加链霉亲和素偶联微泡，混匀，孵育，使目标细胞进一步被微泡标记，添加磷酸盐缓冲液稀释；离心使目标细胞分离，结合了特异性抗体和微泡的目标细胞浮于液体上层，而非目标细胞沉于下部；吸取包含目标细胞的上层液体，即得。该方法可从外周血简易、快速、高效地分离获取免疫细胞、造血干细胞等目标细胞，避免现有磁珠法的磁珠残留、流式分选引入荧光素的弊端等问题，不需要昂贵的仪器设备、成本低、并且对所结合的靶细胞毒性极小、不易使之失活；分选出的细胞纯度、活力高。
Description
技术领域
本发明涉及从血液特别是外周血例如全血中简易、快速、高效地分离获取目标细胞例如免疫细胞、造血干细胞等的方法，还涉及分离出的这些目标细胞在治疗疾病中的应用，具体涉及从健康人体的血液中特别是外周血中简易、快速、高效分离免疫细胞的方法。本发明所述目标细胞例如但不限于CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞等T细胞，CD56+细胞等NK细胞，CD19+细胞等B细胞，CD34+细胞等造血干细胞。
背景技术
免疫细胞(immune cell)是人体的一类重要细胞，其也俗称白细胞，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛。研究发现血液中蕴含丰富的淋巴细胞，由于这类细胞具有免疫调控和自我复制等特点，所以一直受到人们的关注。淋巴细胞具有自然杀伤和自我保护的特性，针对病毒、细菌、真菌感染的治疗均起到关键的作用，在癌症的治疗中具有很大的临床应用价值。
免疫细胞在健康人体的血液中蕴含丰富，但由于年龄老化、亚健康、罹患疾病等原因，血液中的免疫细胞数目会显著降低，增殖分化能力亦大幅度衰退；而其他健康人的免疫细胞移植给患者则可能引起免疫排斥反应；提取免疫细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了免疫细胞的临床应用，使得寻找一种稳定可靠的免疫细胞获取来源成为一个重要的问题。
研究显示，健康人的新鲜血液中含有大量有效的免疫细胞并且能有效分离，这种组织来源的免疫细胞不仅保持了免疫细胞的特异性免疫应答的生物学特性，而且分离出来的免疫细胞具有原始的、强劲的增殖能力，同时还易于冷冻保存和复苏。由于免疫细胞起源于自身，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对健康的被采集者无任何危害及损伤。以上原因足以令从血液中分离免疫细胞成为获得免疫细胞的有效途径。
近些年，随着我们对免疫系统认识不断深入，利用免疫系统的不同组分治疗癌症的免疫疗法的研究取得了重大突破，目前已有一些相关药物通过了美国食品药品管理局的审核并在临床中使用。例如，用抗体治疗乳腺癌、黑色素瘤、淋巴癌、急慢性白血病等；用癌疫苗治疗前列腺癌；用干扰素和IL2等细胞因子增强广泛的免疫应答；多个免疫检查点的抑制剂也已被找到。T细胞作为淋巴细胞的一种，在人体获得性免疫中发挥着至关重要的作用。成熟的T细胞能活化其他免疫细胞，调节免疫功能，识别特异的抗原并杀死受到感染的细胞或者癌细胞。T细胞回输疗法在处理病毒感染病例的实践中由来已久。回输瘤体浸润T细胞疗法在治疗黑色素瘤的临床试验中，证明了T细胞回输针对肿瘤抗原也有一定的疗效。如何利用现有技术快速、高效的从血液中分离出足够用于治疗的T细胞则称为当前肿瘤免疫研究的核心问题和技术难点。
目前关于血液免疫细胞的分离方法不一，且大多步骤复杂，获得较多数量血液免疫细胞也存在一定困难，同时患者在罹患疾病时采集血液存在一定风险。因此，本领域需要有从血液中分离免疫细胞的简单、有效的方法，以满足医药、科研、临床应用等领域的需求。
细胞分选(cell sorting)是获取较为均一的细胞群体的技术方法。在细胞生物学研究中，获得较为均一的细胞群体(纯化细胞)往往是科研实验及临床研究的必要条件。获取一定纯度的细胞方法主要有两大类技术，一是培养纯化，二是直接分选。培养纯化是较为传统的技术，包括差速贴壁、培养体系筛选等，但周期相对较长，得到的细胞均一性不稳定。细胞分选是快速获取特性细胞的方法，目前应用较多的分选技术包括密度梯度离心、流式细胞分选(FACS)、免疫磁珠(MACS)分选等。
免疫磁珠分离技术是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。免疫磁珠细胞分离技术的细胞回收率及得率取决于磁珠所连接的单抗对细胞的特异性和磁珠的大小(磁性)，然而太小的磁珠得率不高，太大的磁珠又会影响细胞活性，导致后期的检测效果不理想。并且目前市面上多采用微米级甚至纳米级的磁珠，该方法存在诸多局限性：1)磁珠比表面积相对较小，降低了磁珠捕获靶细胞的几率；2)由于磁珠的颗粒性质，其与细胞之间存在多相反应(multiphase reaction)结合，通常需要更久的时间去捕获特异性的靶细胞；3)无论是微米及或是纳米及磁珠，单分散性较差，极易容易产生磁珠的聚集或沉淀从而导致细胞活性降低；4)免疫磁珠的制作过程是将特异性抗体直接偶联到磁珠表面，磁珠本身的性质和其表面带有的疏水或亲水基团容易引起抗体空间构想的改变，从而降低抗体的生物学活性；5)样本粘稠度偏高会导致免疫磁珠的非特异性吸附，从而很难获得纯度较高的靶细胞；6)纳米磁珠直径一般在5nm～1um之间，因其体积较小，极容易因细胞的内吞作用而进入到细胞内部，从而影响了细胞正常的生物学活性且难以去除，给临床免疫治疗带来影响。
流式细胞分选技术(FACS)是利用流式细胞仪自带的分选功能，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。虽然流式细胞分选的精度很高，但是依然存在诸多不利因素：1)设备投入资金较大，市场上一台具有分选功能的流式细胞仪一般都在几十万元，这对科研及临床试验的开展无疑造成了不小的经济压力；2)少量细胞分选时，流式细胞分选精确度较高、速度较快。但如果细胞量超过10^9个，则需要耗费10小时以上，并且分选后细胞的活力会受到很大的影响；3)开放性操作较多，因为流式细胞仪的使用局限性，致使其不能安置在洁净区等无菌环境中，若进行流式细胞分选操作势必会在非无菌环境下进行，这对细胞样本质量和后期的培养等都会造成一定影响，甚至染菌。因此流式分选的样本很难用于临床治疗或一些对样本要求严格的科研试验；4)一般流式分选采用的抗体均会标记荧光素，而荧光素难以从分选后的细胞样本中去除，这不但会对后期的实验造成影响，同时更制约着临床治疗的应用。
现有技术公开了诸多从外周血分离相关目标细胞的方法，例如CN102876631A(中国专利申请号2012103794314)公开了一种简单有效的血液免疫细胞的提取方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法，其包括如下步骤：全血样本预处理、Ficoll法分离、MNC收集和洗涤、MNC计数、MNC冻存、细胞复苏、MNC计数和细胞扩增。据信该发明发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞，该免疫细胞可用于治疗肿瘤。
又例如，CN104694473A(中国专利申请号201510112515.5)公开了一种简单有效的从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，特别是涉及一种使用AXP全自动细胞分离设备来从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法，其包括如下步骤：全血样本预处理、自动分离、单个核细胞收集和任选的对所得免疫细胞检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。据信该发明发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞，该免疫细胞可用于治疗肿瘤。
然而，本领域技术人员仍然期待有新的方法以便从血液特别是外周血例如全血中简易、快速、高效地分离获取目标细胞例如免疫细胞、造血干细胞等的方法，期待这些方法能够在非常短的时间例如1小时内以高回收率、高细胞活力、高细胞纯度之一种或多种的效果分离获取目标细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从血液特别是外周血例如全血中简易、快速、高效地分离获取目标细胞例如免疫细胞、造血干细胞等的方法。已经出人意料地发现，通过本发明方法能够以一种或多种技术效果获得相关的目标细胞。本发明基于此类发现而得以完成。
具体地说，本发明第一方面提供一种从外周血中分离目标细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将预先用抗凝剂经抗凝处理的外周血置于试管内，添加用生物素标记的目标细胞特异性抗体，混合均匀，孵育，使得目标细胞被特异性抗体标记；
(2)接着向试管内添加链霉亲和素偶联微泡，混合均匀，孵育，使目标细胞进一步被微泡标记，添加磷酸盐缓冲液稀释；
