CN110291396A - 用于自主免疫测定的微流体分析平台 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于自主免疫测定如ELISA的微流体分析装置和平台，包括多孔层和多孔臂，多孔层中具有至少一个槽且多孔臂从多孔层延伸并绕臂的根部可枢转，多孔臂可在其中多孔臂与槽间隔开的关闭位置以及其中多孔臂设置在槽中的打开位置之间枢转，并且亲水元件跨越槽以限定横跨槽的流体流动路径；设置在多孔层下面的热响应形状记忆聚合物(SMP)，SMP响应于被加热而弹性变形以使多孔臂在打开和关闭位置之间移动；以及与SMP导热接触的热源以使SMP弹性变形。

Description

用于自主免疫测定的微流体分析平台
相关申请的引用
本申请要求2016年10月7日提交的美国临时申请第62/405,492号的权益，其全部内容通过引用的方式结合到本文中。
技术领域
本发明提供了一种微流体分析装置和平台，用于自主免疫测定，例如ELISA。
背景技术
及时(point-of-care，POC)生物传感器被设计用于快速且灵敏地检测样品流体中的分子标记物，并且可以改善个人保健，确保食品安全并监测环境安全。基于微流体纸的分析装置(μPAD)越来越成为POC诊断方法中最重要的候选之一，并提供廉价、易用且安全的生物传感平台[1]。酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种广泛用于临床诊断的测定，其已经在μPAD上实现，可以使健康相关的应用可使用[2,3]。然而，这些ELISA μPAD需要人为干涉，例如重复移取试剂，使用扫描仪或照相机捕获测定读出信号，以及通过软件分析成像结果，因此需要一定程度的操作员技能，这限制这些基于纸张的装置被未经训练或不熟练的用户使用。非常希望在μPAD上实现ELISA的完全自动化，这将消除人为干预并确保所开发的μPAD提供完全保证的(由世界卫生组织(WHO)提出的；可负担的，敏感的，特异性的，用户友好的，快速和稳健的，无需设备的，并可交付给最终用户的)测试[1]。
多孔纸的固有毛细管作用免除了用于流体操纵的μPAD的泵送仪器，但仍需要纸基板上的可控流体阀来实现测定自动化。在过去的几年中，由机械装置控制的基于纸的微流体阀已被用于μPAD上的流体流动的可编程控制[4-6]。尽管这些方法消除了试剂溶液的重复移液，但仍需要手动操作来进行阀门驱动。最近，据报道，一种新型的常开和常闭磁定时阀用于基于纸的微流体的流体控制[7]。该设计使具有磁性纳米颗粒的机械悬臂阀官能化，使其可通过磁力控制。这节省了打开或关闭阀门的手动操作。它被证明是多步测定中常用的自动单步流体操作。然而，每个磁阀需要用于致动的片外，相对庞大的电磁体，并且多个磁阀的集成将导致μPΑD的较大的足迹(印迹，large foot print)(对于四阀装置，>10cm×10cm)。Yager及其同事还展示了μPAD上的局部阀门，其中压缩海绵作为集成工具包中的致动器[8]。未经训练的用户可以使用集成这种阀门的μPΑD进行“样品应答”(SIAO)ELISA。然而，该设计包括许多移动部件(例如，测试条，基于海绵的阀和玻璃纤维致动通道)，其可能限制装置制造和操作的可靠性。此外，该工具包仅直接提供定性诊断答案，随后需要对比色结果进行片外分析以进行定量读出。对于已经开发的所有可控流体阀门，它们只能单向地从“打开”状态切换到“关闭”或从“关闭”状态切换到“打开”状态，并且没有设计可以通过同一个阀随后实现打开(关闭)和关闭(打开)操作。
因此，仍然需要提供用于自主ELISA的改进的系统和装置。
发明内容
