CN110305822B - 一株可实现重金属在线监测的嗜甲基菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可实现重金属在线监测的嗜甲基菌及其应用，其中，该嗜甲基菌筛选自山东烟台逛荡河入海口，是严格好氧菌，其好氧呼吸及耗氧量对Pb2+和Hg2+这两种重金属离子响应敏感，Pb2+和Hg2+会强烈抑制该菌株的呼吸作用，该菌株的保藏编号为CGMCC No.13058。本发明的有益之处在于：该菌株好氧呼吸及耗氧量对Pb2+和Hg2+这两种重金属离子响应敏感，通过监测耗氧率变化，可以实现饮用水、地表淡水、海水的Pb2+、Hg2+重金属离子的快速响应和预警，响应速度快、操作简单；（2）该菌株可实现自动培养，无需大量菌体冻干粉的供给，成本更低；（3）该菌株在重金属实时在线监测与预警技术仪器研发等方面具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株嗜甲基菌及其应用，具体涉及一株可实现重金属在线监测的嗜甲基菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
在第二次工业革命后的一个多世纪的时间里，人类工业和农业生产能力飞速提高，人类生活水平在大幅度提升的同时，伴随而来的还有严重的环境污染问题，其中，重金属污染一直是水环境污染重点关注的污染物。
近一个世纪以来，由于食用重金属富集的鱼虾蟹贝造成的人类重金属中毒事件屡见不鲜，最早的报道是20世纪三十年代日本出现的由于矿山废水污染而造成的镉中毒事件（骨痛病）。类似的事件随之发生，20世纪五十年代日本水俣湾附近部分渔民由于食用大量被汞污染的水生生物而患有水俣病，2006年甘肃陇南儿童血铅超标事故，2008年广西河池砷中毒事件等，各种食品重金属超标事件更是屡禁不止。
近些年，由于人们对水产品营养价值的认知不断提高和水产品的消费不断增大，水中的重金属通过重金属富集的鱼虾蟹贝等水产品转移到人体，对人体造成了更大的损害。水体的重金属污染加重，除了影响人类健康，还会严重影响水生生物的生长、繁殖，造成水域群落多样性降低，危害水生生态系统。
在众多重金属中，汞和铅是对人体和生态系统危害较大的重金属。
在人体方面，铅可经呼吸、皮肤、肠胃进入人体，主要累积在肾，其次累积在肝、脾、甲状腺，在骨骼中也会有累积，铅与蛋白质的巯基结合，会破坏细胞代谢，影响肝脏解毒功能，使肾衰竭，引起慢性中毒及神经衰弱症候群，铅在骨骼中累积会严重损害骨骼造血系统。另外，铅还可通过胎盘对幼儿神经系统造成损伤。
在生态系统方面，铅对水生生物的安全浓度为0.16 mg/L，若超过这个安全浓度，将会危害到水生生物；若用含铅量0.1 mg/L以上的水灌溉农作物，将会引起铅在农作物中的明显堆积，从而会污染环境。
在线监测重金属的技术主要有两大类：物理化学监测技术、生物毒性监测技术。
1、物理化学监测技术
重金属的物理化学监测技术大多采用流动注射-湿法化学分析方法。该方法需要大量高毒性试剂，会造成水体的二次污染。
2、生物毒性监测技术
重金属的生物毒性监测技术主要是利用生物毒性监测仪进行重金属的在线监测，生物毒性监测仪主要是根据微生物、浮游动物、鱼类等的某方面指标（例如：发光强度、群落组成、行为等）对重金属的反应判断重金属的含量范围。其中，微生物作为指示生物，具有培养成本低、繁殖周期短、反应即时且敏感等多种优势，但目前用于重金属毒性监测的微生物大多为发光细菌，通过监测器发光强度判断重金属含量，但发光细菌无法实现在线监测，需制备冻干粉，还需进行长时间的菌株复苏，在环境重金属和毒性监测中具有一定的局限性。
生物毒性监测方法相对物理化学监测方法，二次污染风险大幅度降低，且生物毒性监测不仅可监测1种重金属，还可以反应环境中的综合毒性，对于水环境和饮用水重金属含量超标预警具有重要意义。
