CN110277135A - 一种基于预期疗效选择个体化肿瘤新抗原的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于预期疗效选择个体化肿瘤新抗原的方法和系统,包括如下步骤细胞选择性模型的建立与优化,治疗效果模型的建立与优化和个体化肿瘤新抗原的辅助选择等步骤,本发明可以在不涉及患者的情况下,最大化利用生物学实验进行试错,建立最为精确的细胞选择性模型,最大化利用生物学实验提高针对个体患者的有效性;然后进一步考虑新抗原细胞选择性与患者免疫状态的关联,建立完整疗效预测模型,以实际疗效评估特定新抗原对特定患者的适用性,为医生选择合适的新抗原进行免疫治疗提供高价值的参考信息,同时最大化利用医生治疗的实际效果反馈,不断提升新抗原免疫治疗整体有效性的预测精度。

Description

一种基于预期疗效选择个体化肿瘤新抗原的方法和系统
技术领域
本发明涉及肿瘤新抗原选择领域,具体来说,本发明涉及一种基于预期疗效选择个体化肿瘤新抗原的方法和系统。这一系统可以协助医生分析数据,加速新抗原免疫治疗的过程,提高治疗效果。与新药发现流程进行类比,本发明提供的系统,对应于新药发现流程中的一种候选药物辅助设计系统(软件工具)。
背景技术
目前肿瘤患者的常规治疗主要依赖非个体化的手术切除、放化疗、靶向药物治疗等手段,但这些常规手段存在很多问题,如治疗不彻底、副作用大、易使肿瘤转移耐药等,仅短暂延长肿瘤患者的生存期。
近年来,通过肿瘤患者自身的免疫系统靶向患者肿瘤细胞进行肿瘤免疫治疗的方法进入了人们的视野。有研究表明,个体化肿瘤免疫治疗在黑色素瘤、乳腺癌等实体瘤中可能具有较好疗效。在个体化肿瘤免疫治疗中,发挥关键作用的肿瘤患者特异靶标分子被称为肿瘤新抗原。肿瘤新抗原的本质是蛋白质,由肿瘤基因组突变产生,因含有非同义突变,与异常表达的肿瘤自体蛋白抗原不同。在体内,肿瘤新抗原能够被自身免疫系统识别为外来抗原,不受中枢耐受影响,从而使自身免疫系统特异性靶向患者肿瘤细胞。因此,将肿瘤新抗原制备成疫苗或多肽制剂进行肿瘤免疫治疗,可以选择性杀灭肿瘤细胞,安全性高,效果显著。而在这一策略中,准确高效地在众多可能区分肿瘤和正常组织的肽段中个体化地选择预期疗效好的肿瘤新抗原尤为关键。
在新抗原免疫治疗的过程中,医生需要综合考虑多种因素选择合适的新抗原进行治疗,可以借助专业工具进行辅助。现有的一些肿瘤新抗原辅助选择方法中,考虑了一些与个体化肿瘤免疫治疗的疗效弱相关的肿瘤新抗原特征(如胞内肽段剪切呈递效率、肽段相似性得分等)。这些特征与实际治疗效果的相关性还存在机制不明、参考数据量少等缺点。在缺乏机制了解、参考数据不足的情况下,使用这些特征进行建模,反而会降低高疗效肿瘤新抗原被正确选择的可能性。此外,现有的肿瘤新抗原选择方法,大多仅通过作者提出的疗效相关性理论对肿瘤新抗原进行打分,从而获得作者认为最有效的肿瘤新抗原。由于目前对肿瘤新抗原产生疗效的机制仍有很多不明之处,现有理论很不完善,所以仅仅依据某一作者的理论思考,难以有效地选择高疗效的肿瘤新抗原。同时,这些方法采用非人工智能方法,不能通过现有的理论找到与正常蛋白相比更具免疫原性肿瘤新抗原,也不能在肿瘤新抗原数据不断积累的情况下,充分利用这些数据,实现肿瘤新抗原辅助选择方法的自身进化。
发明内容
本发明针对现有肿瘤新抗原辅助选择方法中存在的不足,提供一种基于预期疗效,辅助医生进行个体化肿瘤新抗原选择的方法和系统(软件工具),本发明通过以下技术方案来实现:
本发明公开了一种基于疗效预测选择个体化肿瘤新抗原的方法,包括如下步骤:
1)、细胞选择性模型的建立与优化;
2)、治疗效果模型的建立与优化;
3)、个体化肿瘤新抗原的辅助选择。
作为进一步地改进,本发明所述的步骤1)细胞选择性模型的建立包括如下步骤:
1.1.1、获取目标细胞系、对照细胞系测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的短肽;
1.1.2、根据步骤1.1.1中的测序数据,提取细胞选择性相关特征;
1.1.3、使用步骤1.1.1中目标细胞系,构建对应疾病模型;
1.1.4、使用步骤1.1.3中构建的疾病模型,进行生物学实验评估;
1.1.5、收集步骤1.1.2和步骤1.1.4中得到的细胞选择性相关特征描述和生物学实验评估结果,建立细胞选择性初始模型。
作为进一步地改进,本发明所述的步骤1)细胞选择模型的优化包括如下步骤:
1.2.1、获取目标细胞系、对照细胞系测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的短肽;
1.2.2、根据步骤1.2.1中的测序数据,提取细胞选择性相关特征;
1.2.3、根据步骤1.2.2中的细胞选择性相关特征,利用细胞选择性模型打分;
1.2.4、使用步骤1.2.1中的目标细胞系,构建对应疾病模型;
1.2.5、使用步骤1.2.4中构建的疾病模型,进行生物学实验评估;
1.2.6、评估步骤1.2.3中得到的细胞选择性模型打分结果与步骤1.2.5中得到的生物学实验结果的一致性,优化细胞选择性模型。
作为进一步地改进,本发明所述的步骤2)中,治疗效果模型的建立包括如下步骤:
2.1.1、根据细胞选择性模型,获取细胞选择性特征得分;
2.1.2、根据测序数据,提取免疫治疗效果相关特征;
2.1.3、预测患者预期疗效;
2.1.4、收集步骤2.1.1、步骤2.1.2、步骤2.1.3中的细胞选择性特征得分、免疫治疗效果相关特征、患者预期疗效,建立治疗效果初始模型。
作为进一步地改进,本发明所述的步骤2)中,治疗效果模型的优化包括如下步骤:
2.2.1、根据细胞选择性模型,获取细胞选择性特征得分;
2.2.2、根据测序数据,提取免疫治疗效果相关特征;
2.2.3、收集步骤2.2.1、步骤2.2.2中的细胞选择性特征得分、免疫治疗效果相关特征,利用治疗效果模型打分,得到肿瘤新抗原疗效预测得分;
2.2.4、对患者进行疗效追踪;
2.2.5、评估步骤2.2.3中得到的治疗效果模型打分结果与步骤2.2.4中得到的患者实际疗效的一致性,优化治疗效果模型。
作为进一步地改进,本发明所述的步骤3)中,个体化肿瘤新抗原的选择包括如下步骤:
3.1、获取肿瘤组织、正常组织样本(例如瘤旁组织)的测序数据,或利用单细胞测序技术得到肿瘤样本中的肿瘤和非肿瘤细胞的测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的候选新抗原;
3.2、根据步骤3.1中的测序数据,提取与细胞选择性、免疫治疗效果相关特征;
3.3、收集步骤3.2中的细胞选择性相关特征,利用细胞选择性模型对肿瘤新抗原进行打分;
3.4、收集步骤3.2、步骤3.3中的免疫治疗效果相关特征、细胞选择性特征得分,利用治疗效果模型进行打分,得到不同肿瘤新抗原的预期治疗效果得分;
3.5、收集步骤3.4中的肿瘤新抗原预期治疗效果得分,生成关于肿瘤新抗原预期疗效和关键影响因素的报告,辅助医生选择新抗原进行后续治疗。
作为进一步地改进,本发明所述的细胞选择性模型,其输入是候选新抗原的特征,这些特征可能在目标细胞与对照细胞之间产生免疫选择性;其输出是细胞选择性的一个度量(分数);治疗效果模型,其输入是患者分子生理状态特征,这些特征可能与免疫治疗效果相关,其输出是不同新抗原的预期治疗效果的一个度量(分数)。
作为进一步地改进,本发明所述的细胞选择性模型包括特征提取层和机器学习层。特征提取层提取与细胞选择性相关特征,包括多肽丰度、亲和力、癌症倾向性等,用于从原始测序数据中提取与细胞选择性相关的特征。机器学习层借助机器学习进行建模,包括支持向量机、贝叶斯算法、神经网络、深度学习等,用于对第一层提取的各种特征进行筛选,然后拟合生物学实验测得的细胞选择性。
