CN110327221A

CN110327221A - 一种牙本质胶原纤维脱矿材料及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110327221A
Application number: CN201910302362.9A
Authority: CN
Inventors: 牛丽娜; 陈吉华; 郑智明; 郭景梅; 余凡; 焦凯
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2019-10-15
Also published as: JP6928686B2; US20200330360A1; JP2020176110A; US20220273546A1; EP3725289A1

Abstract

本发明涉及一种牙本质胶原纤维脱矿材料及其制备方法与应用。具体而言，本发明涉及一种水溶性壳聚糖与氨基羧酸金属螯合剂的缀合物，其用于牙科脱矿，优选牙本质脱矿的用途。本发明还公开了一种牙本质胶原纤维脱矿材料及其制备方法与应用，本发明的材料由0.5‑1质量份水溶性壳聚糖、10‑30质量份EDTA和0.8‑1.5质量份交联剂制备而成。本发明还涉及一种牙科脱矿组合物，其包含本发明的缀合物和材料。本发明的缀合物、材料和组合物可用于牙科粘接修复前的牙本质脱矿处理，在用作牙本质胶原脱矿剂时，具有优异的选择性纤维外脱矿性能、良好的生物相容性、有效的抑菌及抑制内源性基质蛋白酶活性的作用以及极低的细胞毒性。

Description

一种牙本质胶原纤维脱矿材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于牙科粘接修复材料学领域，具体涉及一种牙本质胶原纤维脱矿材料及其制备方法与应用。

背景技术

牙齿是人体高度矿化的器官。正常的牙本质基质由有序编织的胶原纤维基质、迭序排列的无机相磷灰石晶体和少量的非胶原蛋白组成。

根据羟基磷灰石和胶原的相对位置关系，牙本质的矿化可以分为纤维内矿化和纤维外矿化两部分。尽管牙本质中65％的矿物质位于纤维外，但纤维内矿化对于保持原纤维形貌至关重要，并且决定着牙本质在纳米尺度上的力学性能，并能够防止胶原在牙本质中内源性基质金属蛋白酶作用下变性降解。

在正常生理情况下，牙齿的脱矿与再矿化相互平衡，然而在病理情况下，脱矿作用就会大于再矿化作用，导致牙体组织的破坏，进而损害牙齿的功能。

口腔首要疾患--龋病，就是最常见的病理性脱矿的结果。致龋微生物可使碳水化合物分解产酸，并与牙本质内源性基质金属蛋白酶协同作用，导致牙齿无机质的脱矿和胶原有机质的降解，逐步形成龋洞。目前，龋病已被世界卫生组织列为继癌症、心血管疾病之后的第三大慢性非传染性疾病。2015年世界卫生组织(WHO)研究数据显示：恒牙患龋己达24亿人，乳牙患龋己达6.21亿人，龋病防治已不仅是口腔医学问题，也日益成为倍受关注的公共卫生课题。

目前临床上对于龋病的治疗仍以外科手术治疗为主，即在去净龋坏牙体组织的基础上，首先用酸蚀剂(如30-40％的磷酸)酸蚀粘接面，使牙本质胶原纤维脱矿，进而涂布粘结剂，使其进入裸露的胶原纤维间并与之交联缠绕形成混合层，最后采用修复材料充填窝洞以恢复牙体的生理形态与功能。所使用的修复材料主要是以树脂牙本质粘接为基础的牙色复合树脂材料。可以看出，粘接剂与牙本质胶原形成的混合层的完整性与稳定性是治疗成功以及修复体长期存在的关键因素。然而，由于磷酸等的强酸蚀性，往往造成牙本质胶原基质在酸蚀剂作用下发生完全脱矿，干燥后从网状结构塌陷成片状，导致树脂粘接剂很难渗入胶原纤维中间，胶原无法被粘接树脂良好保护。在内源性基质蛋白酶的作用下，这部分树脂渗透不良区域很容易降解，从而使粘接面的完整性被破坏，粘接强度降低，最终可能导致树脂-牙本质粘接修复的失败。此外，有研究发现这些内源性基质蛋白酶可以在酸性环境中大量活化，因此使用磷酸酸蚀牙本质一定程度上刺激了基质蛋白酶的活性。这些缺点是造成修复体周围继发龋高发和牙本质胶原降解的主要因素。

甲壳素(chitin)又称几丁质或壳多糖，为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中。壳聚糖(chitosan)的化学名是β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，其为甲壳素脱N-乙酰基的产物，一般而言，N-乙酰基脱去55％以上的就可称之为壳聚糖。

