CN110283853A - 一株季也蒙毕赤酵母通过降解聚乙烯产生烷烃的方法 - Google Patents
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Abstract
一株季也蒙毕赤酵母通过降解聚乙烯产生烷烃的方法,涉及一种聚乙烯的微生物降解及烷烃同步合成的方法。本发明是要解决大量塑料的广泛使用却难于降解造成的严重环境污染问题并且通过生物法产生能源物质烷烃为缓解能源危机提供新的思路。方法:一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化;二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯;三、季也蒙毕赤酵母降解聚乙烯后生成烷烃及表征。本发明方法成本低廉,操作简单;本发明的季也蒙毕赤酵母可生物降解聚乙烯,同时在60天以后会产生能源物质烷烃。本发明生物降解聚乙烯并产生烷烃的方法能够用于处理塑料污染、缓解能源短缺等领域,为解决塑料白色污染及能源短缺问题提供新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体而言,本发明涉及微生物降解聚乙烯产生烷烃的方法。
背景技术
聚合物塑料的生产是全球工业发展最快的领域之一,其使用历史已有100年。合成塑料在现代生活的各个方面都发挥着不可或缺的作用。然而,大量塑料的广泛使用造成了严重的环境问题,需要对塑料废物进行适当的管理。聚烯烃,主要是高密度聚乙烯,低密度聚乙烯,线性低密度聚乙烯和聚丙烯,占城市固体废物总塑料含量的60%以上。当前,大部分的废旧聚乙烯塑料主要采用焚烧和填埋的方式进行处理,废旧塑料占垃圾填埋场总废物量的5-25wt%,其中大量塑料废物的填埋导致了管理问题和环境危害,如破坏土壤理化性质、造成土壤硬化,而焚烧会产生CO、HCl、NOx、SO2及二恶英等大量有毒气体进而污染空气,这两种处理方式均对环境造成严重的污染。目前关于利用聚乙烯转化为烷烃类的研究,大多为物理化学方法,例如Jia X等研究报道在温和条件下使用串联催化交叉烷烃复分解方法使不同分子量、不同类型的聚乙烯转化为有用的液体燃料和蜡,但鲜少有研究报道通过微生物降解PE生成烷烃,所以该菌在降解PE的同时可将其转化为晶体类的混合烷烃物质是一个很好的开始,为生物降解聚乙烯提供了新的研究方向。
本发明提供了一株季也蒙毕赤酵母通过降解聚乙烯产生烷烃的方法,目前利用该菌株降解聚乙烯并产生烷烃的方法尚未见到。
发明内容
本发明是要解决目前塑料污染以及能源物质烷烃短缺多数只能用物理化学方法合成的问题,提供一种利用季也蒙毕赤酵母降解聚乙烯产生烷烃的方法,为聚乙烯的降解及烷烃的产生提供新的研究方向。
本发明利用季也蒙毕赤酵母降解聚乙烯合成烷烃的方法,按以下步骤进行:
一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化:使用接种针刮取保存于YPD斜面培养基的季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondiiZJC-1,接种于新的YPD固体培养基中,28℃培养3-5天,进行菌株活化。
二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯:活化Meyerozyma guilliermondii ZJC-1,以聚乙烯为唯一碳源,使用无碳培养基在30℃、120r/min条件恒温振荡培养60天,60天后检测降解前后的聚乙烯的接触角、表面化学结构及其失重率。
三、季也蒙毕赤酵母降解聚乙烯后生成烷烃及表征:活化Meyerozymaguilliermondii ZJC-1,以聚乙烯为唯一碳源,使用无碳培养基在30℃、120r/min条件恒温振荡培养60天,期间观察锥形瓶底部,直到有颗粒物的产生,随后将烷烃类颗粒物取出并去除杂质,使用实体显微镜、红外光谱仪及气质联用仪对其进行表征。
本发明利用活化的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)菌体来生物降解聚乙烯同步产生烷烃的方法,是要解决大量塑料的广泛使用却难于降解造成的严重环境污染问题并且通过生物法产生能源物质烷烃为缓解能源危机提供新的思路。本发明方法成本低廉,操作简单;本发明的季也蒙毕赤酵母可生物降解聚乙烯,同时在60天以后会产生能源物质烷烃。本发明生物降解聚乙烯并产生烷烃的方法能够用于处理塑料污染、缓解能源短缺等领域,为解决塑料白色污染及能源短缺问题提供新的思路。
附图说明
图1为菌株Meyerozyma guilliermondiiZJC-1降解前后的聚乙烯表面水接触角图;图2为菌株Meyerozyma guilliermondiiZJC-1降解聚乙烯前后聚乙烯的表面化学结构的红外谱图;图3为菌株季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondiiZJC-1在60天期间降解聚乙烯前后的聚乙烯的失重率;图4为本发明Meyerozyma guilliermondiiZJC-1降解聚乙烯产生的烷烃的实体显微镜图;图5为本发明菌株Meyerozyma guilliermondiiZJC-1降解聚乙烯产生的烷烃的红外光谱图;图6为菌株Meyerozyma guilliermondiiZJC-1降解聚乙烯产生的烷烃的气质联用谱图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯产生烷烃的方法,按以下步骤进行:
一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化:使用接种针刮取保存于YPD斜面培养基的季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondiiZJC-1,接种于新的YPD固体培养基中,28℃培养24~48小时,进行菌株活化。
二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯:活化Meyerozyma guilliermondii ZJC-1,以聚乙烯为唯一碳源,使用无碳培养基在30℃、120r/min条件恒温振荡培养60天,60天后检测降解前后的聚乙烯的接触角、表面化学结构及其失重率。
三、季也蒙毕赤酵母降解聚乙烯后生成烷烃及表征:活化Meyerozymaguilliermondii ZJC-1,以聚乙烯为唯一碳源,使用无碳培养基在30℃、120r/min条件恒温振荡培养60天,期间观察锥形瓶底部,直到有颗粒物的产生,随后将烷烃类颗粒物取出并去除杂质,使用实体显微镜、红外光谱仪及气质联用仪对其进行表征。
步骤一中所述YPD斜面培养基为由YPD固体培养基制成的斜面培养基。
酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD):胰蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g,(固体YPD培养基加琼脂15~20g,融化),补蒸馏水至1000ml,115℃高压灭菌20min。
步骤二中无碳培养基(LCFBM):称取0.7g KH2PO4,0.7g K2HPO4,0.7g MgSO4·7H2O,1.0g NH4NO3,0.005g NaCl,0.002g FeSO4·7H2O,0.002g ZnSO4·7H2O和0.001g MnSO4·H2O,补蒸馏水至1000ml(无碳固体培养基需加琼脂15~20g),121℃高压灭菌15min。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤一中季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii ZJC-1筛选于蜡螟幼虫肠道液中,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号,保藏日期为2018年12月17日,保藏编号为CGMCC No:16956。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤一中于30℃下培养36小时。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:步骤二中于30℃、150rpm恒温振荡培养60天。其它与具体实施方式一至三之一相同。
实施例1:
本实施方式利用季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯产生烷烃的方法,按以下步骤进行:
一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化:使用接种针刮取保存于YPD斜面培养基的季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondiiZJC-1,接种于新的YPD固体培养基中,28℃培养3-5天,进行菌株活化。
二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯:活化Meyerozyma guilliermondii ZJC-1,以聚乙烯为唯一碳源,使用无碳培养基在30℃、120r/min条件恒温振荡培养60天,60天后检测降解前后的聚乙烯的接触角、表面化学结构及其失重率。
三、季也蒙毕赤酵母降解聚乙烯后生成烷烃及表征:活化Meyerozymaguilliermondii ZJC-1,以聚乙烯为唯一碳源,使用无碳培养基在30℃、120r/min条件恒温振荡培养60天,期间观察锥形瓶底部,直到有颗粒物的产生,随后将烷烃类颗粒物取出并去除杂质,使用实体显微镜、红外光谱仪及气质联用仪对其进行表征。
季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii ZJC-1,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号,保藏日期为2018年12月17日,保藏编号为CGMCC No:16956。
(1)接触角分析
如图1所示,菌株Meyerozyma guilliermondii ZJC-1降解后的聚乙烯接触角分为78.6±1.2°,对照聚乙烯的接触角为99.9±0.8°,降解后的聚乙烯接触角对照组,接触角的变小表示聚乙烯得疏水性变低、亲水性变高,可初步说明聚乙烯表面被菌株MeyerozymaguilliermondiiZJC-1氧化产生亲水基团。
(2)红外光谱仪检测聚乙烯表面化学结构
取菌株Meyerozyma guilliermondii ZJC-1降解60天前后的聚乙烯膜片,去除生物膜。使用FTIR对Meyerozyma guilliermondiiZJC-1降解前后的聚乙烯膜的表面化学结构进行分析检测。采用Origin 8.5对其检测数据进行拟合处理。
如图2所示,Meyerozyma guilliermondiiZJC-1降解后的聚乙烯膜在1735cm-1处有峰,而对照组则没有,1735cm-1处峰值的出现是由羰基(-C=O-)的伸缩振动引起的,羰基的出现证明聚乙烯表面的官能团被氧化。
(3)失重率分析
