CN110286230A - 一种acpa阴性的ra诊断标志物及其应用 - Google Patents

一种acpa阴性的ra诊断标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

一种ACPA阴性的RA诊断标志物及其应用。本发明提供serine/threonine kinase 3，即STK3或其片段在制备用于诊断抗瓜氨酸多肽抗体阴性的类风湿性关节炎疾病的试剂中的用途。本发明筛选出的自身抗原STK3作为RA诊断标志物的特异性达89.45％，敏感性达20.69％，AUC可达0.6006。利用Western blot检测进一步确证了自身抗体anti‑STK3在抗瓜氨酸多肽抗体阴性RA患者中的表达和可检测性，提示了该检测标志物的临床转化潜力。

Description

一种ACPA阴性的RA诊断标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种ACPA阴性的RA诊断标志物及其应用。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病。基本病理改变为滑膜炎、血管翳形成，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终可能导致关节畸形和功能丧失。类风湿关节炎全球发病率约0.5-1.0％，我国大陆地区发病率约为0.42％，总患病人数约500万。任何年龄均可发病，病程反复，致残率高。类风湿性关节炎的临床表现异质性强，并发症复杂，给患者带来巨大的疾病负担。针对新发RA病例的早期识别和有效干预，可延缓或阻滞RA进展为慢性侵蚀状态，降低致残率，提高患者长期生活质量。因此，对于类风湿性关节炎来说，早期的诊断和治疗是阻止不可逆性关节破坏的关键。
关于RA诊断标志物的探索和研发始终是该领域的研究热点。RA患者血清中发现自身抗体已经超过70年，类风湿因子(RF)以人类IgG的Fc片段为靶点，是发现的第一组自身抗体，包括IgG和IgM等各类亚型。但RF特异性低，在其他自身免疫病和高龄人群中也可出现。随着研究深入，研究者在1964年和1979年分别发现RA患者中存在抗核周因子抗体(APF)和抗角蛋白抗体(AKA)。尽管这两种抗体诊断RA特异性高，但检测困难。1995年研究者发现抗核周蛋白和抗角蛋白抗体有共同靶点，即来自精氨酸残基去亚胺化所形成的瓜氨酸残基。2002年血清抗环瓜氨酸肽抗体(ACPA)测试实现商业化，使ACPA能够作为RA常规检查的生物标志物。该自身抗体系统加深了人们对RA的理解和分类，对RA的诊断具有重要意义。2009年ACR/EULAR更新RA诊断标准,ACPA阳性也被纳入诊断标准。
尽管ACPA是类风湿性关节炎的血清特异性标志物，临床上还存在近三分之一的RA患者ACPA抗体阴性。并且随着研究不断深入，多项研究发现ACPA抗体阳性的RA患者和ACPA抗体阴性的RA患者存在较强临床异质性，对药物的反应以及发病机制都有所不同。但由于目前临床对ACPA抗体阴性的RA患者缺乏特异性生物标志物，该类患者的早期诊断和治疗成为当前类风湿性关节炎诊治中的重大挑战。
因此当前研究也聚焦于发现ACPA以外的新型自身抗体，如有研究发现RA患者血清中存在新的自身抗体亚型(抗Carp抗体)，识别氨基甲酰化蛋白。该抗体系统独立于ACPA，存在于部分ACPA阴性患者。2009年Auger等人用含有8268个蛋白的芯片筛选ACPA阴性RA患者血清，发现PAD4和BRAF两个候选标志物。其中以蛋白质瓜氨酸化的酶为靶点的抗PAD抗体不仅与靶点结合，还对PAD具有激活作用。它能够通过降低该瓜氨酸化酶钙的需要量而增加PAD4的催化能力。Charpin C等人通过研究则发现：RA病人体内存在着抗BRAF催化结构域的抗体，主要集中在416位到766位的氨基酸序列上。
总之，RA作为一种慢性自身免疫性疾病，临床表现差异明显，患者治疗反应也存在极大差别。自身抗体标记物的检测在疾病的诊断中具有重要作用。目前，临床诊疗中缺乏对RA患者进行分组的高效能生物标志物。血清标志物ACPA的发现具有深远影响，因为这是首次可以根据血清标志物对RA不同的疾病特征进行分组。但ACPA阳性和ACPA阴性的RA患者在疾病的遗传学和环境决定因素、受累关节分子特征、缓解率以及对治疗的应答率方面都存在显著差异。对于ACPA阴性的RA患者，能够进行亚组区分的靶点有限，缺乏强有力的生物标志物。因此鉴定更多RA尤其是ACPA阴性RA的自身抗体有助于揭示RA发病机制，实现早期诊断和治疗，降低致畸致残率，突破当前的诊疗瓶颈。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供ACPA阴性的RA诊断标志物及其应用。