螯合剂能够与金属原子或离子相互作用，将金属原子或离子包合到螯合剂内部，形成稳定的络合物或螯合物。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的包括提供一种牙科脱矿剂，其能够防治龋齿并提高粘接界面稳定性，从而延长粘接修复体的使用。更具体而言，本发明的目的包括提供一种缀合物、材料和组合物，其用于牙科脱矿，更具体的是牙本质胶原纤维脱矿。例如,本发明的目的在于提供一种牙本质胶原纤维脱矿材料。所述缀合物、材料和组合物能够使牙本质胶原纤维维持其原本的外貌及网状结构，利于后续的树脂粘结剂渗透。

本发明的技术问题通过提供一种水溶性壳聚糖与氨基羧酸金属螯合剂的缀合物来解决。

在一个方面，本发明涉及一种水溶性壳聚糖与氨基羧酸金属螯合剂的缀合物，其用于牙科脱矿、优选牙本质脱矿、更优选牙本质胶原纤维脱矿的用途。在所述缀合物中，所述水溶性壳聚糖的氨基与所述氨基羧酸金属螯合剂的羧基形成酰胺键。

在本发明中，壳聚糖可具有以下结构式：

其中n和m是整数且n与m的比例取决于所述壳聚糖脱乙酰的程度。在一个方面，本发明壳聚糖的脱乙酰程度为至少55％、例如60％至100％，65％至99％，70％至98％，75％至97％，80％至96％，85％至95％，或者至少90％。例如,对于脱乙酰程度为90％的壳聚糖而言，在上述结构式中，n与m的比例为9:1。本领域技术人员理解,在上式(I)中，含氨基的单体(即葡糖胺单体)和含乙酰胺基的单体(即乙酰葡糖胺单体)通常是随机分布,包括单体的位置和相同单体的连续数目可以是随机的。在一个方面，n+m的总数为大于100，例如大于150，优选大于200，大于250，大于300，大于350，大于400，大于450，大于500，大于600，大于800或大于1000。在另一方面，n+m的总数为小于10000，优选小于8000，小于7000，小于6000，小于5000，小于4000，小于3500，小于3000，小于2500，小于2000或小于1500。

在一个方面，本发明的水溶性壳聚糖可以是可溶于水的壳聚糖的盐、酯、片段、衍生物或类似物形式，它们保留了氨基能够与氨基羧酸金属螯合剂的羧基形成酰胺键。所述盐可以是酸加成盐，例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、或者C₁-C₆羧酸盐例如乙酸盐等。所述酯可以为硫酸酯、磺酸酯、或者C₁-C₆羧酸酯例如乙酸酯等。所述壳聚糖的片段可为壳聚糖的水解产物，其保留壳聚糖的单体结构、聚合程度更小和水溶性提高。壳聚糖的水溶性衍生物包括向所述壳聚糖引入了增加水溶性基团(例如羟基、C1-C6羧基例如乙酸基、或硫酸基)的衍生物。

在一个方面，本发明的水溶性壳聚糖可以选自乙二醇脱乙酰壳聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖硫酸酯、壳聚糖寡糖和类透明质酸壳聚糖中的一种或两种以上的混合物。

上述乙二醇脱乙酰壳聚糖可具有以下结构式：

同理，a和b是整数，且a与b之间的比例取决于所述壳聚糖脱乙酰的程度；所述乙二醇脱乙酰壳聚糖的脱乙酰程度可如上文关于式I所定义；并且a+b的总数可如上文关于式I中n+m的总数所定义。本领域技术人员也理解，在上式(II)中，含氨基的单体和含乙酰胺基的单体通常是随机分布,包括单体的位置和相同单体的连续数目可以是随机的。在式II中，游离的氨基可以与氨基羧酸金属螯合剂中的羧基形成酰胺键。

在一个方面，本发明的氨基羧酸金属螯合剂具有羧基能够与水溶性壳聚糖中的氨基形成酰胺键。此外，所述螯合剂通常是含有一个或多个氨基(例如1-4个氨基，通常是叔氨基)的多元羧酸(例如1-6元羧酸)，其中氨基和羧基能够与金属原子/离子形成配位键。此外，所述螯合剂可具有6-18个碳原子，例如6、10、14、16或18个碳原子，并且任选具有羟基和氧基。在一个方面，氨基羧酸金属螯合剂能够螯合的金属原子或离子包括钙、镁、铁、铜、锌等，优选钙。氨基羧酸金属螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、氨基三乙酸(又称次氮基三乙酸，NTA)、二羟乙基甘氨酸(DEG)，乙二醇双四乙酸(EGTA)、乙二胺二乙酸(EDDHA)、三乙四胺六乙酸(TTHA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA),1,4,8,11-四氮杂环十二烷四乙酸(TETA)，优选乙二胺四乙酸。在一方面，所述氨基羧酸金属螯合剂可包括上述多元羧酸或其盐的形式，例如钠盐或钾盐。