筛选能够即时、敏感的反应环境中重金属含量范围的菌株，能够实现自动培养，能够通过简单指标判断菌株的生长情况，对于新型环境毒性监测仪的研制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株对Pb2+和Hg2+这两种重金属离子响应敏感、能够实现自动培养、能够通过简单指标（例如培养基pH值）判断生长情况、可实现Pb2+和Hg2+这两种重金属在线监测的嗜甲基菌及其应用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一株可实现重金属在线监测的嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus），其特征在于，该嗜甲基菌筛选自山东烟台逛荡河入海口，是严格好氧菌，其好氧呼吸及耗氧量对Pb2+和Hg2+这两种重金属离子响应敏感，Pb2+和Hg2+会强烈抑制该菌株的呼吸作用，该菌株已于2016年 9月 28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13058。
前述的可实现重金属在线监测的嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus），其特征在于，该嗜甲基菌能够在线培养，所用培养基为MeM培养基，配方如下：
KH2PO4 3g/L、Na2HPO4•7H2O 12.8g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1.5g/L、MgSO4 0.3g/L、甲醇4ml/L，pH调节至8.5。
前述的可实现重金属在线监测的嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus），其特征在于，该嗜甲基菌在线培养的方法为：
培养池中放入MeM培养基，菌株在MeM培养基中生长，培养温度8-40℃，无震荡，保持培养池稳定曝气，当培养池中的MeM培养基pH值低于6.5时，排出9/10菌液，以新的MeM培养基补足，继续培养即可。
前述的可实现重金属在线监测的嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus）在淡水和海水的Pb2+、Hg2+重金属离子的快速响应和预警中的应用，其特征在于，通过监测该嗜甲基菌的耗氧率，对水环境中的Pb2+、Hg2+重金属离子浓度进行实时在线监测和预警。
前述的应用，其特征在于，对水环境中的Pb2+、Hg2+重金属离子浓度进行实时在线监测的方法具体如下：
Step1：计算无污染状态下菌株的耗氧率
向密封检测池内等体积加入无菌水和菌液，通过溶解氧探头记录加入菌液后第2min和第3min密封检测池的溶解氧浓度，通过公式（1）计算无污染状态下该嗜甲基菌的耗氧率：
（1）
其中，是无污染状态下加入菌液后第2min时密封检测池的溶解氧浓度，是无污染状态下加入菌液后第3min时密封检测池的溶解氧浓度；
Step2：计算重金属污染状态下菌株的耗氧率
向密封检测池内等体积加入不同浓度的Pb2+、Hg2+重金属离子溶液和菌液，通过溶解氧探头记录加入菌液后第2min和第3min密封检测池的溶解氧浓度，通过公式（2）计算重金属污染状态下该嗜甲基菌的耗氧率：
（2）
其中，是重金属污染状态下加入菌液后第2min时密封检测池的溶解氧浓度，是重金属污染状态下加入菌液后第3min时密封检测池的溶解氧浓度；
Step3：计算耗氧抑制率
根据无污染状态下菌株的耗氧率和重金属污染状态下菌株的耗氧率，通过公式（3）计算耗氧抑制率：
（3）
Step4：获得重金属污染浓度范围
通过耗氧抑制率的监测和计算，可反推获得水环境中的重金属污染浓度范围。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明筛选得到的菌株（保藏编号为CGMCC No.13058），其好氧呼吸及耗氧量对Pb2+和Hg2+这两种重金属离子响应敏感，利用Pb2+和Hg2+这两种重金属离子对该菌株的呼吸抑制作用，通过监测耗氧率变化，可以实现饮用水、地表淡水、海水的Pb2+、Hg2+重金属离子的快速响应和预警，响应速度快、操作简单；