本发明提供的ACPA阴性的RA诊断标志物为STK3(serine/threonine kinase 3,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3)。
本发明还提供STK3或它们的片段在制备用于诊断ACPA阴性RA的试剂中的用途。
其中，所述诊断包括：测定获自呈现ACPA阴性的RA患者的生物样品中对STK3或它们的片段的反应性抗体的水平；任选地，与对照数据比较所述生物样品中抗体的水平，其中相对于所述对照数据所述样品中对STK3为反应性的抗体的可检测的提高表明患ACPA阴性RA的可能性。
其中，所述生物样品为血清样品。
其中，STK3的抗体水平通过以下步骤来测量，包括：
a.使来自患者的生物样品与STK3或它们的片段接触；
b.在生物样品中存在的抗体与STK3或它们的片段之间形成抗体-蛋白质复合物；
c.洗涤来除去任何未结合的抗体；
d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；
e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；
f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号；其中可检测信号的存在表明所述患者中存在抗STK3的抗体。
其中，所述的STK3或它们的片段沉积或固定在固相支持物上。
其中，所述支持物是乳胶珠子、多孔平板或膜条的形式。
其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
本发明还提供一种用于鉴定来自患者的样品中对STK3或它们的片段，或它们的组合为反应性的抗体的存在或水平的设备，包括：
a.至少一种STK3或它们的片段，或它们的组合；和
b.至少一种固相支持物，其中所述STK3或它们的片段，或它们的组合沉积在所述支持物上。
本发明所述的设备，进一步包括检测抗体，其中所述检测抗体特异于所述患者的样品中对STK3或它们的片段，或它们的组合为反应性的抗体，并且所述检测抗体产生可检测信号。
其中，所述患者的样品为血清样品。
本发明通过高密度蛋白质芯片与RA和对照血清杂交筛选到STK3作为候选ACPA阴性的RA自身抗原。为验证该自身抗原的特异性和敏感性，本发明制备了低探针密度的RA自身抗原蛋白质芯片。然后通过大样本RA血清、疾病对照血清和健康人血清与自身抗原芯片杂交，数据分析，鉴定到蛋白质抗原STK3在ACPA阴性RA的血清中具有较高的灵敏度和特异度，为新发现的自身抗原，其作为RA诊断标志物的特异性达89.45％，敏感性达20.69％，AUC可达0.6006。利用Western blot检测进一步确证了自身抗体anti-STK3在ACPA阴性RA患者中的表达和可检测性，提示了该检测标志物的临床转化潜力。
附图说明
图1：蛋白质芯片的质控检测。
图2：GST检测蛋白质芯片上所有重组蛋白质探针平行点之间的相关性。
图3：小样本血清与高密度蛋白质芯片杂交局部效果图。
图4：小样本血清STK3在RA患者和对照组信号分布。
图5：Blank和EMPTY的信号强度在蛋白质芯片上的分布。
图6：大样本血清STK3在RA患者和对照组信号分布。
图7：ACPA阴性RA和对照血清anti-STK3的Western Blot验证。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
血清样本(血清样本收集及相关临床检测均由北京协和医院风湿免疫科完成)
本课题研究共使用609份血清，包括：
350份来自RA确诊患者的血清，平均年龄±标准差：45.2±12.5；
9份骨关节炎血清(osteoarthritis,OA)，平均年龄±标准差：67.2±16.6；
10份系统性红斑狼疮血清(systemic lupus erythematosus，SLE)，平均年龄±标准差：44.9±9.7；