本公开的一个目的是提供一种微流体分析装置，其包括多孔层和多孔臂，多孔层中具有至少一个槽且多孔臂从多孔层延伸出并可绕臂的根部枢转，该多孔臂的远端具有亲水元件，该多孔臂可在其中多孔臂与槽间隔开的关闭位置和其中多孔臂设置在槽中的打开位置之间枢转，并且亲水元件跨越槽以限定横跨槽的流体流动路径；设置在多孔层下面并且邻接多孔臂的热响应形状记忆聚合物(SMP)，SMP响应于被加热而弹性变形以使多孔臂在打开和关闭位置之间移动；和与SMP导热接触的热源以使SMP弹性变形。
在一个实施方式中，多孔层选自由多孔纤维素纸、多孔亲水织物、多孔硝化纤维素纸和膜(纸膜，paper and membrane)、多孔玻璃微纤维膜和多孔碳纳米纤维膜组成的组。
在另一个实施方式中，多孔层包括限定亲水区域的边界的不渗透流体的屏障；亲水区包括流体通道、试剂储存区和测试区；流体通道连接试剂储存区和测试区。
在其他实施方式中，测试区包含固定化分析物粘合剂。
在另外的实施方式中，槽断开流体通道。
本发明还提供了一种分析系统，其包括在其上设置有加热电阻器的印刷电路板，该印刷电路板可操作以向加热电阻器功能来从其中产生热量；和微流体分析装置，其包括设置在印刷电路板上的多孔层和多孔臂，多孔层中具有槽，多孔臂从多孔层延伸出并可绕臂的根部枢转，多孔臂的远端具有亲水元件，多孔臂可在其中多孔臂与槽间隔开的关闭位置和其中多孔臂设置在槽中的打开位置之间枢转，且亲水元件跨越槽以限定横跨槽的流体流动路径；和设置在多孔层下方和印刷电路板上方的热响应形状记忆聚合物(SMP)，SMP邻接多孔臂并与加热电阻器导热接触，SMP可响应于被加热电阻器加热而弹性变形以使多孔臂在打开和关闭位置之间移动。
在一个实施方式中，本文的分析系统还包括用于测量测定的输出信号的发光二极管(LED)和红绿蓝颜色传感器。
在另一个实施方式中，本文的分析系统还包括用于显示测定信号的液晶显示器(LCD)屏幕。
在其他实施方式中，本文描述的分析系统还包括用于将测定结果数据发送到蜂窝电话或计算机的无线通信模块。
在一个实施方式中，无线通信模块是蓝牙通信模块。
本发明还提供了一种分析流体分析物的方法，包括加热多孔臂以将多孔臂折叠到槽内，多孔臂的亲水部分跨越槽并形成横跨槽的流体流动路径；和将流体试剂在折叠的多孔臂的亲水部分上输送横跨槽并进入测试区中；和分析测试区中的流体分析物。
在一个实施方式中，流体分析物选自由抗原和抗体标记物组成的组。
在其他实施方式中，本文描述的方法用于直接或夹心ELISA。
附图说明
现在将参考附图。
图1示出了(a)具有用于自主ELISA的SMP致动的微阀的μPAD的示意图；和在(b)中直接ELISA方案。
图2表示SMP致动的阀的操作，示出了在(a)中阀初始状态为关闭；在(b)-(d)中在激活#1和#2之后，试剂从储存区转移到测试区。
图3示出了在(a)中示例性便携式平台的照片，其可以容纳μPAD，激活阀门并读出比色信号；并且在(b)中示出了具有主要组件的示例性实施方式的平台架构的分解图。
图4是蜡印的μPAD中的测试区对具有氨基的共价结合蛋白的官能化的示意图。
图5表示使用FTIR的官能化测试区的表征。
图6表示用于检测具有官能化测试区的μPAD和未修饰的μPAD上的兔IgG的标准化平均灰度强度值作为直接ELISA。
图7表示通过RGB颜色传感器在每个ELISA步骤从测试区测量的透光率信号。
图8涉及PBS中兔IgG的直接ELISA的信息，其中(a)是不同IgG浓度下的兔IgG的直接ELISA测试区的照片；和在(b)中是平均灰度强度信号与测试区上的IgG浓度的校准曲线。
图9表示基于兔IgG的直接ELISA，用RGB颜色传感器、扫描仪和照相机评估不同的定量方法。
图10示出了从RGB颜色传感器到来自扫描仪的平均灰度强度的平均灰度强度的建模实验的显示校准曲线。
图11示出了用于蓝牙模块的智能电话上的控制板的示例性界面。
图12提供了与PBS和大鼠组织提取中的大鼠TNF-α的夹心ELISA相关的信息，其显示在(a)中平均灰度强度信号对测试区上的TNF-α浓度的校准曲线；和在(b)中在本文的标准TNF-α样品和装置中从大鼠声带组织中提取TNF-α的检测性能。
