CN110286189B - 肾病综合征病变进程相关代谢标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属肾病综合征标志物筛选鉴定技术领域，提供一种肾病综合征病变进程相关代谢标志物及其应用。双（4‑乙基苄基）山梨醇,C16二氢鞘氨醇,溶血磷脂酰乙醇胺(22:6),溶血磷脂酰胆碱(22:5),N‑乙醇胺,脯氨酸为进展性标志物；油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S‑羟基‑二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)和(18:1)为早期标志物；酰基肉毒碱C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)，DL‑色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3‑吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇‑1‑磷酸，L‑苏式‑二氢鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/14:0)为晚期标志物。可量化，快速灵敏度高、特异性强。

Description

肾病综合征病变进程相关代谢标志物及其应用
技术领域
本发明属于肾病综合征标志物筛选鉴定技术领域，具体涉及肾病综合征病变进程相关代谢标志物及其应用。具体而言，利用两种阿霉素肾病模型和LC-MS技术分析获得的与肾病综合征病变进程相关的标志物及其在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的用途。
背景技术
肾病综合症表现出大量蛋白尿，低蛋白血症和高脂血症的症状，是由于各种病因导致的肾小球滤过膜通透性发生改变的一个症候群，且肾病综合征为儿童多发难治性疾病，发病率高，严重影响人类健康。临床诊断主要依据尿蛋白定量以及血浆白蛋白水平；具体病理依据需要依据肾穿刺组织病理进行判断。诊断依据前者专属性差，后者病人依从性差，对该病的治疗和预后都非常不利，因而建立非入侵快速诊断方法非常重要，尤其寻找能够作为反映肾病综合征病变进程的潜在病理标志物，对减缓肾功能的恶化，预防并发症尤为关键。
阿霉素诱导的大鼠肾病模型是公认的模拟人类肾脏疾病的动物模型，其临床表现接近肾病综合征的特征。实验中可依据24 h尿蛋白定量判断肾病综合征模型复制成功与否，而肾病的病理类型及病变程度主要依据肾组织病理学检查，不仅主观性强且耗时耗力，目前尚无肾病综合征病变进程动态评价方法，因而需要建立一种整体非入侵、快速、高灵敏度、专属性好的可用于肾病诊断以及动态反映疾病的病程的方法。
代谢组学以其不断增加的覆盖范围及其内在的高通量能力在许多领域中得到应用，如疾病诊断和治疗，药物毒性研究，生物标志物发现以及疾病机制探索等。因而，采用阿霉素大鼠肾病模型模拟肾病综合征，结合LC-M代谢组学技术与数理统计方法寻找与肾病综合征病变进程相关的潜在标志物，以期寻找与肾病综合征发病进程相关的潜在病理标志物，为该病诊断、治疗及预后提供研究基础。
发明内容
本发明为了解决现有技术不能确定肾病综合征病变进程的缺点，提供了一种肾病综合征病变进程相关代谢标志物及其应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种肾病综合征病变进程相关代谢标志物，所述代谢标志物为双（4-乙基苄基）山梨醇，C16二氢鞘氨醇，溶血磷脂酰乙醇胺(22:6)，溶血磷脂酰胆碱(22:5)，N-乙醇胺，脯氨酸作为进展性标志物；油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S-羟基-二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)和溶血磷脂酰胆碱(18:1) 作为早期标志物；酰基肉毒碱 C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)，DL-色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3-吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇-1-磷酸，L-苏式-二氢鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/14:0)作为晚期标志物。
所有代谢标志物中，以神经酰胺(d18:0/14:0)为例，d表示结构式中有两个羟基，N原子连接两个长碳链，一个有18个碳上面有0个双键（即18:1）；另一个有12个碳，上面没有双键（即14:0）。
筛选所述的一种肾病综合征病变进程相关代谢标志物的方法，步骤如下：