在一个方面，本发明涉及一种牙科脱矿材料，优选牙本质胶原纤维脱矿材料。在该方面中，所述牙科脱矿材料由上述水溶性壳聚糖与上述氨基羧酸金属螯合剂通过缀合反应制成。在该方面中，所述缀合反应在交联剂的存在下进行。在所述反应中,相对于反应物的总质量，水溶性壳聚糖的质量份可为0.05至20、优选0.1至15、0.2至10、0.5至8、例如0.8、0.9、1、1.2、1.5、2、3、4或5。在所述反应中,相对于反应物的总质量，氨基羧酸金属螯合剂的质量份可为1至60、优选5至50、10至40、例如15、20、25、30、35或45。在所述反应中,相对于反应物的总质量，交联剂的质量份可为0.1至15、优选0.2至10、0.5至5、例如0.6、0.8、1、1.5、2、2.5、3或3.5。

优选地，本发明提供的材料由0.5-1质量份水溶性壳聚糖、10-30质量份氨基羧酸金属螯合剂和0.8-1.5质量份交联剂制备而成。

本发明提供的材料由0.5-1质量份水溶性壳聚糖、10-30质量份EDTA和0.8-1.5质量份交联剂制备而成。通过交联剂的作用水溶性壳聚糖与EDTA发生共价结合反应。

在上述缀合反应或共价结合反应中，水溶性壳聚糖的游离胺基与氨基羧酸金属螯合剂的游离羧基之间形成酰胺键。

优选的，本发明材料的pH为中性或碱性。

优选的，本发明水溶性壳聚糖选自乙二醇脱乙酰壳聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖硫酸酯、壳聚糖寡糖和类透明质酸壳聚糖中的一种或两种以上的混合物。

优选的，本发明交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、双亚胺酸酯和马来酰亚胺中的一种或两种以上的混合物。

在一方面，与缀合反应或共价结合反应前的水溶性壳聚糖相比，本发明缀合物或材料的游离胺基含量为小于20％、优选0％至15％、例如0.5％至10％，例如1％至5％，例如约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％或约4.5％。

在一方面，本发明缀合物和材料的Mn为大于40kDa、优选大于50kDa、例如60kDa至600kDa、80kDa至500kDa、100kDa至400kDa、120kDa至300kDa、150kDa至200kDa，例如约130kDa、约140kDa、约160kDa、约170kDa、约180kDa或约190kDa。

在一方面，本发明缀合物和材料的Mw为大于80kDa、优选大于100kDa、例如200kDa至800kDa，例如300kDa至700kDa，例如约250kDa、约350kDa、约400kDa、约450kDa、约500kDa、约550kDa、约600kDa或约650kDa。

在一方面，本发明缀合物和材料的Mp为大于60kDa、优选大于70kDa、例如80kDa至600kDa，例如100kDa至500kDa，例如约150kDa、约200kDa、约250kDa、约300kDa、约350kDa、约400kDa或约450kDa。

在一个方面，本发明缀合物和材料的多分散性指数PDI为1至5，优选2-4，例如约1.5、约2.5、约3、约3.5或约4.5。

在一个方面，本发明的缀合物或者材料的pH值为中性或碱性，例如pH7-10，例如7.5、8、8.5、9或9.5。

在一个方面，本发明涉及乙二醇脱乙酰壳聚糖与乙二胺四乙酸的缀合物或者由它们制成的牙科脱矿材料。在一个方面，所述缀合物和材料可由以下结构式表示：

本领域技术人员理解，具有式III的缀合物还可包含含有游离氨基的单体(即葡糖胺单体)，所述游离氨基未与EDTA的羧基形成酰胺键。此外，本领域技术人员理解，在所述缀合物中，含乙酰胺基的单体(即乙酰葡糖胺单体)、含EDTA酰胺基的单体(即EDTA酰化葡糖胺单体)和任选的含游离氨基的单体(即葡糖胺单体)在式III中通常是随机分布,包括单体的位置和相同单体的连续数目可以是随机的。在所述缀合物或材料或式III中，含EDTA酰胺基的单体(任选连同含游离氨基的单体)与含乙酰胺基的单体之间的比例是可变的，取决于所用的乙二醇脱乙酰壳聚糖的脱乙酰程度，所述脱乙酰程度如上文关于式I或式II所定义。所述缀合物或材料中，与缀合反应或共价结合反应前的乙二醇脱乙酰壳聚糖相比，本发明缀合物或材料的游离胺基含量为小于20％、优选0％至15％、例如0.5％至10％，例如1％至5％，例如约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％或约4.5％。在一个方面，n为大于100，例如大于150，优选大于200，大于250，大于300，大于350，大于400，大于450，大于500，大于600，大于800或大于1000。在另一方面，n为小于10000，优选小于8000，小于7000，小于6000，小于5000，小于4000，小于3500，小于3000，小于2500，小于2000或小于1500。