作为进一步地改进,本发明所述的治疗效果模型包括特征提取层和机器学习层。所述的特征提取层提取与免疫治疗效果相关特征,包括患者免疫状态特征、受损基因特征等,用于从原始测序数据中提取与免疫治疗效果相关的特征。所述的机器学习层借助机器学习进行建模,包括支持向量机、贝叶斯算法、神经网络、深度学习等,用于对第一层提取的各种特征以及细胞选择性数学模型输出的各种特征进行筛选,然后拟合患者疗效追踪的数据。
本发明还公开了一种基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原方法的系统,系统包括:细胞选择性预测模型、治疗效果预测模型和肿瘤新抗原辅助选择模型;所述的细胞选择性预测模型包括:
多肽获取模块,用于从目标细胞系、对照细胞系的测序数据中获取非同义突变多肽及其注释信息;
细胞选择性模型特征提取模块,用于提取与细胞选择性模型相关的特征值;
生物学实验评估模块,用于构建相应疾病模型,通过生物学实验评估多肽是否具有免疫原性;
细胞选择性模型建立模块,用于将细胞选择性模型相关特征值与评估结果输入机器学习层,构建细胞选择性模型;
细胞选择性模型打分模块,用于对细胞选择性模型相关特征打分;
细胞选择性模型优化模块,用于对模型进行优化,提高细胞选择性模型的预测精度;
治疗效果预测模型包括:
治疗效果模型特征提取模块,用于提取与治疗效果模型相关的特征值;
治疗效果模型建立模块,用于将治疗效果模型相关特征值输入机器学习层,建立治疗效果初始模型;
患者疗效追踪模块,用于追踪患者的实际治疗效果,收集数据;
治疗效果模型打分模块,用于对治疗效果模型相关特征打分;
治疗效果模型优化模块,用于对模型进行优化,提高治疗效果模型的预测精度;
肿瘤新抗原辅助选择模型包括:
多肽获取模块,用于从目标细胞系、对照细胞系的测序数据中获取非同义突变多肽及其注释信息;
细胞选择性模型特征提取模块,用于提取与细胞选择性模型相关的特征值;
细胞选择性模型打分模块,用于对细胞选择性模型相关特征打分;
治疗效果模型特征提取模块,用于提取与治疗效果模型相关的特征值;
治疗效果模型打分模块,用于对治疗效果模型相关特征打分;
肿瘤新抗原特征报告模块,用于向医生报告候选新抗原的预期疗效和相关关键特征,供医生在选择新抗原进行免疫治疗时参考。
本发明的优势是:可以在不涉及患者的情况下,最大化利用生物学实验进行试错,建立最为精确的细胞选择性模型,最大化利用生物学实验提高针对个体患者的有效性;然后进一步考虑新抗原细胞选择性与患者免疫状态的关联,建立完整疗效预测模型,以实际疗效评估特定新抗原对特定患者的适用性,为医生选择合适的新抗原进行免疫治疗提供高价值的参考信息,同时最大化利用医生治疗的实际效果反馈,不断提升新抗原免疫治疗整体有效性的预测精度。
本发明的有益效果如下:
(1)、本发明通过有机地结合不涉及肿瘤患者的生物学实验和涉及患者的疗效追踪,将肿瘤新抗原治疗的疗效预测因素进行分解,分步骤分阶段对模型进行优化。其中,细胞选择性模型通过生物学实验进行拟合和优化;具有特定肿瘤细胞选择性的新抗原应用于具体患者时的治疗效果模型依据患者的疗效追踪数据进行优化。通过这一方法可以为医生提供高精度的新抗原有效性预测,为医生选择合适的新抗原进行免疫治疗提供参考。
(2)、本发明借助多种实验方法选择个体化肿瘤新抗原。本发明利用多种实验方法包括但不限于肿瘤疾病模型(如细胞系模型、PDX小鼠模型等)实验,进行肿瘤新抗原的选择,可进一步提高所选择肿瘤新抗原的可靠性。同时,最大化利用生物学实验进行试错,建立最为精确的肿瘤细胞选择性模型,可提高其预测精度。
(3)、本发明构建了一个自学习自适应的肿瘤新抗原选择人工智能系统。一方面,随着数据量的不断增多,本人工智能系统会去除治疗效果模型中与肿瘤新抗原临床治疗效果无关的指标,并不断收入与肿瘤新抗原临床治疗效果相关的指标(如肿瘤新抗原标志物等);另一方面,结合过去经验、模型评估结果,肿瘤细胞选择性模型和治疗效果模型的计算方法和参数都会通过本人工智能系统不断进行自进化。
人工智能系统,最初通过体外模型训练一个接近最优的选择模型,作为起点。初始疗效模型也可同现有的选择方法进行比较,以确认模型已经达到了足够的精度,能够准确选择肿瘤新抗原。随着实际应用该系统的新抗原免疫治疗的案例的不断增加,系统会将实际案例补充到模型的训练集中,以自学习自适应的方式,进一步提高肿瘤新抗原的选择精度和选择效率。这一系统可以拓展人类经验积累的局限,利用个人无法分析处理的大数据案例集,建立普适稳健的预测模型。
(4)、本发明选取与个体化肿瘤免疫治疗效果强相关的肿瘤新抗原特征。与这些特征预测相关的数据质量高、数据量大,使用这些特征进行建模,会大大提高高疗效肿瘤新抗原的选择效能。
(5)、本发明系统地考虑了肿瘤新抗原从选择到应用的整个过程中影响个体化肿瘤新抗原实际效果的因素,通过对全流程进行建模,可以更有效地指导新抗原的选择。
(6)、本发明构建了基于个体化肿瘤模型的评估方法,一方面可以对系统选择的肿瘤新抗原进行评估,检测肿瘤新抗原是否具有免疫原性,另一方面方便对整个系统进行动态修正,提高系统的精度和效率。
附图说明
图1为本发明技术方案的具体流程示意图;
图2为本发明技术方案细胞选择性模型的建立与优化的流程示意图;
图3为本发明技术方案治疗效果模型的建立与优化的流程示意图;
图4是肝癌细胞系中选择的突变肽及其野生肽免疫原性检测的ELISPOT实验结果示意图;
图5肝癌细胞系中选择的突变肽及其野生肽免疫反应性检测的LDH试验结果示意图;
图6是细胞选择性模型与文献模型(pVAC-Seq[1]、TSNAD[2]、MuPeXI[3])的ROC曲线图;
图7是非小细胞肺癌样本中选择的突变肽及其野生肽免疫原性检测的ELISPOT实验结果示意图;
图8是非小细胞肺癌样本中选择的突变肽及其野生肽免疫反应性检测的LDH试验结果示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种基于疗效预测选择个体化肿瘤新抗原的方法和系统,具体方法包括如下内容:
图2为本发明技术方案细胞选择性模型的建立与优化的流程示意图:
1、细胞选择性模型的建立与优化:
细胞选择性模型与肿瘤细胞的选择能力相关,模型建立后立即可用,其准确性不断进行优化。在模型建立前,使用文献发表的方法,对新抗原的细胞选择性进行初步预测。将初步预测结果组建为理论训练数据集,用于模型拟合,得到与文献预测精度相当的初始模型。在模型建立后,利用细胞系数据和真实患者数据,结合生物学实验评估,组建真实训练数据集,用于模型修正,进一步提高预测精度。
1.1、细胞选择性模型的建立:
细胞选择性模型,其输入是候选新抗原的特征,这些特征可能在目标细胞与对照细胞之间产生免疫选择性;其输出是细胞选择性的度量。输入与输出均为多维。具体来说,与细胞选择性相关的候选新抗原特征由多肽丰度、MHC亲和力、癌症倾向三部分组成。多肽丰度即目标组织特异突变的肽段与对照组织未突变肽段的表达量。MHC亲和力即突变和未突变肽段与主要组织相容性复合体的结合亲和力。癌症倾向即突变基因功能受损引起癌症的倾向性。
1.1.1、获取目标细胞系、对照细胞系测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的短肽:
选用两种不同肿瘤细胞系作为目标细胞系和对照细胞系,进行高通量转录组测序,分析得到目标细胞系特异的突变。作为进一步改进,可将对照细胞系进行基因组测序,用于验证转录组测序选择的肿瘤组织特异体细胞突变(特别是可变剪切)的准确性,同时可以选择其他特异位点(如肿瘤组织和瘤旁正常组织均发生突变但表达量存在显著差异的突变位点)。
