JP2018525002A - 疾患および障害の個別化された治療 - Google Patents

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Abstract

本発明は、一般的に、ヒト化非ヒト哺乳動物モデルを用いた疾患または障害の個別化された治療に関する。本発明は、特に、有効な治療分子を同定して疾患または障害の個別化された治療を提供するためのヒト化非ヒト哺乳動物モデルの使用に関する。
【選択図】図１

Description

（関連出願との相互参照）
本出願は、２０１５年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／２０４５３６号を基礎とする優先権および利益を主張し、当該出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般的に、ヒト化非ヒト哺乳動物モデルを用いた疾患または障害の個別化された治療に関する。本発明は、特に、有効な治療分子を同定して疾患または障害の個別化された治療を提供するためのヒト化非ヒト哺乳動物モデルの使用に関する。
個別化された薬物治療の前には、特定のタイプおよび段階の癌を有するほとんどの患者が同じ治療を受けていた。しかし、いくつかの治療は一部の患者ではよい結果が得られ、他の患者ではよい結果が得られなかった。したがって、特定の患者に有効な効果的で個別化された治療分子またはワクチンを開発する必要がある。個別化された治療戦略は、標準治療で期待されるよりもより効果的であり、副作用を少なくすることができる。
腫瘍は、ヒトのＤＮＡの突然変異のために発生し、ホストによって産生される対応する正常タンパク質内に存在しないネオエピトープ（新しいエピトープ）を含む突然変異タンパク質の産生を引き起こす。これらのネオエピトープの多くは、Ｔ細胞応答を刺激し、免疫系による初期段階の癌性細胞の破壊をもたらす。しかし、確立された癌の場合、免疫応答は不十分である。他の例では、癌における腫瘍抗原を標的とするが、そのネオエピトープを特異的に標的としない有効な長期のワクチンの開発は困難であることが証明されている。このようになる主な理由は、腫瘍自己抗原に特異的なＴ細胞は、耐性の機序によって排除されるかまたは不活性化されることにある。
ネオエピトープは、疾病、例えば癌に関連するタンパク質内に存在するエピトープであり、特異的「ネオエピトープ」は、疾患のない対象または組織に関連する対応する正常タンパク質内には存在しない。ネオエピトープは、それらがまれであり、個々人によって異なる可能性があるため、同定するのが困難となり得る。更に、実際の免疫応答を誘発するためにホストと十分に異なるこれらのネオエピトープを同定することは、更に別の困難さを伴う。
ネオエピトープの使用は、患者において観察される継続的で客観的な応答を伴う、癌および他の疾患の免疫療法のための有望な治療方法である。しかし、現在の動物モデルでは、ヒト免疫系とマウス免疫系との違いのために、臨床的潜在能力が最も高い免疫療法を特定できないことが多い。
したがって、ヒト免疫系の状況においてネオエピトープを試験するための信頼できる動物モデルが必要とされている。
国際公開第２０１４／００５２７０７号 米国特許出願公開第２００４／００９６８９２号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０２１０６４５号明細書 米国特許第８６０４２７１号明細書 米国特許第８０７１８３９号明細書 米国特許第６６７６９２４号明細書 米国特許第５８７４５４０号明細書 米国特許第８６５８１５４号明細書 米国特許第８１１０７２０号明細書 米国特許第５７７７１９４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０２９１１３４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０２１７０４３号明細書 米国特許出願公開第２０１２／００６６７８０号明細書 米国特許出願公開第２００５／００８９５３８号明細書 米国特許出願公開第２００２／００１８７５０号明細書 米国特許出願第６２／１６５４６４号明細書 国際公開第２００２／１４３７９５号 国際公開第２００８／１４０７５１号
Lundegaard et al., NetMHC-3.0: accurate web accessible predictions of human, mouse, and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11, Nucleic Acids Research 36:w509-w512
本発明の方法は、特定の疾患関連細胞に対して個人の免疫系を活性化する治療剤を提供するために有用である。治療剤は、疾患細胞に特異的なエピトープを同定するために配列を分析することによって提供される。同定された疾患特異的エピトープは、ヒト免疫系の成分を含むように操作された動物において合成され、試験され得る。したがって、動物において良好な結果を示すエピトープの１つ以上が、疾患細胞に対する個人の免疫系を活性化するための有効なエピトープとして提供される。それらの有効なエピトープの１つ以上を含む治療剤を作製することができ、この治療剤を治療に使用することができる。