（1）两种阿霉素肾病模型的复制与传统评价：将大鼠随机分为空白对照组，早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组，早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组采用尾静脉注射阿霉素进行诱导，建立阿霉素肾病模型；利用肾组织病理损伤程度与尿蛋白定量水平对阿霉素肾病模型进行评价；
（2）差异代谢物的寻找：收集各组大鼠的血清样品，对血清进行LC-MS分析，归属出代谢物；液质图谱经处理转换为数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行差异代谢物寻找；
（3）结合统计方法筛选、确定反映肾病综合征病变进程的标志物；
（4）基于代谢物的相对含量，采用热图、相关分析图对代谢物进行确证，并采用ROC曲线对标志物的诊断能力进行评估，最终确定出反应肾病综合征模型的早期、晚期和进展性标志物。
步骤（1）中两种阿霉素肾病模型的复制的具体方法为：大鼠适应环境一周，收集大鼠24 h的尿液，并记录尿液体积；以大鼠的尿蛋白定量和体重为依据进行初筛，将合格大鼠随机分为空白对照组与早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组，实验过程中自由饮水进食；早期阿霉素肾病模型组大鼠于第1天尾静脉注射4 mg/kg的阿霉素，随后隔1周，于第8天尾静脉注射2 mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病早期模型；晚期阿霉素肾病模型组大鼠于第1天一次性尾静脉注射6 mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病晚期模型；空白对照组以相同的方式给予等剂量的生理盐水；
在模型复制过程中，分别于第0天、第7天、第14天、第28天、第42天早上9:00将空白对照组和早期和晚期阿霉素肾病模型组大鼠分别置于大鼠代谢笼中，于次日早上9:00收集尿液，并记录尿液体积，对收集的尿液样品于4℃，3500 rpm离心15 min后取上清液，置于-80℃冰箱备用；
对尿液采用双辛丁酸BCA法进行尿蛋白定量分析，在562 nm处定量测定大鼠24 h尿液吸光度，依据标准曲线计算尿液蛋白浓度，通过将尿蛋白浓度mg/mL乘以24 h尿体积mL来计算24 h尿蛋白排泄量Upro。
血清样品进行LC-MS分析具体方法为：采用HESI离子化方式，喷雾电压：正极，3.5kV；负极，2.5kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z100-1500，正离子切换采集模式；分辨率采用MS Full Scan 35000 FWHM，MS/MS17500FWHM，NCE为12.5eV，25eV和37.5eV；
所有原始文件，包括空白对照组与早期和晚期阿霉素肾病模型组，都是通过Xcalibur 工作站和Compound Discover 2.0导出的，得到了一个独立的峰值表m/z和保留时间；所有样品均采用以下参数进行研究：S/N阈值：3，质量范围：100~1500 Da，质量公差：5ppm。
步骤（2）中血清样品数据处理方法为：将数据矩阵导入SIMCA-P 13.0软件中，以空白对照组与早期和晚期阿霉素肾病模型组构建无监督的模式识别主成分分析PCA，然后构建偏最小二乘法判别分析PLS-DA，排列实验评价模型的可靠性，并用于后续差异代谢物的鉴定；构建V+S-plot coefficient>0.7结合VIP>1寻找对二者分组贡献较大的差异代谢物，通过t-test（p<0.05）确定具有显著性的差异代谢物。
步骤（3）具体方法为：根据S-plot和VIP值，选定具有统计学显著差异的质谱离子VIP>1.0及P<0.05，确定为鉴定的差异物标志物；将早期和晚期模型均有的差异代谢物认为是进展性标志物；
根据S-plot和VIP值，对空白对照组和早期阿霉素肾病模型组进行分析，选定具有统计学显著差异的质谱离子VIP>1.0及P<0.05，确定为潜在早期标志物；以上述潜在早期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择相关分析方法，计算二者的相关系数，确定早期标志物；依据ROC曲线下面积，以AUC>0.7的代谢物作为反映肾病综合征的早期标志物；
根据S-plot和VIP值，对空白对照组和晚期阿霉素肾病模型组进行分析，选定具有统计学显著差异的质谱离子VIP>1.0及P<0.05，确定为潜在晚期标志物；以上述潜在晚期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择相关分析方法，计算二者的相关系数，确定晚期标志物；依据ROC曲线下面积，以AUC>0.7的代谢物作为反映肾病综合征的晚期标志物。
所述的一种肾病综合征病变进程相关代谢标志物的应用，所述代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的用途。