(3)将试管离心使目标细胞分离，结合了特异性抗体和微泡的目标细胞浮于液体上层，而非目标细胞沉于下部；
(4)吸取包含目标细胞的上层液体，即得目标细胞。
根据本发明第一方面的方法，其中用于对外周血抗凝处理的所述抗凝剂选自：乙二胺四乙酸及其盐例如EDTA-Na2、EDTA-K2、EDTA-K3，草酸盐例如草酸钠，肝素及其盐例如肝素钠，枸橼酸及其盐例如枸橼酸钠。对外周血进行抗凝处理的操作是本领域的常识。
根据本发明第一方面的方法，其中用于对外周血抗凝处理的所述抗凝剂选自：EDTA-K2抗凝剂。
根据本发明第一方面的方法，所述目标细胞选自：CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞等T细胞，CD56+细胞等NK细胞，CD19+细胞等B细胞，CD34+细胞等造血干细胞。
根据本发明第一方面的方法，所述用生物素标记的目标细胞特异性抗体选自：CD3生物素抗体、CD4生物素抗体、CD8生物素抗体、CD56生物素抗体、CD19生物素抗体、CD34生物素抗体。
根据本发明第一方面的方法，所述用生物素标记的目标细胞特异性抗体选自：生物素标记的鼠抗人CD3抗体、生物素标记的鼠抗人CD4抗体、生物素标记的鼠抗人CD8抗体、生物素标记的鼠抗人CD56抗体、生物素标记的鼠抗人CD19抗体、生物素标记的鼠抗人CD34抗体。这些抗体可通过本领域技术人员公知的方法制备得到，亦可从市售途径购得。在本发明中，如未另外说明，所用到的生物素标记的抗体尤其是上述列明的这些抗体均是直接购自BD Biosciences公司。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，每1mL外周血添加抗体5～50ul，例如10～40ul，例如10～30ul。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述孵育是在室温下孵育10～45min，例如在室温下孵育20～40min，例如在室温下孵育25～35min。
根据本发明第一方面的方法，所述链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡。
在本发明中，术语“包埋气体微泡”亦可称为“充气微泡”等，它们具有相同含义且可互换使用，并且是指一种包裹气体的脂质囊泡。
根据本发明第一方面的方法，其中所述包埋气体微泡的包埋气体选自C3F8、SF6、CF4、氟利昂、N2、CO2、O2、空气，尤其是选自C3F8、SF6、CF4。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡，每1mL外周血添加相当于包含0.5～20×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡(术语“0.5～20×10^7个微泡”表示0.5～20×10的7次方个微泡，在本文中类似表述时有类似含义)，例如添加相当于包含1～15×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～10×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡，每1mL外周血添加相当于包含1～20ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～15ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～10ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述孵育是在室温下孵育5～30min，例如在室温下孵育5～25min，例如在室温下孵育10～20min。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液是包含如下组分的水溶液：0.8～1.2％w/v的人血白蛋白、0.8～1.2mM的EDTA、0.1～0.15M的氯化钠、2～3mM的氯化钾、7.5～8.0mM的磷酸氢二钠、0.8～1.2mM的磷酸二氢钾。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液是包含如下组分的水溶液：1％w/v的人血白蛋白、1mM的EDTA、0.13M的氯化钠、2.55mM的氯化钾、7.7mM的磷酸氢二钠、1mM的磷酸二氢钾。
根据本发明第一方面的方法，其任选的还包括如下步骤：
(5)将上一步骤吸取的包含目标细胞的上层液体置于一个可密封并可压缩内部空气的容器内，使容器内充满空气，密封容器，接着压缩容器内的空气至原始体积的0.05～0.5倍(例如0.05～0.25倍，例如0.05～0.2倍)，必要时释放压力后重复进行压缩空气，减压释放容器内气体，即得基本上不包含包埋气体的目标细胞悬液。通过这种对目标细胞悬液进行压缩，能够使微泡内部的包埋气体得以释放出来，而残余在目标细胞悬液中的磷脂、聚乙二醇、棕榈酸这些物质本身就是能够为人体利用的，因此得到的目标细胞悬液中即使存在这些物质亦能够安全地应用于临床。
根据本发明第一方面的方法，其任选的还包括如下步骤：
(6)对所得目标细胞悬液进行冻存处理。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)所述链霉亲和素偶联微泡是如本发明第二方面任一实施方案所述的用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，或者是如本发明第三方面任一实施方案所述的用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂添加水性载体液配制的。
进一步的，本发明第二方面涉及一种用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其为一种存在于水性载体液中的充气微泡悬浮液，其中的微泡与链霉亲和素偶联，微泡直径大小在0.2-10μm范围内，每1mL充气微泡悬浮液中包含0.5～200×10^8个微泡的链霉亲和素偶联微泡，每1mL充气微泡悬浮液中微泡内的包埋气体量为1～200ug。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述微泡直径大小在1-10μm范围内。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其每1mL充气微泡悬浮液中包含1～150×10^8个微泡的链霉亲和素偶联微泡。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其每1mL充气微泡悬浮液中包含1～100×10^8个微泡的链霉亲和素偶联微泡。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其每1mL充气微泡悬浮液中微泡内的包埋气体量为5～150ug。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其每1mL充气微泡悬浮液中微泡内的包埋气体量为10～100ug。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述包埋气体选自C3F8、SF6、CF4、氟利昂、N2、CO2、O2、空气，尤其是选自C3F8、SF6、CF4。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂、分子量2000～6000的聚乙二醇、脂肪酸。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂10重量份、分子量2000～6000的聚乙二醇200～2000重量份、脂肪酸0.2～5重量份。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂10重量份、分子量2000～6000的聚乙二醇250～1500重量份、脂肪酸0.25～2.5重量份。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂10重量份、分子量2000～6000的聚乙二醇500～1000重量份、脂肪酸0.5～2重量份。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂10重量份、分子量2000～6000的聚乙二醇600～800重量份、脂肪酸0.75～1.5重量份。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述聚乙二醇的分子量为3000～5000，例如所述聚乙二醇是聚乙二醇4000。