疾患特異的エピトープを同定するための配列分析は、疾患細胞を特徴付ける一連の突然変異を同定し、これらの突然変異を含む核酸によってコードされるポリペプチド配列を生成するために、ヒトから得られた病気細胞および健常細胞の両方から核酸を配列決定することを含み得る。そのポリペプチド配列は、ポリペプチド配列中の疾患特異的エピトープを同定し、そのＭＨＣ結合親和性を予測する、ペプチド：ＭＨＣ親和性測定値（例えば、ＮｅｔＭＨＣサーバ）で訓練された人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）のようなツールに入力される。
疾患特異的エピトープを試験することは、ヒト化動物、すなわち少なくともヒト免疫系の一部を有する動物にエピトープを投与することを含み得る。その動物はまた、ヒト腫瘍異種移植片を含み得る。エピトープの有効性は、例えば腫瘍増殖の阻害を観察することによって、動物に対するその効果を観察することにより確立され得る。
エピトープは、疾患細胞を特徴付ける突然変異を含む配列から選択されるので、治療剤は、疾患細胞を健常細胞よりも優先的に標的とする。突然変異は、人からの配列を分析することによって決定されるので、エピトープは、それらのネオエピトープ、非常にまれなエピトープ、または個々人により異なるエピトープ、すなわち他の個別化されていない方法によって提供され得ないエピトープを含み得る。ＭＨＣ結合親和性は、例えば、ＮｅｔＭＨＣサーバにおいて実施されるような、訓練されたニューラルネットワークなどのツールを用いて各エピトープについて予測されるので、常に多数のエピトープを最初に同定して、潜在的有効性の最も高い疾患特異的エピトープを同定するための非常に多数のエピトープセットを得ることができる。エピトープはヒト免疫成分を示す動物で試験されるので、これらのエピトープの実際の有効性がスクリーニングされるだけでなく、ヒトにおける潜在的な有害作用も特定され、排除され得る。したがって、本発明の方法により、個別化されたエピトープを迅速に同定およびスクリーニングして、ヒトの治療に使用することができる有効な疾患特異的エピトープを提供することができる。
一態様では、本発明は、対象における疾患を治療するための有効な治療分子を同定するための方法であって、
対象から前記疾患に関連する生物学的な試料を得るステップと、
前記生物学的試料中の前記疾患に関連する１つ以上の遺伝子改変を決定するステップと、
１つ以上の疾患特異的エピトープを同定し、それによって前記１つ以上の疾患特異的エピトープをそれぞれ有する１つ以上の抗原性エピトープペプチドを同定するステップと、
ヒト化された非ヒト哺乳動物（例えばマウス）を提供するステップであって、前記非ヒト哺乳動物が、ヒト免疫系で再構成された免疫不全非ヒト哺乳動物である、該ステップと、
前記対象における前記疾患を治療する際の前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を試験するステップであって、
前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドを前記ヒト化された非ヒト哺乳動物に投与し、
前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を評価し、
前記対象において前記疾患を治療するのに有効な抗原性エピトープペプチドを同定することによって治療効果を試験する、該試験するステップとを含み、
それによって前記対象における前記疾患を治療するための前記有効な治療用分子を同定することを特徴とする方法を提供する。例示的な実施形態では、非ヒト哺乳動物はマウスである。
いくつかの実施形態では、前記方法は、健常組織および疾患組織の両方から得られた患者のＲＮＡまたはＤＮＡの少なくとも一部を配列決定して、前記健常組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列および疾患組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を生成し、前記健常組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列と前記疾患組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列とを比較し、前記健常組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列と前記疾患組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列との間の相違を同定して変異体ＤＮＡマーカーセットを生成するステップと、予測アルゴリズムを用いて疾患特異的エピトープを同定するステップとを含む。一実施形態では、患者の全ゲノムのコード領域を、配列変異（例えば、一塩基変異、挿入および欠失）について評価する。別の実施形態では、患者のトランスクリプトームを評価する。