（2）本发明筛选得到的菌株（保藏编号为CGMCC No.13058），其可实现自动培养（在线培养），无需大量菌体冻干粉的供给，成本更低；
（3）本发明筛选得到的菌株（保藏编号为CGMCC No.13058），在重金属实时在线监测与预警技术仪器研发等方面具有极大的应用前景。
附图说明
图1是菌株Me的电镜扫描图；
图2是菌株Me的生长与培养基pH的关系；
图3是添加不同浓度的Hg2+时反应池内溶解氧随时间的变化；
图4是Hg2+的浓度与菌株Me的耗氧抑制率的关系；
图5是Pb 2+的浓度与菌株Me的耗氧抑制率的关系。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、菌株筛选
2015年4月17日、4月22日、4月27日，我们从山东省烟台市逛荡河入海口处分别取回了3个沉积物样品（分别编号为沉积物样品1、沉积物样品2、沉积物样品3），随后从中筛选得到了一株对Pb2+和Hg2+都具有很强的呼吸抑制响应的细菌，筛选的详细过程如下：
（1）菌株富集
取1g沉积物样品1置于含有100mL NCM液体培养基的锥形瓶中，于30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养5d，再向其中加入1g沉积物样品2，用同样的方法继续培养5d，之后再向其中加入1g沉积物样品3，再用同样的方法继续培养5d。共计富集培养15d后，取1mL悬浊液置于含有100mL NCM液体培养基的锥形瓶中，于30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养3d，重复3次，筛选得到自养型亚硝化细菌和寡营养状态下能够生长的菌株。
（2）严格耗氧菌株筛选
将步骤（1）得到的富集菌液稀释不同梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6），于NCM固体培养基上进行平板涂布，共得到5个单菌落，这5个单菌落分别记为N-1、N-2、N-3、N-4和N-5。将这5个单菌落分别接种于5个NCM液体培养基中，当菌体浓度达到1OD时，将菌液置于密闭容器内，通过溶解氧探头测定2min内菌液溶解氧DO的浓度变化，然后通过下面的公式计算耗氧率OCR：
式中，OCR为耗氧率（%），为初始溶解氧浓度（mg/L），为终止溶解氧浓度（mg/L），为耗氧时间（min）。
这5个单菌落的耗氧率OCR的计算结果如下：
| 样品标号 | 耗氧率OCR（%） |
| N-1 | 29.14 |
| N-2 | 30.33 |
| N-3 | 18.21 |
| N-4 | 10.01 |
| N-5 | 9.79 |
（3）对Pb2+、Hg2+重金属离子响应敏感的菌株筛选
通过对比这5个菌株的耗氧率，我们选择耗氧率相对较高的N-1和N-2进行Pb2+、Hg2 +重金属离子敏感菌株筛选。
将N-1和N-2分别接种于NCM液体培养基中，当菌体浓度达到2OD时，分别与等体积的500ng/L Pb2+混合，记录混合初始和终止DO浓度；与此同时，将菌株分别与等体积富氧水混合，记录初始和终止DO浓度。先分别计算有Pb2+条件下的耗氧率和无Pb2+条件下的耗氧率，之后按照下面的公式计算耗氧抑制率OIR：
式中，OIR为耗氧抑制率（%），为无重金属条件下菌株的耗氧率，为有重金属条件下菌株的耗氧率。
以同样方法计算Hg2+的耗氧抑制率。
重金属对2个菌株的耗氧抑制率的计算结果如下：
| 样品标号 | Pb<sup>2+</sup>的耗氧抑制率（%） | Hg<sup>2+</sup>的耗氧抑制率（%） |
| N-1 | 41.22 | 39.61 |
| N-2 | 100.00 | 90.05 |
最终筛选出对Pb2+、Hg2+重金属离子耗氧响应敏感的菌株N-2，根据鉴定结果将菌株N-2编号为Me。