在一个方面，本发明涉及一种牙科脱矿组合物，其包含本发明的缀合物或材料，和口腔应用上可接受的辅料或溶媒。在所述组合物中，基于组合物重量计算，所述缀合物或材料的含量为0.05％至50％重量，优选0.1％至40％重量，例如0.2％至30％重量，0.5％至20％重量，1％至10％重量，例如1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、7％、8％或9％重量。在该方面中，本发明的缀合物材料可以是粉末(例如冻干粉)、溶液剂、凝胶剂或混悬剂的形式。在牙科脱矿本发明的组合物中，口腔应用上可接受的辅料或溶媒是指所提供的浓度或量施用于口腔时对人体是安全的、且通常不干扰组合物中其他成分的活性的辅料或溶媒。在一个实例中，所述辅料包括胶凝剂、增稠剂、表面活性剂、染料、防腐剂等，如美国专利公开号US2003/0157034A1、US2011/0076646A1和US2012/0161067A1所述，其通过引用合并到本文中。在一个实例中，所述溶媒可包括水。

在一个方面，本发明涉及一种牙科粘接修复试剂盒或药盒，其包含本发明的缀合物、材料或组合物，和牙科粘接剂和/或修复剂。粘接剂和修复剂的实例包括牙科用的银合金粉；复合树脂、例如丙烯酸树脂；水门汀类等。例如，所述粘接剂可和/或修复剂为以商品名Adper^TM Single Bond 2或者Filtek^TM Z250售卖的那些。

在一个方面，本发明涉及一种牙科粘接修复方法，所述方法包括(a)将有效量的本发明的缀合物、材料或组合物施用于需要修复的牙齿表面，任选去除所述缀合物、材料或组合物，和将牙科粘接剂和/或修复剂施用于需要修复的牙齿表面。

在一个方面，本发明涉及制备本发明缀合物、材料或组合物的方法，所述方法包括：在交联剂的存在下，将水溶性壳聚糖与氨基羧酸金属螯合剂混合从而获得水溶性壳聚糖与氨基羧酸金属螯合剂的缀合物。优选地，将0.5-1质量份水溶性壳聚糖、10-30质量份氨基羧酸金属螯合剂和0.8-1.5质量份交联剂制备而成。

本发明同时还提供了一种牙本质胶原纤维脱矿材料的制备方法。

本发明所提供的方法包括：

将水溶性壳聚糖水溶液与EDTA水溶液混合，将交联剂溶解于混合溶解中，室温下反应。在交联剂的作用水溶性壳聚糖与EDTA发生共价结合反应。在所述反应中,相对于反应物的总质量，水溶性壳聚糖的质量份可为0.05至20、优选0.1至15、0.2至10、0.5至8、例如0.8、0.9、1、1.2、1.5、2、3、4或5。在所述反应中,相对于反应物的总质量，氨基羧酸金属螯合剂的质量份可为1至60、优选5至50、10至40、例如15、20、25、30、35或45。在所述反应中,相对于反应物的总质量，交联剂的质量份可为0.1至15、优选0.2至10、0.5至5、例如0.6、0.8、1、1.5、2、2.5、3或3.5。

优选的，本发明的制备方法中调节混合液的pH为中性或碱性，例如pH7-10，例如7.5、8、8.5、9或9.5。

优选的，本发明的方法包括：

将浓度为5～10mg/mL的水溶性壳聚糖水溶液与浓度为100～300mg/mL的EDTA水溶液等体积混合，调节混合溶液PH＝6.0后，加入8～15mg的交联剂室温12-16小时，通过合适条件的透析去除未反应残留物后冷冻干燥获得牙本质胶原纤维脱矿材料。

本发明牙本质胶原纤维脱矿材料可用于制备牙科粘接修复中的牙本质脱矿处理，用于制备牙科粘接修复系统。

本发明具有以下效果：

本发明通过共价交联的方式将氨基羧酸金属螯合剂(例如EDTA)分子结构中的大多数供体原子结合到优化的水溶性壳聚糖类物质骨架上，制备出一种新型的钙离子螯合剂，使其综合发挥壳聚糖的天然大分子特性和EDTA优异的钙离子螯合能力，在应用于龋损区域矿化牙本质表面时能够发挥多重优势：

第一，共价结合了氨基羧酸金属螯合剂(例如EDTA)的水溶性壳聚糖钙离子螯合能力显著增强，能够快速与牙本质胶原纤维外的矿物质发生反应，在临床治疗可接受的时间范围内(30秒或更短)完成脱矿；