具体实施方式
根据本发明，提供了一种用于自主ELISA的全自动基于纸的微流体平台。微流体分析装置的多孔层是纤维素纸。在其他可能的实施方式中，多孔层选自多孔亲水织物、多孔硝化纤维素纸和膜、多孔玻璃微纤维膜和多孔碳纳米纤维膜的组。
热响应形状记忆聚合物(SMP)首次集成到μPAD上，用于致动纸悬臂梁以用作双向阀。基于SMP的阀门由在纸装置下方的印刷电路板(PCB)上制造的各个加热电阻器触发，因此尺寸小并且允许在具有小占地面积的μPΑD上集成多个阀门。基于这种设计，制造了自动操作的μPAD，集成了多个基于SMP的阀门，用于执行自动直接和夹层ELISA。该平台集成了多个功能组件：(i)用于控制阀门和执行自动化测定操作的微控制器；(ii)带有加热电阻器的柔性PCB，用于编程触发μPΑD上的阀门；(iii)定制的比色读取器，包括发光二极管-LED(作为光源)和红绿蓝(RGB)颜色传感器(作为比色读取单元)，用于定量读出来自μPΑD的最终比色信号；(iv)用于显示定量结果的液晶显示器(LCD)屏幕；(v)蓝牙模块用于测试结果的无线数据传输。通过检测透光率差异来的阀门故障的自检机构也可以包含在装置中，以检测μPΑD操作的失效，并提醒用户用新的替换失效的μPΑD。这种用户友好装置在多步ELISA期间无需人为干预。除标准校准实验外，还证明了使用真实大鼠样品检测TNF-α的平台的有效性，并获得了与标准ELISA相当的测试结果。
图1a显示了用于直接ELISA的具有SMP致动值的μPAD。所有试剂都储存在储存区中，并通过来自入口的缓冲液流转移到测试区。SMP驱动的阀门可以连接和断开存储区和测试区，从而根据自主ELISA方案控制试剂转移的顺序和时间。热负责的SMP在高于切换转变温度(Ttrans)的温度下从其永久形状变形为临时形状，并通过冷却至低于Ttrans的温度来保持其临时形状。当再次在高于Ttrans加热时，SMP将转变回为其永久形状。由于这种热负责响应，已经报道了具有SMP的自组装机器人实现了局部和连续的三维折叠过程[9,10]。通过将一片热负责的SMP连接到可折叠纸悬臂(图2a)，可以制造热控流体阀，并且该设计最终导致能够进行自主多步ELISA的μPΑD。
每个阀(图2a)包括从μPΑD预切割的纸臂，一片SMP(附接到纸臂的可折叠根部)，其通过其下方的加热电阻器和附接在纸臂尖上的亲水纸巾桥经由焦耳加热而变形。使用预切割铰链将SMP片材附接到纸臂根部，并且纸臂最初在45°上弯(图2b)。聚烯烃(PO，Ttrans＝95℃)用作SMP材料。按照铜加热电阻器的优化形状[9]，PO片材的宽度和长度分别通过实验确定为6mm和12mm。在对不同PO板进行比较以获得最佳阀门性能后，选择RNF-100 1”×4’BLK(厚度＝0.89mm)的SMP模型进行μPΑD制造，这提供了适当的响应时间和最高的成功率(表1)。
表1
三种SMP致动的阀(n＝15)在装置上的阀性能比较
激活时间#1是铜迹线从开始到关闭的加热时间。激活时间#2是在将液体转移1分钟后铜迹线从开始到关闭的加热时间。激活#1和激活#2的成功完成对于成功率收集计为阳性。
SMP在加热25秒后扁平化纸臂(激活#1，打开)以打开阀门，并连接通道。然后，关闭加热器以保持SMP平坦(即，保持通道连接，并且阀门上游的缓冲液将储存的试剂转移到测试区域(图2c)。最后，将SMP再次加热55秒(激活#2，关闭)使其恢复到其初始形状并关闭阀门(图2d)。可以看出，单个阀门可以顺序执行“打开”和“关闭”操作。
μPΑD(图3)由一层层压塑料(用于减少蒸发)和带有附接有SMP片的纸阀的图案化微流体通道的纸片组成。在μPAD下面放置一片印满有蜡和激光切割开口的隔离纸，以防止液体从通道向下泄漏到加热电阻器层。在每次测定期间，将夹具置于μPΑD的顶部以确保SMP片和铜加热电阻器之间的紧密接触(图3)。