本发明最终确定了反映肾病综合征进展性病变的标志物。即以双（4-乙基苄基）山梨醇，C16二氢鞘氨醇，溶血磷脂酰乙醇胺(22:6)，溶血磷脂酰胆碱(22:5)，N-乙醇胺, 脯氨酸作为进展性标志物；油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S-羟基-二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)和溶血磷脂酰胆碱(18:1) 作为早期标志物；酰基肉毒碱 C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)，DL-色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3-吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇-1-磷酸，L-苏式-二氢鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/14:0)作为晚期标志物；用于肾病综合征模型病变及病程进行评价。与传统血清生化指标或肾脏组织病理分析相比，可量化，具有快速、灵敏度高、特异性强的特点，能够反映肾病的病变进程。
附图说明
图1为组织病理切片图分析结果，图中：A为C组大鼠肾脏组织HE染色；B为M1组大鼠肾脏组织HE染色；C为M2组大鼠肾脏组织HE染色；D为C组大鼠肾脏组织Masson染色；E为M1组大鼠肾脏组织Masson染色；F为M2组大鼠肾脏组织Masson染色。
图2为对血清样品实验数据分析图；图中：A为C组与M1组大鼠血清PCA散点图；B为C组与M1组大鼠PLS-DA排列实验图；C为C组与M1组大鼠血清V-S-Plot散点图；D为C组与M2组大鼠血清PCA散点图；E为C组与M2组大鼠PLS-DA排列实验图；F为C组与M2组大鼠血清V-S-Plot散点图；
图3为进展性标志物的相对含量图与热图；图中：A为6种进展性标志物相对含量图；B为6种进展性标志物的热图；
图4为7种早期标志物与尿蛋白的相关分析图与相关分析图；图中：A为7种早期标志物与尿蛋白的相关分析图；B为7种早期标志物的ROC曲线图；
图5为12种晚期标志物与尿蛋白的相关分析图与ROC曲线图；图中：A为12种晚期标志物与尿蛋白的相关分析图；B为12种晚期期标志物的ROC曲线图。
具体实施方式
材料和仪器：Dionex UltiMate 3000超高效液相相色谱及四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱，(Dionex UltiMate 3000 UHPLC-Q Exactive HR-MS, Thermo-Fisher, USA)，Xcalibur工作站(Thermo Fi油er Scientific Inc., Waltham, Ma, USA)，TGL-16高速台式冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司)；KYJ-3 氮吹仪专用空气源(北京斯珀特科技有限公司)；Sartorius BSA124S分析天平(德国Sartorius公司)。
试剂：HPLC级乙腊、甲醇和甲酸(Fisher Scientific公司)；阿霉素(注射用盐酸多柔比星，深圳万乐药业股份有限公司，批号:1409E3)。
动物：SPF级雄性SD大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK (京) 2013-0014；动物饲养室保持温度（23±1.5)℃，相对湿度(45±15)%。
一、阿霉素肾病模型的复制与传统评价
1.阿霉素肾病模型的复制：雄性SD大鼠共30只，适应环境一周，收集30只大鼠24 h的尿液，并记录尿液体积。以大鼠的尿蛋白定量和体重为依据进行初筛，去除尿蛋白或体重过高与过低的不合格大鼠，将合格大鼠随机分为空白对照组（C组）与阿霉素肾病模型组（M1组和M2组），每组7只，实验过程中自由饮水进食；
M1组大鼠于第1天尾静脉注射4 mg/kg的阿霉素，随后隔1周，于第8天尾静脉注射2mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病早期模型。
M2组大鼠于第1天一次性尾静脉注射6 mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病晚期模型。C组以相同的方式给予等剂量的生理盐水。
2.阿霉素肾病模型的传统评价：
A、病理组织切片分析：C、M1和M2组大鼠于第42天腹腔注射水合氯醛，进行解剖，取出右肾放到10%福尔马林中固定。
具体病理组织切片分析流程：第一步，制片；第二步，脱水及包埋；第三步，切片；第四步，染色；第五步，透明及封片；第六步，光镜检查。
B、尿蛋白定量分析：在模型复制过程中，分别于第0天、第7天、第14天、第28天、第42天早上9:00将C、M1和M2组大鼠分别置于大鼠代谢笼中，于次日早上9:00收集尿液，并记录尿液体积，对收集的尿液样品于4℃，3500 rpm离心15 min后取上清液，置于-80℃冰箱备用。
