CN110343656A - 一种克氏原螯虾血淋巴细胞的分离方法 - Google Patents

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水燕
刘国锋
徐增洪
唐建清
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Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
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Freshwater Fishery Research Center Chinese Academy Of Aquatic Sciences
Freshwater Fisheries Research Institute of Jiangsu Province
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明公开了一种克氏原螯虾血淋巴细胞的分离方法，所述分离方法包括如下步骤：(1)细菌培养；(2)药物注射；(3)细胞收集。本发明通过预先用细菌进行诱导，成功收集并获得克氏原螯虾血淋巴细胞，实现了甲壳动物血淋巴细胞的体外分离，可控培养，所需样品少，操作时间短，流程简单，获得的血淋巴细胞密度高，活性强，成活率高，可广泛应用于甲壳动物免疫相关的功能研究。

Description

一种克氏原螯虾血淋巴细胞的分离方法
技术领域
本发明涉及细胞的分离方法，具体涉及一种克氏原螯虾血淋巴细胞的分离方法，属于细胞技术领域。
背景技术
大多数无脊椎动物拥有开管循环系统以及并不发达的心血管系统。大量的血淋巴细胞浸润其组织，并发挥多种多样的功能。由于无脊椎动物缺乏免疫球蛋白以及参与适应性免疫反应的淋巴细胞，它们依赖其血淋巴细胞参与免疫防御，清除病原以及自身凋亡细胞，分泌各种固有免疫分子参与宿主的免疫防御反应。甲壳动物属于无脊椎动物中重要的一个分支，其免疫反应主要依靠吞噬、包囊和凝集，属于非特异性免疫。血淋巴细胞在甲壳动物的免疫系统中具有重要作用。造血组织和造血干细胞为血淋巴细胞的生成、补充和更新提供了保障。血淋巴细胞成熟后分为不同类型，对血淋巴细胞分型的研究正在从采用传统的形态学方法向采用生物技术方法的方向发展，单克隆抗体技术已经应用于甲壳动物血淋巴细胞分型，结果更为客观准确。不同类型的血淋巴细胞在细胞化学特性与功能方面表现出明显差异。
在甲壳动物的免疫反应中，血淋巴细胞数量在不同的免疫应激状态下发生明显变化。当外来病原体较小时，血淋巴细胞通过吞噬作用吞入病原体，在细胞内部将病原杀灭；当入侵的病原体或寄生虫的个体大于10μm时，则以多个血淋巴细胞的包囊作用或凝集作用来完成。
甲壳动物的免疫反应是一个交互作用的复杂过程，必然涉及多层次、多个因子的参与。其中造血组织的结构，血淋巴细胞的产生及调控机理，免疫因子在免疫反应中的功能及它们之间的相互作用的网络关系等尚需深入研究。
当前我国淡水小龙虾(学名克氏原螯虾Procambarus clarkii，又称小龙虾)养殖产业发展呈现出井喷式增长态势。据不完全统计，2007至2017年，全国小龙虾养殖产量由约26.6万吨增加到约112.97万吨，增长约324％，全国养殖面积超过1000万亩。随着养殖规模的扩大，受病害侵袭的危害日益严重。危害小龙虾养殖的病原主要有病毒、细菌、真菌、寄生虫等，其中以前两种病原的危害最大。对小龙虾免疫系统生成以及造血组织、血淋巴细胞的调控机制的研究成为一个当前需要开展的重要课题。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种克氏原螯虾血淋巴细胞的分离方法。本发明成功收集并获得克氏原螯虾血淋巴细胞，实现了甲壳动物血淋巴细胞的体外分离，可控培养。
本发明的技术方案如下：
一种克氏原螯虾血淋巴细胞的分离方法，所述分离方法包括如下步骤：
(1)细菌培养；
(2)药物注射；
(3)细胞收集。
步骤(1)中所述细菌培养的方法为：
用LB液体培养基扩大培养水产动物细菌病原体，培养后可在LB固体培养基上划线分离；用接种棒将细菌接种于LB培养基中，28℃，220rpm的条件下震荡过夜培养，4℃，8000rpm条件下离心5min后，去除上清，用灭菌的生理盐水重悬至OD＝0.1备用，即细菌重悬液；
所述病原体为大肠杆菌或嗜水气单胞菌；
所述LB培养基配制备方法为：准确称取蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，NaCl50ml，加蒸馏水定容至50ml，用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.5。
步骤(2)中的具体操作为：
S1：选取健康，有活力的克氏原螯虾，分成实验组和对照组，每组10只，实验前，用灭菌生理盐水冲洗3遍；
S2：实验组的实验动物中，在第四步足的侧面的薄膜用微量注射器注射100μL步骤(1)制得的细菌重悬液，对照组实验动物同样位置注射同等计量的灭菌生理盐水，注射完之后的实验动物分别置于不同的培养箱内休息。所述的药物注射的部位在第四步足，抽取时在其它步足。