为了自动操作μPAD，开发了集成电子夹持器(图3)，用于从μPΑD读取程序化阀门激活和比色信号。夹持器包括微控制器电路、图案化的加热电阻器层、塑料外壳、LED光源、RGB颜色传感器、LCD屏幕和蓝牙通信模块。铜加热电阻器迹线宽0.5mm，并通过湿法蚀刻图案化。每个电阻器迹线都呈蛇形图案以最大化加热效率，然后粘合到一块硬纸板上并固定在我们装置的室上。每个迹线由微控制器控制的晶体管切换，并在并联降压电路中作为热源提供1.2W功率。白色LED(Amax＝550nm)和基于IC的RGB颜色传感器分别用作光源和光电检测器。颜色传感器包含3×3红色滤光、绿色滤光和蓝色滤光光电二极管阵列，并提供RGB传感值的数字读出。LED和颜色传感器与μPΑD的测试区同轴安装，用于基于透射的比色测量。
Xerox 8570Dn喷墨打印机用于在沃特曼1号层析纸上的蜡基固体墨水的照片质量打印，以形成微流体通道的图案。然后，将纸在120℃下在热板上放置30秒以熔化蜡来形成μPΑD的亲水通道。通过每5分钟点样3μL的0.031M KIO4(pH＝5)溶液时间为2小时并在65摄氏度下烘烤(图4)，将μPΑD的测试区(直径6mm)氧化用于醛官能化。官能化后，将10μL的去离子水(DI H2O)加入到测试区两次以洗去残留的氧化物。最后，在使用前将纸在干燥器中干燥至少12小时。测试区中的醛基可以通过席夫碱键有效地将具有氨基的蛋白质固定到纸的纤维素骨架上。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)监测氧化过程。从红外光谱看，由于C＝O双键的伸缩振动，氧化纤维素区中醛基的特征吸收带出现在1726cm-1处(图5)。我们还使用直接ELISA验证了醛官能化纸的性能(图6)。
通过实验，发现SMP致动阀的操作成功率为93％(n＝60)。为了监控阀门操作并消除故障阀门操作，还在阀门故障装置中建立了自检机构。阀门的故障无法连接通道并从入口传输液体。因此，通过在干燥和(半)湿状态下检测测试区的透光率差异，RGB颜色传感器在阀门打开(激活#1)之后和在阀门关闭(激活#2)之后一分钟立刻监测测试区中的平均灰度强度。由于液体的显着散射能力，如果阀成功连接通道并将携带试剂的流体转移到测试区，则测试区的透光率将显着提高。这可以通过RGB颜色传感器对测试区的传输读出来确认(图7)。对于除洗涤步骤之外的所有ELISA步骤，自检机构通过检测干燥和(半)湿状态下的测试区的透光率差异来识别阀门故障(因为每个步骤在10分钟孵化后进行，其干燥测试区)。对于通过PBS去除无边界抗体的洗涤步骤，其仅在孵化一分钟后进行，这使得测试区仅略微不太湿润(我们称之为“半干”状态)。RGB颜色传感器仍能够在湿润和半湿润状态之间区分测试区的透光率差异一分钟(图7)。
实施例I
材料和试剂
沃特曼1号色谱纸、牛血清白蛋白(BSA)、兔IgG、抗兔IgG(碱性磷酸酶标记的)、抗兔IgG(异硫氰酸荧光素标记的)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)(99％)，/NBT、20、10×磷酸盐缓冲盐水(PBS)和高碘酸钾购自Sigma-Aldrich，无需进一步纯化即可使用。重组大鼠TNF-α、大鼠抗TNF-α抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素购自Abeam(Toronto,ON)。生物素化抗大鼠TNF-α购自BioLegend(San Diego,CA)。白色LED和聚烯烃(PO)购自Digi-Key公司(Thief River Falls,MN,USA)。Arduino UNO作为微控制器和16×2LCD作为显示器购自RobotShop Inc.(Mirabel,QC,Canada)。从DuPont获得(LF7062)铜包覆的聚酰亚胺膜作为样品。购买氯化铁用于蚀刻来自MGChemicals的铜。RGB颜色传感器(TCS34725)购自Adafruit(New York,NY,USA)。Scotch塑料热层压袋购自3M。