测序数据下机后进行预处理操作。对测序数据进行质控分析、参考基因组比对,选择并注释肿瘤组织特异的非同义体细胞突变(包括但不限于SNP、Indel、基因融合、可变剪切)。生成含有非同义体细胞突变的由8-11个氨基酸组成的短肽,作为候选新抗原。
作为进一步改进,本步骤可通过其他方法实现(如免疫肽段组学、非参考基因组比对等),旨在找到含非同义体细胞突变的候选新抗原。
1.1.2、根据步骤1.1.1中的测序数据,提取细胞选择性相关特征:
在多肽丰度方面,可以提取的特征包括但不限于FPKM值、RPKM值、TPM值、RPM值。这些特征可以通过StringTie、Cufflinks等软件提取。在MHC亲和力方面,可以提取的特征为多肽与MHC分子结合亲和力(包括MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子)。这些特征可以通过MHCflurry、NetMHC或NetMHCpan等软件提取。在癌症倾向方面,可以提取的特征为多肽所含突变的突变类型和突变频率。相关特征可以通过Annovar、VEP、MuTect2或VarScan2等软件提取。此外,收集癌症驱动基因突变信息,建立癌症驱动基因突变数据库,用于评估突变的癌症倾向性。
作为进一步改进,本发明所述的细胞选择性相关特征中,最新文献中关于NetTepi、NNAlign、NetCTL等分析软件的输出结果均可以成为相应特征,供细胞选择性模型的机器学习层筛选。
1.1.3、使用步骤1.1.1中目标细胞系,构建对应疾病模型:
使用肿瘤疾病模型,包括但不限于细胞系模型和动物模型。细胞系模型包括但不限于使用商业化的标准细胞系,使用患者原代细胞建系,或者通过遗传操作新建带有肿瘤突变特征的细胞系。动物模型包括普通荷瘤鼠模型和患者来源肿瘤组织移植鼠(PDX)模型。
1.1.4、使用步骤1.1.3中构建的疾病模型,进行生物学实验,评估新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的识别能力和杀伤能力:
对于细胞系模型,可以使用酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked ImmunospotAssay,ELISPOT)评估新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的识别能力;可以使用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放试验评估新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
对于动物模型,可以使用ELISPOT实验检测小鼠PBMC中斑点形成细胞的数目评估新抗原特异性T细胞对肿瘤组织的识别能力;可以通过观察小鼠瘤块前后变化评估新抗原特异性T细胞对肿瘤组织的杀伤能力。
1.1.5、收集步骤1.1.2和步骤1.1.4中得到的细胞选择性相关特征描述和生物学实验评估结果,建立细胞选择性初始模型:
将步骤1.1.4中的肿瘤新抗原实验评估结果作为初始模型的训练数据,与步骤1.1.2中提取的细胞选择性相关特征,输入到机器学习层进行模型训练(训练方法包括但不限于支持向量机、贝叶斯算法、深度学习)。在没有进行新抗原选择性实验评估前,使用文献发表的方法,对新抗原进行初步预测,结合生物学实验评估结果,组建理论训练数据集。将提取的细胞选择性相关特征与预测新抗原的实验评估结果作为训练数据,训练预测模型。此时模型与文献方法的预测精度相当,且立即可用。
1.2、细胞选择性模型的优化:
通过细胞选择性模型优化,进一步提高模型预测精度。将肿瘤患者组织进行测序分析,结合生物学实验评估,组建真实训练数据集,对细胞选择性模型的计算方法及参数进行修正,必要时可加入其它肿瘤细胞选择性相关特征。最终得到精度高于文献方法的细胞选择性模型。
1.2.1、获取目标细胞系、对照细胞系测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的短肽:
将肿瘤患者的肿瘤组织和癌旁正常组织作为目标细胞系和对照细胞系,进行高通量转录组测序,分析得到肿瘤组织特异的体细胞突变。作为进一步改进,与步骤1.1.1相同,可获取肿瘤患者的正常组织(包括但不限于口腔黏膜细胞或唾液),进行基因组测序。
通过与步骤1.1.1相同的方法,进行数据预处理,最终生成含有突变的由8-11个氨基酸组成的短肽,作为候选新抗原。
1.2.2、根据步骤1.2.1中的测序数据,提取细胞选择性相关特征:
使用与步骤1.1.2相同的方法,提取的细胞选择性相关特征。
1.2.3、收集步骤1.2.2中的细胞选择性特征,利用细胞选择性模型打分:
将步骤1.2.2中得到的细胞选择性相关特征,输入到细胞选择性模型中进行打分,得到候选新抗原的细胞选择性特征得分。
1.2.4、使用步骤1.2.1中的目标细胞系,构建对应疾病模型:
使用肿瘤疾病模型,包括但不限于细胞系模型和动物模型。细胞系模型使用患者原代细胞建系。动物模型使用患者来源肿瘤组织移植鼠(PDX)模型。
1.2.5、使用步骤1.2.4中构建的疾病模型,进行生物学实验,评估评估新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的识别能力和杀伤能力:
通过与步骤1.1.4相同的方法进行生物学实验评估。
1.2.6、评估步骤1.2.3中得到的细胞选择性模型打分结果与步骤1.2.5中得到的生物学实验结果的一致性,优化细胞选择性模型:
在步骤1.2.5完成后,组建真实训练数据集,利用实际数据训练修正细胞选择性模型。经过大量肿瘤细胞系数据训练后,得到精度高于文献方法的细胞选择性模型。
系统会将肿瘤细胞选择性模型打分结果与生物学实验评估结果进行比较,计算二者的一致性。当二者一致性较差,则根据生物学实验评估结果对肿瘤细胞选择性模型及其参数进行修正。必要时,可加入其他肿瘤细胞选择性相关特征。
图3为本发明技术方案治疗效果模型的建立与优化的流程示意图:
2、治疗效果模型的建立与优化:
治疗效果模型与肿瘤患者的免疫状态相关,模型建立后立即可用,其准确性不断进行优化。在初始模型建立时,使用文献中与免疫相关的特征,结合细胞选择性模型得分和受损基因相关特征,建立治疗效果初始模型。模型建立后,追踪肿瘤患者最终治疗效果,与治疗效果模型预测结果进行比较,当治疗效果模型结果与患者最终治疗效果不一致时,对模型进行优化,进一步提高预测精度。
2.1、治疗效果模型的建立:
治疗效果模型,其输入是患者分子生理状态特征,这些特征可能与免疫治疗效果相关,其输出是最终选择的肿瘤新抗原。具体来说,输入特征可以为细胞选择性模型得分、受损基因特征、免疫治疗效果特征(包括但不限于肿瘤细胞免疫相关转录组特征变量、特征表达基因)和患者预期疗效。其中细胞选择性模型得分由细胞选择性模型打分得到,受损基因特征和免疫治疗效果特征从测序数据中提取得到,患者预期疗效通过细胞选择性模型得分预测得到。
2.1.1、根据细胞选择性模型,获取细胞选择性特征得分:
根据肿瘤患者肿瘤组织和正常组织的转录组测序预处理结果,提取细胞选择性相关特征后,利用细胞选择性模型打分得到。
2.1.2、根据测序数据,提取免疫治疗效果相关特征:
根据肿瘤患者肿瘤组织和正常组织的转录组测序预处理结果,提取免疫治疗效果相关特征(包括但不限于患者免疫状态特征、受损基因特征)。其中,患者免疫状态特征包括但不限于肿瘤细胞免疫相关转录组特征变量、特征表达基因;受损基因特征包括但不限于受损基因与肿瘤的相关性、基因受损程度。
2.1.3、预测患者预期疗效:
根据步骤2.1.1、步骤2.1.2、步骤2.1.3中的细胞选择性特征得分、受损基因相关特征、免疫治疗效果相关特征,对患者预期疗效进行预测。