NCM液体培养基配方如下：
KH2PO4 3g/L、Na2HPO4•7H2O 12.8g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1.5g/L、MgSO4 0.3g/L，pH调节至7.5，120℃高压灭菌15min。
NCM固体培养基配方如下：
KH2PO4 3g/L、Na2HPO4•7H2O 12.8g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1.5g/L、MgSO4 0.3g/L，琼脂 15g/L，pH调节至7.5，120℃高压灭菌15min。
二、菌株Me的鉴定
我们对菌株Me进行了形态学和分子生物学鉴定。
菌株Me的主要生物学特征有：
（1）革兰氏阴性菌，短杆菌，电镜扫描图见图1；
（2）细胞色素氧化酶试验、过氧化氢酶试验、赖氨酸脱羧酶试验均为阳性；
（3）鸟氨酸脱羧酶试验、尿素酶试验均为阴性；
（4）最适生长温度为25-30 ℃，最适生长pH为7.2-8.0；
（5）在固体培养基上为圆形菌落，透明度高。
菌株Me经16S rRNA序列比对分析，与嗜甲基菌Methylophilus methylotrophus相似度高达99.58%。
鉴定结果：菌株Me是嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus）。
三、菌株Me的在线培养
1、MeM培养基
KH2PO4 3g/L、Na2HPO4•7H2O 12.8g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1.5g/L、MgSO4 0.3g/L、甲醇4ml/L，pH调节至8.5。相比NCM液体培养基增加了甲醇，可提高菌株生长速度。
2、菌株Me的生长与培养基pH的关系
将菌株Me接种到MeM培养基中，于30℃、160 r/min震荡培养19h，期间间隔1h或2h取样，测定菌液的pH值和OD600的值，获得菌株Me的生长与培养基pH的关系，结果如图2所示。
由图2可知，随着菌株浓度的增加，菌液pH快速下降，当pH降至6.3时，菌株生长进入平台期，平台期菌株的耗氧率明显低于生长期。当pH低于6.5时，及时更换培养液，排出平台期菌株，可使菌株保持在指数期高耗氧状态。
如果是在低温无震荡条件下培养菌株Me，其生长会更为缓慢。
3、菌株Me的在线培养
培养池中放入MeM培养基，菌株Me在MeM培养基中生长，培养温度8-40℃，无震荡，保持培养池稳定曝气，当培养池中的MeM培养基pH值低于6.5时，排出9/10菌液，以新的MeM培养基补足，继续培养即可。
四、菌株Me的应用
菌株Me是严格好氧菌，其好氧呼吸及耗氧量对Pb2+和Hg2+这两种重金属离子响应敏感，Pb2+和Hg2+会强烈抑制该菌株的呼吸作用，利用Pb2+和Hg2+对其的呼吸抑制作用，通过监测该菌株的耗氧率，可对水环境中的Pb2+和Hg2+这两种重金属离子浓度进行实时监测与预警。
、通过监测菌株Me的耗氧率实时在线监测水体中Hg2+的含量
Step1：计算无污染状态下菌株Me的耗氧率
取2.5mL无菌水注入5mL密封检测池中，向密封检测池中快速加入等体积菌液（2.5mL），通过溶解氧探头记录加入菌液后第2min和第3min密封检测池的溶解氧浓度，重复五组实验，通过公式（1）计算无污染状态下菌株Me的耗氧率：
（1）
其中，是无污染状态下加入菌液后第2min时密封检测池的溶解氧浓度，是无污染状态下加入菌液后第3min时密封检测池的溶解氧浓度。
Step2：计算重金属污染状态下菌株Me的耗氧率
取2.5mL浓度为5ng/L、10ng/L、20ng/L、40ng/L、60ng/L、80ng/L、100ng/L、150ng/L的Hg2+溶液分别注入5mL密封检测池中，向密封检测池中快速加入等体积菌液（2.5mL），通过溶解氧探头记录加入菌液后第2min和第3min密封检测池的溶解氧浓度，重复五组实验，通过公式（2）计算重金属污染状态下菌株Me的耗氧率：