采用双辛丁酸（BCA）法进行尿蛋白定量测定，于562 nm测定大鼠24 h尿液吸光度，依据标准曲线计算尿蛋白浓度。通过将尿蛋白浓度（mg/mL）乘以24 h尿体积（mL）来计算24h尿蛋白排泄量（Upro）。
3.差异代谢物的寻找：血清样品的数据采集：将收集的C1组与M1组和M2组血清样本进行LC-MS分析。在分析之前，血浆样品在冰水混合物中解冻，取200 μL并加入800 μL乙腈，充分震荡均匀后，4℃下13,000 rpm离心20 min, 取上清液800 μL，置于氮气下吹干。加入200 μL 80%乙腈-水（v/v）后,涡旋2 min, 0.22 μm滤膜滤过，待LC-MS分析。
采用HESI离子化方式，喷雾电压：正极，3.5kV；负极，2.5kV。毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z100-1500，正离子切换采集模式；分辨率采用MS Full Scan 35000 FWHM，MS/MS17500FWHM，NCE为12.5eV，25eV和37.5eV。
所有原始文件，包括C1组与M1组和M2组，都是通过Xcalibur 工作站和CompoundDiscover 2.0导出的，得到了一个独立的峰值表m/z和保留时间。所有样品均采用以下参数进行研究：S/N阈值：3，质量范围：100~1500 Da，质量公差：5 ppm。
血清样品的数据处理：将数据矩阵导入SIMCA-P 13.0（Umetrics，Umea，Sweden）软件中。以C组与M1组和M2组构建无监督的模式识别主成分分析（PCA），可以反映数据的原始状态，较直观显示不同样品之间的整体差异；以C组与M1组和M2组构建偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），以排列实验（permutation test）评价模型的可靠性，并用于后续差异代谢物的鉴定；以C组与M1组和M2组构建V+S-plot（coefficient>0.7）结合VIP（>1）寻找对二者分组贡献较大的差异代谢物，进一步通过t-test（p<0.05）确定具有显著性的差异代谢物。
4.标志物的鉴定
阿霉素模型大鼠血清生物标志物的鉴定：根据S-plot和VIP值，选定具有统计学显著差异的质谱离子（VIP>1.0及P<0.05），确定为鉴定的差异物标志物。这些质谱离子的PCA分析显示空白组和模型组能明显区分，进一步结合其他的统计学分析方法，根据与血清代谢组学代谢产物的鉴定方法，利用质谱数据和HMBD、Chemspider、KEGG和Lipidmaps等数据库最终在M1组和M2组分别鉴定13个和18个有显著差异的代谢产物，它们可能是肾病综合征的血清标志物。
进展性的标志物：M1组为早期模型，M2组为晚期模型，将两者均有的差异代谢物认为是进展性标志物。为了进一步了解代谢变化，以生物标志物为基础进行了热图分析。此外，这些特定代谢物的相对含量的详细变化用柱状图表示。最终确定这些代谢产物可能为肾病综合征的进展性标志物。
早期生物标志物：M1为早期模型，根据S-plot和VIP值，对C组和M1组进行分析，选定具有统计学显著差异的质谱离子（VIP>1.0及P<0.05），确定为鉴定的早期标志物。以上述潜在早期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择合适的相关分析方法，计算二者的相关系数，确定早期标志物；依据ROC曲线下面积，评估进展性标志物的诊断准确性，通常认为AUC<0.5为无诊断能力，0.5<AUC<0.7为诊断准确性较低，0.7<AUC<0.9为诊断准确性较好，AUC>0.9为诊断准确性最好。以AUC>0.7的代谢物，最终被认为可作为反映肾病综合征的早期标志物。
晚期生物标志物：M2为晚期模型，根据S-plot和VIP值，对C组和M2组进行分析，选定具有统计学显著差异的质谱离子（VIP>1.0及P<0.05），确定为鉴定的晚期标志物。以上述潜在晚期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择合适的相关分析方法，计算二者的相关系数，确定晚期标志物；依据ROC曲线下面积，评估进展性标志物的诊断准确性。以AUC>0.7的代谢物，最终被认为可作为反映肾病综合征的晚期标志物。
二、结果
1.模型传统评价结果：由尿蛋白定量分析结果（见表1）可知，与C组比较，M组大鼠造模后尿蛋白定量随时间呈现稳定上升趋势，且于第14天具有显著性差异（p<0.05），表明造模成功。其中M2组比M1组尿蛋白定量结果更高，间接显示出M2模型损伤严重，可作为晚期模型。
表1 空白组与阿霉素肾病模型组大鼠尿蛋白定量动态分析
Figure DEST_PATH_IMAGE002
“*”代表与空白对照组相比，*p<0.0
由组织病理切片图分析结果（图1）可知，与C组比较，M1组和M2组肾小管上皮细胞中至重度水样变性，小管嗜碱性变及蛋白管型多见，成纤维细胞中至重度成纤维细胞增生，间质炎细胞中至重度炎细胞浸润，部分小管上皮细胞萎缩，管腔变大，表明模型复制成功。其中M2组比M1组组织病理损伤更严重，间接显示出M2模型损伤严重，可作为晚期模型。