28份白塞氏病血清(Behcet’s disease，BD)，平均年龄±标准差：54.2±20.7；
10份ANCA相关性血管炎血清(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies,ANCA)，平均年龄±标准差：46.9±16.3；
39份强直性脊柱炎血清(ankylosing-spondylitis,AS)，平均年龄±标准差：38.2±15.1；
21份干燥综合症血清(Sjogren Syndrome,SS)，平均年龄±标准差：52.7±13.2；
10份大动脉炎血清(Takayasu arteritis，TA)，平均年龄±标准差：38.4±13.5；
132份健康人血清，平均年龄±标准差：37.5±12.1；
RA的诊断按照2010年ACR/EULAR确立的标准，OA,SLE,BD,ANCA,AS,SS和TA亦分别满足各自的诊断和/或分类标准。
所有血清由北京协和医院风湿免疫科自2006年至2014年收集，所有疾病血清均来自临床确诊患者，诊断有争议的患者至少通过了临床三名主任医师的会诊后确定诊断。
所有RA血清均进行了血清相应抗体的检测，包括ANA 3项：ANA-IF(免疫荧光法)，DNA-IF(免疫荧光法)和ds-DNA(ELISA法)的检测，抗CCP抗体即ACPA检测(>25IU/ml定义为阳性)，RF检测，AKA和APF检测，MCV检测，GPI检测。所有抗CCP抗体和/或抗AKA,APF,MCV抗体阴性的RA患者均满足RA滑膜炎的B超或核磁的诊断标准。本试验得到了北京协和医院伦理委员会的审核批准。
实施例1高密度蛋白质芯片构建
高密度蛋白质芯片以及含目的基因序列的酿酒酵母表达重组质粒由美国约翰·霍普金斯大学朱衡教授实验室提供。每张高密度蛋白质芯片上共计47616个蛋白点(包括阳性对照点和阴性对照点；每种蛋白抗原具有两个平行点)，含有48个微矩阵(block)，每个微矩阵包含992个探针点，呈32*31的阵列排列。该蛋白质芯片包含21827种非冗余重组人源蛋白质。重组蛋白质来自酿酒酵母宿主表达的相应基因全长开放阅读框(open readingframe，ORF)，其N端具有谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase，GST)标签。
使用小鼠抗GST单克隆抗体与芯片杂交验证芯片质量，确保用于血清筛选的芯片上绝大多数重组蛋白质能被检测到且同一探针的两平行点之间具有较高的平行性。如图1所示，芯片上检测到的GST标签阳性点为红色(信号饱和时显示为白色)。每张蛋白质芯片上有48个block，每个block中所有蛋白探针以32*31的阵列排列，每种探针由左右两个平行点组成。每张芯片上含有21827种非冗余组蛋白质及其他对照探针。所有重组蛋白均带有GST标签。A和C分别显示小鼠抗GST单克隆抗体检测结果的整体效果图和单个block的样图；B显示芯片上所有探针点的信噪比分布图。当两个平行探针点的信噪比(SNR)均大于3时即认为芯片上该探针点可被检测。以每个蛋白质探针的2个平行点的信号强度做散点图，显示平行探针点之间具有良好的重复性(图2)。
实施例2高密度蛋白质芯片与RA及对照组血清杂交
选取60份RA血清(30份ACPA阴性RA血清，30份ACPA阳性RA血清)及60份对照血清(30份自身免疫病血清：包括10份白BD血清，10份TA血清，10份SLE血清和30份健康对照血清)与120张芯片杂交，通过信号采集及数据分析鉴定候选RA自身抗原。用PE-Cy5标记的抗人IgG抗体检测血清中自身抗体与相应自身抗原探针的反应。扫描得到每张芯片的荧光信号图，将该图与芯片的模板文件即gail文件同时拖到GenePix Pro 6.0软件中进行一一对应。然后将GenePix Pro 6.0软件采集到的每张芯片上所有探针的信号信息转化并导入Excel表格中。每个探针点的前景信号强度(F635median)分别除以其周围背景信号强度(B635median)作为该点的信号值。即I ij＝F635median/B635median(I ij代表block j中的蛋白质i点的信号值)。蛋白质抗原探针的信号值越趋近于1，说明血清中相应的自身抗体越无法检测到。信号值越高说明自身抗体的结合靶标蛋白质抗原探针的能力越强。