一実施形態では、前記疾患は癌である。いくつかの実施形態では、前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果は、前記疾患に関連するヒト腫瘍異種移植片を含むヒト化マウスにおいて評価または試験することができる。
別の態様では、本発明は、対象における疾患（例えば癌の疾患）を治療するための方法であって、
前記対象から前記疾患に関連する生物学的試料を得るステップと、
前記生物学的試料中の前記疾患に関連する遺伝子改変を決定するステップと、
１つ以上の疾患特異的エピトープを同定し、それによって前記１つ以上の疾患特異的エピトープをそれぞれ有する１つ以上の抗原性エピトープペプチドを同定するステップと、
非ヒト哺乳動物（例えばマウス）を提供するステップであって、前記非ヒト哺乳動物が、ヒト免疫系で再構成された免疫不全非ヒト哺乳動物である、該ステップと、
前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドを前記非ヒト哺乳動物に投与することによって前記対象における前記疾患を治療する際の前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を試験するステップと、
前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を評価するステップと、
前記対象において前記疾患を治療するのに有効な抗原性エピトープペプチドを同定するステップと、
前記有効な治療剤を前記患者に投与し、それによって前記患者における前記疾患を治療するステップとを含むことを特徴とする方法を提供する。
更に別の態様では、本発明は、患者の腫瘍を治療するための個別化された治療を提供するための方法を提供する。
本発明の態様は、疾患のある人のための治療薬を提供するための方法を含む。前記方法は、メモリサブシステムに接続された少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータシステムを使用することによって複数のエピトープを同定するステップであって、各エピトープは、ヒト由来の健常細胞からの対応する配列と少なくとも１つの変異体によって異なる配列の一部によってコードされている、該ステップを含む。前記コンピュータシステムは、そのエピトープの予測されるＭＨＣ結合親和性に基づいて前記複数のエピトープのなかの少なくとも１つを選択するために使用される。前記方法は更に、ヒト免疫系の一部を含むように操作された非ヒト動物に対する選択されたエピトープの治療効果を観察するステップと、前記選択されたエピトープを前記人の疾患を治療するための治療薬として同定するステップとを含む。前記核酸配列を得るステップは、１つ以上の疾患に冒された細胞からの核酸を配列決定するステップを含み得る。前記方法は、健常細胞由来の追加の核酸を配列決定して健常型配列を得ることを更に含み得る。前記複数のエピトープを同定するステップは、配列を前記健常型配列と比較して、少なくとも１つの変異体を同定するステップを含み得る。
いくつかの実施形態では、前記複数のエピトープを同定する前記ステップは、
健常細胞からの対応する配列と完全に一致する配列の部分を除いて、前記核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、前記アミノ酸配列をメモリシステム内の有形の記憶装置に格納するステップを含む。ある特定の実施形態では、そのエピトープの予測されるＭＨＣ結合親和性に基づいて前記複数のエピトープのなかの少なくとも１つを選択する前記ステップは、ペプチド：ＭＨＣ親和性測定データに関して訓練された人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）を用いて親和性を予測するプログラムへの入力としての前記複数のエピトープを提供するステップを含む。
前記非ヒト哺乳動物は、ヒト免疫系で再構成された免疫不全マウスであり得る。いくつかの実施形態では、前記非ヒト哺乳動物は、ヒト免疫系で再構成された免疫不全ヌードマウスである。前記マウスは、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）Ｓｈｉ−Ｓｃｉｄ ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスであり得る。ある特定の実施形態では、前記非ヒト哺乳動物は、ヒトＣＤ３４＋細胞で再構成されたマウスであり得る（好ましくは、再構成後の所定時間、前記マウスは、成熟ヒトＣＤ４５＋細胞を提供することができる）。前記マウスは、ｈＣＤ３＋、ｈＣＤ４＋、およびｈＣＤ８＋細胞を含み得る。
ある特定の実施形態では、前記疾患は癌である。非ヒト哺乳動物は、患者の腫瘍の異種移植片を含む（例えば皮下移植された）マウスであり得る。前記ヒト腫瘍異種移植片は、メラノーマ腫瘍移植片、結腸直腸腫瘍移植片、乳房腫瘍移植片、肺腫瘍移植片、ヒト間葉性軟骨肉腫の異種移植片、ヒト平滑筋肉腫の異種移植片、またはヒト非小細胞肺癌の異種移植片であり得る。好ましくは、前記マウスは、前記腫瘍の表現型安定性を示す。