2.差异代谢物的寻找：C组与M1和M2组大鼠血清代谢物归属：参照文献以及比对标准品，分别指认出化合物13个和18个（见表2）。
表2 大鼠血清中主要化合物的LC-MS数据归属
Figure DEST_PATH_IMAGE004
TR代表化学位移
对C组与M1和M2组血清代谢轮廓数据进行PCA（见图2A，2D）、PLS-DA排列实验（见图2B,2E）和V-S-plot（见图2C,2F），可以看出，图（2A，2D）中C组与M1和M2组二者明显分开,说明模型复制成功。模型参数(M1: R2Y=0.970, Q2=0.893; M2: R2Y=0.977, Q2=0.859)，且R2和Q2均接近1，说明所建分类模型稳定可靠，可用于后面差异代谢物的寻找。相应的V+S-plot（图2C,2F）结合VIP（>1），并经过t-test筛选，找到对分组贡献较大的代谢物。
进展性的标志物：M1组和M2组中双（4-乙基苄基）山梨醇, C16二氢鞘氨醇, 溶血磷脂酰乙醇胺(22:6), 溶血磷脂酰胆碱(22:5), N-乙醇胺, 脯氨酸均发生显著变化。双（4-乙基苄基）山梨醇, C16二氢鞘氨醇, N-乙醇胺, 脯氨酸这4个代谢物在M1和M2组持续降低，而溶血磷脂酰乙醇胺(22:6), 溶血磷脂酰胆碱(22:5)在M1和M2组持续升高。最终确定这些代谢产物可能为肾病综合征的进展性标志物。
早期的标志物：以上述7个早期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，计算二者的相关系数（见图4A），研究结果发现阿霉素肾病模型尿蛋白定量与油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S-羟基-二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)呈正相关，与溶血磷脂酰胆碱(18:1)呈负相关，相关系数均大于0.5。采用ROC曲线对早期标志物的诊断能力进行评估（见图4B），最终得出油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S-羟基-二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)和溶血磷脂酰胆碱(18:1)的曲线下面积均大于0.9，可作为早期标志物，用于肾病综合征模型早期病变的评价。
晚期的标志物：以上述12个晚期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，计算二者的相关系数（见图5A），研究结果发现阿霉素肾病模型尿蛋白定量与酰基肉毒碱 C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)呈正相关，与DL-色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3-吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇-1-磷酸，L-苏式-二氢鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/14:0)呈负相关，相关系数均大于0.5。采用ROC曲线对晚期标志物的诊断能力进行评估（见图5B），最终得出酰基肉毒碱 C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)，DL-色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3-吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇-1-磷酸和神经酰胺(d18:0/14:0)的曲线下面积均大于0.9，可作为晚期标志物，用于肾病综合征模型晚期病变的评价。
本发明最终确定了反映肾病综合征进展性病变的标志物。即以双（4-乙基苄基）山梨醇, C16二氢鞘氨醇, 溶血磷脂酰乙醇胺(22:6), 溶血磷脂酰胆碱(22:5), N-乙醇胺,脯氨酸作为进展性标志物；油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S-羟基-二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)和溶血磷脂酰胆碱(18:1) 作为早期标志物；酰基肉毒碱 C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)，DL-色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3-吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇-1-磷酸，L-苏式-二氢鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/14:0)作为晚期标志物；用于肾病综合征模型病变及病程进行评价。