为了消除不同芯片及同一芯片上不同空间对杂交造成的差异，芯片数据的处理采用芯片内归一化(within-chip normalization)的方法对每张芯片上的信号进行归一化。即假设芯片内所有靶标蛋白是随机点制到基片上的，且只有很少部分(小于5％)的靶标蛋白质作为自身抗原被血清中相应的靶标自身抗体识别而被检测到，因此芯片上信号的分布是随机的，不同block之间是一致的。本研究设定每个block中的所有探针点信号值的中位值为1，以此来归一化芯片上不同block内探针点的信号值。即 代表block j中所有点信号值的中位值，代表归一化后的block j中的蛋白质i点的信号值)。
在此基础上，根据Hu S,Xie Z,Onishi A,Yu X,Jiang L,Lin J,Rho HS,WoodardC,Wang H,Jeong JS,Long S,He X,Wade H,Blackshaw S,Qian J,Zhu H.Profiling thehuman protein-DNA interactome reveals ERK2as a transcriptional repressor ofinterferon signaling.Cell 2009；139:610-622中记载的方法设定cutoff值判断芯片上所有探针点是否为阳性。即计算整张芯片上所有点信号值的均值I average，以及所有信号值小于1的信号值的标准差SD，以I average+5SD为cutoff值，来判断芯片上的探针点是否为阳性。然后统计每份血清与芯片上各蛋白质抗原探针免疫反应阳性的信息，利用非参数检验卡方检验(chi-square test，X 2)或Fisher精确检验(Fisher exact test)确定候选RA自身抗原。在筛选候选标志物时，将特异性达到90％，敏感性不小于25％的抗原作为候选的RA自身抗原。该过程中我们筛选到STK3可作为候选自身抗原，其具体信息见表1。
表1 STK3详细信息
图3所示为高密度蛋白质芯片与血清反应后的代表性局部图像结果，方框内为差异的蛋白质抗原探针。A、B、C、D显示的是四份RA血清与芯片杂交的示意图。E、F、G、H显示的是四份对照组血清(包括健康对照和疾病对照)与芯片杂交的示意图。方框中两个平行点蛋白质探针为STK3。图4所示，RA的STK3抗原探针信号值显著高于疾病对照和健康对照组。
实施例3 RA自身抗原蛋白质芯片的构建与血清筛选验证
通过分析高密度蛋白质芯片与小样本血清杂交结果筛选到STK3可作为候选RA自身抗原。为验证该自身抗原的特异性和敏感性，本发明制备了低探针密度的RA自身抗原蛋白质芯片。
RA自身抗原蛋白质芯片上所有探针都具有重复的双点。每张基片上共点制14个微阵列，在血清与芯片的杂交反应前，用围栏将每一个微阵列隔离开，这样每一个微阵列都形成一个独立的空间，因此每张芯片可同时检测14份血清。与RA自身抗原芯片杂交的大样本血清包括290份RA血清(145份ACPA-RA血清和145份ACPA+RA血清)及199份疾病对照血清(9份OA血清、39份AS血清、18份BD血清、10份ANCA血清、21份SS血清及102份健康人血清)。利用Genepix Pro 6.0软件采集RA自身抗原蛋白质芯片杂交结果中探针点的信息，每个探针点的前景值除去背景值即为芯片上该探针点的信号强度。取每个探针的两个平行点杂交信号的平均值为该探针与血清杂交的信号值并用于进一步分析。
采用阴性对照孔蛋白信号对此次实验做一个评估检测。在制备的含RA自身抗原的蛋白质芯片上含有阴性对照蛋白孔，包括6个Blank(空白对照)和3个EMPTY(阴性对照)，利用阴性对照孔蛋白的平均信号强度值来进行蛋白质芯片的质量评估。如图5所示，将每张芯片的每个block上的阴性对照蛋白信号强度值分别提取，做一信号强度值的频率分布图。可以观察到，Blank和EMPTY的信号强度基本都围绕在1左右，表明该点的前景值与背景值几乎相同，说明由这些芯片提取的蛋白信号强度值都是可靠合理的。
针对标志物STK3，选取不同的cutoff值，根据每个cutoff值计算敏感性和特异性，并用这些点(1-specificity，sensitivity)绘制ROC曲线，并计算AUC。发现STK3蛋白质抗原作为RA诊断标志物，特异性达89.45％，敏感性达20.69％。图6中所示为这种蛋白标志物在RA病人和健康对照及疾病对照组中的信号分布图，可以观察到RA病人中这种自身抗体的表达高于对照组，且在ACPA-RA患者中，该抗体表达也显著高于对照组。