第二，天然牙本质胶原自身具有选择渗透性，分子量大于40kDa的物质会被完全排斥在胶原分子外，分子量小于6kDa的物质可以自由通过胶原纤维内的空间，介于二者之间的物质可以部分进入胶原纤维内部。由于水溶性壳聚糖分子量较大(82kDa)，致使螯合剂无法进入纤维内部，从而达到选择性地从粘接界面的牙本质胶原中去除纤维外矿物质，保留纤维内矿物质，从而维持牙本质胶原的网状结构，促进树脂粘接剂的渗透；

第三，水溶性壳聚糖类物质富含大量聚阳离子结构，对继发龋和活跃的根面龋中的浮游微生物和细菌性生物膜均能产生显著的抑制作用，赋予了这种新型钙离子螯合剂兼具快速脱矿和有效抗菌的双重功能；

第四，水溶性壳聚糖极佳的生物相容性和低细胞毒性能够有效保护活髓牙牙髓干细胞的活性，避免了传统酸蚀剂对牙髓干细胞的不良刺激作用，为龋损及脱矿的牙本质再生创造了良好的先决条件；

第五，水溶性壳聚糖与氨基羧酸金属螯合剂(例如EDTA)的共价结合物呈PH中性或碱性，避免了传统酸蚀剂形成的局部酸环境，造成内源性基质蛋白酶大量活化的缺陷；同时，由于脱矿过程中螯合了大量钙离子，显著抑制了混合层牙本质胶原周围基质蛋白酶的活性，从而发挥保护胶原不发生酶解的作用；

综上，本发明可选择性地脱去牙本质胶原纤维外的矿物质，使牙本质胶原纤维维持其原本的形貌及网状结构，利于后续的树脂粘接剂渗透；同时胶原内部仍能受到矿物质保护，免于在外源性刺激下发生降解，对防治龋病和提高粘接界面稳定性，延长粘接修复体使用均有明显效果。

附图说明

图1为EDTA,乙二醇脱乙酰壳聚糖和乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA的红外光谱图。

图2为电感耦合等离子体原子发射光谱法测量矿化牙本质中，不同浓度的乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA钙离子螯合剂(50、25和10mg/mL)螯合Ca²⁺的速度，以0.1M EDTA为对照。

图3(A)为不同的牙本质脱矿剂——32％磷酸(PA),0.1M EDTA,或25mg/mL乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA(GCE)，在湿粘接或干粘接模式下,粘接剂对牙本质的微拉伸强度的比较。

图3(B)为矿化牙本质经不同的牙本质脱矿剂——0.1M EDTA或25mg/mL乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA处理后的透射电子显微镜影像。

图4为对比不同浓度的EDTA和乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA(GCE)对人重组内源性基质金属蛋白酶-9(rHMMP-9)活性的抑制作用，以32％磷酸(PA)为对照；图4(A)为EDTA和乙二醇壳聚糖-EDTA对人重组内源性基质金属蛋白酶-9活性的抑制程度相似；图4(B)比较了各组牙本质混合层中牙本质胶原的降解程度。

图5为不同的牙本质脱矿剂——32％磷酸(PA),0.1M EDTA,或25mg/mL乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA(GCE)的细胞毒性检测。以PBS为对照；图5(A)为人牙髓干细胞暴露于不同的牙本质脱矿剂环境之后细胞线粒体脱氢酶活性检测；图5(B)为人牙髓干细胞暴露于不同的牙本质脱矿剂环境之后细胞内DNA含量的检测。

具体实施方式

本发明综合发挥了水溶性壳聚糖天然大分子优势和EDTA高效的钙离子螯合作用，方法包括将水溶性壳聚糖溶液与EDTA水溶液等体积混合，加入共价交联剂，使二者在交联剂作用下发生共价结合。

以下是发明人提供的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。

实施例1：

该实施例的材料是采用合适浓度的乙二醇脱乙酰壳聚糖(聚合度≥400,MilliporeSigma,St.Louis,MO,USA)水溶液与EDTA水溶液混合后，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺交联剂于室温下持续搅拌14小时后，采用合适的透析条件去除未发生反应的残留物。其中乙二醇脱乙酰壳聚糖总量为10g、EDTA 300g、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺交联剂15g。

例如，一种优选的透析条件是将上述反应液置于截留分子量为12-14kDa并含有0.05M NaOH的透析膜中透析以去除分子量较小的反应物，再次用截留分子量为12-14kDa并含有双蒸水的透析膜透析以去除未交联的残留物。其中乙二醇脱乙酰壳聚糖总量为10mg、EDTA300mg、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺交联剂以15mg。过程中可通过调节pH值确保EDTA充分快速溶解，例如pH调节为8.0。