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述水性载体液选自：水、0.9％氯化钠溶液、5％葡萄糖溶液，优先的是0.9％氯化钠溶液。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其每1ml中包含的磷脂为10～200ug，例如为20～150ug，例如为50～100ug。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述磷脂选自：卵磷脂类例如磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂和神经鞘磷脂，例如是二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、二棕榈酰磷脂酰甘油(酸型，DPPG)或其钠盐(DPPG-Na，1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol sodium(DPPG-Na))、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述磷脂是DSPC和DPPG-Na二者。例如DSPC和DPPG-Na二者以重量比1：0.2～5的组合，例如DSPC和DPPG-Na二者以重量比1：0.5～2的组合，例如DSPC和DPPG-Na二者以重量比1：1的组合。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述微泡上偶联有链霉亲和素，磷脂与链霉亲和素的重量比为100：0.01～0.2。通常来讲，由于根据使用环境的不同，链霉亲和素的偶联量可以在较大范围内变化。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其中所述脂肪酸选自棕榈酸、硬脂酸、油酸。
根据本发明第二方面的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，其是通过如下方式制备得到：取本发明第三方面任一项所述用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂，通过注射器穿刺胶塞向玻璃瓶内注入水性载体液，剧烈振荡使玻璃瓶内容物溶解、混悬，即得充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂。
进一步的，本发明第三方面提供了一种用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂，其包括用胶塞密封的玻璃瓶，玻璃瓶内分装有能够在遇到水性载体液时形成微泡的冻干粉末，并且玻璃瓶内的空间气氛为选自下列的用于包裹到所述微泡中的包埋气体：C3F8、SF6、CF4、氟利昂、N2、CO2、O2、空气(尤其是选自：C3F8、SF6、CF4)；所述微泡与链霉亲和素偶联并且由选自下列的材料构成：分子量2000～6000的聚乙二醇、磷脂、脂肪酸。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其用水性载体液溶解形成的充气微泡悬浮液(例如，水性载体液的添加量为，使所得充气微泡悬浮液每1ml中包含的磷脂为10～200ug，例如为20～150ug，例如为50～100ug)中，微泡直径大小在0.2-10μm范围内(例如在1-10μm范围内)，每1mL充气微泡悬浮液中包含0.5～200×10^8个微泡的链霉亲和素偶联微泡(例如添加相当于包含1～150×10^8个微泡的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～100×10^8个微泡的链霉亲和素偶联微泡)，每1mL充气微泡悬浮液中微泡内的包埋气体量为1～200ug(例如5～150ug，例如10～100ug)。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂、分子量2000～6000的聚乙二醇、脂肪酸。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂10重量份、分子量2000～6000的聚乙二醇200～2000重量份、脂肪酸0.2～5重量份。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂10重量份、分子量2000～6000的聚乙二醇250～1500重量份、脂肪酸0.25～2.5重量份。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂10重量份、分子量2000～6000的聚乙二醇500～1000重量份、脂肪酸0.5～2重量份。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述微泡是由选自下列的材料构成：磷脂10重量份、分子量2000～6000的聚乙二醇600～800重量份、脂肪酸0.75～1.5重量份。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述聚乙二醇的分子量为3000～5000，例如所述聚乙二醇是聚乙二醇4000。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述水性载体液选自：水、0.9％氯化钠溶液、5％葡萄糖溶液，优先的是0.9％氯化钠溶液。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其用水性载体液溶解形成的充气微泡悬浮液中，每1ml中包含的磷脂为10～200ug，例如为20～150ug，例如为50～100ug。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述磷脂选自：卵磷脂类例如磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂和神经鞘磷脂，例如是二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、二棕榈酰磷脂酰甘油(酸型，DPPG)或其钠盐(DPPG-Na，1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol sodium(DPPG-Na))、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述磷脂是DSPC、DPPG-Na或其组合。例如DSPC和DPPG-Na二者以重量比1：0.2～5的组合。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述微泡上偶联有链霉亲和素，磷脂与链霉亲和素的重量比为100：0.01～0.2，由于根据使用环境的不同，链霉亲和素的偶联量可以在较大范围内变化。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述脂肪酸选自棕榈酸、硬脂酸、油酸。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述玻璃瓶中密封的用于形成微泡的磷脂与空间气氛中的包埋气体的重量比为10：100～5000，例如聚乙二醇与包埋气体的重量比为10：500～2500，例如聚乙二醇与包埋气体的重量比为10：1000～2000。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中所述玻璃瓶内的密封空间容量与空间气氛中包埋气体重量的比为10ml：20～200mg，例如密封空间容量与空间气氛中包埋气体重量的比为10ml：25～150mg，例如密封空间容量与空间气氛中包埋气体重量的比为10ml：25～100mg。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中由聚乙二醇、磷脂和脂肪构成的呈冻干粉末状的冻干脂质，该冻干脂质事先与链霉亲和素偶联，该冻干脂质存在于密封玻璃瓶内，并且该密封玻璃瓶内的空间气氛为包埋气体。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其中由聚乙二醇、磷脂和脂肪构成的呈冻干粉末状的冻干脂质，该冻干脂质事先与链霉亲和素偶联，该冻干脂质存在于密封玻璃瓶内，并且该密封玻璃瓶内的空间气氛为包埋气体；当向该密封玻璃瓶内添加水性载体液时，冻干脂质形成微泡并将所述包埋气体包裹于该微泡中，从而形成悬浮于水性载体液中、偶联有链霉亲和素、并且包裹了包埋气体的充气微泡。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其在添加水性载体液时，添加水性载体液的体积为所述玻璃的瓶内容量的20～80％，例如为30～70％，例如为40～60％。
