CN110357932B - 一种羧甲基壳寡糖的制备方法 - Google Patents

一种羧甲基壳寡糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羧甲基壳寡糖的制备方法，包括步骤1，将壳寡糖加入异丙醇中室温振荡得溶胀壳寡糖；步骤2，向步骤1所得溶胀壳寡糖中添加NaOH溶液，室温振荡碱化得碱性料液；步骤3，向步骤2所得碱性料液中添加氯乙酸的异丙醇溶液进行羧基化反应；步骤4，将步骤3羧基化后的料液先用HCl溶液调节pH至中性，再用无水乙醇醇沉得含有沉淀的料液；步骤5，将步骤5含有沉淀的料液离心并收集沉淀，再将沉淀多次洗涤，后将洗涤后的沉淀干燥制粉即得羧甲基壳寡糖粉末。该制备方法以化学方法制备可得羧甲基壳寡糖，操作简单，可得到高取代度产物，产物具有优良的抗菌抗氧化性能。

Description

一种羧甲基壳寡糖的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羧甲基壳寡糖的制备方法。
背景技术
壳寡糖是一种带有氨基的小分子寡糖，它是由源于虾蟹壳中的甲壳素，经降解和脱乙酰化而成的，具有纯天然、无毒等特点。同时，壳寡糖无免疫抗原性，用于抑制细菌时，耐药菌株产生的风险大大减小，且具有分子量低、水溶性好、功能作用大、易被吸收、生物活性高等优势。在对壳寡糖活性的研究中发现，抗菌抑菌作用和抗氧化作用是壳寡糖的最主要活性。但当前用壳寡糖制备的抗菌剂、抗氧化剂其作用效果还不太理想，这可能与其尚未清楚的作用机制，以及未进行化学改性增强单一或几个生物活性来针对性使用有关。
随着壳寡糖生物活性研究的深入，改性壳寡糖的研究将有助于在保留壳寡糖纯天然、无免疫抗原性等优势的基础上，开发更高效的动物应激反应调节剂，应用于动物营养、生物医药与保健等多个领域。有研究表明，羧甲基壳聚糖表现出较壳聚糖更好的抗菌性，抗氧化活性。
羧甲基壳寡糖是在壳寡糖原有结构的基础上引入了羧甲基，既提高了水溶性，又增强了对金属离子的螯合能力，具有良好的保湿性、水溶性、乳化性。羧甲基基团在壳寡糖上的取代可以打破分子链的紧密排列，改善分子结构，削弱分子间的相互作用，从而提高活性羟基的暴露几率，形成较强的自由基清除活性，增强了抗氧化活性。
壳寡糖改性后的产物羧甲基壳寡糖，作为一种极有潜力的天然资源，其生物活性的研究与开发，将有助于动物应激反应调节剂的开发与应用，使其优秀的生物活性能够得到充分发挥。但目前利用化学方法制备羧甲基壳寡糖的技术不够成熟，生产制备的工艺及参数未优化。
发明内容
本发明提供了一种羧甲基壳寡糖的制备方法，实现了利用化学方法制备羧甲基壳寡糖的目的。
本发明所采用的技术方案是，一种羧甲基壳寡糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将壳寡糖加入异丙醇中室温振荡得溶胀壳寡糖；
步骤2，向步骤1所得溶胀壳寡糖中添加NaOH溶液，室温振荡碱化得碱性料液；
步骤3，向步骤2所得碱性料液中添加氯乙酸的异丙醇溶液进行羧基化反应；
步骤4，将步骤3羧基化后的料液先用HCl溶液调节pH至中性，再用无水乙醇醇沉得含有沉淀的料液；
步骤5，将步骤5含有沉淀的料液离心并收集沉淀，再将沉淀用乙醇多次洗涤，后将洗涤后的沉淀干燥制粉即得羧甲基壳寡糖粉末。
本发明的特点还在于，