（2）
其中，是重金属污染状态下加入菌液后第2min时密封检测池的溶解氧浓度，是重金属污染状态下加入菌液后第3min时密封检测池的溶解氧浓度。
Step3：计算耗氧抑制率
根据无污染状态下菌株Me的耗氧率和重金属污染状态下菌株Me的耗氧率，通过公式（3）计算耗氧抑制率：
（3）
添加不同浓度的Hg2+时，反应池（即检测池）内溶解氧随时间的变化如图3所示。
添加不同浓度的Hg2+时，Hg2+的浓度与菌株Me的耗氧抑制率的关系如图4所示。
由图3可知，不同浓度的Hg2+均对菌株Me的呼吸有抑制作用，当Hg2+的浓度高于40ng/L时，Hg2+对菌株Me有明显的呼吸抑制。在加入Hg2+的前4min内，菌株Me仍有明显的耗氧行为，随着环境DO的降低和Hg2+对菌株Me的刺激，耗氧行为明显减弱。所以在加入菌液的前4min内为最佳的反应时间。
由图4可知，随着Hg2+浓度的增加，Hg2+对菌株Me的耗氧抑制率逐渐增大，当Hg2+浓度达到100ng/L时，Hg2+对菌株Me的呼吸抑制率接近100%。通过耗氧抑制率的监测和计算，可反推水环境中的Hg2+污染浓度范围。
根据SPSS软件的计算可知，Hg2+的50%耗氧抑制率浓度为22.21ng/L，最低预警值为5ng/L。当水环境中Hg2+达到22.21ng/L时，便可通过菌株Me的呼吸抑制率进行Hg2+示警，当环境中Hg2+达到5ng/L时，菌株Me呼吸抑制率轻微变动，可增加采样频率，排除单次误差，或通过样品采集实验室分析方法，进一步确定Hg2+的浓度和污染状况。
、通过监测菌株Me的耗氧率实时在线监测水体中Pb2+的含量
Step1：计算无污染状态下菌株Me的耗氧率
取2.5mL无菌水注入5mL密封检测池中，向密封检测池中快速加入2.5mL菌液，通过溶解氧探头记录加入菌液后第2min和第3min密封检测池的溶解氧浓度，重复五组实验，通过公式（1）计算无污染状态下菌株Me的耗氧率：
（1）
其中，是无污染状态下加入菌液后第2min时密封检测池的溶解氧浓度，是无污染状态下加入菌液后第3min时密封检测池的溶解氧浓度。
Step2：计算重金属污染状态下菌株Me的耗氧率
取2.5mL浓度为33ng/L、66ng/L、90ng/L、132ng/L、166ng/L、331ng/L、497ng/L的Pb2+溶液分别注入5mL密封检测池中，向密封检测池中快速加入2.5mL菌液，通过溶解氧探头记录加入菌液后第2min和第3min密封检测池的溶解氧浓度，重复五组实验，通过公式（2）计算重金属污染状态下菌株Me的耗氧率：
（2）
其中，是重金属污染状态下加入菌液后第2min时密封检测池的溶解氧浓度，是重金属污染状态下加入菌液后第3min时密封检测池的溶解氧浓度。
Step3：计算耗氧抑制率
根据无污染状态下菌株Me的耗氧率和重金属污染状态下菌株Me的耗氧率，通过公式（3）计算耗氧抑制率：
（3）
添加不同浓度的Pb2+时，Pb2+的浓度与菌株Me的耗氧抑制率的关系如图5所示。
由图5可知，随着Pb2+浓度的增加，Pb2+对菌株Me的耗氧抑制率逐渐增大，当Pb2+浓度达到350ng/L时，Pb2+对菌株Me的呼吸抑制率接近100%。
通过耗氧抑制率的监测和计算，可反推水环境中的Pb2+污染浓度范围。
根据SPSS软件的计算可知，Pb2+的50%耗氧抑制率浓度为91.40ng/L，最低预警值为33ng/L，当水环境中Pb2+达到99.40ng/L时，便可通过菌株Me的呼吸抑制率进行Pb2+污染示警；当环境中Pb2+达到33ng/L时，菌株Me呼吸抑制率轻微变动，可增加采样频率，排除单次误差，或通过样品采集实验室分析方法，进一步确定Pb2+的浓度和污染状况。
五、菌种保藏
菌株Me能够即时、敏感的反应环境中Pb2+和Hg2+这两种重金属的含量范围，能够实现在线培养（即自动培养），能够通过简单指标（培养基pH值）判断生长情况，对于新型环境毒性监测仪的研制具有重要意义。