实施例II
测试区在纸上的可视化和成像
当在一天的不同时间拍摄成像时，均匀光是再现性的关键。对于手机摄像头，不同的光线条件(高噪声)会导致同一图像的不同比色强度值。在拍摄图像时，使用迷你摄影棚来过滤环境光线以使其均匀。该方法在手机相机的比色强度值上实现了更高的再现性。
实施例III
检测方法的一致性
对于基于纸的ELISA，用于测定的反应底物是纤维素纸。因此，蛋白质(抗原、抗体等)在整个纸张厚度上吸附到纤维素纤维上(对于沃特曼1号色谱纸，为180μm)。用于基于纸的ELISA的当前检测方法主要利用扫描仪或手机来捕获图像，然后使用ImageJ或其他软件分析平均灰度强度。这两种方法仅反映纸表面的颜色强度，并且基于纸张的ELISA的检测方法都不会读取整个纸张厚度的完整着色值。然而，基于我们装置中的检测机构，RGB颜色传感器可以反映整个纸张厚度的颜色强度。
实施例IV
用于测量通过纸的光透射的近似
在本文的装置中，检测机构模仿紫外-可见光谱，其限制从LED到检测器(我们的装置中的RGB颜色传感器)的光路以固定取向横跨基于纸的微流体的测试区。一种光学模式[19]充分考虑了纸纤维的折射，由于样品的吸光度导致的非测定衰减，以及空气-纸和纸-空气界面的边界传输因子，已在等式(1)中建立。在该模式中，总透射率(T)根据不同因素而变化。l(W/cm2)是使用比色测定通过测试区从LED传输到RGB颜色传感器的强度，l0(W/cm2)是源强度，αsamp(cm-1)是由测试区中的样品引起的衰减因子(散射和吸收二者)，且z是纸的厚度。此外，ε(M-1cm-1)和c(M)是摩尔消光系数和分析物浓度。在该等式中，c是导致比色结果的样品的表观浓度，因此它也可以定义为lvalid(纸中显示的有效比色强度；还使用希尔方程式与样品的实际浓度进行非线性回归)。
为了简化计算方法，确认RGB颜色传感器检测到的总透射率与测试区中的lvalid在与P-ELISA中的比色变化重叠的小强度间隔中具有线性关系。根据一些之前的工作[20,21]，通过量化由表面上分析物的着色引起的颜色强度(lvalid)的变化，使用扫描仪直接检测分析物。使用紫色染料以2倍稀释(1:1至1:32)进行建模实验，其具有与ELISA比色结果相似的颜色以测试通过RGB颜色传感器和扫描仪检测到的信号响应；PBS用作阴性对照。图10证明，在具有ELISA比色结果的相同强度区间期间，RGB颜色传感器和扫描仪检测到的信号具有极好的线性依赖性。
实施例V
蓝牙模块
图11示出了本文描述的平台中的无线传输架构，从装置到PC或智能电话，最后到远程站点。PC软件和智能手机APP都可以打开装置的蓝牙端口并触发自动化测定，并通过无线传输接收数据。数据不仅可以通过USB从恒电位仪传输到PC，还可以通过互联网(通过PC或智能手机)或移动网络(通过移动网络)传输到远程站点(例如，集中式实验室或公共卫生数据库)，用于远程诊断或医疗数据收集。
实施例VI
自主直接ELISA