2.1.4、收集步骤2.1.1、步骤2.1.2、步骤2.1.3中的细胞选择性特征得分、免疫治疗效果相关特征、患者预期疗效,建立治疗效果初始模型:
通过将步骤2.1.1中的细胞选择性特征得分,步骤2.1.2中提取的免疫治疗效果相关特征,和步骤2.1.3中预测的患者预期疗效输入到机器学习层进行模型训练,建立治疗效果初始模型。
2.2、治疗效果模型的优化:
通过治疗效果模型优化,进一步提高模型预测精度。提取治疗效果模型输入特征,经由治疗效果模型进行打分。治疗效果模型打分结果可由医生进行参考,辅助诊断治疗。追踪肿瘤患者的实际治疗效果,当治疗效果模型结果与患者最终治疗效果不一致时,对模型进行修正。
2.2.1、根据细胞选择性模型,获取细胞选择性特征得分:
通过与步骤2.1.1相同的方法,获取细胞选择性特征得分。
2.2.2、根据测序数据,提取免疫治疗效果相关特征:
通过与步骤2.1.2相同的方法,提取免疫治疗效果相关特征(包括但不限于患者免疫状态特征、受损基因特征)。
2.2.3、收集步骤2.2.1、步骤2.2.2中的细胞选择性特征得分、免疫治疗效果相关特征,利用治疗效果模型打分:
通过将步骤2.2.1中的细胞选择性特征得分、步骤2.2.2中提取的免疫治疗效果相关特征,输入治疗效果模型中进行打分,得到治疗效果模型打分结果,生成新抗原治疗辅助报告。
2.2.4、对患者进行疗效追踪:
步骤2.2.3中获得的新抗原治疗辅助报告,为医生提供诊断治疗参考。选择后续进行新抗原免疫治疗的肿瘤患者,进行定期疗效追踪。
2.2.5、评估步骤2.2.3中得到的治疗效果模型打分结果与步骤2.2.4中得到的患者实际疗效的一致性,优化治疗效果模型:
系统会判断治疗效果模型结果与肿瘤患者的实际治疗效果的一致性,当治疗效果模型结果与肿瘤患者的实际治疗效果不一致,则根据实际治疗效果对治疗效果模型的计算方法及其参数进行修正。必要时,可加入其他免疫治疗效果特征。
3、个体化肿瘤新抗原的辅助选择:
3.1、获取肿瘤组织、正常组织样本测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的候选新抗原:
获得肿瘤患者肿瘤组织、瘤旁正常组织,进行高深度转录组测序。测序预处理后,分析得到患者肿瘤组织特异的体细胞突变。作为进一步改进,与步骤1.1.1相同,可获取肿瘤患者的正常组织(包括但不限于口腔黏膜细胞或唾液),进行基因组测序。
测序数据下机后进行预处理操作。对测序数据进行质控分析、参考基因组比对,选择并注释肿瘤组织特异的非同义体细胞突变(包括但不限于SNP、Indel、可变剪切)。生成含有突变的由8-11个氨基酸组成的短肽,作为候选新抗原。
3.2、根据步骤3.1中的测序数据,提取与细胞选择性、免疫治疗效果相关特征:
提取的细胞选择性相关特征,在多肽丰度方面,可以提取的特征包括但不限于FPKM值、RPKM值、TPM值、RPM值。这些特征可以通过StringTie等软件提取。在MHC亲和力方面,可以提取的特征为多肽与MHC分子结合亲和力(包括MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子)。这些特征可以通过MHCflurry、NetMHC或NetMHCpan等软件提取。在等位基因突变频率方面,可以提取的特征为多肽所含突变的突变频率。相关特征可以通过MuTect2或VarScan2等软件提取。
提取的免疫治疗效果相关特征,包括但不限于患者免疫状态特征、受损基因特征。其中,患者免疫状态特征包括但不限于肿瘤细胞免疫相关转录组特征变量、特征表达基因;受损基因特征包括但不限于受损基因与肿瘤的相关性、基因受损程度。
3.3、收集步骤3.2中的细胞选择性相关特征,利用细胞选择性模型对肿瘤新抗原进行打分:
将步骤3.2中得到的细胞选择性相关特征,输入细胞选择性模型进行打分,得到候选肿瘤新抗原的细胞选择性特征得分。
3.4、收集步骤3.2、步骤3.3中的免疫治疗效果相关特征、细胞选择性特征得分,利用治疗效果模型进行打分,得到不同新抗原的预期治疗效果得分:
将步骤3.2、步骤3.3中得到的免疫治疗效果相关特征、细胞选择性特征得分,输入治疗效果模型进行打分,得到肿瘤新抗原预期治疗效果得分。
3.5、收集步骤3.4中的肿瘤新抗原预期治疗效果得分,生成关于肿瘤新抗原预期疗效和关键影响因素的报告,辅助医生选择新抗原进行后续治疗。
将步骤3.4中的肿瘤新抗原预期治疗效果得分,按照得分降序排列。医生可以参考预期治疗效果信息选择肿瘤新抗原进行治疗,并追踪患者的实际治疗效果。本系统收集医生的反馈信息,通过与步骤2.2.5相同的方法,优化治疗效果模型。
本方法可以拓展应用于慢性病毒感染的免疫系统疾病的新抗原选择,如乙肝、艾滋病等。
本方法可以采用单细胞测序,将患者肿瘤组织细胞进行分群,鉴别出肿瘤细胞、非肿瘤细胞或免疫相关细胞。将肿瘤细胞和非肿瘤细胞分别作为目标细胞系和对照细胞系,提取细胞选择性相关特征,在免疫相关细胞提取免疫治疗效果相关特征,进行肿瘤新抗原的选择。
本方法可以辅助医生或其他专业人员根据本发明选择的肿瘤新抗原制备制剂,包括但不限于疫苗、多肽制剂。
本发明所公开的系统通过有机地结合不涉及患者的生物学实验和涉及患者的疗效追踪,将新抗原治疗的疗效预测因素分解。其中,新抗原的肿瘤细胞选择性数学模型通过生物学实验进行拟合和优化;具有特定肿瘤细胞选择性的新抗原应用于具体患者时的治疗效果数学模型依据患者的疗效追踪数据进行优化。肿瘤细胞选择性数学模型的输入是肿瘤和正常组织(瘤旁组织或其他正常组织)的转录组、基因组测序数据,输出是代表肿瘤细胞选择性的多个分值(特异性、覆盖度等)。
细胞选择性数学模型具有两层结构:第一层是特征提取层,用于从原始测序数据中提取与细胞选择性相关的特征(例如某个肽段的表达量和主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)亲和力等);第二层是机器学习层,用于对第一层提取的各种特征进行筛选,然后拟合生物学实验测得的细胞选择性。治疗效果数学模型也具有两层结构:第一层是特征提取层,用于从原始测序数据中提取与免疫治疗效果相关的特征(如患者免疫状态特征、受损基因特征等),细胞选择性数学模型的输出也视为第一层提取的特征;第二层是机器学习层,用于对第一层提取的各种特征以及细胞选择性数学模型输出的各种特征进行筛选,然后拟合患者疗效追踪的数据。该模型的特点是:整体上模型可以通过肿瘤和正常组织的转录组、基因组测序数据预测新抗原的疗效,其中一部分模型的精度可以不依赖患者治疗数据,经由生物学实验进行优化,另一部分则通过追踪患者的实际治疗情况进行不断自我优化。
治疗效果数学模型的特征提取层提取与免疫治疗效果相关特征,免疫疗效相关特征包括但不限于患者免疫状态特征、受损基因特征。其所述的患者免疫状态特征包括但不限于肿瘤细胞免疫相关特征表达基因、转录组特征变量,特征表达基因包括但不限于CD80、CD86、TGFB1、TGFB2、TGFB3、PD-L1、PD-L2、TNFSF1、TNFSF2、TNFSF3、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、CCR4、CCR5、CCR6、ISOSLG、CD276、VTCN-1、TGFBR1、TGFBR2、IL6、IL10、LGALS9、SIRPB1、TREM1、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF7、TNFRSF8、CLEC5A、SIGLEC14、CD25、CD56、CD68、CD204、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、CD19、CD28、CTLA4、CD279、HRH4、EDA、CCL2、CCL4、CCL5、CCL17、CCL22、CD4、CD8A、CD8B、ADAM12、JAK2、FOXP3、ICOS、BTLA;转录组特征变量包括转录本表达量,表达量为FPKM、RPKM、TPM或RPM等。其所述的受损基因特征包括但不限于受损基因与肿瘤的相关性、基因受损程度。