根据本发明第三方面的冻干制剂，所述玻璃瓶内容量为2～200ml，例如为2～100ml，例如为5～50ml，例如为5～25ml，例如为10ml。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其是照本发明第四方面任一实施方案所述方法制备得到的。
根据本发明第三方面的冻干制剂，其通过如下方式制备成链霉亲和素偶联微泡的液体制剂以作为分离试剂用于从外周血中分离目标细胞的方法中：取本发明第三方面任一项所述用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂，通过注射器穿刺胶塞向玻璃瓶内注入水性载体液，剧烈振荡使玻璃瓶内容物溶解、混悬，即得充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂。
进一步的，本发明第四方面提供了制备冻干制剂例如本发明第三方面任一实施方案所述冻干制剂的方法，(本发明方法描述中各种物料添加量可以随所用仪器设备而放大或者缩小，在本文描述时物料添加量是示意性的，实际工作中可以依据具体生产条件而相应的调整生产规模)，包括如下步骤：
(i)在室温下在烧瓶中使1g磷脂和相应量脂肪酸用有机溶剂(有机溶剂的用量通常为能够达到使溶质充分溶解的程度，例如20～50ml)溶解，接着在旋转蒸发仪上于50～80℃蒸除溶剂，然后于30～40℃真空干燥；
(ii)向烧瓶中加水10～50ml，超声波振荡使形成混悬液；
(iii)取所得混悬液，加入相应量聚乙二醇(例如以5～20％水溶液形式添加)，混匀，加入链霉亲和素，室温孵育20～45分钟；
(iv)将上一步骤所得混悬液分装到玻璃瓶中，使密封用的胶塞将玻璃瓶半加塞，在真空冷冻干燥机内进行抽真空、冷冻、升华、干燥以除去水分，压塞密封，得到冻干粉末；
(v)通过针头穿刺胶塞向密塞玻璃瓶内充入包埋气体(例如，在每一个玻璃瓶空间内，充入的包埋气体重量与磷脂重量比为50～500：1，例如为100～250：1，例如为100～200：1)，使玻璃瓶内的空间气氛充满包埋气体，即得到冻干制剂。
在本发明中，类似上述的“通过针头穿刺胶塞向密塞玻璃瓶内充入包埋气体”的操作，是以液化的包埋气体的形式充入的。尽管以气体形式充入亦是可行的，然而从工业操作的便利性来说，以液化形式的包埋气体充入玻璃瓶中是优选的。
根据本发明第四方面的方法，其中包埋气体是以该气体的液化气形式添加的。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(i)中，所述有机溶剂选自丙酮、己烷、乙醇及其组合，这些溶剂或溶剂混合物能够容易的溶解磷脂和脂肪酸，并且在后续的旋转蒸发过程中容易除去。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(i)中，有机溶剂的用量通常为能够达到使溶质充分溶解的程度，例如20～50ml。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(iii)中，聚乙二醇是以5～15％水溶液形式添加。
进一步的，本发明第五方面提供了本发明第二方面任一项所述链霉亲和素偶联微泡的液体制剂在从外周血中分离目标细胞的方法中作为分离试剂的用途，所述从外周血中分离目标细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将预先用抗凝剂经抗凝处理的外周血置于试管内，添加用生物素标记的目标细胞特异性抗体，混合均匀，孵育，使得目标细胞被特异性抗体标记；
(2)接着向试管内添加链霉亲和素偶联微泡，混合均匀，孵育，使目标细胞进一步被微泡标记，添加磷酸盐缓冲液稀释；
(3)将试管离心使目标细胞分离，结合了特异性抗体和微泡的目标细胞浮于液体上层，而非目标细胞沉于下部；
(4)吸取包含目标细胞的上层液体，即得目标细胞。
根据本发明第五方面的用途，其中用于对外周血抗凝处理的所述抗凝剂选自：乙二胺四乙酸及其盐例如EDTA-Na2、EDTA-K2、EDTA-K3，草酸盐例如草酸钠，肝素及其盐例如肝素钠，枸橼酸及其盐例如枸橼酸钠。对外周血进行抗凝处理的操作是本领域的常识。
根据本发明第五方面的用途，其中用于对外周血抗凝处理的所述抗凝剂选自：EDTA-K2抗凝剂。
根据本发明第五方面的用途，所述目标细胞选自：CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞等T细胞，CD56+细胞等NK细胞，CD19+细胞等B细胞，CD34+细胞等造血干细胞。
根据本发明第五方面的用途，所述用生物素标记的目标细胞特异性抗体选自：CD3生物素抗体、CD4生物素抗体、CD8生物素抗体、CD56生物素抗体、CD19生物素抗体、CD34生物素抗体。
根据本发明第五方面的用途，所述用生物素标记的目标细胞特异性抗体选自：生物素标记的鼠抗人CD3抗体、生物素标记的鼠抗人CD4抗体、生物素标记的鼠抗人CD8抗体、生物素标记的鼠抗人CD56抗体、生物素标记的鼠抗人CD19抗体、生物素标记的鼠抗人CD34抗体。这些抗体可通过本领域技术人员公知的方法制备得到，亦可从市售途径购得。在本发明中，如未另外说明，所用到的生物素标记的抗体尤其是上述列明的这些抗体均是直接购自BD Biosciences公司。
根据本发明第五方面的用途，其中步骤(1)中，每1mL外周血添加抗体5～50ul，例如10～40ul，例如10～30ul。
根据本发明第五方面的用途，其中步骤(1)中，所述孵育是在室温下孵育10～45min，例如在室温下孵育20～40min，例如在室温下孵育25～35min。
根据本发明第五方面的用途，所述链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡。
根据本发明第五方面的用途，其中所述包埋气体微泡的包埋气体选自C3F8、SF6、CF4、氟利昂、N2、CO2、O2、空气，尤其是选自C3F8、SF6、CF4。
根据本发明第五方面的用途，其中步骤(2)中，链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡，每1mL外周血添加相当于包含0.5～20×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡(术语“0.5～20×10^7个微泡”表示0.5～20×10的7次方个微泡，在本文中类似表述时有类似含义)，例如添加相当于包含1～15×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～10×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡。
根据本发明第五方面的用途，其中步骤(2)中，链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡，每1mL外周血添加相当于包含1～20ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～15ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～10ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡。
根据本发明第五方面的用途，其中步骤(2)中，所述孵育是在室温下孵育5～30min，例如在室温下孵育5～25min，例如在室温下孵育10～20min。
根据本发明第五方面的用途，其中步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液是包含如下组分的水溶液：0.8～1.2％w/v的人血白蛋白、0.8～1.2mM的EDTA、0.1～0.15M的氯化钠、2～3mM的氯化钾、7.5～8.0mM的磷酸氢二钠、0.8～1.2mM的磷酸二氢钾。
根据本发明第五方面的用途，其中步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液是包含如下组分的水溶液：1％w/v的人血白蛋白、1mM的EDTA、0.13M的氯化钠、2.55mM的氯化钾、7.7mM的磷酸氢二钠、1mM的磷酸二氢钾。
根据本发明第五方面的用途，所述从外周血中分离目标细胞的方法任选的还包括如下步骤：
(5)将上一步骤吸取的包含目标细胞的上层液体置于一个可密封并可压缩内部空气的容器内，使容器内充满空气，密封容器，接着压缩容器内的空气至原始体积的0.05～0.5倍(例如0.05～0.25倍，例如0.05～0.2倍)，必要时释放压力后重复进行压缩空气，减压释放容器内气体，即得基本上不包含包埋气体的目标细胞悬液。通过这种对目标细胞悬液进行压缩，能够使微泡内部的包埋气体得以释放出来，而残余在目标细胞悬液中的磷脂、聚乙二醇、棕榈酸这些物质本身就是能够为人体利用的，因此得到的目标细胞悬液中即使存在这些物质亦能够安全地应用于临床。