Claims (6)

1.一种大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物，其特征在于：所述代谢标志物为双（4-乙基苄基）山梨醇, C16-二氢鞘氨醇, 溶血磷脂酰乙醇胺(22:6), 溶血磷脂酰胆碱(22:5), N-乙醇胺和脯氨酸作为进展性标志物；油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S-羟基-二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)和溶血磷脂酰胆碱(18:1)作为早期标志物；酰基肉毒碱 C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)，DL-色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3-吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇-1-磷酸，L-苏式 - 二氢鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/14:0)作为晚期标志物；
筛选所述大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物的方法，步骤如下：
（1）两种阿霉素肾病模型的复制与传统评价：将大鼠随机分为空白对照组，早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组，早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组采用尾静脉注射阿霉素进行诱导，建立阿霉素肾病模型；利用肾组织病理损伤程度与尿蛋白定量水平对阿霉素肾病模型进行评价；
（2）差异代谢物的寻找：在不同时间阶段收集各组大鼠的血清样品，对血清进行LC-MS分析，归属出代谢物；液质图谱经处理转换为数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行差异代谢物寻找；
（3）结合统计方法筛选、确定反映肾病综合征病变进程的标志物；
（4）基于代谢物的相对含量，采用热图、相关分析图对代谢物进行确证，并采用ROC曲线对标志物的诊断能力进行评估，最终确定出反应肾病综合征模型的早期、晚期和进展性标志物。
2.根据权利要求1所述的大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物，其特征在于：步骤（1）中两种阿霉素肾病模型的复制的具体方法为：大鼠适应环境一周，收集大鼠24 h的尿液，并记录尿液体积；以大鼠的尿蛋白定量和体重为依据进行初筛，将合格大鼠随机分为空白对照组与早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组，实验过程中自由饮水进食；早期阿霉素肾病模型组大鼠于第1天尾静脉注射4 mg/kg的阿霉素，随后隔1周，于第8天尾静脉注射2 mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病早期模型；晚期阿霉素肾病模型组大鼠于第1天一次性尾静脉注射6 mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病晚期模型；空白对照组以相同的方式给予等剂量的生理盐水；
在模型复制过程中，分别于第0天、第7天、第14天、第28天、第42天早上9:00将空白对照组和早期和晚期阿霉素肾病模型组大鼠分别置于大鼠代谢笼中，于次日早上9:00收集尿液，并记录尿液体积，对收集的尿液样品于4℃，3500 rpm离心15 min后取上清液，置于-80℃冰箱备用；
对尿液采用双辛丁酸BCA法进行尿蛋白定量分析，在562 nm处定量测定大鼠24 h尿液吸光度，依据标准曲线计算尿液蛋白浓度，通过将尿蛋白浓度mg/mL乘以24 h尿体积mL来计算24 h尿蛋白排泄量Upro。
3.根据权利要求1所述的大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物，其特征在于：血清样品进行LC-MS分析具体方法为：采用HESI离子化方式，喷雾电压：正极，3.5kV；负极，2.5kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z100-1500，正离子切换采集模式；分辨率采用MSFull Scan 35000 FWHM，MS/MS17500FWHM，NCE为12.5eV，25eV和37.5eV；
所有原始文件，包括C1组与M1组和M2组，都是通过Xcalibur 工作站和CompoundDiscover 2.0导出的，得到了一个独立的峰值表m/z和保留时间；所有样品均采用以下参数进行研究：S/N阈值：3，质量范围：100~1500 Da，质量公差：5 ppm。