生物学评估实验通过细胞系模型和/或动物模型完成,细胞系模型包括使用商业化的标准细胞系,使用患者原代细胞建系,或者通过遗传操作修改出发细胞建系,所述的动物模型包括普通荷瘤鼠模型和患者来源肿瘤组织移植鼠(PDX)模型。
以下结合附图对本发明的实施例进行说明,此处所描述的实施例仅用于解释本发明,并不用于限定本发明,图1为本发明技术方案的具体流程示意图;
1、细胞选择性模型的建立与优化:
1.1、细胞选择性模型的建立:
1.1.1、获取目标细胞系、对照细胞系测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的短肽:
选取已知的肝癌细胞系SK-HEP-1和HepG2分别作为目标细胞系和对照细胞系,应用Illumina TruSeq对目标细胞系和对照细胞系进行高通量转录组测序。测序采用双端测序,每个读长150bp,测序深度为6千万双端读段。
获得测序数据后,进行预处理。使用FastQC工具进行质控分析;使用Trimmomatic工具进行修剪和过滤,去除读长前15bp;使用HISAT2工具将转录组测序数据与参考基因组(GRCh38.91版本)进行比对;使用Picard和GATK(GenomeAnalysisTK)工具对测序数据进一步处理,使用MuTect2工具发现肿瘤患者的突变信息(突变类型包括但不限于SNP、Indel、基因融合、可变剪切),使用VEP(Variant Effect Prediction)工具对突变信息进行注释,获得3325个非同义体细胞突变(例表1),其中2918个错义突变,73个框内插入,18个框内缺失。
例表1肝癌细胞系SK-HEP-1/HepG2非同义体细胞突变
根据设计算法,生成含突变位点、由8-11个氨基酸组成的突变肽及对应野生肽,作为候选肿瘤新抗原(例表2)。
例表2肝癌细胞系SK-HEP-1/HepG2候选肿瘤新抗原
1.1.2、根据步骤1.1.1中的测序数据,提取细胞选择性相关特征:
使用seq2HLA工具预测SK-HEP-1的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)分型,其HLA分型为HLA-A0201、HLA-A2402、HLA-B3502、HLA-B4403、HLA-C0401、HLA-C0401;使用NetMHC4.0工具预测短肽与MHC-I结合亲和力,短肽长度设置为8-11aa,HLA分型设置为HLA-A0201;使用MuTect2工具计算VAF;使用StringTie工具计算转录本的FPKM值。
收集COSMIC数据库中的癌症驱动基因突变信息,建立癌症驱动基因突变数据库(例表3)。
例表3癌症驱动基因突变数据库
将细胞选择性相关特征进行汇总,生成细胞选择性相关特征描述(例表4)。其中,对于任一突变,若癌症驱动基因突变数据库中含有该突变信息,则该突变的癌症倾向特征为1;反之,则为0。
例表4肝癌细胞系SK-HEP-1/HepG2细胞选择性相关特征描述
nMmt a:突变肽结合亲和力;nMwt b:野生肽结合亲和力;P:癌症倾向性
1.1.3、构建步骤1.1.1中目标细胞系,构建对应疾病模型:
收集HLA-A0201阳性的健康供体来源的外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)。选用目标细胞系SK-HEP-1作为疾病模型,进行后续的生物学实验。
1.1.4、通过步骤1.1.3中构建的疾病模型,进行生物学实验评估:
选取FPKM>5、VAF>40%、目标细胞系中结合亲和力nMmt<500nM、对照细胞系中结合亲和力nMwt>500nM、nMwt/nMmt>5的候选肿瘤新抗原(例表5),交由公司合成相应的突变肽,纯度>95%,标准型转盐服务。
例表5肝癌细胞系SK-HEP-1/HepG2候选肿瘤新抗原
通过生物学实验,评估肿瘤新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的识别能力。将合成的候选肿瘤新抗原肽体外刺激健康供体来源的PBMC,培养12-14天后,得到候选肿瘤新抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)。通过酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked Immunospot Assay,ELISPOT)检测候选肿瘤新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的识别作用,斑点形成细胞(Spots-forming Cell,SFC)代表对肿瘤细胞有响应的T细胞。发现与野生肽刺激组相比,候选肿瘤新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的响应能力显著增强(图4是肝癌细胞系中选择的突变肽及其野生肽免疫原性检测的ELISPOT实验结果示意图)。将突变肽及其野生肽刺激过的CTL进行ELISPOT实验,发现突变肽刺激过的CTL对肿瘤细胞的响应能力显著增强。
通过生物学实验,评估肿瘤新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放试验来评估肿瘤新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。将合成的候选肿瘤新抗原突变肽和野生肽体外刺激健康供体来源的PBMC,分别得到候选肿瘤新抗原突变肽和野生肽特异性的CTL。将CTL与SK-HEP-1分别以1:1、3:1、10:1的比例进行共培养,借助LDH释放试剂盒来检测CTL对SK-HEP-1的杀伤能力,发现候选肿瘤新抗原特异性的CTL细胞毒性百分比显著提高(图5肝癌细胞系中选择的突变肽及其野生肽免疫反应性检测的LDH试验结果示意图);将突变肽刺激过的CTL和野生肽刺激过的CTL分别与SK-HEP-1以1:1、3:1、10:1进行共培养,检测CTL对SK-HEP-1的杀伤能力。横坐标是效应细胞与靶细胞的比率,纵坐标是细胞毒性。
1.1.5、收集步骤1.1.2和步骤1.1.4中得到的细胞选择性相关特征描述和生物学实验评估结果,建立细胞选择性初始模型:
将肿瘤新抗原评估结果作为初始模型的训练数据,与提取的细胞选择性相关特征,输入到机器学习层进行模型训练。训练后得到细胞选择性初始模型如下:
S=SVM(E,F,RM,RW,P)
其中,S表示肿瘤新抗原选择分数,E表示肿瘤新抗原相关转录本表达量,F表示突变位点的等位基因频率,Rm表示突变肽与MHC结合亲和力排名,Rw表示野生肽与MHC结合亲和力排名,P表示癌症倾向分数。
通过肿瘤新抗原选择分数,得到肿瘤新抗原是否具有免疫原性的预测结果。使用描述性统计方法,分析初始模型机器学习分类器的预测准确性。初始模型的准确性通过初始模型预测结果与其他已公开发表的肿瘤新抗原选择方法预测结果比较后得出(图6是细胞选择性模型与文献模型(pVAC-Seq[1]、TSNAD[2]、MuPeXI[3])的ROC曲线图)。细胞选择性模型优于其他三种文献模型。
[1]Jasreet H,Beatriz MC,Allegra AP,et al.pVAC-Seq:A genome-guided insilico approach to identifying tumor neoantigens.Genome Medicine.2016;8(1):1.