根据本发明第五方面的用途，所述从外周血中分离目标细胞的方法任选的还包括如下步骤：
(6)对所得目标细胞悬液进行冻存处理。
进一步的，本发明第六方面提供了本发明第三方面任一项所述用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂在从外周血中分离目标细胞的方法中作为分离试剂的用途，所述从外周血中分离目标细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将预先用抗凝剂经抗凝处理的外周血置于试管内，添加用生物素标记的目标细胞特异性抗体，混合均匀，孵育，使得目标细胞被特异性抗体标记；
(2)使链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂用水性载体液溶解得到微泡悬浮液，接着向试管内添加链霉亲和素偶联微泡，混合均匀，孵育，使目标细胞进一步被微泡标记，添加磷酸盐缓冲液稀释；
(3)将试管离心使目标细胞分离，结合了特异性抗体和微泡的目标细胞浮于液体上层，而非目标细胞沉于下部；
(4)吸取包含目标细胞的上层液体，即得目标细胞。
根据本发明第六方面的用途，其中用于对外周血抗凝处理的所述抗凝剂选自：乙二胺四乙酸及其盐例如EDTA-Na2、EDTA-K2、EDTA-K3，草酸盐例如草酸钠，肝素及其盐例如肝素钠，枸橼酸及其盐例如枸橼酸钠。对外周血进行抗凝处理的操作是本领域的常识。
根据本发明第六方面的用途，其中用于对外周血抗凝处理的所述抗凝剂选自：EDTA-K2抗凝剂。
根据本发明第六方面的用途，所述目标细胞选自：CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞等T细胞，CD56+细胞等NK细胞，CD19+细胞等B细胞，CD34+细胞等造血干细胞。
根据本发明第六方面的用途，所述用生物素标记的目标细胞特异性抗体选自：CD3生物素抗体、CD4生物素抗体、CD8生物素抗体、CD56生物素抗体、CD19生物素抗体、CD34生物素抗体。
根据本发明第六方面的用途，所述用生物素标记的目标细胞特异性抗体选自：生物素标记的鼠抗人CD3抗体、生物素标记的鼠抗人CD4抗体、生物素标记的鼠抗人CD8抗体、生物素标记的鼠抗人CD56抗体、生物素标记的鼠抗人CD19抗体、生物素标记的鼠抗人CD34抗体。这些抗体可通过本领域技术人员公知的方法制备得到，亦可从市售途径购得。在本发明中，如未另外说明，所用到的生物素标记的抗体尤其是上述列明的这些抗体均是直接购自BD Biosciences公司。
根据本发明第六方面的用途，其中步骤(1)中，每1mL外周血添加抗体5～50ul，例如10～40ul，例如10～30ul。
根据本发明第六方面的用途，其中步骤(1)中，所述孵育是在室温下孵育10～45min，例如在室温下孵育20～40min，例如在室温下孵育25～35min。
根据本发明第六方面的用途，所述链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡。
根据本发明第六方面的用途，其中所述包埋气体微泡的包埋气体选自C3F8、SF6、CF4、氟利昂、N2、CO2、O2、空气，尤其是选自C3F8、SF6、CF4。
根据本发明第六方面的用途，其中步骤(2)中，链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡，每1mL外周血添加相当于包含0.5～20×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡(术语“0.5～20×10^7个微泡”表示0.5～20×10的7次方个微泡，在本文中类似表述时有类似含义)，例如添加相当于包含1～15×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～10×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡。
根据本发明第六方面的用途，其中步骤(2)中，链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡，每1mL外周血添加相当于包含1～20ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～15ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～10ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡。
根据本发明第六方面的用途，其中步骤(2)中，所述孵育是在室温下孵育5～30min，例如在室温下孵育5～25min，例如在室温下孵育10～20min。
根据本发明第六方面的用途，其中步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液是包含如下组分的水溶液：0.8～1.2％w/v的人血白蛋白、0.8～1.2mM的EDTA、0.1～0.15M的氯化钠、2～3mM的氯化钾、7.5～8.0mM的磷酸氢二钠、0.8～1.2mM的磷酸二氢钾。
根据本发明第六方面的用途，其中步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液是包含如下组分的水溶液：1％w/v的人血白蛋白、1mM的EDTA、0.13M的氯化钠、2.55mM的氯化钾、7.7mM的磷酸氢二钠、1mM的磷酸二氢钾。
根据本发明第六方面的用途，所述从外周血中分离目标细胞的方法任选的还包括如下步骤：
(5)将上一步骤吸取的包含目标细胞的上层液体置于一个可密封并可压缩内部空气的容器内，使容器内充满空气，密封容器，接着压缩容器内的空气至原始体积的0.05～0.5倍(例如0.05～0.25倍，例如0.05～0.2倍)，必要时释放压力后重复进行压缩空气，减压释放容器内气体，即得基本上不包含包埋气体的目标细胞悬液。通过这种对目标细胞悬液进行压缩，能够使微泡内部的包埋气体得以释放出来，而残余在目标细胞悬液中的磷脂、聚乙二醇、棕榈酸这些物质本身就是能够为人体利用的，因此得到的目标细胞悬液中即使存在这些物质亦能够安全地应用于临床。
根据本发明第六方面的用途，所述从外周血中分离目标细胞的方法任选的还包括如下步骤：
(6)对所得目标细胞悬液进行冻存处理。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它任一实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明针对现有的技术缺陷，提供了不依赖于磁珠等常规方法的一种目标细胞分选方法，避免了磁珠的残留、流式分选引入荧光素的弊端等问题。本发明还为该等方法提供了相关试剂。本发明方法简单迅速、不需要昂贵的仪器设备、成本低、并且对所结合的靶细胞毒性极小、不易使之失活；分选出的细胞纯度、活力高，并可用于后续的实验、培养以及临床应用。
附图说明
图1是外周全血在经本发明方法分选CD3细胞前、后一个典型的示意性的流式细胞图，从图中可见，经本发明方法分选后目标细胞即CD3细胞得以富集。
图2描绘了本发明方法的基本原理，即：向添加了细胞混合物(在本文中可以是全血)的试管中添加抗体；在室温下温育使得目标细胞被特异性抗体标记；加入本发明微泡液体制剂，在室温下温育，使目标细胞被微泡标记；接着离心以分离目标细胞，结合了特异性抗体和微泡的目标细胞浮于液面，而非目标细胞沉于底部。在离心之后，浮于液面的是微泡层(通常呈白色)，位于中间的是血浆层，位于离心管下部的是红细胞层。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
实施例1、制备用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂
(i)在室温下、在圆底烧瓶中，使1g磷脂(DSPC：DPPG-Na＝1：1，w/w)和0.1g脂肪酸(棕榈酸)用有机溶剂(己烷/乙醇＝4/1，25ml)溶解，接着在旋转蒸发仪上于65℃蒸除溶剂，然后于35℃真空干燥；
(ii)向烧瓶中加水30ml，超声波振荡使形成混悬液；
(iii)取所得混悬液，加入聚乙二醇(PEG4000，添加量是磷脂重量的70倍，以12％水溶液形式添加)，混匀，加入链霉亲和素(磷脂：链霉亲和素＝100：0.1，w/w)，室温孵育30分钟；
(iv)将上一步骤所得混悬液分装到10ml容量规格的玻璃瓶中，每瓶分装量相当于磷脂0.4mg，使密封用的胶塞将玻璃瓶半加塞，在真空冷冻干燥机内进行抽真空、冷冻(-45～-40℃)、升华、干燥以除去水分，压塞密封，得到冻干粉末；
(v)通过针头穿刺胶塞向密塞玻璃瓶内充入包埋气体(SF6，液化气形式添加，在每一个玻璃瓶空间内，充入的包埋气体重量与磷脂重量比为160：1)，使玻璃瓶内的空间气氛充满包埋气体，即得到冻干制剂。
