CN110317738A - 一种利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，涉及一种生物降解聚乙烯的方法。本发明是要解决目前由于大量使用的聚乙烯制品分子量较大，稳定性较好，表面的疏水性较强、表面的能量过低等原因导致其在自然环境中的降解速度非常缓慢而造成环境污染的问题。方法：一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化；二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯。本发明方法成本低廉，操作简单；本发明的季也蒙毕赤酵母可生物降解聚乙烯，其60天的降解率高达13.97％。本发明生物降解聚乙烯的方法能够用于处理塑料污染等领域，为解决塑料白色污染问题提供新的思路。

Description

一种利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法
技术领域
本发明涉及一种生物降解聚乙烯的方法。
背景技术
聚乙烯是日常生活中应用最广泛的高分子合成材料之一，其手感似蜡，无臭无毒，稳定性较好，除氧化性酸以外，能够耐受绝大多数强酸强碱的侵蚀，常温下不溶于一般溶剂，吸水性小，具有优良的电绝缘性能和耐低温性能。据调查显示，72％的聚乙烯塑料制品集中在包装、日用和农用上，但这类塑料制品多为一次性制品，其使用周期较短，使用后便成废弃物。废弃的塑料物一般很少被回收，例如大量的农用聚乙烯塑料薄膜使用后一般堆积和散落在田地，由于田地中塑料薄膜的不完全分解，导致塑料碎片和塑料微颗粒的大量积累在土壤中长达数十年，累积的残膜碎片不仅会影响土壤环境，还可能进入食物链。在中国，长期使用塑料薄膜覆盖物导致估计在表土(0-20厘米)中积累50-260kg/hm2的残余塑料，这些累积的塑料碎片和颗粒会降低土壤孔隙度，导致土壤空气循环减少，增加土壤水分排斥，减少土壤渗透和吸水从而影响土壤生态系统，除此之外塑料碎片或颗粒还可以吸附农业系统中使用的化学药品，进而作为有毒化学物质的载体，提供了污染土壤环境的通道。
长期以来，世界各国都在致力于对聚乙烯类塑料废品处理方式的研发，从传统的填埋、焚烧、回收再利用到如今利用光、热、水、气和微生物降解以及几个因素综合利用等这类环保处理方式，目前已取得一定成效，缓解了塑料制品对环境的污染。同时为了更好地配合光/生物降解，以聚乙烯塑料为母料的各类掺混型和结构型可降解聚乙烯塑料制品被开发了出来，如将淀粉、壳聚糖和甲壳素等微生物可利用的糖类物质与氯化聚乙烯填充或共混。但这类制品最终剩余的物质仍是氯化聚乙烯，并没有达到完全降解氯化聚乙烯的效果，因此，这类废弃物长时间的累积就成为严重的“白色污染”问题的主要原因之一，寻求绿色环保的降解方法仍然迫在眉睫。本发明提供了一种季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，目前利用该菌株处理聚乙烯的方法尚未见到。
发明内容
本发明是要解决目前采用传统填埋、焚烧等方法处理聚乙烯造成环境污染的问题，提供一种利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法。
本发明利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，按以下步骤进行：
一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化：刮取保存在4℃的YPD斜面培养基上的季也蒙毕赤酵母接种到YPD固体培养基上，于30℃下培养24～48h，得活化的菌株；
二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯：用接种针刮取活化的菌株，接种到80mLPDA液体培养基中，于30℃、150rpm恒温振荡培养24～48h后，9000rpm离心收集菌体，用无菌生理盐水清洗3次所收集的菌体，制备菌悬浮液，将经预处理(紫外照射2h)的氯化聚乙烯片(200mg)和季也蒙酵母菌悬浮液(10mL)加入到具有90mL无碳培养基(LCFBM)的500mL锥形瓶中，最终的季也蒙酵母菌浓度为约108个细胞/mL，30℃下，120rpm培养60天。60天后检测氯化聚乙烯的失重率，表面形貌，表面疏水性及降解产物的产生。
本发明利用活化的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)菌体来生物降解聚乙烯，是要解决目前由于大量使用的聚乙烯制品分子量较大，稳定性较好，表面的疏水性较强、表面的能量过低等原因导致其在自然环境中的降解速度非常缓慢而造成环境污染的问题。本发明方法成本低廉，操作简单；本发明的季也蒙毕赤酵母可生物降解聚乙烯，其60天的降解率高达13.9％。本发明生物降解聚乙烯的方法能够用于处理塑料污染等领域，为解决塑料白色污染问题提供新的思路。