步骤1中壳寡糖与异丙醇的配比为2g：15ml～25ml，其中，壳寡糖以质量计算，异丙醇以体积计算。
步骤2的NaOH溶液的质量百分比浓度为30％，碱化时间为2h～12h；壳寡糖与NaOH溶液的配比为2g：6.67ml～20ml，其中，壳寡糖以质量计算，NaOH溶液以体积计算。
壳寡糖与氯乙酸的质量比为2：2～10；步骤3的氯乙酸与异丙醇的配比为2g～10g：10ml～50ml，其中氯乙酸以质量计算，异丙醇溶液以体积计算。
步骤3的羧基化时间为4h～24h，羧基化温度为35℃～40℃。
步骤4的HCl溶液的质量百分比浓度为9.5％～10.5％。
步骤5的离心转速为2500r/min～3000r/min，离心时长为20min～30min。
步骤5的真空冷冻干燥，真空度为-10MPa，温度为-40℃，时间为20h～24h。
本发明一种羧甲基壳寡糖的制备方法的有益效果是，实现了以化学方法制备羧甲基壳寡糖的目的，采用本发明所提供的方法制备羧甲基壳寡糖操作简单，可以减少制备的时间，得到高取代度的产物，产物具有优良的抗菌抗氧化活性，并且环保无污染残留。
附图说明
图1是本发明氯乙酸用量与羧甲基壳寡糖取代度的条形图；
图2是壳寡糖与本发明的羧甲基壳寡糖的红外光谱表征图；
图3是本发明羧甲基壳寡糖抑菌曲线图；
图4是不同浓度的本发明的羧甲基壳寡糖对金黄色葡萄糖菌的抑菌曲线图；
图5是不同浓度的本发明的羧甲基壳寡糖对大肠杆菌的抑菌曲线图；
图6是不同浓度的壳寡糖对金黄色葡萄糖菌的抑菌曲线图；
图7是不同浓度的壳寡糖对大肠杆菌的抑菌曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明所采用的技术方案是，一种羧甲基壳寡糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将壳寡糖加入异丙醇中室温振荡得溶胀壳寡糖；壳寡糖与异丙醇的配比为2g：15ml～25ml，其中，壳寡糖以质量计算，异丙醇以体积计算；
步骤2，向步骤1所得溶胀壳寡糖中添加NaOH溶液，室温振荡碱化得碱性料液；NaOH溶液的质量百分比浓度为30％，碱化时间为2h～12h；壳寡糖与NaOH溶液的配比为2g：6.67ml～20ml，其中，壳寡糖以质量计算，NaOH溶液以体积计算。
步骤3，向步骤2所得碱性料液中添加氯乙酸的异丙醇溶液在35℃～40℃羧基化反应4h～24h；壳寡糖与氯乙酸的质量比为2：2～10；氯乙酸与异丙醇的配比为2g～10g：10ml～50ml，其中氯乙酸以质量计算，异丙醇溶液以体积计算；
步骤4，将步骤3羧基化后的料液先用质量百分比浓度为9.5％～10.5％的HCl溶液调节pH至中性，再用无水乙醇醇沉得含有沉淀的料液；
步骤5，将步骤5含有沉淀的料液离心并收集沉淀，再将沉淀用乙醇多次洗涤，后将洗涤后的沉淀干燥制粉即得羧甲基壳寡糖粉末；其中，离心转速为2500r/min～3000r/min，离心时长为20min～30min；真空冷冻干燥，真空度为-10MPa，温度为-40℃，时间为20h～24h。
原料来源：壳寡糖购于大连美仑生物技术有限公司，该壳寡糖具有如下特点：淡黄色至黄褐色粉末，脱乙酰度≥90％，分子量≤2000Da；异丙醇、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、30％过氧化氢、氯化钠均购于重庆川东化工有限公司AR；氯乙酸、七水硫酸亚铁、水杨酸，均购于上海麦克林生化科技有限公司AR；酵母浸出粉，购于成都市科龙化工试剂厂BR；蛋白胨，购于北京奥博星生物技术有限责任公司BR；琼脂，购于重庆东试化工有限公司AR；大肠杆菌ATCC8537、金葡球菌ATCC6538。