优选的的方案中，在制备时可通过调节混合液的PH值为中性或碱性，来制备PH值为中性或碱性脱矿材料。

实施例2：

该实施例与实施例1不同的是：

(1)将乙二醇脱乙酰壳聚糖溶于去离子水中形成浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液；

(2)将EDTA溶解于去离子水中形成浓度为300mg/mL的EDTA水溶液；

(3)将上述两种溶液等体积混合，调节混合液的PH＝6.0；

(4)将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺交联剂以15mg/mL的浓度溶解于上述混合液中，使EDTA分子链上的羧基功能团与可溶性壳聚糖骨架上的胺基功能团共价结合，并于室温下持续搅拌14小时；

(5)将上述反应液置于截留分子量为12-14kDa并含有0.05M NaOH的透析膜中透析以去除分子量较小的反应物，再次用截留分子量为12-14kDa并含有双蒸水的透析膜透析以去除未交联的残留物，并置于-20℃冻干保存。即制得水溶性壳聚糖交联EDTA钙离子螯合剂材料。

按照实施例2所述，本发明所构建水溶性壳聚糖交联EDTA钙离子螯合剂材料具有以下特点：

如图1所示EDTA,乙二醇脱乙酰壳聚糖和乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA的红外光谱图。红外吸收峰的位置与强度反映了EDTA,乙二醇脱乙酰壳聚糖和乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA结构组成或化学基团的特点。乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA在1300-1400cm^-1波长处检测到EDTA特征性的吸收峰峰(C＝O拉伸振动)，表明EDTA与乙二醇脱乙酰壳聚糖发生了化学结合。

如图2所示电感耦合等离子体原子发射光谱法测量矿化牙本质中，不同浓度的乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA钙离子螯合剂(50、25和10mg/mL)螯合Ca2+的速度，以0.1MEDTA为对照。结果表明0.1M EDTA具有最强的脱矿效果，乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA的脱矿能力随着浓度增加而增强。

如图3所示，不同的牙本质脱矿剂——，不同的磷酸(PA),0.1M EDTA,或25mg/mL乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA(GCE)处理牙本质表面后对粘接强度的影响。对于湿粘接而言,在粘接前使用无绒纸从牙本质表面去除多余的水从而使经过处理的样品保持湿润。对于干粘接而言，用不含油和水分的空气将经过处理的牙本质风干5秒。用以下方法测定牙本质粘接强度：在用各种脱矿试剂处理后，用去离子水清洗，之后使用Adper Single Bond 2(3M,ESPE；St Paul,MN,USA)粘接每个牙齿片段。在粘接后，使用增量的光固化使4mm厚的复合树脂(Z250,3M ESPE)置于覆盖了粘接剂的牙本质表面。将粘接的牙齿在水中于37℃储存24h。随后将每个样品切成0.9mm x 0.9mm x 7mm的长条，每个长条在中间具有树脂-牙本质界面。每个长条用氰基丙烯酸酯胶水(Zapit；Dental Ventures of America,Corona,CA,USA)连接到测试工具并在通用测试机器(Vitrodyne V1000；Liveco Inc.,Burlington,VT,USA)”中以1mm/min的十字头速度对其施用拉伸力直到断裂。记录在断裂时的拉伸负荷并除以所测定的每一束的横截面积以获得拉伸粘接强度。用每个牙齿的4束长条获得的平均粘接强度来表示每个特定牙齿的拉伸粘接强度。使用牙齿作为统计单元(n＝10个牙齿)进行随后的数据分析。图3(A)为在湿粘接或干粘接模式下,32％磷酸处理15秒,0.1M EDTA 60秒,或25mg/mL乙二醇壳聚糖-EDTA 30秒，粘接剂对牙本质的微拉伸强度的比较。以磷酸-湿粘接为对照组进行统计分析，结果表明在干粘接模式下32％磷酸和0.1M EDTA组检测到粘结强度明显降低(p<0.05)。25mg/mL乙二醇壳聚糖-EDTA组对牙本质湿粘结或干结合所获得的粘结强度与对照组没有显著差异。图3(B)为矿化牙本质经0.1M EDTA处理60秒，或经25mg/mL乙二醇壳聚糖-EDTA处理30秒的透射电子显微镜影像。EDTA组表现为部分区域完全脱矿、还有一些区域部分脱矿。乙二醇壳聚糖-EDTA组则呈现出牙本质部分脱矿，可见明显的无矿物质存在的纤维外空间，而纤维内矿化仍然完整。