附图说明
图1为实施例1中经季也蒙酵母菌生物降解60天的聚乙烯的扫描电镜图；图2为实施例1中未经任何处理的聚乙烯的扫描电镜图；图3为实施例1中经季也蒙酵母菌生物降解60天的聚乙烯的接触角图；图4为未经任何处理的聚乙烯的接触角图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，按以下步骤进行：
一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化：刮取保存在4℃YPD斜面培养基上的季也蒙毕赤酵母接种到YPD固体培养基上，于30℃下培养24～48小时，得活化的菌株；
二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯：用接种针刮取活化的菌株，接种到80mL YPD液体培养基中，于30℃、150rpm恒温振荡培养24～48小时后，9000rpm离心收集菌体，用无菌生理盐水清洗3次所收集的菌体，制备菌悬浮液，将经紫外照射2小时的氯化聚乙烯片(200mg)和季也蒙毕赤酵母菌悬浮液(10mL)加入到具有90mL无碳培养基(LCFBM)的500mL锥形瓶中，最终的菌浓度为约108个细胞/mL，30℃下，120rpm培养60天。60天后检测聚乙烯的失重率，表面形貌，表面疏水性及降解产物的产生。
步骤一中所述YPD斜面培养基为由YPD固体培养基制成的斜面培养基。
酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)：胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，(固体YPD培养基加琼脂15～20g，融化)，补蒸馏水至1000ml，115℃高压灭菌20min。
无碳培养基(LCFBM)：称取0.7g KH2PO4，0.7g K2HPO4，0.7g MgSO4·7H2O，1.0gNH4NO3，0.005g NaCl，0.002g FeSO4·7H2O，0.002g ZnSO4·7H2O和0.001g MnSO4·H2O，补蒸馏水至1000ml(无碳固体培养基需加琼脂15～20g)，121℃高压灭菌15min。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中季也蒙毕赤酵母Meyerozymaguilliermondii ZJC-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为2018年12月17日，保藏编号为CGMCC No：16956。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中于30℃下培养36小时。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中于30℃、150rpm恒温振荡培养36小时。其它与具体实施方式一至三之一相同。
实施例1：
本实施例利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，按以下步骤进行：
一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化：刮取保存在4℃YPD斜面培养基上的季也蒙毕赤酵母接种到YPD固体培养基上，于30℃下培养24～48小时，得活化的菌株；
二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯：用接种针刮取活化的菌株，接种到80mLPDA液体培养基中，于30℃、150rpm恒温振荡培养24～48小时后，9000rpm离心收集菌体，用无菌生理盐水清洗3次所收集的菌体，制备菌悬浮液，将经紫外照射2小时的聚乙烯片(200mg)和季也蒙酵母菌悬浮液(10mL)加入到具有90mL无碳培养基(LCFBM)的500mL锥形瓶中，最终的季也蒙酵母菌浓度为约108个细胞/mL，30℃下，120rpm培养60天。60天后检测氯化聚乙烯的失重率，表面形貌，表面疏水性及降解产物的产生。
季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii ZJC-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为2018年12月17日，保藏编号为CGMCC No：16956。
(1)进行扫描电镜法分析
将本实施例中经季也蒙毕赤酵母生物作用的聚乙烯的生物膜去除，首先在2％SDS中浸泡4小时，然后在2％的戊二醛中浸泡2h，用50％的乙醇超声波清洗两次，每次30分钟，接着放在75％的乙醇中过夜，用100％的无水乙醇清洗3次，每次30分钟，之后用无菌蒸馏水清洗，最后将聚乙烯膜片放在真空干燥机中干燥。通过扫描电镜表征聚乙烯的表面形貌变化。如图1所示，可观察到经季也蒙酵母菌生物降解60天的聚乙烯的表面有凹坑和孔洞的形成，图2为未经任何处理的聚乙烯，其表面保持光滑，无任何瑕疵，这表明季也蒙酵母的接种对聚乙烯材料有降解作用。