本发明是利用正交试验来确定影响壳寡糖羧基取代度的因素，如表1所示，先确定正交试验的因素和水平，然后按照实施例1-9实施试验；如表2所示，再确定每个因素对试验指标的影响的主次顺序，最终确定那个因素使得羧甲基壳寡糖的取代度的影响最大，可以指导选择最优化的方案。
表1 L9(34)正交试验因素水平表
Figure BDA0002182825320000051
实施例1
步骤1，称取2g壳寡糖于1L容积的烧杯里，贴好保鲜膜，加入15ml异丙醇，室温振荡溶胀30min；
步骤2，先向步骤1所得的溶胀壳寡糖中添加质量百分比浓度为30％的NaOH溶液6.67ml，后室温振荡碱化2h得碱性料液；
步骤3，向步骤2所得的碱性料液中添加氯乙酸的异丙醇溶液35℃下羧基化反应4h，其中氯乙酸的异丙醇溶液的氯乙酸的质量为2g，异丙醇的体积为50ml；
步骤4，将步骤3羧基化后的料液先用质量百分比浓度为9.5％的HCl调节pH至中性，然后乙醇醇沉6.5小时，倒掉上清液，将杯底的沉淀物溶在适量水中再次乙醇醇沉得到含有沉淀的料液；
步骤5，先将步骤5含有沉淀的料液以2500r/min的转速低温离心20min，然后将收集的沉淀用质量百分比浓度为80％的乙醇溶液多次洗涤，再将沉淀中的乙醇脱水，最后将沉淀真空冷冻干燥20h后刮下来研磨成粉即得羧甲基壳寡糖。
实施例2
实施步骤与实施例1除了碱化时间、氯乙酸添加量、羧基化时间不同，其余步骤均相同，本实施例中的碱化时间为7h，氯乙酸添加量为3g，羧基化时间为12h。
实施例3
实施步骤与实施例1除了碱化时间、氯乙酸添加量、羧基化时间不同，其余步骤均相同，本实施例中的碱化时间为12h，氯乙酸添加量为4g，羧基化时间为24h。
实施例4
实施步骤与实施例1除了碱化时间、NaOH溶液添加量、羧基化时间不同，其余步骤均相同，本实施例中的碱化时间为7h，NaOH溶液添加量为13.33ml，羧基化时间为24h。
实施例5
实施步骤与实施例1除了碱化时间、NaOH溶液添加量、氯乙酸添加量不同，其余步骤均相同，本实施例中的碱化时间为12h，NaOH溶液添加量为13.33ml，氯乙酸添加量为3g。
实施例6
实施步骤与实施例1除了NaOH溶液添加量、氯乙酸添加量、羧基化时间不同，其余步骤均相同，本实施例中的NaOH溶液添加量为13.33ml，氯乙酸添加量为4g，羧基化时间为12h。
实施例7
实施步骤与实施例1除了碱化时间、NaOH溶液添加量、羧基化时间不同，其余步骤均相同，本实施例中的碱化时间为12h，NaOH溶液添加量为20ml，羧基化时间为12h。
实施例8
实施步骤与实施例1除了NaOH溶液添加量、氯乙酸添加量、羧基化时间不同，其余步骤均相同，本实施例中的NaOH溶液添加量为20ml，氯乙酸的添加量为3g，羧基化时间为24h。
实施例9
实施步骤与实施例1除了碱化时间、NaOH溶液添加量、氯乙酸添加量不同，其余步骤均相同，本实施例中的碱化时间为7h，NaOH溶液添加量为20ml，氯乙酸的添加量为4g。
实施例1-9的正交试验结果如表2所示：
表2 L9(34)正交试验结果
Figure BDA0002182825320000081