如图4所示，对比不同浓度的EDTA和乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA(GCE)对人重组内源性基质金属蛋白酶-9(rHMMP-9)活性的抑制作用，以32％磷酸(PA)为对照。在该实验中，使用纯化的重组人MMP-9(rhMMP-9)和通用的MMP测定试剂盒(Sensolyte,AnaSpecInc.,Fremont,CA,USA)评价GCE对于可溶性MMP-9的抑制效果。MMP试剂盒含有完整的thiopeptolide，其被特异性的MMP切割从而释放巯基，所述巯基可以通过Ellman’s试剂产生显色的2-硝基-5-巯基苯甲酸。使用EDTA和GCE溶液的系列稀释液(50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、1mg/mL)作为测试试剂，并且32％的H₃PO₄作为比较。以1:50的体积比用测定缓冲液将thiopeptolide底物溶液稀释至0.2mM。在测试化合物组中，每孔含有2含有的rhMMP-9(19.6ng/孔)，10，6的潜在MMP抑制剂和50剂6的thiopeptolide底物溶液。加入额外的测定缓冲剂以产生100缓冲剂孔。对照组包括(1)仅含有rhMMP-9酶而不含潜在抗MMP剂的阳性对照；(2)含有rhMMP-9酶和10ML的GM6001(一种已知的MMP抑制剂)的抑制剂对照；(3)含有测定缓冲液和不同浓度测试溶液的测试化合物对照；(4)含有测定缓冲液的底物对照。在37℃下孵育60分钟后获得读数。使用96-孔板读数器(VICTOR Nivo^TM,PerkinElmer)在412nm下测定吸光度。背景吸光度由“底物对照”测定并从含有thiopeptolide底物的其他孔的读数中减除。GM6001、试剂盒所含的MMP抑制剂和三种浓度的EDTA或GCE的功效表示为“阳性对照”的调整吸光度的百分比。MMP的抑制(％)计算为1-([A]_{测试化合物组}-[A]_{测试化合物对照})/([A]_阳性对照-[A]_底物对照)，其中[A]表示各孔的吸光度值。对于每个测试溶液，由6个孔的值计算平均吸光度值。图4(A)结果表明，EDTA和乙二醇壳聚糖-EDTA对人重组内源性基质金属蛋白酶-9活性的抑制程度相似。图4(B)比较了各组牙本质混合层中牙本质胶原的降解程度。结果显示，32％磷酸组胶原降解率最高，EDTA次之，乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA最弱，表明乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA组对牙本质胶原的保护效果最佳。

如图5所示，不同的牙本质脱矿剂——，不同的磷酸(PA),0.1M EDTA,或25mg/mL乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA(GCE)的细胞毒性检测。以PBS为对照。结果显示，乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA组细胞活力最高，EDTA组次之，32％磷酸组最低，说明三种牙本质脱矿剂中乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA的细胞毒性最低。

表1为凝胶渗透色谱法对乙二醇脱乙酰壳聚糖和乙二醇脱乙酰壳聚糖交联EDTA的分子量表征，以及乙二醇脱乙酰壳聚糖和EDTA之间的交联程度表征。结果表明,交联后形成的乙二醇脱乙酰壳聚糖-EDTA分子量显著升高，同时游离胺基量显著降低，说明乙二醇脱乙酰壳聚糖骨架上几乎所有的胺基都与EDTA分子上的羧基发生了反应，共价结合形成酰胺键。

表1

缩写：Mn:数字平均分子量；Mw:加权平均分子量；Mp:分子量峰值；PDI:多分散性指数(mw/mn)

实施例3：

该实施例与实施例2不同之处在于：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中形成浓度为7mg/mL的壳聚糖溶液。

(2)将EDTA溶解于去离子水中形成浓度为200mg/mL的EDTA水溶液，将EDTA水溶液与羧甲基壳聚糖溶液等体积混合，调节混合液的PH＝6.0；将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺交联剂以13mg/mL的浓度溶解于上述混合液中，并于室温下持续搅拌12小时。

实施例4：

该实施例与实施例2不同之处在于：

(1)将类透明质酸壳聚糖溶于去离子水中形成浓度为8mg/mL的壳聚糖溶液。

(2)将EDTA溶解于去离子水中形成浓度为250mg/mL的EDTA水溶液。将EDTA水溶液与类透明质酸壳聚糖溶液等体积混合，将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺交联剂以12mg/mL的浓度溶解于上述混合液中，并于室温下持续搅拌13小时。

实施例5：

该实施例与实施例2不同之处在于：

(1)将乙二醇脱乙酰壳聚糖溶于去离子水中形成浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液。

(2)将EDTA溶解于去离子水中形成浓度为100mg/mL的EDTA水溶液。将EDTA水溶液与乙二醇脱乙酰壳聚糖溶液等体积混合，调节混合液的PH＝6.0。将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺交联剂以8mg/mL的浓度溶解于上述混合液中，并于室温下持续搅拌15小时。

实施例6：

该实施例与实施例2不同之处在于：

(1)将乙二醇脱乙酰壳聚糖溶于去离子水中形成浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液。将EDTA溶解于去离子水中形成浓度为300mg/mL的EDTA水溶液，将EDTA水溶液与乙二醇脱乙酰壳聚糖溶液等体积混合。