实施例4 ACPA-RA血清中自身抗体anti-STK3的WB验证
为进一步验证抗STK3抗体作为临床检验生物标志物的转化潜力，本发明应用纯化STK3蛋白，使用传统的Western印迹法进行验证。样本包括2名anti-STK3抗体阳性的ACPA阴性RA患者血清样本，以及2例疾病对照(骨关节炎和强直性关节炎)和1例健康对照血清样本。具体方法如下：
(1)配置12.5％SDS-PAGE胶。
(2)取适量纯化STK3蛋白,与5X上样缓冲液混合，煮沸变性10min；
(3)上样，恒压80V电泳，待样品在分离胶和浓缩胶分界处形成狭窄条带，调整电压至120V，电泳至溴酚蓝泳动至底部停止；
(4)转膜：恒流200mA,90min；
(5)封闭：5％脱脂牛奶封闭1h；
(6)血清孵育：待测样本血清1：100稀释，4度孵育过夜；
(7)弃去血清，TBST洗三次，每次10min,anti-HUMAN IgG孵育1h,TBST洗三次；
(8)显影：HRP敏感化学发光底物A和B混合液(1：1混合)，滴加在PVDF膜上，显影观察目的分子量处条带结果。
如图7所示，利用Western blot印迹法，ACPA阴性RA血清中检测到相应分子量条带，对照组未检测到该条带。该结果进一步确证了anti-STK自身抗体在ACPA阴性RA患者中的存在，并为该抗体检测的临床转化提供可能。
对比例1
本发明在小样本筛选过程中，还筛选到了一些其他的抗原，但经过大样本验证分析，候选RA自身抗原并非与小样本筛选阶段结果完全一致，不能全部被确证。按照实施例1-2的方法，同样筛选到了一个RA候选抗原，PDCD2，具体信息如下。
表2 PDCD2详细信息
按照跟前述验证STK3类似的方法进行大样本验证分析，结果表明，RA血清及ACPA-RA与对照血清相比，PDCD2信号值均无统计学差异(P＝0.7165，0.6275)。且该抗原作为RA诊断标志物，AUC仅0.5097，敏感性为20.00％时，特异性仅81.91％。这些结果表明，PDCD2不适合作为ACPA-RA的生物标志物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.丝氨酸/苏氨酸激酶3，即STK3，或其片段在制备用于诊断抗瓜氨酸多肽抗体阴性的类风湿性关节炎疾病的试剂中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断包括：测定获自抗瓜氨酸多肽抗体阴性的类风湿性关节炎患者的生物样品中对STK3或其片段的反应性的抗体水平；任选地，与对照数据比较所述生物样品中抗体的水平，其中相对于所述对照数据所述样品中对STK3反应性抗体的可检测提高表明患抗瓜氨酸多肽抗体阴性的类风湿性关节炎的可能性。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述生物样品为血清样品。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中，STK3抗体的水平通过以下步骤来测量，包括：
a.使来自患者的生物样品与STK3或其片段接触；
b.在生物样品中存在的抗体与STK3或其片段之间形成抗体-蛋白质复合物；
c.洗涤除去任何未结合的抗体；
d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；
e.洗涤除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；
f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号；其中可检测信号的存在表明所述患者中存在抗STK3抗体。
5.如权利要求4所述的用途，其中，所述的STK3或其片段沉积或固定在固相支持物上。
6.如权利要求5的用途，其中，所述支持物是乳胶珠子、多孔平板或膜条的形式。
7.如权利要求4所述的用途，其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
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