活化菌株Meyerozyma guilliermondii ZJC-1,将10mL菌悬浮液加入90mL LCFBM的500mL锥形瓶中,然后放入0.2g预处理的聚乙烯膜作为唯一碳源。对照组为0.2g的预处理聚乙烯片与10mL的无菌生理盐水。在10、30、50、60天的培养期间分别制备3个重复,在30℃、120r/min的恒温振荡培养箱培养。10、30、50、60天时取出实验组与对照组聚乙烯膜,去除生物膜,将去除生物膜的聚乙烯片在电热鼓风干燥箱中干燥。干燥处理结束后观察聚乙烯膜有无损耗,在精良天平称取重量,计算失重率。失重率计算公式如下:
失重率=损失重量/原始重量
如图3所示,聚乙烯在Meyerozyma guilliermondiiZJC-1降解10、30、50、60天期间的失重率分别为1.24%、3.87%、9.39%、13.97%,对照组没有明显的变化。
(4)实体显微镜下观察
在Meyerozyma guilliermondii ZJC-1降解聚乙烯的培养期间观察锥形瓶底部,直到有颗粒物的产生后,去除残余聚乙烯膜及培养液,取出颗粒物使用75%酒精浸泡3分钟,使用无菌水清洗3次。取颗粒物在实体显微镜下进行观察。如图4所示,可以看到该物质为半透明状、颜色为白色,长度在0至1mm之间,多为棒状。
(5)红外光谱仪检测化学结构
将颗粒物研磨成粉末状,使用红外光谱仪检测其化学结构,采用Origin 8.5对其红外光谱数据进行处理,其结果如图5,谱图显示该物质在571.16cm-1、759.21cm-1、1004.56cm-1、1435.54cm-1、1682.04cm-1、2924.54cm-1、3236cm-1处有峰值。571cm-1的峰值为C-X的振动引起、759.21cm-1为C-H面外弯曲振动吸收峰,1004.56cm-1为C-O的伸缩振动吸收峰,1435.54cm-1为CH3的伸缩振动吸收峰,1682.04cm-1为C=O的伸缩振动吸收峰,2924.54cm-1为烷烃C-H的特征峰,3236cm-1为-OH的伸缩振动吸收峰。1004.56cm-1、1682.04cm-1、3236cm-1峰值的出现预示该固体降解产物含有有机酸。759.21cm-1、1435.54cm-1、2924.54cm-1峰值预示着该颗粒物为烷烃有机酸混合物。
(6)气质联用仪对其进行定性分析检测
将颗粒物研磨后的粉末,使用乙酸乙酯在70℃加热溶解。溶解液使用气质联用仪对(安捷伦7890A-7000B)其进行定性分析检测。检测条件见如下:
气质联用分析检测的载气为氦气,色谱柱为HP-5MS,尺寸30mx250μmx0.25μm,初始柱温45℃,升温速度为3℃/min,在200℃保持5min,进样口温度220℃,传输线温度280℃,离子源温度230℃,四级杆温度为150℃,离子源为EI源,扫描模式质量范围为45amu~550amu。
如图6所示,颗粒物气质联用谱图显示该未知颗粒物峰值较多,杂峰较少,可初步判断该物质为有机混合物,根据谱图中的特征峰和标准谱图库进行比对,确认特征峰所对应的化合质,匹配度较高峰值的对应化合物及其保留时间见表1,保留时间为12.778、19.766、22.715、27.871、35.826、39.862和43.025min的峰值对应的化合物分别是4,5-二甲基-壬烷、十五烷、十四烷、十六烷、二十五烷和二十七烷,可以看出该未知颗粒物中含有较多的烷烃类物质,烷烃类物质的碳链长度在10~30之间,该结果的产生可能是由于菌的的降解作用使聚乙烯的长链断裂形成了短链的烷烃类物质。
表1
Claims (5)
1.一株季也蒙毕赤酵母通过降解聚乙烯产生烷烃的方法,其特征在于该方法按以下步骤进行:一、季也蒙毕赤酵母菌株的活化;二、季也蒙毕赤酵母生物降解聚乙烯;三、季也蒙毕赤酵母降解聚乙烯后生成烷烃及表征。
2.根据权利要求1所述的一株季也蒙毕赤酵母通过降解聚乙烯产生烷烃的方法,其特征在于步骤一中季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii ZJC-1,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号,保藏日期为2018年12月17日,保藏编号为CGMCC No:16956。
3.根据权利要求1中所述的一株季也蒙毕赤酵母通过降解聚乙烯产生烷烃的方法,其特征在于步骤一中所述季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii ZJC-1的活化方法为:使用接种针刮取保存于YPD斜面培养基的季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondiiZJC-1,接种于新的YPD固体培养基中,28℃培养3-5天,进行菌株活化。
4.根据权利要求1所述所述的一株季也蒙毕赤酵母通过降解聚乙烯产生烷烃的方法,其特征在于步骤二中,活化Meyerozym aguilliermondii ZJC-1,以聚乙烯为唯一碳源,使用无碳培养基在30℃、120r/min条件恒温振荡培养60天,60天后检测降解前后的聚乙烯的接触角、表面化学结构及其失重率。
5.根据权利要求1所述的一株季也蒙毕赤酵母通过降解聚乙烯产生烷烃的方法,其特征在于步骤三中,活化Meyerozyma guilliermondii ZJC-1,以聚乙烯为唯一碳源,使用无碳培养基在30℃、120r/min条件恒温振荡培养60天,期间观察锥形瓶底部,直到有颗粒物的产生,随后将烷烃类颗粒物取出并去除杂质,使用实体显微镜、红外光谱仪及气质联用仪对其进行表征。
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