4.根据权利要求1所述的大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物，其特征在于：步骤（2）中血清样品数据处理方法为：将数据矩阵导入SIMCA-P 13.0软件中，以空白对照组与早期和晚期阿霉素肾病模型组构建无监督的模式识别主成分分析PCA；以空白对照组与早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组构建偏最小二乘法判别分析PLS-DA，以排列实验评价模型的可靠性，并用于后续差异代谢物的鉴定；构建V+S-plot coefficient>0.7结合VIP>1寻找对二者分组贡献较大的差异代谢物，通过t-test，p<0.05确定具有显著性的差异代谢物。
5.根据权利要求1所述的大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物，其特征在于：步骤（3）具体方法为：根据S-plot和VIP值，选定具有统计学显著差异的质谱离子VIP>1.0及P<0.05，确定为鉴定的差异物标志物；将早期和晚期模型均有的差异代谢物认为是进展性标志物；
根据S-plot和VIP值，对空白对照组和早期阿霉素肾病模型组进行分析，选定具有统计学显著差异的质谱离子VIP>1.0及P<0.05，确定为潜在早期标志物；以上述潜在早期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择相关分析方法，计算二者的相关系数，确定早期标志物；依据ROC曲线下面积，以AUC>0.7的代谢物作为反映肾病综合征的早期标志物；
根据S-plot和VIP值，对空白对照组和晚期阿霉素肾病模型组进行分析，选定具有统计学显著差异的质谱离子VIP>1.0及P<0.05，确定为潜在晚期标志物；以上述潜在晚期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择相关分析方法，计算二者的相关系数，确定晚期标志物；依据ROC曲线下面积，以AUC>0.7的代谢物作为反映肾病综合征的晚期标志物。
6.权利要求1所述的大鼠模型肾病综合征病变进程的相关代谢标志物的应用，其特征在于：所述代谢标志物在制备大鼠模型肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111426766A (zh) * 2020-04-17 2020-07-17 中国药科大学 一种药源性急性肾损伤小鼠模型的构建及评价方法
CN111413431B (zh) * 2020-04-17 2022-03-01 中国药科大学 一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法
WO2021232211A1 (zh) * 2020-05-19 2021-11-25 深圳市中医院 诊断肾病的标志物以及诊断方法
CN111896728B (zh) * 2020-07-07 2023-10-13 山西大学 一种检测柴胡石油醚部位抗抑郁量-效与量-毒关系的组合标志物及其应用
CN115963249B (zh) * 2022-12-08 2025-03-25 浙江大学医学院附属儿童医院 一种生物标志物在制备早期诊断肾病综合征试剂中的应用
CN115951071B (zh) * 2023-01-31 2025-08-22 复旦大学附属中山医院 一种基于内源性多肽的疾病特征多肽标志物的检测方法
CN116068161A (zh) * 2023-03-07 2023-05-05 中国中医科学院中药研究所 一种诊断肝病的生物标志物及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102901789A (zh) * 2012-09-21 2013-01-30 中国药科大学 糖尿病肾病早期诊断的血清代谢标志物测定方法
US20180003721A1 (en) * 2015-01-15 2018-01-04 Joslin Diabetes Center Metabolite Biomarkers Predictive Of Renal Disease In Diabetic Patients
CN108918571B (zh) * 2018-06-15 2021-02-02 山西大学 代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的应用
CN109507337B (zh) * 2018-12-29 2022-02-22 上海交通大学医学院附属新华医院 一种基于血尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的新方法

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