(2)进行接触角测量分析
将本实施例中经季也蒙毕赤酵母生物作用的聚乙烯的生物膜去除，首先在2％SDS中浸泡4小时，然后在2％的戊二醛中浸泡2小时，用50％的乙醇超声波清洗两次，每次30分钟，接着放在75％的乙醇中过夜，用100％的无水乙醇清洗3次，每次30分钟，之后用无菌蒸馏水清洗，最后将聚乙烯膜片放在真空干燥机中干燥。通过接触角测量装置测量聚乙烯片表面疏水性的变化。如图3为经季也蒙酵母菌生物降解60天的聚乙烯材料的接触角，图4为未经任何处理的氯化聚乙烯材料的接触角，其结果表明，经季也蒙生物降解60天后的聚乙烯的接触角变小，疏水性减小，可初步说明聚乙烯表面被菌株Meyerozyma guilliermondiiZJC-1氧化产生亲水基团。
(3)进行聚乙烯失重率的检测分析
将本实施例中经季也蒙毕赤酵母生物作用的聚乙烯的生物膜去除，首先在2％SDS中浸泡4小时，然后在2％的戊二醛中浸泡2小时，用50％的乙醇超声波清洗两次，每次30分钟，接着放在75％的乙醇中过夜，用100％的无水乙醇清洗3次，每次30分钟，之后用无菌蒸馏水清洗，最后将聚乙烯膜片放在真空干燥机中干燥。膜片处理结束后观察聚乙烯膜片有无损耗，进行称重，计算失重率。如表1所示，可看出聚乙烯材料经过季也蒙酵母的作用60天后其重量损失达13.97％，表明Meyerozyma guilliermondii ZJC-1可降解聚乙烯。
表1
(4)降解聚乙烯产物的气质联用分析
将本实施例中的液体培养物在60天后收集降解产物，以10,000rpm离心15min收集上清液，将上清液通过0.22μm膜过滤器过滤后使用乙酸乙酯萃取可溶产物，将肉眼可见的不可溶的降解物质分离提纯，去除杂质后使用乙酸乙酯在70℃加热溶解，然后使用气质联用仪对降解产物进行分析检测。
气质联用分析中的气相色谱仪和质谱仪分别为Agilent7890A、Agilent7000B。分析检测的载气为氦气，，色谱柱为HP-5MS，尺寸30mx250μmx0.25μm，初始柱温45℃，升温速度为3℃/min，在200℃保持5min，进样口温度220℃，传输线温度280℃，离子源温度230℃，四级杆温度为150℃，离子源为EI源，扫描模式质量范围为45amu～550amu。35℃，根据气质联用仪分析测定中SCAN模式全扫描的谱图结果，将所述谱图中的每个特征峰和标准谱图库进行比对，可确认每个特征峰对应的物质，如表2和表3所示，表2为可溶性产物，表3为不可溶产物。
表2
表3

Claims (5)

1.一种利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化：刮取保存在4℃ YPD斜面培养基上的季也蒙毕赤酵母接种到固体培养基上，于30℃下培养24～48h，得到活化的菌株；
二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯：用接种针刮取活化的菌株，接种到80mL PDA液体培养基中，于30℃、150rpm恒温振荡培养24～48h后，9000rpm离心收集菌体，用无菌生理盐水清洗3次所收集的菌体，制备菌悬浮液，将经预处理(紫外照射2h)的PE片(200mg)和酵母菌悬浮液(10mL)加入到具有90mL无碳培养基(LCFBM)的500mL锥形瓶中，最终的酵母菌浓度为约108个细胞/mL，30℃下，120rpm培养60d。60天后检测聚乙烯的失重率，表面形貌，表面疏水性及降解产物的产生。
2.根据权利要求1所述的一种利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，其特征在于步骤一中季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii ZJC-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为2018年12月17日，保藏编号为CGMCC No：16956。
3.根据权利要求1所述的一种利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，其特征在于步骤一中于30℃下培养24～48h。
4.根据权利要求1所述的一种利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，其特征在于步骤二中于30℃、150rpm恒温振荡培养24～48h。
5.根据权利要求1所述的一种利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯的方法，其特征在于步骤二中于30℃下，120rpm恒温振荡培养60d。
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