[2]Zhou Z,Lyu X,Wu J,et al.Tsnad:an integrated software for cancersomatic mutation and tumour-specific neoantigen detection.Roy Soc OpenSc.2017;4(4):170050.
[3]Bjerregaard AM,Nielsen M,Hadrup SR,et al.Mupexi:prediction of neo-epitopes from tumor sequencing data.Cancer Immunol Immunother.2017;66(9):1123-30.
1.2、细胞选择性模型的优化:
1.2.1、获取目标细胞系、对照细胞系测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的短肽:
获取一位非小细胞肺癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织,分别作为目标细胞系和对照细胞系,应用Illumina TruSeq对目标细胞系和对照细胞系进行高通量转录组测序。测序采用双端测序,每个读长150bp,测序深度为6千万双端读段。
获得测序数据后,进行预处理。使用FastQC工具进行质控分析;使用Trimmomatic工具进行修剪和过滤,去除读长前15bp;使用HISAT2工具将转录组测序数据与参考基因组(GRCh38.91版本)进行比对;使用BWA、STAR等工具将基因组测序数据与参考基因组(GRCh38.91版本)进行比对;使用Picard和GATK工具对测序数据进一步处理,使用MuTect2工具选择肿瘤患者的突变信息(突变类型包括但不限于SNP、Indel、基因融合、可变剪切),使用VEP工具对突变信息进行注释,获得183个体细胞突变(例表6),其中136个错义突变,11个框内插入,8个框内缺失。
例表6非小细胞肺癌患者非同义体细胞突变
根据设计算法,生成以突变位点为中心、含21个氨基酸的突变肽及对应野生肽,作为候选肿瘤新抗原(例表7)。
例表7非小细胞肺癌患者候选肿瘤新抗原
1.2.2、根据步骤1.2.1中的测序数据,提取细胞选择性相关特征:
使用seq2HLA工具预测非小细胞肺癌患者的HLA分型,其HLA分型为HLA-A0201、HLA-A0201、HLA-B3801、HLA-B5101、HLA-C1203、HLA-C1203;根据设计的算法,生成含21个氨基酸的以突变位点为中心的突变肽及对应野生肽;使用NetMHC4.0预测短肽与MHC-Ⅰ结合亲和力,短肽长度设置为8-11aa,HLA分型设置为HLA-A0201;使用MuTect2工具计算VAF;使用StringTie工具计算转录本的FPKM值;通过查询癌症驱动基因突变数据库来确定癌症倾向性P值。
将细胞选择性相关特征进行汇总,生成细胞选择性相关特征描述(例表8)。
例表8非小细胞肺癌患者细胞选择性相关特征描述
nMmt a:突变肽结合亲和力;nMwt b:野生肽结合亲和力;P:癌症倾向性
1.2.3、收集步骤1.2.2中的细胞选择性相关特征,利用细胞选择性模型打分:
将得到的细胞选择性相关特征,输入到细胞选择性模型中进行打分,得到候选肿瘤新抗原的细胞选择性特征得分(例表9)。
例表9非小细胞肺癌患者细胞选择性相关特征得分
1.2.4、根据步骤1.2.1中的目标细胞系,构建对应疾病模型:
收集肿瘤患者的PBMC和肿瘤组织,其中部分肿瘤组织用于建立相应肿瘤细胞系模型和PDX小鼠模型,作为疾病模型进行后续的生物学实验。
1.2.5、通过步骤1.2.4中构建的疾病模型,进行生物学实验评估:
选取细胞选择性模型打分排名前8位的候选肿瘤新抗原,交由公司合成相应的突变肽,纯度>95%,标准型转盐服务。
肿瘤细胞系模型实验评估:
(1)、评估肿瘤新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的识别能力。将合成的候选肿瘤新抗原肽体外刺激肿瘤患者来源的PBMC,培养12-14天后,得到候选肿瘤新抗原特异性CTL。通过ELISPOT检测候选肿瘤新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的识别作用,SFC代表对肿瘤细胞有响应的T细胞。发现与野生肽刺激组相比,候选肿瘤新抗原肽刺激过的CTL对肿瘤细胞的响应能力显著增强(图7是非小细胞肺癌样本中选择的突变肽及其野生肽免疫原性检测的ELISPOT实验结果示意图)。将突变肽及其野生肽刺激过的CTL进ELISPOT实验,发现突变肽刺激过的CTL对肿瘤细胞的响应能力显著增强。
(2)、评估肿瘤新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。通过LDH释放试验来评估肿瘤新抗原对肿瘤细胞的杀伤能力。将合成的候选肿瘤新抗原突变肽和野生肽体外刺激肿瘤患者来源的PBMC,分别得到候选肿瘤新抗原突变肽和野生肽特异性的CTL。将CTL与肿瘤细胞分别以1:1、3:1、10:1的比例共培养,借助LDH释放试剂盒来检测CTL对肿瘤细胞的杀伤能力,发现候选肿瘤新抗原特异性的CTL细胞毒性百分比显著提高(图8是非小细胞肺癌样本中选择的突变肽及其野生肽免疫反应性检测的LDH试验结果示意图)。将突变肽刺激过的CTL和野生肽刺激过的CTL分别与非小细胞肺癌肿瘤细胞以1:1、3:1、10:1进行共培养,检测CTL对肿瘤细胞的杀伤能力。横坐标是效应细胞与靶细胞的比率,纵坐标是细胞毒性。
PDX小鼠模型实验评估:
(1)、建立PDX小鼠模型:选择8-12周龄雌性BALB/c裸鼠,皮下注射1*106个肿瘤细胞(细胞浓度为1*107/mL,重悬于无菌生理盐水中)。每天观察肿瘤生长情况,待肿瘤直径达3-4mm时,尾静脉注射经肿瘤新抗原刺激的PBMC,每星期回输一次,每次回输细胞量为5*106个细胞。
(2)、评估肿瘤新抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的识别能力和杀伤能力。设置实验组与对照组,每组5只荷瘤小鼠,随机分组。实验组回输肿瘤新抗原特异性T细胞,对照组回输非特异性T细胞或生理盐水。每天观察肿瘤生长情况,分别在接受T细胞治疗后的第30天、60天处死部分小鼠,发现实验组小鼠肿瘤明显变小。取小鼠PBMC及其肿瘤组织,将肿瘤组织制成单细胞悬液,流式检测其免疫细胞表型,观察到处理组T细胞在肿瘤中浸润情况良好,ELISPOT检测结果显示PBMC中SFC的含量显著增加。
1.2.6、判断步骤1.2.3中得到的细胞选择性模型打分结果与步骤1.2.5中得到的生物学实验评估结果的一致性,优化细胞选择性模型:
计算肿瘤细胞选择性模型打分结果与生物学实验评估结果的Pearson相关系数,发现二者Pearson相关系数为0.92,说明一致性较好。
2、治疗效果模型的建立与优化:
2.1、治疗效果模型的建立:
2.1.1、根据细胞选择性模型,获取细胞选择性特征得分:
获取多组肿瘤患者的肿瘤组织和癌旁正常组织,分别提取细胞选择性相关特征,使用细胞选择性模型进行打分。以下均以非小细胞肺癌患者这组样本为例,进行具体说明。
非小细胞肺癌患者样本中提取的细胞选择性相关特征按照步骤1.2.2的方法得到。将细胞选择性相关特征作为细胞选择性模型的输入,进行非小细胞肺癌患者的细胞选择性模型打分(例表10)。
例表10非小细胞肺癌患者候选肿瘤新抗原细胞选择性模型得分
2.1.2、根据测序数据,提取免疫治疗效果相关特征:
免疫治疗效果相关特征,包括患者免疫状态特征、受损基因特征。
根据非小细胞肺癌患者的肿瘤组织和正常组织的转录组测序结果,使用StringTie工具计算基因的表达量(FPKM值),提取免疫状态相关基因(如CD80、TNF等)的表达量,获得患者免疫状态特征(例表11)。
例表11非小细胞肺癌患者免疫状态特征