所以，我们对菌株Me进行了菌种保藏，保藏日期：2016年 9月 28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC No.13058。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一株可实现重金属在线监测的嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus），其特征在于，该嗜甲基菌筛选自山东烟台逛荡河入海口，是严格好氧菌，其好氧呼吸及耗氧量对Pb2+和Hg2+这两种重金属离子响应敏感，Pb2+和Hg2+会强烈抑制该菌株的呼吸作用，该菌株已于2016年 9月 28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13058。
2.根据权利要求1所述的可实现重金属在线监测的嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus），其特征在于，该嗜甲基菌能够在线培养，所用培养基为MeM培养基，配方如下：
KH2PO4 3g/L、Na2HPO4•7H2O 12.8g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1.5g/L、MgSO4 0.3g/L、甲醇4ml/L，pH调节至8.5。
3.根据权利要求2所述的可实现重金属在线监测的嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus），其特征在于，该嗜甲基菌在线培养的方法为：
培养池中放入MeM培养基，菌株在MeM培养基中生长，培养温度8-40℃，无震荡，保持培养池稳定曝气，当培养池中的MeM培养基pH值低于6.5时，排出9/10菌液，以新的MeM培养基补足，继续培养即可。
4.权利要求1所述的可实现重金属在线监测的嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus）在淡水和海水的Pb2+、Hg2+重金属离子的快速响应和预警中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过监测该嗜甲基菌的耗氧率，对水环境中的Pb2+、Hg2+重金属离子浓度进行实时在线监测和预警。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，对水环境中的Pb2+、Hg2+重金属离子浓度进行实时在线监测的方法具体如下：
Step1：计算无污染状态下菌株的耗氧率
向密封检测池内等体积加入无菌水和菌液，通过溶解氧探头记录加入菌液后第2min和第3min密封检测池的溶解氧浓度，通过公式（1）计算无污染状态下该嗜甲基菌的耗氧率：
（1）
其中，是无污染状态下加入菌液后第2min时密封检测池的溶解氧浓度，是无污染状态下加入菌液后第3min时密封检测池的溶解氧浓度；
Step2：计算重金属污染状态下菌株的耗氧率
向密封检测池内等体积加入不同浓度的Pb2+、Hg2+重金属离子溶液和菌液，通过溶解氧探头记录加入菌液后第2min和第3min密封检测池的溶解氧浓度，通过公式（2）计算重金属污染状态下该嗜甲基菌的耗氧率：
（2）
其中，是重金属污染状态下加入菌液后第2min时密封检测池的溶解氧浓度，是重金属污染状态下加入菌液后第3min时密封检测池的溶解氧浓度；
Step3：计算耗氧抑制率
根据无污染状态下菌株的耗氧率和重金属污染状态下菌株的耗氧率，通过公式（3）计算耗氧抑制率：
（3）
Step4：获得重金属污染浓度范围
通过耗氧抑制率的监测和计算，可反推获得水环境中的重金属污染浓度范围。
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