从表1及表2的数据可以看出，优水平组合为A3B3C3D3，即最优工艺条件为每2g壳寡糖碱加量6g，加氯乙酸量4g，碱化时间为12h，羧化时间为24h。试验因素对试验指标的影响的主次顺序为BCDA，即添加氯乙酸量对羧甲基壳寡糖取代度的影响最大。通过试验结果可以看出，随着氯乙酸添加量的升高，羧甲基壳寡糖的取代度也随之升高，因此可以设计在其他因素为最优水平下，继续提升氯乙酸的添加量以优化生产工艺得到最佳取代度的羧甲基壳寡糖。
实施例10
步骤1，称取2g壳寡糖于1L容积的烧杯里，贴好保鲜膜，加入25ml异丙醇，室温振荡溶胀30min；
步骤2，先向步骤1所得的溶胀壳寡糖中添加质量百分比浓度为30％的NaOH溶液20ml，后室温振荡碱化12h得碱性料液；
步骤3，向步骤2所得的碱性料液中添加氯乙酸的异丙醇溶液40℃下羧基化反应24h，其中氯乙酸的异丙醇溶液的氯乙酸的质量为5g，异丙醇的体积为10ml；
步骤4，将步骤3羧基化后的料液先用质量百分比浓度为10.5％的HCl调节pH至中性，然后乙醇醇沉6.5小时(醇沉时间至少6个小时)，倒掉上清液，将杯底的沉淀物溶在适量水中再次乙醇醇沉得到含有沉淀的料液；
步骤5，先将步骤5含有沉淀的料液以3000r/min的转速低温离心30min，然后将收集的沉淀用质量百分比浓度为80％的乙醇溶液多次洗涤，再将沉淀中的乙醇脱水，最后将沉淀真空冷冻干燥24h后刮下来研磨成粉即得羧甲基壳寡糖。
实施例11
实施步骤与实施例10除了氯乙酸的添加量不同，其余步骤均相同，本实施例中的氯乙酸添加量为6g。
实施例12
实施步骤与实施例10除了氯乙酸的添加量不同，其余步骤均相同，本实施例中的氯乙酸添加量为7g。
实施例13
实施步骤与实施例10除了氯乙酸的添加量不同，其余步骤均相同，本实施例中的氯乙酸添加量为8g。
实施例14
实施步骤与实施例10除了氯乙酸的添加量不同，其余步骤均相同，本实施例中的氯乙酸添加量为9g。
实施例15
实施步骤与实施例10除了氯乙酸的添加量不同，其余步骤均相同，本实施例中的氯乙酸添加量为10g。
表3氯乙酸用量对羧甲基壳寡糖取代度的影响(结果用均数±标准差表示，n＝3)
Figure BDA0002182825320000101
氯乙酸用量对羧甲基壳寡糖取代度的影响如图1所示，数据以均数±标准差表示,n＝3,数据上标无特殊符号或相同特殊符号表示差异不显著(P>0.05),不同特殊符号表示差异显著(P<0.05)，其中特殊符号为#或*。从实施例10-15、表3及图1可以看出，随着氯乙酸添加量的提高，所制得羧甲基壳寡糖的取代度逐渐增加，当氯乙酸添加量为8g时达到最高，此时取代度为109.81％显著高于其他组的取代度(P<0.05)。
对实施例10-15制备得到的羧甲基壳寡糖进行如下分析与测定：
(1)FT-IR分析
对壳寡糖(COS)、羧甲基壳寡糖(CMCOS)进行FT-IR分析，壳寡糖、羧甲基壳寡糖的红外光谱表征如图2所示，壳寡糖与羧甲基壳寡糖的光谱显示3100cm-1到3400cm-1处有较广泛的吸收带，这是由于O-H和N-H的拉伸振动引起的。与壳寡糖光谱相比，羧甲基壳寡糖在1599cm-1处出现了COO-的特征吸收峰，而壳寡糖在此处无吸收峰，说明壳寡糖发生了羧甲基化反应。
(2)体外抗氧化性能测定
采用水杨酸比色法，通过对羟自由基的清除能力比较抗氧化性能，不同浓度下的壳寡糖和羧甲基壳寡糖清除羟自由基的能力如表4所示。