患者的受损基因特征,包括受损基因与肿瘤的相关性、基因受损程度两部分。建立肿瘤特征基因集(包括免疫逃逸相关基因、肿瘤生长相关基因、肿瘤坏死因子基因等),使用GSLA工具评估受损基因与肿瘤特征基因集的功能关联(例表12),用于评估受损基因与肿瘤的相关性。使用SIFT工具预测突变对蛋白质功能的影响(例表13),用于评估基因受损程度。
例表12非小细胞肺癌样本GSLA评估受损基因与肿瘤特征基因集的功能关联
例表13非小细胞肺癌样本SIFT预测突变对蛋白质功能的影响
2.1.3、预测患者预期疗效:
根据步骤2.1.1、步骤2.1.2中的细胞选择性特征得分、免疫治疗效果相关特征,对患者预期疗效进行预测。
2.1.4、收集步骤2.1.1、步骤2.1.2、步骤2.1.3中的细胞选择性特征得分、免疫治疗效果相关特征、患者预期疗效,建立治疗效果初始模型:
经机器学习层训练后得到治疗效果初始模型如下:
T=SVM(S,P,D,C)
其中,T表示肿瘤新抗原治疗效果(Therapeutic Effect),S表示肿瘤新抗原选择分数(Selection Score),P表示患者免疫状态特征(Characteristics of Patient ImmuneStatus),D表示基因受损程度(Degree of Genetic Damage),C表示受损基因与肿瘤的相关性(Correlation Between Damaged Gene and Tumor)。
2.2、治疗效果模型的优化:
2.2.1、根据细胞选择性模型,获取细胞选择性特征得分:
获取一位非小细胞肺癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织,应用Illumina TruSeq对目标细胞系和对照细胞系进行高通量转录组测序。测序采用双端测序,每个读长150bp,测序深度为6千万双端读段。
测序数据预处理后,通过与步骤2.1.1相同的方法,提取细胞选择性相关特征,进行非小细胞肺癌患者的细胞选择性模型打分。
2.2.2、根据测序数据,提取免疫治疗效果相关特征:
通过与步骤2.1.2相同的方法,提取免疫治疗效果相关特征。
2.2.3、收集步骤2.2.1、步骤2.2.2中的细胞选择性特征得分、免疫治疗效果相关特征,利用治疗效果模型打分,得到肿瘤新抗原疗效预测得分:
将得到的细胞选择性特征得分和免疫治疗效果相关特征,输入治疗效果模型中进行打分,得到候选肿瘤新抗原的治疗效果预测结果(例表14)。
例表14非小细胞肺癌患者候选肿瘤新抗原治疗效果预测结果
2.2.4、对患者进行疗效追踪:
步骤2.2.3中获得的新抗原治疗效果预测结果供医生参考,辅助医生进行诊断治疗。选择后续进行新抗原免疫治疗的肿瘤患者,进行定期疗效追踪。
2.2.5、判断步骤2.2.3中得到的治疗效果模型打分结果与步骤2.2.4中得到的患者实际疗效的一致性,优化治疗效果模型:
将治疗效果模型结果与肿瘤患者的实际治疗效果进行比较,发现肿瘤患者实际治疗效果很好,与治疗效果模型结果一致。若治疗效果模型结果与肿瘤患者的最终治疗效果不一致,则将最终治疗效果加入真实训练数据集,通过机器学习层,对治疗效果模型的计算方法及其参数进行修正。
3、个体化肿瘤新抗原的辅助选择:
在细胞选择性模型和治疗效果模型建立结束后,即可利用本系统进行个体化肿瘤新抗原的辅助选择。以下均以非小细胞肺癌患者这组样本为例,进行具体说明。
3.1、获取肿瘤组织、正常组织样本测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的短肽:
获得肿瘤患者肿瘤组织、瘤旁正常组织,应用Illumina TruSeq进行高深度转录组测序;获取肿瘤患者口腔黏膜细胞,应用Illumina HiSeq进行基因组测序。测序采用双端测序,每个读长150bp,测序深度为6千万双端读段。
获取肿瘤组织、癌旁正常组织的转录组测序数据和口腔黏膜细胞基因组测序数据后,进行预处理,对非同义体细胞突变进行预测及注释。使用FastQC工具进行质控分析;使用Trimmomatic或cutadapter等工具进行修剪和过滤,去除读长前15bp;使用HISAT2、TopHat2、STAR或RASER等工具将转录组测序数据与参考基因组(GRCh38.91版本)进行比对;使用BWA、STAR等工具将基因组测序数据与参考基因组(GRCh38.91版本)进行比对;使用Picard和GATK(GenomeAnalysisTK)工具对测序数据进一步处理;使用MuTect2或VarScan2等工具发现肿瘤患者的突变信息(突变类型包括但不限于SNP、Indel、基因融合、可变剪切);使用VEP(Variant Effect Prediction)或ANNOVAR等工具对突变信息进行注释,获得183个非同义体细胞突变(例表15),其中136个错义突变,11个框内插入,8个框内缺失。
例表15非小细胞肺癌患者非同义体细胞突变
根据设计算法,生成以突变位点为中心、含21个氨基酸的突变肽及对应野生肽,作为候选肿瘤新抗原(例表16)。
例表16非小细胞肺癌患者候选肿瘤新抗原
3.2、根据步骤3.1中的测序数据,提取与细胞选择性、免疫治疗效果相关特征:
(1)提取细胞选择性相关特征:使用seq2HLA、SOAP-HLA、HLAminer或Athlates等工具预测患者的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)分型;使用MHCflurry、NetMHC或NetMHCpan等工具预测短肽与MHC-I结合亲和力,短肽长度为8-11;使用MuTect2或VarScan2等工具计算等位基因突变频率(variant allele frequency,VAF);使用StringTie工具计算转录本的表达量(包括但不限于FPKM值、RPKM值、TPM值);通过查询癌症驱动基因突变数据库来确定癌症倾向性P值(例表17)。
例表17非小细胞肺癌患者细胞选择性相关特征描述
nMmt a:突变肽结合亲和力;nMwt b:野生肽结合亲和力;P:癌症倾向性
(2)提取免疫治疗效果相关特征:免疫治疗效果相关特征,包括患者免疫状态特征、受损基因特征。
使用StringTie工具计算基因的表达量(包括但不限于FPKM值、RPKM值、TPM值),提取免疫状态相关基因(如CD80、TNF等)的表达量和突变特征,获取患者免疫状态特征(例表18)。
例表18非小细胞肺癌患者免疫状态特征
使用GSLA工具评估受损基因与肿瘤特征基因集(包括免疫逃逸相关基因、肿瘤生长相关基因、肿瘤坏死因子基因等)的功能关联(例表19),用于评估受损基因与肿瘤的相关性。使用SIFT工具预测突变对蛋白质功能的影响(例表20),用于评估基因受损程度。
例表19非小细胞肺癌样本GSLA评估一阶功能友邻基因集与肿瘤特征基因集的关联
例表20非小细胞肺癌样本SIFT预测突变对蛋白质功能的影响
3.3、收集步骤3.2中的细胞选择性相关特征,利用细胞选择性模型对肿瘤新抗原进行打分:
将得到的细胞选择性相关特征,输入到细胞选择性模型中进行打分,得到候选肿瘤新抗原的细胞选择性特征得分(例表21)。
例表21非小细胞肺癌患者候选肿瘤新抗原细胞选择性模型得分
3.4、收集步骤3.2、步骤3.3中的免疫治疗效果相关特征、细胞选择性特征得分,利用治疗效果模型进行打分,得到不同新抗原的预期治疗效果得分:
将得到的免疫治疗效果相关特征和细胞选择性特征得分,输入治疗效果模型进行打分,得到肿瘤新抗原的预期治疗效果得分(例表22)。
例表22非小细胞肺癌患者候选肿瘤新抗原预期治疗效果得分
3.5、收集步骤3.4中的肿瘤新抗原预期治疗效果得分,生成肿瘤新抗原预期疗效和关键影响因素的报告,辅助医生选择新抗原进行后续治疗:
将步骤3.4中的肿瘤新抗原预期治疗效果得分,按照得分降序排列(例表23)。根据预期治疗效果得分,生成肿瘤新抗原预期疗效和关键影响因素的报告,辅助医生进行诊断治疗。报告的详细信息包括预期治疗效果得分,细胞选择性特征、免疫治疗效果特征得分,及其计算依据。
例表23非小细胞肺癌患者候选肿瘤新抗原预期治疗效果得分降序排列结果