实施例2、制备用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂
(i)在室温下、在圆底烧瓶中，使1g磷脂(DSPC：DPPG-Na＝1：0.2，w/w)和0.05g脂肪酸(棕榈酸)用有机溶剂(丙酮/乙醇＝3/1，20ml)溶解，接着在旋转蒸发仪上于80℃蒸除溶剂，然后于30℃真空干燥；
(ii)向烧瓶中加水10ml，超声波振荡使形成混悬液；
(iii)取所得混悬液，加入聚乙二醇(PEG3000，添加量是磷脂重量的50倍，以5％水溶液形式添加)，混匀，加入链霉亲和素(磷脂：链霉亲和素＝100：0.2，w/w)，室温孵育20分钟；
(iv)将上一步骤所得混悬液分装到10ml容量规格的玻璃瓶中，每瓶分装量相当于磷脂0.5mg，使密封用的胶塞将玻璃瓶半加塞，在真空冷冻干燥机内进行抽真空、冷冻(-45～-40℃)、升华、干燥以除去水分，压塞密封，得到冻干粉末；
(v)通过针头穿刺胶塞向密塞玻璃瓶内充入包埋气体(C3F8，液化气形式添加，在每一个玻璃瓶空间内，充入的包埋气体重量与磷脂重量比为50：1)，使玻璃瓶内的空间气氛充满包埋气体，即得到冻干制剂。
实施例3、制备用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂
(i)在室温下、在圆底烧瓶中，使1g磷脂(DSPC：DPPG-Na＝1：5，w/w)和0.2g脂肪酸(硬脂酸)用有机溶剂(丙酮/己烷＝1/5，50ml)溶解，接着在旋转蒸发仪上于50℃蒸除溶剂，然后于40℃真空干燥；
(ii)向烧瓶中加水50ml，超声波振荡使形成混悬液；
(iii)取所得混悬液，加入聚乙二醇(PEG5000，添加量是磷脂重量的100倍，以20％水溶液形式添加)，混匀，加入链霉亲和素(磷脂：链霉亲和素＝100：0.01，w/w)，室温孵育45分钟；
(iv)将上一步骤所得混悬液分装到10ml容量规格的玻璃瓶中，每瓶分装量相当于磷脂0.3mg，使密封用的胶塞将玻璃瓶半加塞，在真空冷冻干燥机内进行抽真空、冷冻(-45～-40℃)、升华、干燥以除去水分，压塞密封，得到冻干粉末；
(v)通过针头穿刺胶塞向密塞玻璃瓶内充入包埋气体(CF4，液化气形式添加，在每一个玻璃瓶空间内，充入的包埋气体重量与磷脂重量比为100：1)，使玻璃瓶内的空间气氛充满包埋气体，即得到冻干制剂。
实施例4、制备用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂
(i)在室温下、在圆底烧瓶中，使1g磷脂(DSPC)和0.075g脂肪酸(油酸)用有机溶剂(乙醇，40ml)溶解，接着在旋转蒸发仪上于60℃蒸除溶剂，然后于35℃真空干燥；
(ii)向烧瓶中加水20ml，超声波振荡使形成混悬液；
(iii)取所得混悬液，加入聚乙二醇(PEG3300，添加量是磷脂重量的80倍，以15％水溶液形式添加)，混匀，加入链霉亲和素(磷脂：链霉亲和素＝100：0.05，w/w)，室温孵育40分钟；
(iv)将上一步骤所得混悬液分装到10ml容量规格的玻璃瓶中，每瓶分装量相当于磷脂0.6mg，使密封用的胶塞将玻璃瓶半加塞，在真空冷冻干燥机内进行抽真空、冷冻(-45～-40℃)、升华、干燥以除去水分，压塞密封，得到冻干粉末；
(v)通过针头穿刺胶塞向密塞玻璃瓶内充入包埋气体(SF6，液化气形式添加，在每一个玻璃瓶空间内，充入的包埋气体重量与磷脂重量比为250：1)，使玻璃瓶内的空间气氛充满包埋气体，即得到冻干制剂。
实施例5、制备用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂
(i)在室温下、在圆底烧瓶中，使1g磷脂(DPPG-Na)和0.15g脂肪酸(棕榈酸)用有机溶剂(己烷30ml)溶解，接着在旋转蒸发仪上于70℃蒸除溶剂，然后于35℃真空干燥；
(ii)向烧瓶中加水40ml，超声波振荡使形成混悬液；
(iii)取所得混悬液，加入聚乙二醇(PEG3500，添加量是磷脂重量的60倍，以10％水溶液形式添加)，混匀，加入链霉亲和素(磷脂：链霉亲和素＝100：0.15，w/w)，室温孵育25分钟；
(iv)将上一步骤所得混悬液分装到10ml容量规格的玻璃瓶中，每瓶分装量相当于磷脂0.35mg，使密封用的胶塞将玻璃瓶半加塞，在真空冷冻干燥机内进行抽真空、冷冻(-45～-40℃)、升华、干燥以除去水分，压塞密封，得到冻干粉末；
(v)通过针头穿刺胶塞向密塞玻璃瓶内充入包埋气体(SF6，液化气形式添加，在每一个玻璃瓶空间内，充入的包埋气体重量与磷脂重量比为500：1)，使玻璃瓶内的空间气氛充满包埋气体，即得到冻干制剂。
实施例6、制备用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂
分别照实施列1～5，不同的仅是在添加链霉亲和素时还添加甘氨酸(5个实例中甘氨酸添加量分别是磷脂量的6、8、4、2、10倍)，制备5种冻干制剂，可分别记为实施例61、实施例62、实施例63、实施例64、实施例65。
实施例11：制备用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂
制备用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂的方法：取玻璃瓶装的链霉亲和素偶联微泡冻干制剂，通过注射器穿刺胶塞向玻璃瓶内注入水性载体液，剧烈振荡使玻璃瓶内容物溶解、混悬，即得充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂。
照下表所示比例，将实施例1所得冻干制剂制成充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，在配制好该悬浮液后的5小时内，测定微泡直径、微泡浓度和包埋气体量，结果如下表。
*向冻干制剂中添加水性载体液的添加量，使所得充气微泡悬浮液每1ml中包含的磷脂的重量(μg)。
微泡浓度是通过血球计数器对所制成的充气微泡悬浮液测定所得结果，微泡直径是通过显微镜读取视野中至少100个微泡统计所得结果，均为每个样品测定3次所得平均值。
充气微泡悬浮液中的包埋气体量使用以下方法测定：精密吸取充气微泡悬浮液20ml，置于一个100ml的玻璃注射器内，抽取注射器的柱塞到满刻度100ml使得注射器内充入大约80ml空气，然后使用旋塞将注射器连接针头的入口密封，精密称定整个注射器(M1)，然后在旋塞密封状态下压缩注射器内的空气(至注射器刻度约30ml处，难以再进行压缩)，松开柱塞，重复上述操作5次对注射器内的空间进行压缩，打开旋塞，将柱塞推到20ml处(以不会溢出微泡悬浮液为准)以排出注射器内空间气氛的气体，然后再抽取注射器的柱塞到满刻度100ml使得注射器空间气氛以空气代替，用旋塞密封，精密称定整个注射器(M2)，M1与M2的差值即为20ml充气微泡悬浮液中的包埋气体量。所得结果为每个样品测定3次所得平均值，具体测定时，根据天平灵敏度可适当选取适宜大小的注射器。
根据上表针对实施例1的方式，进一步测定实施例2～6的冻干制剂，结果：
实施例2冻干制剂分别加三种或二种量的0.9％氯化钠、水、5％葡萄糖所得充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，经测定，微泡直径均在2.1～8.9μm范围内，微泡浓度均在17～93×10^8个/mL范围内，包埋气体量均在11～142ug/mL范围内；
实施例3冻干制剂分别加三种或二种量的0.9％氯化钠、水、5％葡萄糖所得充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，经测定，微泡直径均在1.5～8.3μm范围内，微泡浓度均在6～143×10^8个/mL范围内，包埋气体量均在7～113ug/mL范围内；
实施例4冻干制剂分别加三种或二种量的0.9％氯化钠、水、5％葡萄糖所得充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，经测定，微泡直径均在2.8～9.5μm范围内，微泡浓度均在13～97×10^8个/mL范围内，包埋气体量均在13～93ug/mL范围内；
实施例5冻干制剂分别加三种或二种量的0.9％氯化钠、水、5％葡萄糖所得充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，经测定，微泡直径均在1.3～8.6μm范围内，微泡浓度均在3～136×10^8个/mL范围内，包埋气体量均在4～86ug/mL范围内；
实施例6五种冻干制剂各自分别加三种或二种量的0.9％氯化钠、水、5％葡萄糖所得充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，经测定，微泡直径均在1.6～8.3μm范围内，微泡浓度均在8～124×10^8个/mL范围内，包埋气体量均在9～82ug/mL范围内。