使用该平台，证明了自主直接ELISA用于在我们装置上检测兔IgG。可以使用模拟储存的试剂的食用染料使整个系统操作可视化。在测定之前，使用KIO4对μPAD中的测试区进行官能化以放大比色信号。之后，遵循针对我们的侧向流动μPAD优化的直接ELISA[2]的方案，将兔IgG抗原(3μL，在不同的已知浓度下)固定到测试区并且使用1×PBS作为阴性对照。阻断缓冲液(3μl的0.5％(v/v)吐温-20和10％(w/v)BSA的PBS溶液)、碱性磷酸酶(ALP)-标记的抗体(3μL的1:10稀释的抗体的PBS溶液)和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基蓝四唑鎓底物(3μL的4.59mM的BCIP，3.67mM的NBT，50mM的MgCl2的1M Tris缓冲液的溶液，pH9.5)移液到它们各自的μPΑD的储存区(直径6mm)。最后，手动组装μPAD。
为了运行ELISA，用户将μPAD安装到装置中的室上，并在μPΑD的缓冲液入口处添加250μL的PBS，关闭平台门(用于最小化蒸发并维持用于比色测量的暗室)，按下平台上的按钮开始测定。四个纸系统的自动操作由微控制器按照预编程协议控制：(i)在静置3分钟以润湿上游纸通道后，将阻滞缓冲液从储存区转移到测试区，然后将测试区孵化10分钟；(ii)将ALP-标记的抗体转移到测试区以标记固定化抗原，并孵化1分钟；(iii)用PBS洗涤试验区以除去未结合的抗体，并孵化10分钟；(iv)将BCIP/NBT底物转移至测试区，并孵化30分钟进行信号放大；和(v)微控制器点亮LED以将入射光照射到测试区，并且RGB颜色传感器测量传输的比色信号并将16位数字数据传输到微控制器用于LCD上的结果显示。在测定期间，阀门故障的自检机构持续监控所有阀门的操作，并在发生故障时报告错误。
进行直接ELISA以检测10倍稀释(6.7mM至6.7pM)的兔IgG，并且测量的比色强度对IgG浓度的校准结果显示在图8中。为了将RGB颜色传感器的性能与其他比色读数方法的性能进行比较，通过台式扫描仪(CanoScan LiDE 210扫描仪，CANON Inc.；设置为彩色照片扫描，300dpi分辨率)和手机(XperiaTMZ手机，SONY Electronics Inc.；4128×3096像素)捕获相同的测定结果。使用I mageJ以平均灰度强度分析图像。使用希尔方程(图8b)将所有数据拟合成S形曲线，并计算检测限(LOD)。
对于使用希尔方程(Hill Equation)拟合的测定系数，最差拟合方法的最佳拟合是：RGB颜色传感器(0.993)、扫描仪(0.970)和手机(0.894)。用于捕获图像的扫描仪的连续闪烁导致对μPΑD上的测定检测的真实比色强度的光学校正。因此，它对于真正的测定系数有轻微的失真。对于手机，虽然我们设置了一个避难所以将环境光过滤成均匀的光源以拍摄手机图像(支持信息)，但图像仍然受到环境反射、相机失真和低对比度的影响。因此，与桌面扫描仪和手机相比，RGB颜色传感器提供了用于量化比色信号的最小方差。对于LOD，具有最低LOD和最高LOD的读数来自：RGB颜色传感器(27pM)、扫描仪(255pM)和手机(836pM)。此外，RGB颜色传感器为测定提供了最高的灵敏度。此外，与扫描仪和手机相比，检测误差对结果影响最小(图9)。尽管扫描仪的强烈闪光改善了影印外观，但由于强烈的背景光，它减少了浅色和深色的强度差异，从而降低了测定的灵敏度。基于手机的相机增强了用户拍摄照片的便利性，但是手机的某些功能(例如，ISO自我调节，和色彩再现或失真)不适合于在我们的测定中测量比色结果。在我们的装置中，检测机构基于测试区中的比色结果，其具有由LED提供的入射光和透射光。光学模式被简化[11]，并将其近似为我们的检测机构，更好地反映了自主ELISA(图10)。
实施例VII
用于真实大鼠样品的自主夹心ELISA