本発明の他の特徴および利点は、後述の詳細な実施形態の説明および図面から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者には明らかであるので、詳細な説明および特定の例は、本発明のある好適実施形態を示しているに過ぎないことを理解されたい。
図１は、本発明の一実施形態による、対象における疾患を治療するための有効な治療用分子を同定する方法の流れ図を示す。
本発明は、ヒト化非ヒト哺乳動物モデルを用いて疾患または障害の個別化された治療を提供する。具体的には、本発明は、有効な治療分子を同定するためのヒト化非ヒト哺乳動物モデルの使用を提供して、疾患または障害の個別化された治療を提供する。
本出願の発明者らは、２つの革新的な手法を組み合わせたシステムおよび方法を開発した。具体的には、本発明は、疾患（例えば、癌）を治療するための有効な治療用抗原を同定するために、ヒト化マウスモデルを用いる手法と個別化されたゲノム解析とを組み合わせる。
本願において提供されるのは、一態様では、対象の疾患を治療するために有効な治療分子を同定するための方法であって、
前記対象から前記疾患に関連する生物学的試料を得るステップと、
前記生物学的試料中の前記疾患に関連する遺伝子改変を決定するステップと、
１つ以上の疾患特異的エピトープを同定し、それによって前記１つ以上の疾患特異的エピトープをそれぞれ有する１つ以上の抗原性エピトープペプチドを同定するステップと、
ヒト免疫系で再構成された免疫不全非ヒト哺乳動物である、ヒト化された非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）を提供するステップと、
前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドを前記ヒト化された非ヒト哺乳動物に投与することによって前記対象における前記疾患を治療するための前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を試験するステップと、
前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を評価するステップと、
前記対象における前記疾患を治療するために有効な抗原性エピトープペプチドを同定し、それによって前記対象における前記疾患を治療するための前記有効な治療分子を同定するステップとを含む。例示的な実施形態において、非ヒト哺乳動物はマウスである。
本明細書で使用される「生物学的試料」という用語は、生物全体またはその組織、細胞若しくは構成要素のサブセット、またはそれらの画分若しくは部分から作製されたあらゆる試料を指し、以下に限定しないが、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器系、腸系および尿生殖路、涙液、唾液、牛乳、血液細胞、腫瘍、臓器などの血液成分などが挙げられる。特定の実施形態では、生物学的な試料は腫瘍組織である。
本明細書で使用される「遺伝子改変」という用語は、例えば、変異、転座、およびコピー数多型などの任意の型の遺伝子改変を意味し得る。
例示的な実施形態では、疾患に関連する遺伝子改変は、当業者に公知の任意の適切な方法によって決定され得る。一例では、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．によって開発されたＣａｎｃｅｒＸｏｍｅ（商標）手法が、遺伝子改変を決定するために使用される。
一実施形態において、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、当技術分野で公知の技術によって疾患および健康な生体試料から単離される。いくつかの実施形態において、患者のゲノムの全部または一部は、単離され、当技術分野で公知の配列決定方法によって配列決定される。高スループットＤＮＡ配列決定法は当該分野で公知であり、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる、ＨｉＳｅｑ（商標）２０００システムを含み、このシステムは、１回の実行につき数十億塩基の高品質ＤＮＡ配列を生成するために大規模なパラレル配列決定手法を使用している。
特定の実施形態では、疾患に応じて、患者のゲノムの特定の部分が配列決定される。好ましい実施形態では、全ゲノムまたはトランスクリプトームが配列決定される。一実施形態において、患者の全ゲノムのコード領域が、配列変異（例えば、単一塩基変異、挿入および欠失）について評価される。別の実施形態では、患者のトランスクリプトームが評価される。ゲノムは、深いシーケンス深度で（特定のゲノム領域を多数回シークエンシングするディープシークエンシングで）または浅いシーケンス深度で配列決定されて、ゲノムまたはトランスクリプトームのより少ない部分またはより多くの部分を含めることができる。いくつかの実施形態では、ＣＨＡＳＭ、デジタル染色体解析、および他の手法を使用する更に別の詳細な計算分析が実施され得る。