使上述十种冻干制剂各自分别加三种或二种量的0.9％氯化钠、水、5％葡萄糖所得充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，使它们在4～8℃条件下放置48小时，于48～50小时期间测定它们的微泡直径、微泡浓度、包埋气体量，结果：
全部十种冻干制剂各自分别加三种或二种量的水性载体液后微泡直径基本未变化且均在1.4～9.6μm范围内，微泡浓度基本未变化且均在7～142×10^8个/mL范围内，并且每个冻干制剂用某种量的某种水性载体液配制成液体制剂后，5小时内测定的结果与48小时后测定的结果基本相同，例如实施例1冻干制剂加75ug量的0.9％氯化钠所得液体制剂48小时后的微泡直径为5.4μm、微泡浓度为53×10^8个；
对于某一种冻干制剂用某种量的某种水性载体液配制成液体制剂后48小时后包埋气体量相当于5小时内包埋气体量的百分数，记为经历48小时放置后的包埋气体残余百分数，即48小时后包埋气体量除以5小时内包埋气体量所得商值乘以100％所得百分数，该百分数越接近于100％表明该液体制剂中包埋气体越稳定，实施例6五种冻干制剂各自分别加三种或二种量的水性载体液后包埋气体残余百分数均在96～102％范围内，例如实施例61冻干制剂加75ug量0.9％氯化钠后包埋气体残余百分数为98.7％，然而实施例1～5五种冻干制剂各自分别加三种或二种量的水性载体液后包埋气体残余百分数均在63～72％范围内，例如实施例1冻干制剂加75ug量0.9％氯化钠后包埋气体残余百分数为66.4％。
尽管在实际操作过程中，冻干制剂可以临用现配制成充气微泡悬浮液即链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，以用于目标细胞分选，即实施例1～5五种冻干制剂可以满足相关的细胞分选操作需求，然而实施例6的冻干制剂是更加优选的，因为它们能够使细胞分选方法更加具有普遍适用性。实施例6冻干制剂与实施例1～5冻干制剂的区别仅在于增补了甘氨酸，发现的上述结果是现有技术根本无法预见的。因此，在本发明任一方面的任一实施方案中，例如本发明第二方面液体制剂或者本发明第三方面冻干制剂中，构成所述微泡的材料还包括甘氨酸，其中甘氨酸添加量是磷脂量的2～10倍；在本发明任一方面的任一实施方案中，例如本发明第四方面制备冻干制剂的步骤中，在添加链霉亲和素时还添加甘氨酸，甘氨酸添加量是磷脂量的2～10倍。
实施例21：使用链霉亲和素偶联微泡从全血中分离CD3+细胞(以1mL全血为例)
一、试剂试药：
生物素标记的鼠抗人CD3抗体购自于BD Biosciences；
链霉亲和素偶联微泡冻干制剂和液体制剂：实施例1所得冻干制剂，其通过本发明实施例11方法添加0.9％氯化钠(添加量75ug)制成液体制剂在5小时内使用；
试管旋转混合仪购自Thermo fisher公司；
台式微量离心机购自于Thermo fisher公司；
20％人血白蛋白购自于山东泰邦生物制品有限公司；
EDTA购自于Gibco；
磷酸盐缓冲液照如下配方配制水溶液：1％w/v的人血白蛋白、1mM的EDTA、0.13M的氯化钠、2.55mM的氯化钾、7.7mM的磷酸氢二钠、1mM的磷酸二氢钾。
二、试验操作：
(1)将预先用抗凝剂(本例用EDTA-K2)经抗凝处理的外周血1mL置于2mL的EP试管内，添加用生物素标记的目标细胞特异性抗体(CD3-biotin抗体20ul)，混合均匀，置于试管旋转混合仪上室温孵育30分钟，使得目标细胞被特异性抗体标记；
(2)接着向试管内添加链霉亲和素偶联微泡的液体制剂(120ul)，混合均匀，置于试管混匀仪上室温孵育(20分钟)，使目标细胞进一步被微泡标记，添加磷酸盐缓冲液0.5mL稀释；
(3)将试管离心(台式微量离心机中，500g，离心10分钟)，使目标细胞分离，结合了特异性抗体和微泡的目标细胞浮于液体上层(即，CD3+细胞层)，而非目标细胞沉于下部；
(4)吸取包含目标细胞的上层液体，即得目标细胞，具体操作如下：
(41)取一支2mL的EP管，标记为“阳性样本”，用200ul移液器小心将分离后的上层样本吸出，移至“阳性样本”EP管中，即为目标细胞；剩余血样即为“阴性样本”；
(42)另取一支EP管，标记为“未分离样本”，向其中加入抗凝全血500uL。
三、还可以继续进行如下用于方法学评价的操作：
(5)准确称重“阳性样本”、“阴性样本”的质量，按照1g≈1mL计算各样本的体积；
(6)微泡的加压裂解：另取一支10mL注射器，将阳性样本中的细胞悬液吸入针筒内，并继续抽取空气10mL左右。取下针头，用luer针帽将注射器针头部位旋紧；手持针筒，用力下压活塞至筒内体积约1mL，保持30秒后，混匀细胞悬液样本；重复本步骤2～3次可以使包埋气体完全从微泡中逸出；观察注射器内的细胞悬液澄清透明后，将样本打回至“阳性样本”EP管中进行后续检测或应用。
四、利用流式细胞仪检测分离后样本的回收率、细胞纯度及活力
仪器试剂：流式细胞仪购自于美国BD公司，型号CANTOII；血球计数仪购自于日本希森美康，型号XN-350；数据分析软件为流式细胞仪自带软件FACSDiva；CD3-FITC抗体购自于BD Biosciences；CD45-PE抗体购自于BD Bioscicences；红细胞裂解液ACK lysisbuffer购自于Gibco。
检测方法：
(a)将分离后的“阳性样本”、“阴性样本”、“未分离样本”用血球计数仪进行白细胞五分类细胞计数，计算样本中白细胞WBC、红细胞RBC等含量；
(b)取三支BD流式管，其上对应标记“pre test”、“positive test”、“negativetest”；
(c)在三支试管中分别加入2ul的CD3-FITC、2ul的CD45-PE(鼠抗人CD45抗体)、2ul的7-AAD试剂(7-AAD抗体)；
(d)取“阳性样本”、“阴性样本”、“未分离样本”中100ul悬液分别加入到对应的流式管中，涡旋混匀2秒后，置于4℃冰箱孵育30分钟；
(e)将孵育好的流式管中加入1mL的ACK红细胞裂解液，涡旋混匀2秒钟后，置于4℃冰箱孵育15分钟；
(f)使用流式细胞仪检测CD3阳性细胞的比例、并利用BD FACSDiva软件计算CD3阳性细胞的回收率、纯度及活力。具体地说，将各样本管上机进行流式细胞仪检测，以SSC-FSC设门，圈选淋巴细胞群P1，用CD45阳性细胞群设门P2，在P2中圈选7-AAD阴性细胞群设门P3，在P3中十字设门圈选CD45、CD3双阳性细胞群Q2，计算CD3+T细胞回收率；
(g)回收率计算公式：
外周全血在经上述方法分选CD3细胞前、后，一个典型的示意性的流式细胞图见图1，从图中可见，经上述方法分选后目标细胞即CD3细胞得以富集。
五、试验结果
外周血(Peripheral Blood，PB，亦通常可称为全血)，得自4个不同的供血者，如上所述从这些全血样品中分离CD3阳性T-细胞。
结果：单位全血(n＝4)分别分给两个独立的试验者，他们分别使用本发明上述方法和MACS法(即磁珠分选法，参照CN101845417A说明书之[0030]-[0044]记载的方法进行)，以1-mL和5-mL的规模来分离CD3+阳性细胞。使用本发明方法时，获得CD3+细胞的回收率平均为79.3％(±7.6％)、生存活力平均92.6％(±8.2％)、细胞纯度平均为95.3％(±3.5％)；使用MACS法时，获得CD3+细胞的回收率平均为61.3％(±8.6％)、生存活力平均90.2％(±7.6％)、细胞纯度平均为93.2％(±6.7％)，这表明本发明方法与MACS法比较细胞生存活力和细胞纯度相当，但是在回收率方面本发明方法显著更高。
本文提供的方法用于分离CD3+细胞，可以直接从外周血即全血高效地分离CD3+T-细胞，所得细胞纯度高达90％以上，并且具有优良的回收率(达70％以上)和优良的细胞生存活力(达85％以上)。
本发明方法整个过程可以在2个小时之内完成，一般地可以在1个小时之内完成，比之于现有技术方法具有显著更高的分选效率。特别地，在MACS法(即磁珠分选法)中，通常CD3+连接磁珠直接根据供应商的说明书进行操作，通常需要数小时以上；而在本发明方法中，从外周血到纯化的CD3+T-细胞分离过程可以在一小时之内完成。
图2描绘了本发明方法的基本原理，即：向添加了细胞混合物(在本文中可以是全血)的试管中添加抗体；在室温下温育使得目标细胞被特异性抗体标记；加入本发明微泡液体制剂，在室温下温育，使目标细胞被微泡标记；接着离心以分离目标细胞，结合了特异性抗体和微泡的目标细胞浮于液面，而非目标细胞沉于底部。在离心之后，浮于液面的是微泡层(通常呈白色)，位于中间的是血浆层，位于离心管下部的是红细胞层。
实施例22：使用链霉亲和素偶联微泡从全血中分离CD3+细胞
参照本文实施例21的方法，不同的是改用链霉亲和素偶联微泡冻干制剂和液体制剂为：实施例61所得冻干制剂，其通过本发明实施例11方法添加0.9％氯化钠(添加量75ug)制成液体制剂后，在4～8℃放置45～48小时期间使用，一方面验证本发明方法适当改变条件后的可靠性，另一方面还可验证本发明液体制剂在贮藏一定时间后的可用性。