步骤(3)细菌收集的具体步骤为：
S1：配制血液抗凝剂，配方为500mmol/L氯化钠，100mmol/L葡萄糖，200mmol/L柠檬酸，30mmol/L柠檬酸钠，10mM EDTA，调整pH至7.3；
S2：按照12h、24h的时序分别从除第四步足之外的未注射的步足的位置用微量注射器进行抽提，抽提之前，注射器内预先存有300ul抗凝剂，每只动物抽取与抗凝剂等量的血淋巴300ul，之后迅速于4℃，1000g条件下离心15min，收集血淋巴细胞；
S3：用细胞计数器或者流式细胞仪进行计数和鉴定，对照组动物也作相同处理。收集的血淋巴细胞可作为细胞原代培养。
本发明有益的技术效果在于：
本发明通过预先用细菌进行诱导，成功收集并获得克氏原螯虾血淋巴细胞，实现了甲壳动物血淋巴细胞的体外分离，可控培养等等，所需样品少，操作时间短，流程简单，但是获得的血淋巴细胞密度高，活性强，成活率高，可广泛应用于甲壳动物免疫相关的功能研究。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
实施例一：用大肠杆菌诱导的克氏原螯虾血淋巴细胞分离
(1)用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。LB培养基配制方案如下：准确称取蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，NaCl 50ml，加蒸馏水定容至50ml，用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.5。
配置LB固体培养基时还需加1克琼脂，整个过程中不断用玻璃棒搅拌，目的是防治琼脂糊底而导致烧杯破裂。灭菌锅内常规灭菌处理。
用接种棒将大肠杆菌接种于LB培养基中，28℃，220rpm的条件下震荡过夜培养，4℃，8000rpm条件下离心5min后，去除上清，用灭菌的生理盐水重悬至OD＝0.1备用，这就是大肠杆菌重悬液。
(2)选取健康，有活力的克氏原螯虾，分成实验组和对照组，每组10只。实验前，用灭菌生理盐水冲洗3遍。实验组的实验动物中，在第四步足的侧面的薄膜用微量注射器注射100μL大肠杆菌重悬液；对照组实验动物同样位置注射同等计量的灭菌生理盐水。过程中注意动作轻柔，不要造成不必要的机体损伤。注射完之后的实验动物分别置于不同的培养箱内休息。
(3)配制血液抗凝剂，配方为500mmol/L氯化钠，100mmol/L葡萄糖，200mmol/L柠檬酸，30mmol/L柠檬酸钠，10mM EDTA，调整pH至7.3。
按照12h、24h的时序分别从未注射的步足(除第四步足之外)的位置用微量注射器进行抽提。抽提之前，注射器内预先存有300μL抗凝剂，每只动物抽取血淋巴300μL(与抗凝剂等量)。之后迅速于4℃，1000g条件下离心15min，收集血淋巴细胞。用细胞计数器或者流式细胞仪进行计数和鉴定。对照组动物也作相同处理。收集的血淋巴细胞可作为细胞原代培养。
实施例二：用嗜水气单胞菌诱导的红鳌螯虾血淋巴细胞分离
(1)用LB液体培养基扩大培养嗜水气单胞菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。LB培养基配制方案如下：准确称取蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，NaCl 50ml，加蒸馏水定容至50ml，用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.5。
配置LB固体培养基时还需加1g琼脂，整个过程中不断用玻璃棒搅拌，目的是防治琼脂糊底而导致烧杯破裂。灭菌锅内常规灭菌处理。
用接种棒将嗜水气单胞菌接种于LB培养基中，28℃，220rpm的条件下震荡过夜培养，4℃，8000rpm条件下离心5min后，去除上清，用灭菌的生理盐水重悬至OD＝0.1备用，这就是嗜水气单胞菌重悬液。
(2)选取健康，有活力的红鳌螯虾，分成实验组和对照组，每组10只。实验前，用灭菌生理盐水冲洗3遍。实验组的实验动物中，在第四步足的侧面的薄膜用微量注射器注射100μL大肠杆菌重悬液；对照组实验动物同样位置注射同等计量的灭菌生理盐水。过程中注意动作轻柔，不要造成不必要的机体损伤。注射完之后的实验动物分别置于不同的培养箱内休息。
(3)配制血液抗凝剂，配方为500mmol/L氯化钠，100mmol/L葡萄糖，200mmol/L柠檬酸，30mmol/L柠檬酸钠，10mM EDTA，调整pH至7.3。
按照12h、24h的时序分别从未注射的步足(除第四步足之外)的位置用微量注射器进行抽提。抽提之前，注射器内预先存有300μL抗凝剂，每只动物抽取血淋巴300μL(与抗凝剂等量)。之后迅速于4℃，1000g条件下离心15min，收集血淋巴细胞。用细胞计数器或者流式细胞仪进行计数和鉴定。对照组动物也作相同处理。收集的血淋巴细胞可作为细胞原代培养。