一例では、健常組織および疾患組織の両方から得られた患者のＲＮＡまたはＤＮＡの１つまたは複数の部分を配列決定して、健常組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列および疾患組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を生成する。健常組織のＲＮＡまたはＤＮＡ配列を、疾患組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列と比較する。健常組織のＲＮＡまたはＤＮＡ配列と疾患組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列との間の相違を同定して、変異体ＤＮＡマーカーセットを生成する。
特定の実施形態では、疾患特異的エピトープセットを同定するために変異体ＤＮＡまたはＲＮＡマーカーセットを分析する際に、ＭＨＣ分子に結合するエピトープペプチドの能力を予測する予測アルゴリズムを使用する。例えば、特定の実施形態では、変異体マーカーセットを含む核酸によってコードされるポリペプチド配列が生成される。ポリペプチド配列は、例えば、Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄら（非特許文献１）に記載されているように、ＮｅｔＭＨＣサーバによって提供される人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）のようなツールへの入力として使用することができる。尚、非特許文献１の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ＮｅｔＭＨＣサーバは、多数の公開された定量的ペプチド：ＭＨＣ親和性測定値、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベースから溶出されたペプチドデータ、および独自の親和性データで訓練されたＡＮＮを提供する。本発明の方法が本発明のシステムを使用して実施される場合、当該システムは、有形のメモリ装置に接続されたプロセッサを含むコンピュータを含み得る。コンピュータは、例えば、規定された長さ（例えば、８〜１１残基）を有するペプチドのリストまたは変異体マーカーセットを含むポリペプチド内に含まれ得る全ての可能性のあるサブペプチドとして、配列をＮｅｔＭＨＣサーバに送ることができる。コンピュータは、入力をＦＡＳＴＡ形式で、または等しい長さのペプチドとして１行当たり１ペプチドの形式でアップロードすることができる。サーバは１回の送信ごとに最大５０００のシーケンスを受け入れ、各配列は、選択された長さの予測に対応する最小長を有する２０，０００個を超えない長さのアミノ酸からなる（後述の説明を参照されたい）。ＮｅｔＭＨＣサーバは、ペプチドの結合親和性を予測し、他の配列のなかから、そのエピトープ配列および予想される親和性のカラム（列）を有する生テキストデータを提供する。また、前記コンピュータを、ＮｅｔＭＨＣサーバから、若しくはＭＨＣ結合についての予測アルゴリズムを実施する別のコンピュータまたはサーバから、疾患特異的エピトープセットの予測された親和性を受け取るために使用することができる。この手法では、ＮｅｔＭＨＣサーバによって実施されるニューラルネットワークアルゴリズムを利用する。他のアルゴリズムを使用してもよい。例えば、ニューラルネットワークを、局所的に（例えば、コンピュータシステムを使用して）インプリメントし、公開された親和性データについて訓練し、次いで、ヒト由来の配列を供給することができる。
選択に応じて、疾患特異的エピトープセットを精製し、ＭＨＣ拘束性疾患特異的エピトープセットを得る。例えば、Ｋ、ＤまたはＬ対立遺伝子のＭＨＣ Ｉ制限エピトープを提供することができる。ＭＨＣ制限エピトープセットは、エピトープを含むペプチドのＭＨＣ−対立遺伝子特異的ペプチドへの結合を決定することによって製造することができる。
予測アルゴリズムは、当技術分野で公知であり、例えば、国際公開第２０１４／０５２７０７号明細書（特許文献１）、米国特許出願公開第２００４／００９６８９２号明細書（特許文献２）、米国特許出願公開第２０１３／０２１０６４５号明細書（特許文献３）に完全に記載されており、これらの特許文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
具体的には、健常生物学的試料と疾患生物学的試料間のＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列差異をエピトープ予測アルゴリズムによって分析する。一実施形態では、そのようなアルゴリズムが、個々の患者の潜在的な疾患特異的エピトープのリストを生成し、各エピトープに数値スコアを与える。現在の技術水準では、高いスコアは、エピトープが免疫化できる確率が高いことを意味し、低い（陰性を含む）スコアは、エピトープが免疫化できる確率が低いことを意味する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、メモリシステムに結合された少なくとも１つのプロセッサと、１つ以上の出力装置とを含む本発明のコンピュータシステムを使用して実施されるステップを含む。