结果：CD3+细胞的回收率平均为80.5％(±4.8％)、生存活力平均93.4％(±5.6％)、细胞纯度平均为97.1％(±5.2％)。该结果表明，本发明液体制剂即使添加甘氨酸仍然具有优良的分离效果，并且其在贮藏一定时间后仍然具有优良的功能。
实施例23：使用链霉亲和素偶联微泡从全血中分离CD4+细胞
参照本文实施例22的方法，不同的是改为分选的目标细胞为CD4+细胞，配好的链霉亲和素偶联微泡液体制剂在配制后1～4小时内使用，并且试验中所用的相关试剂作适应性调整，例如需要用到的生物素标记的鼠抗人CD4抗体同样地可以通过市售途径获得，并且具体是购自于BD Biosciences。本实施例方法可以验证本发明方法、材料等针对其它目标细胞的可用性。
结果：CD4+细胞的回收率平均为82.2％(±6.1％)、生存活力平均91.4％(±7.4％)、细胞纯度平均为96.2％(±3.8％)。该结果表明，本发明方法、材料等针对其它目标细胞仍然是有效的。
实施例24：使用链霉亲和素偶联微泡从全血中分离其它目标细胞
参照本文实施例23的方法，不同的是改为分选的目标细胞分别为CD8+细胞、CD56+细胞、CD19+细胞、CD34+细胞四种细胞，配好的链霉亲和素偶联微泡液体制剂在配制后1～4小时内使用，并且试验中所用的相关试剂作适应性调整，例如需要用到的生物素标记的鼠抗人CD8抗体同样地可以通过市售途径获得，并且具体是购自于BD Biosciences。本实施例方法可以验证本发明方法、材料等针对其它目标细胞的可用性。
结果：CD8+细胞的回收率平均为80.4％(±6.7％)、生存活力平均94.2％(±7.4％)、细胞纯度平均为95.7％(±5.4％)，CD56+细胞的回收率平均为76.2％(±4.5％)、生存活力平均90.5％(±7.4％)、细胞纯度平均为96.6％(±7.4％)，CD19+细胞的回收率平均为79.4％(±5.8％)、生存活力平均92.1％(±7.4％)、细胞纯度平均为97.3％(±5.6％)，CD34+细胞的回收率平均为81.7％(±3.6％)、生存活力平均93.5％(±7.4％)、细胞纯度平均为95.6％(±7.3％)。该结果表明，本发明方法、材料等针对其它目标细胞仍然是有效的。
实施例25：使用链霉亲和素偶联微泡从全血中分离CD3+细胞
参照本文实施例22的方法，不同的是改用链霉亲和素偶联微泡冻干制剂和液体制剂为：实施例62、实施例63、实施例64、实施例65所得冻干制剂，其通过本发明实施例11方法添加水(添加量100ug)制成液体制剂后，在4～8℃放置45～48小时期间使用。
结果：四种冻干制剂针对CD3+细胞的平均回收率均在79.5～83.1％范围内、平均生存活力均在94.2～95.7％范围内、平均细胞纯度均在95.5～97.4％范围内。该结果表明，本发明冻干制剂和液体制剂具有优良的细胞分离效果。
特别地，本发明针对现有的技术缺陷，提供了不依赖于磁珠等常规方法的一种目标细胞分选方法，避免了磁珠的残留、流式分选引入荧光素的弊端等问题。本发明方法简单迅速、不需要昂贵的仪器设备、成本低、并且对所结合的靶细胞毒性极小、不易使之失活；分选出的细胞纯度、活力高，并可用于后续的实验、培养以及临床应用。
本发明实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.从外周血中分离目标细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将预先用抗凝剂经抗凝处理的外周血置于试管内，添加用生物素标记的目标细胞特异性抗体，混合均匀，孵育，使得目标细胞被特异性抗体标记；
(2)接着向试管内添加链霉亲和素偶联微泡，混合均匀，孵育，使目标细胞进一步被微泡标记，添加磷酸盐缓冲液稀释；
(3)将试管离心使目标细胞分离，结合了特异性抗体和微泡的目标细胞浮于液体上层，而非目标细胞沉于下部；
(4)吸取包含目标细胞的上层液体，即得目标细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中用于对外周血抗凝处理的所述抗凝剂选自：乙二胺四乙酸及其盐例如EDTA-Na2、EDTA-K2、EDTA-K3，草酸盐例如草酸钠，肝素及其盐例如肝素钠，枸橼酸及其盐例如枸橼酸钠。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，
所述目标细胞选自：CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞等T细胞，CD56+细胞等NK细胞，CD19+细胞等B细胞，CD34+细胞等造血干细胞；和/或
所述用生物素标记的目标细胞特异性抗体选自：CD3生物素抗体、CD4生物素抗体、CD8生物素抗体、CD56生物素抗体、CD19生物素抗体、CD34生物素抗体；例如，所述用生物素标记的目标细胞特异性抗体选自：生物素标记的鼠抗人CD3抗体、生物素标记的鼠抗人CD4抗体、生物素标记的鼠抗人CD8抗体、生物素标记的鼠抗人CD56抗体、生物素标记的鼠抗人CD19抗体、生物素标记的鼠抗人CD34抗体。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，
步骤(1)中，每1mL外周血添加抗体5～50ul，例如10～40ul，例如10～30ul；和/或
步骤(1)中，所述孵育是在室温下孵育10～45min，例如在室温下孵育20～40min，例如在室温下孵育25～35min。
5.根据权利要求1的方法，所述链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，
所述包埋气体微泡的包埋气体选自C3F8、SF6、CF4、氟利昂、N2、CO2、O2、空气，尤其是选自C3F8、SF6、CF4；
步骤(2)中，链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡，每1mL外周血添加相当于包含0.5～20×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～15×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～10×10^7个微泡的链霉亲和素偶联微泡；和/或
步骤(2)中，链霉亲和素偶联微泡是经链霉亲和素偶联的包埋气体微泡，每1mL外周血添加相当于包含1～20ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～15ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡，例如添加相当于包含1～10ug包埋气体的链霉亲和素偶联微泡。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，
步骤(2)中，所述孵育是在室温下孵育5～30min，例如在室温下孵育5～25min，例如在室温下孵育10～20min；
步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液是包含如下组分的水溶液：0.8～1.2％w/v的人血白蛋白、0.8～1.2mM的EDTA、0.1～0.15M的氯化钠、2～3mM的氯化钾、7.5～8.0mM的磷酸氢二钠、0.8～1.2mM的磷酸二氢钾；
步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液是包含如下组分的水溶液：1％w/v的人血白蛋白、1mM的EDTA、0.13M的氯化钠、2.55mM的氯化钾、7.7mM的磷酸氢二钠、1mM的磷酸二氢钾。
8.根据权利要求1的方法，其任选的还包括如下步骤：
(5)将上一步骤吸取的包含目标细胞的上层液体置于一个可密封并可压缩内部空气的容器内，使容器内充满空气，密封容器，接着压缩容器内的空气至原始体积的0.05～0.5倍(例如0.05～0.25倍，例如0.05～0.2倍)，必要时释放压力后重复进行压缩空气，减压释放容器内气体，即得基本上不包含包埋气体的目标细胞悬液。
9.根据权利要求1的方法，其任选的还包括如下步骤：
(6)对所得目标细胞悬液进行冻存处理。
10.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)所述链霉亲和素偶联微泡是如本发明第二方面任一实施方案所述的用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的液体制剂，或者是如本发明第三方面任一实施方案所述的用于细胞分选的链霉亲和素偶联微泡的冻干制剂添加水性载体液配制的。
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