Claims (5)

1.一种克氏原螯虾血淋巴细胞的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括如下步骤：
(1)细菌培养；
(2)药物注射；
(3)细胞收集。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述细菌培养的方法为：
用LB液体培养基扩大培养水产动物细菌病原体，培养后可在LB固体培养基上划线分离；用接种棒将细菌接种于LB培养基中，28℃，220rpm的条件下震荡过夜培养，4℃，8000rpm条件下离心5min后，去除上清，用灭菌的生理盐水重悬至OD＝0.1备用，即细菌重悬液；
所述病原体为大肠杆菌或嗜水气单胞菌；
所述LB培养基配制备方法为：准确称取蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，NaCl50ml，加蒸馏水定容至50ml，用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.5。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(2)中的具体操作为：
S1：选取健康，有活力的克氏原螯虾，分成实验组和对照组，每组10只，实验前，用灭菌生理盐水冲洗3遍；
S2：实验组的实验动物中，在第四步足的侧面的薄膜用微量注射器注射100μL步骤(1)制得的细菌重悬液，对照组实验动物同样位置注射同等计量的灭菌生理盐水，注射完之后的实验动物分别置于不同的培养箱内休息。
4.根据权利要求3所述的分离方法，所述的药物注射的部位在第四步足，抽取时在其它步足。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(3)细菌收集的具体步骤为：
S1：配制血液抗凝剂，配方为500mmol/L氯化钠，100mmol/L葡萄糖，200mmol/L柠檬酸，30mmol/L柠檬酸钠，10mM EDTA，调整pH至7.3；
S2：按照12h、24h的时序分别从除第四步足之外的未注射的步足的位置用微量注射器进行抽提，抽提之前，注射器内预先存有300ul抗凝剂，每只动物抽取与抗凝剂等量的血淋巴300ul，之后迅速于4℃，1000g条件下离心15min，收集血淋巴细胞；
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