医生可以参考预期治疗效果等信息选择肿瘤新抗原进行治疗,并追踪患者的实际治疗效果。本系统收集医生的反馈信息,通过与步骤2.2.5相同的方法,进一步优化治疗效果模型。
以上所述并非是对本发明的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明实质范围的前提下,还可以做出若干变化、改型、添加或替换,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)、细胞选择性模型的建立与优化;
2)、治疗效果模型的建立与优化;
3)、个体化肿瘤新抗原的辅助选择。
2.根据权利要求1所述的基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原的方法,其特征在于,所述的步骤1)细胞选择性模型的建立包括如下步骤:
1.1.1、获取目标细胞系、对照细胞系测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的短肽;
1.1.2、根据步骤1.1.1中的测序数据,提取细胞选择性相关特征;
1.1.3、使用步骤1.1.1中目标细胞系,构建对应疾病模型;
1.1.4、使用步骤1.1.3中构建的疾病模型,进行生物学实验评估;
1.1.5、收集步骤1.1.2和步骤1.1.4中得到的细胞选择性相关特征描述和生物学实验评估结果,建立细胞选择性初始模型。
3.根据权利要求1所述的基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原的方法,其特征在于,所述的步骤1)细胞选择模型的优化包括如下步骤:
1.2.1、获取目标细胞系、对照细胞系测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的短肽;
1.2.2、根据步骤1.2.1中的测序数据,提取细胞选择性相关特征;
1.2.3、根据步骤1.2.2中的细胞选择性相关特征,利用细胞选择性模型打分;
1.2.4、使用步骤1.2.1中的目标细胞系,构建对应疾病模型;
1.2.5、使用步骤1.2.4中构建的疾病模型,进行生物学实验评估;
1.2.6、评估步骤1.2.3中得到的细胞选择性模型打分结果与步骤1.2.5中得到的生物学实验结果的一致性,优化细胞选择性模型。
4.根据权利要求1或2或3所述的基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原的方法,其特征在于,所述的步骤2)中,治疗效果模型的建立包括如下步骤:
2.1.1、根据细胞选择性模型,获取细胞选择性特征得分;
2.1.2、根据测序数据,提取免疫治疗效果相关特征;
2.1.3、预测患者预期疗效;
2.1.4、收集步骤2.1.1、步骤2.1.2、步骤2.1.3中的细胞选择性特征得分、免疫治疗效果相关特征、患者预期疗效,建立治疗效果初始模型。
5.根据权利要求根据权利要求4所述的基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原的方法,其特征在于,所述的步骤2)中,治疗效果模型的优化包括如下步骤:
2.2.1、根据细胞选择性模型,获取细胞选择性特征得分;
2.2.2、根据测序数据,提取免疫治疗效果相关特征;
2.2.3、收集步骤2.2.1、步骤2.2.2中的细胞选择性特征得分、免疫治疗效果相关特征,利用治疗效果模型打分,得到肿瘤新抗原疗效预测得分;
2.2.4、对患者进行疗效追踪;
2.2.5、评估步骤2.2.3中得到的肿瘤新抗原预测结果与步骤2.2.4中得到的患者最终疗效的一致性,优化治疗效果模型。
6.根据权利要求1或2或3或5所述的基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原的方法,其特征在于,所述的步骤3)中,个体化肿瘤新抗原的选择包括如下步骤:
3.1、获取肿瘤组织、正常组织样本测序数据,分析得到含非同义体细胞突变的候选新抗原;
3.2、根据步骤3.1中的测序数据,提取与细胞选择性、免疫治疗效果相关特征;
3.3、收集步骤3.2中的细胞选择性相关特征,利用细胞选择性模型对肿瘤新抗原进行打分;
3.4、收集步骤3.2、步骤3.3中的免疫治疗疗效相关特征、细胞选择性特征得分,利用治疗效果模型进行打分,得到不同肿瘤新抗原预期治疗效果得分;
3.5、根据步骤3.4中的肿瘤新抗原预期治疗效果得分,生成关于肿瘤新抗原预期疗效和关键影响因素的报告,辅助医生选择新抗原进行后续治疗。
7.根据根据权利要求6所述的基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原的方法,其特征在于,所述的细胞选择性模型,其输入是候选新抗原的特征,所述的特征可能在目标细胞与对照细胞之间产生免疫选择性,其输出是细胞选择性的度量;所述的治疗效果模型,其输入是患者分子生理状态特征,所述的特征可能与免疫治疗疗效相关,其输出是最终发现的肿瘤新抗原。
8.根据根据权利要求7所述的基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原的方法,其特征在于,所述的细胞选择性模型包括特征提取层和机器学习层,所述的特征提取层提取与细胞选择性相关特征,包括多肽丰度、亲和力、癌症倾向性,用于从原始测序数据中提取与细胞选择性相关的特征,所述的机器学习层借助机器学习进行建模,包括支持向量机、贝叶斯算法、神经网络、深度学习,用于对第一层提取的各种特征进行筛选,然后拟合生物学实验测得的细胞选择性。
9.根据根据权利要求7或8所述的基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原的方法,其特征在于,所述的治疗效果模型包括特征提取层和机器学习层,所述的特征提取层提取与免疫疗效相关特征,用于从原始测序数据中提取与免疫治疗疗效相关的特征,所述的机器学习层借助机器学习进行建模,包括支持向量机、贝叶斯算法、神经网络、深度学习,用于对第一层提取的各种特征以及细胞选择性数学模型输出的各种特征进行筛选,然后拟合患者疗效追踪的数据。
10.一种实现如权利要求1或2或3或5所述的基于预期疗效辅助选择个体化肿瘤新抗原方法的系统,其特征在于,所述的系统包括:细胞选择性预测模型、治疗效果预测模型和肿瘤新抗原辅助选择模型;所述的细胞选择性预测模型包括:
多肽获取模块,用于从目标细胞系、对照细胞系的测序数据中获取非同义突变多肽及其注释信息;
细胞选择性模型特征提取模块,用于提取与细胞选择性模型相关的特征值;
生物学实验评估模块,用于构建相应疾病模型,通过生物学实验评估多肽是否具有免疫原性;
细胞选择性模型建立模块,用于将细胞选择性模型相关特征值与评估结果输入机器学习层,构建细胞选择性模型;
细胞选择性模型打分模块,用于对细胞选择性模型相关特征打分;
细胞选择性模型优化模块,用于对模型进行优化,提高细胞选择性模型的预测精度;
所述的治疗效果预测模型包括:
治疗效果模型特征提取模块,用于提取与治疗效果模型相关的特征值;
治疗效果模型建立模块,用于将治疗效果模型相关特征值输入机器学习层,建立治疗效果初始模型;
患者疗效追踪模块,用于追踪患者的实际治疗效果;
治疗效果模型打分模块,用于对治疗效果模型相关特征打分;
治疗效果模型优化模块,用于对模型进行优化,提高治疗效果模型的预测精度;
所述的肿瘤新抗原辅助选择模型包括:
多肽获取模块,用于从目标细胞系、对照细胞系的测序数据中获取非同义突变多肽及其注释信息;
细胞选择性模型特征提取模块,用于提取与细胞选择性模型相关的特征值;
细胞选择性模型打分模块,用于对细胞选择性模型相关特征打分;
治疗效果模型特征提取模块,用于提取与治疗效果模型相关的特征值;
治疗效果模型打分模块,用于对治疗效果模型相关特征打分;
肿瘤新抗原特征报告模块,用于向医生报告候选新抗原的预期疗效和相关关键特征,供医生在选择新抗原进行免疫治疗时参考。
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