表4不同浓度壳寡糖与本发明的羧甲基壳寡糖清除羟自由基能力(结果用均数±标准差表示，n＝5)
Figure BDA0002182825320000111
注：同列数据肩标无特殊符号或相同特殊符号表示差异不显著(P>0.05)，不同特殊符号表示差异显著(P<0.05)。
如表4所示，壳寡糖与羧甲基壳寡糖都显示了明显的羟自由基清除活性，且在一定质量浓度范围内活性大小与样品浓度呈正相关，在样品浓度为6mg/mL时壳寡糖与羧甲基壳寡糖的羟自由基清除率均达到最大值分别为95.7％和99.89％，且在本试验中的质量浓度范围内羧甲基壳寡糖的羟自由基清除率均显著高于壳寡糖(P<0.05)。
(3)抗菌活性测定
通过测定不同浓度的羧甲基壳寡糖对菌液吸光度值的影响来找到羧甲基壳寡糖对两种细菌的最小抑菌浓度，图3中的数据以均数±标准差表示,n＝4；由图3可知，两条曲线第一拐点的横坐标值就是羧甲基壳寡糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度值，分别为0.3％和0.1％。由此表明羧甲基壳寡糖与壳寡糖对金黄色葡萄球菌的抗菌效果要比大肠杆菌好。
(4)动态抑菌效果测定
由前期抑菌浓度测定结果得到的羧甲基壳寡糖的MIC(最小抑菌浓度)值，结合文献中已知壳寡糖的MIC。分别将两种寡糖配制成2倍MIC值、MIC值和1/2MIC值浓度，在600nm波长测定其24h内的吸光值变化，动态抑菌效果如图4-7所示，图中数据以均数±标准差表示,n＝4，*表示与对照组比较差异显著(P<0.05)，由图4-7可知，羧甲基壳寡糖与壳寡糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抗菌性且羧甲基壳寡糖对金黄色葡萄球菌要比壳寡糖更敏感。
本发明制备羧甲基壳寡糖操作简单，可以得到高取代度的产物，产物具有优良的抗菌抗氧化活性，并且环保无污染残留。

Claims (1)

1.一种羧甲基壳寡糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将壳寡糖加入异丙醇中室温振荡得溶胀壳寡糖；壳寡糖与异丙醇的配比为2g：25ml，其中，壳寡糖以质量计算，异丙醇以体积计算；
步骤2，向步骤1所得溶胀壳寡糖中添加NaOH溶液，室温振荡碱化得碱性料液；NaOH溶液的质量百分比浓度为30％，碱化时间为12h；所述壳寡糖与NaOH溶液的配比为2g：20ml，其中，壳寡糖以质量计算，NaOH溶液以体积计算；
步骤3，向步骤2所得碱性料液中添加氯乙酸的异丙醇溶液进行羧基化反应；羧基化时间为24h，羧基化温度为40℃；
壳寡糖与所述氯乙酸的质量比为2：7；氯乙酸与异丙醇的配比为7g：10ml，其中氯乙酸以质量计算，异丙醇溶液以体积计算；
步骤4，将步骤3羧基化后的料液先用HCl溶液调节pH至中性，再用无水乙醇醇沉得含有沉淀的料液；HCl溶液的质量百分比浓度为10.5％；
步骤5，将步骤5含有沉淀的料液离心并收集沉淀，再将沉淀用乙醇多次洗涤，后将洗涤后的沉淀真空冷冻干燥制粉即得羧甲基壳寡糖粉末；离心转速为3000r/min，离心时长为30min；真空冷冻干燥，真空度为-10MPa，温度为-40℃，时间为20h～24h。
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