メモリサブシステムは、好ましくは、マザーボードを介して接続されたＲＡＭチップおよびハードドライブのような、動作上リンクされた１つ以上のメモリデバイスを含む。メモリサブシステムは、好ましくは、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、光ディスク、または他の同様のコンピュータ可読媒体などの少なくとも１つの有形の非一時的メモリデバイスを含む。本発明のコンピュータシステムは、ヒトの疾患に冒された細胞１つ以上から核酸配列を取得し、本明細書に記載の方法を使用して複数のエピトープを同定するために使用され得る。好ましくは、各エピトープは、少なくとも１種類の変異体により、人の健常細胞の対応する配列とは異なる配列の部分によってコードされる。
一態様では、当業者は抗原性を最大にするべく１つ以上の抗原性エピトープペプチドを改変することができる。一例では、１つまたは複数の抗原性エピトープペプチドは、当業者に知られている適切なベクターまたは担体に入れることができる。
１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果は、１つ以上の抗原性エピトープペプチドをヒト化非ヒト哺乳動物モデルに投与することによって試験することができる。本明細書で使用する「ヒト化」という用語は、異種免疫細胞の集団を導入された免疫不全の哺乳動物を意味する。異種免疫細胞の供給源は、ドナー哺乳動物または別のヒト化哺乳動物のいずれかであり得る。
非ヒト哺乳動物の例としては、実験動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、サルおよび類人猿）、家畜（例えば、ウシ、ブタおよびウマ）、飼育された動物（たば、イヌ、ネコ、ウサギ、およびウマなど）、ヒトのコンパニオンアニマル（伴侶的動物）、動物園の動物および野生動物などが挙げられる。
特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物モデルはマウスモデルである。本発明のマウスモデルは、免疫が障害された（易感染性の）または免疫不全のヌードマウスであり得る。任意の適切なマウスを用いて、本発明のマウスモデルを開発することができる。例示的な実施形態において、マウスは、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）Ｓｈｉ−Ｓｃｉｄ ＩＬ−２Ｒ γｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスである。マウスの他の例としては、Ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉマウス、ＩＬ−２Ｒｎｕｌｌマウス、ＮＯＤ／Ｓｃｉ−Ｓｃｉｄマウスが挙げられるが、これらに限定されない。
非ヒト哺乳動物、例えばマウスは、当業者に公知の任意の適切な方法によってヒト化することができる。マウスをヒト化するための方法は、当分野で公知であり、米国特許第８６０４２７１号明細書（特許文献４）、米国特許第８０７１８３９号明細書（特許文献５）、米国特許第６６７６９２４号明細書（特許文献６）、米国特許第５８７４５４０号明細書（特許文献７）、米国特許第８６５８１５４号明細書（特許文献８）、米国特許第８１１０７２０号明細書（特許文献９）、並びに米国特許第５７７７１９４号明細書（特許文献１０）、米国特許出願公開第２０１３／０２９１１３４号明細書（特許文献１１）、米国特許出願公開第２０１３／０２１７０４３号明細書（特許文献１２）、米国特許出願公開第２０１２／００６６７８０号明細書（特許文献１３）、米国特許出願公開第２００５／００８９５３８号明細書（特許文献１４）、および米国特許出願公開第２００２／００１８７５０号明細書（特許文献１５）に記載されており、これらの特許文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）モデルをヒトＣＤ３４＋細胞で再構成する。一実施形態では、成熟ヒトＣＤ４＋細胞を提供することができる再構成後の所定時間（例えば、ｈＣＤ３４＋再構成後の４〜１０週）、再構成された非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）は、成熟ヒトＣＤ４５＋細胞を提供することができる。特定の実施形態において、再構成された非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）は、ｈＣＤ３＋、ｈＣＤ４＋、およびｈＣＤ８＋細胞を提供することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のヒト化非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）モデルは、脾細胞の養子移入によって開発することができる。この手法は、米国特許出願第６２／１６５４６４号明細書（特許文献１６）に完全に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