直接ELISA是用于测试我们平台的性能的快速(具有较少步骤)和直接测定。由于其更广泛地用于测试真实复杂的临床样品并且具有更高的灵敏度和特异性，因此还展示了在所提出的平台上的夹心ELISA。基于μPAD的相同结构，通过增加试剂储存区的数量来修改其设计，使得可以使用本文的纸装置进行具有更多反应步骤的夹心ELISA(因此更多类型的试剂)。首先在产生校准曲线的装置上进行5倍稀释(59nM至19pM)的大鼠TNF-α的夹心ELISA。在测定之前，在氧化的测试区中固定抗大鼠TNF-α(3μL的1:10稀释的抗体的PBS中的溶液)作为捕获抗体，然后将大鼠TNF-α(3μL)点样到测试区以与捕获抗体结合。PBS用作阴性对照。将预混合的生物素标记的抗大鼠TNF-α(1.5μL的1:5稀释的抗体在PBS中的溶液)作为二次抗体，HRP链霉亲和素(1.5μL的1:5稀释的酶的PBS溶液)，HRP底物(3μl的TMB的DMSO溶液和0.05M的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液与痕量的新鲜的30％过氧化氢，pH 5.0)和终止溶液(3μL的4mM的硫酸)预先储存在储存区中。然后，通过与上述直接ELISA相同的定制程序操作这些步骤。最后，通过RGB颜色传感器量化测试区，并将结果拟合到希尔方程中(图12a)。为了在夹心ELISA中确认二次抗体和HRP链霉亲和素的预混合溶液的可行性，还分别通过添加二次抗体和HRP链霉亲和素进行测定。通过比较不同的方法，通过学生t检验两种测定结果显示没有差异(p＝0.132；n＝7)。
为了研究该装置在临床试验中的潜在应用，证明夹心ELISA用于在声带手术后4周内从大鼠声带组织中的流体提取中的TNF-α，并比较酶标仪上的检测性能与传统ELISA试剂盒。首先，进行通过酶标仪定量的标准TNF-α大鼠ELISA试剂盒实验以在声带手术后的第2天和第4周测量组织提取物中的TNF-α的浓度分别为21pM和77pM(图12b)。然后，通过平台测试相同批次的提取样品和标准大鼠TNF-α(21pM和77pM)(图12b)。通过学生t检验分析来自标准ELISA和封闭平台的数据(表2)。
表2
通过学生的t检验的在装置上的在声带手术后来自大鼠声带组织提取物中的TNF-α和标准重组大鼠TNF-α的检测性能的比较(n＝5)
对于大鼠样本(在手术2天内和4周内)和标准样本中检测TNF-α之间没有明显差异。该装置还可以在手术后2天内和4周内区分大鼠样本。如图12b所示，与在相同提取样品上的标准ELISA的结果相比，所提出的装置(图12b中的黑色柱)提供了可比较的测试结果(p>0.05)。该比较结果证明了该装置在真实大鼠样本测试中的可行性。
首次开发了用于自主ELISA的独立且自我调节的基于纸的平台。这种用户友好的装置在多步测定期间不需要人为干预(例如，重复移取试剂、捕获和测量量热结果)，并且能够实现样品应答操作。进行兔IgG的直接ELISA以评价装置性能，并且还进行动物样本中的TNF-α的间接ELISA作为实际应用。除了ELISA测试，所提出的平台也可以很容易地适用于其他单步和多步测定，例如检测葡萄糖[12]，其他蛋白质(例如，牛血清白蛋白)[13]，尿酸[14]，乳酸[15]，pH[16]，致病菌(例如，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157.H7，鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌)[17,18]。
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虽然已经结合本发明的特定实施方式描述了本说明书，但是应该理解，它能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖任何变型、用途或改编，包括与本公开的这种偏离，并且可以应用于上文的基本特征，并且如下在所附权利要求的范围内。

Claims (17)

1.一种微流体分析装置，包括：