(2)将戊二醛交联剂以0.8mg/mL的浓度溶解于上述混合液中，并于室温下持续搅拌14小时。

实施例7：

该实施例与实施例2不同之处在于：

(1)将乙二醇脱乙酰壳聚糖溶于去离子水中形成浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液。

(2)将EDTA溶解于去离子水中形成浓度为100mg/mL的EDTA水溶液，将EDTA水溶液与乙二醇脱乙酰壳聚糖溶液等体积混合，将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺交联剂以15mg/mL的浓度溶解于上述混合液中，并于室温下持续搅拌14小时。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。

Claims

1.一种水溶性壳聚糖与氨基羧酸金属螯合剂的缀合物，其用于牙科脱矿，优选牙本质脱矿的用途。

2.权利要求1的缀合物，其特征在于，所述氨基羧酸金属螯合剂选自乙二胺四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、氨基三乙酸、二羟乙基甘氨酸，乙二醇双四乙酸、乙二胺二乙酸、三乙四胺六乙酸、环己烷二胺四乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、1,4,8,11-四氮杂环十二烷四乙酸中的一种或两种以上的混合物，优选乙二胺四乙酸。

3.一种牙本质胶原纤维脱矿材料，其特征在于，所述材料由0.5-1质量份水溶性壳聚糖、10-30质量份乙二胺四乙酸和0.8-1.5质量份交联剂为原料制备而成。

4.前述权利要求中任一项的缀合物或者牙本质胶原纤维脱矿材料，其特征在于，所述缀合物或牙本质胶原纤维脱矿材料的pH值为中性或碱性。

5.前述权利要求中任一项的缀合物或者牙本质胶原纤维脱矿材料，其特征在于，所述水溶性壳聚糖选自乙二醇脱乙酰壳聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖硫酸酯、壳聚糖寡糖和类透明质酸壳聚糖中的一种或两种以上的混合物，优选乙二醇脱乙酰壳聚糖。

6.前述权利要求中任一项的缀合物或者牙本质胶原纤维脱矿材料，其特征在于，与缀合反应前的水溶性壳聚糖相比，所述缀合物或材料的游离胺基含量为小于15％、优选1％至10％，更优选3％至5％。

7.前述权利要求中任一项的缀合物或者牙本质胶原纤维脱矿材料，其特征在于，所述缀合物和材料的Mn为大于40kDa、优选60kDa至300kDa，更优选100kDa至200kDa。

8.前述权利要求中任一项的缀合物或者牙本质胶原纤维脱矿材料，其特征在于，所述缀合物或材料的Mw为大于100kDa、优选200kDa至800kDa，更优选400kDa至600kDa。

9.权利要求3-8中任一项的牙本质胶原纤维脱矿材料，其特征在于，所述交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、双亚胺酸酯和马来酰亚胺中的一种或两种以上的混合物。

10.一种牙科脱矿组合物，其包含

前述权利要求中任一项的缀合物或材料，和

口腔应用上可接受的辅料或溶媒。

11.一种牙科粘接修复试剂盒或药盒，其包含

(a)前述权利要求中任一项的缀合物、材料或组合物，和

(b)牙科粘接剂和/或修复剂。

12.一种牙科粘接修复方法，所述方法包括：

(a)将有效量的权利要求1-10中任一项的缀合物、材料或组合物施用于需要修复的牙齿表面，

(b)任选去除所述缀合物、材料或组合物，和

(c)将牙科粘接剂和/或修复剂施用于需要修复的牙齿表面。

13.一种制备权利要求1-10中任一项的缀合物、材料或组合物的方法，其特征在于，方法包括：

在交联剂的存在下，将水溶性壳聚糖与氨基羧酸金属螯合剂混合从而获得水溶性壳聚糖与氨基羧酸金属螯合剂的缀合物。

14.权利要求13的方法，其特征在于，所述方法包括：

将水溶性壳聚糖水溶液与EDTA水溶液混合，将交联剂溶解于混合溶液中室温下反应制备而成，其中水溶性壳聚糖为0.5-1质量份、EDTA为10-30质量份、交联剂为0.8-1.5质量份。

15.权利要求14的方法，其特征在于，方法包括：

将浓度为5～10mg/mL的水溶性壳聚糖水溶液与浓度为100～300mg/mL的EDTA水溶液等体积混合，调节混合溶液PH＝6.0后，以浓度为8～15mg/mL的量加入交联剂，室温反应12-16小时后，采用透析方法去除未反应残留物后再经冷冻干燥，获得牙本质胶原纤维脱矿材料。

16.权利要求1-10中任一项的缀合物、材料或组合物用于制备牙科粘接修复系统的应用。