多孔层和多孔臂，所述多孔层中具有至少一个槽，所述多孔臂从所述多孔层延伸并绕所述臂的根部可枢转，所述多孔臂的远端具有亲水元件，所述多孔臂在其中所述多孔臂与所述槽间隔开的关闭位置与其中所述多孔臂设置在所述槽中的打开位置之间可枢转，并且所述亲水元件跨越所述槽以限定横跨所述槽的流体流动路径；
设置在所述多孔层下面并且邻接所述多孔臂的热响应形状记忆聚合物(SMP)，所述SMP响应于被加热而可弹性变形以在所述打开位置和所述关闭位置之间移动所述多孔臂；以及
与所述SMP导热接触以使所述SMP弹性变形的热源。
2.根据权利要求1所述的微流体分析装置，其中所述多孔层选自由多孔纤维素纸、多孔亲水织物、多孔硝化纤维素纸和膜、多孔玻璃微纤维膜和多孔碳纳米纤维膜组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的微流体分析装置，其中所述多孔层包括限定亲水区域的边界的不渗透流体的屏障；所述亲水区域包括流体通道、试剂储存区和测试区；所述流体通道连接所述试剂储存区和所述测试区。
4.根据权利要求3所述的微流体分析装置，其中所述测试区包括固定化分析物粘合剂。
5.根据权利要求3所述的微流体分析装置，其中所述槽断开所述流体通道。
6.一种分析系统，包括：
印刷电路板，具有设置在其上的加热电阻器，所述印刷电路板可操作以向所述加热电阻器供给能量从而由所述加热电阻器产生热量；和
微流体分析装置，包括：
设置在所述印刷电路板上的多孔层，以及多孔臂，所述多孔层中具有槽，所述多孔臂从所述多孔层延伸并绕所述臂的根部可枢转，所述多孔臂的远端具有亲水元件，所述多孔臂在其中所述多孔臂与所述槽间隔开的关闭位置和其中所述多孔臂设置在所述槽中的打开位置之间可枢转，并且所述亲水元件跨越所述槽以限定横跨所述槽的流体流动路径；和
设置在所述多孔层下方且在所述印刷电路板上方的热响应形状记忆聚合物(SMP)，所述SMP邻接所述多孔臂并与所述加热电阻器导热接触，所述SMP可响应于被所述加热电阻器加热而可弹性变形从而在所述打开位置和所述关闭位置之间移动所述多孔臂。
7.根据权利要求6所述的分析系统，其中所述多孔层选自由多孔纤维素纸、多孔亲水织物、多孔硝化纤维素纸和膜、多孔玻璃微纤维膜和多孔碳纳米纤维膜组成的组。
8.根据权利要求6或7所述的分析系统，其中所述多孔层包括限定亲水区域的边界的不渗透流体的屏障；所述亲水区域包括流体通道、试剂储存区和测试区；所述流体通道连接所述试剂储存区和所述测试区。
9.根据权利要求8所述的分析系统，其中所述测试区包括固定化分析物粘合剂。
10.根据任一权利要求8所述的分析系统，其中所述槽断开所述流体通道。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的分析系统，还包括发光二极管(LED)和用于测量测定的输出信号的红绿蓝颜色传感器。
12.根据权利要求6-11中任一项所述的分析系统，还包括用于显示测定的信号的液晶显示器(LCD)屏幕。
13.根据权利要求6-12中任一项所述的分析系统，还包括用于将测定结果数据发送到蜂窝电话或计算机的无线通信模块。
14.根据权利要求13所述的分析系统，其中所述无线通信模块是蓝牙通信模块。
15.一种分析流体分析物的方法，包括：
加热多孔臂以将所述多孔臂折叠到槽内，所述多孔臂的亲水部分跨越所述槽并形成横跨所述槽的流体流动路径；和
将流体试剂在所折叠的多孔臂的所述亲水部分上输送横跨所述槽并进入测试区中；和
分析所述测试区中的所述流体分析物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述流体分析物选自由抗原和抗体标记物组成的组。
17.根据权利要求15或16所述的方法，用于直接或夹心ELISA。
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