一例では、本発明のヒト化マウスモデルにおいて、１つまたは複数のヒト腫瘍異種移植片が、例えば、当該分野で公知の任意の適切な方法によって皮下に移植され得る。マウスに腫瘍異種移植片を移植するための方法は、当技術分野で公知であり、国際公開第２００２／１４３７９５号（特許文献１７）および国際公開第２００８／１４０７５１号（特許文献１８）に完全に記載されており、これらの特許文献の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
疾患の治療に応じて、適切な腫瘍移植片を使用することができる。一例では、ヒト腫瘍異種移植片は黒色腫腫瘍移植片である。別の例では、ヒト腫瘍異種移植片は、結腸直腸腫瘍移植片である。別の例では、ヒト腫瘍異種移植片は乳房腫瘍移植片である。別の例では、ヒト腫瘍異種移植片は肺腫瘍移植片である。別の例では、ヒト腫瘍異種移植片はヒト間葉性軟骨肉腫の異種移植片である。別の例では、ヒト腫瘍異種移植片はヒト平滑筋肉腫の異種移植片である。別の例では、ヒト腫瘍異種移植片は、ヒト非小細胞肺癌の異種移植片である。
腫瘍移植片の移植後、腫瘍の表現型安定性を評価することができる。一実施形態では、腫瘍移植片の移植後に、生着率および増殖率を評価することができる。特定の実施形態では、本発明のマウスモデルは、腫瘍の表現型安定性を示す。
別の態様では、患者の腫瘍を治療するための有効な治療計画（治療レジメン）を特定するための方法が本明細書において開示される。この方法は、本発明のヒト腫瘍異種移植片を有するヒト化マウスを提供するステップと、前記マウスにおける腫瘍成長阻害に対するそれらの効果を評価するために、本発明の１つ以上の疾患関連抗原を試験するステップと、前記患者を治療するための有効な治療用抗原を同定するステップとを含む。
本発明の抗原に加えて、治療レジメンは、腫瘍増殖に関して評価される必要がある任意の適切なタイプの治療処置を含み得る。特定の実施形態では、治療レジメンは治療剤である。治療剤の例としては、小分子化合物および大型分子（例えば、抗体）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、治療剤は、免疫チェックポイントを標的とする分子である。
別の態様では、本願において提供されるのは、対象（例えばヒト）における腫瘍を治療する方法であって、ヒト腫瘍異種移植片を含むヒト化マウスを提供するステップと、前記ヒト腫瘍異種移植片を含むヒト化マウスを提供するステップと、マウスにおける腫瘍増殖阻害に対するそれらの効果を評価するために、本発明の１つ以上の治療抗原を試験するステップと、有効な治療用抗原を同定するステップとを含む、方法である。
一例では、同定された有効な治療用抗原はワクチンとして使用することができる。
本明細書で使用する「治療する」および「治療」という用語は、疾患または病的状態に関連する望ましくない生理学的変化を予防または緩徐化（軽減）する予防的または予防的手段を含む治療的処置をさす。有益なまたは所望の臨床結果には、症状の緩和、疾患または病的状態の程度の減少、疾患または病的状態の安定化（すなわち、疾患または病的状態が悪化しない）、疾患または病的状態の遅延または減速、疾患または病的状態の改善または緩和、並びに疾患または病的状態の緩解（部分的または全体的である）を含むが、これらに限定されず、またこれらの結果は検出可能であっても検出不可能であってもよい。「治療」とは、治療を受けていない場合の予想される生存の状況と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。治療を必要とするものには、疾患または病的状態を既に有するもの、並びに疾患または病的状態を有する傾向があるものまたは疾患または病的状態が予防されるべきであるものが含まれる。一例では、「治療する」および「治療」という用語は、腫瘍増殖を阻害することをさす。
本発明の非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）モデルは、対象における任意の疾患または障害（例えば、癌／腫瘍）を治療するために、１つ以上の有効な治療分子（例えば、抗原）を試験および同定するために使用することができる。治療され得る癌／腫瘍の更に別の例としては、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、および胃腸癌が挙げられるが、これらに限定されない。肺癌の例としては、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
治療される癌は、原発腫瘍および二次または転移性腫瘍（肺、乳房または前立腺から転移されたものを含む）、並びに再発性または難治性腫瘍を含み得る。再発性腫瘍は、治療によって阻害されると考えられるが、治療を中止してから最大で５年まで、時には１０年以上になる腫瘍をも包含する。難治性腫瘍は、特定の腫瘍型についての１つ以上の従来の治療法による治療に不応性の腫瘍、または耐性の腫瘍である。難治性腫瘍には、ホルモン不応性（例えば、アンドロゲン非依存性前立腺癌、タモキシフェンに対して不応性である乳癌などのホルモン不応性乳癌）であるもの、１つ以上の化学療法剤による治療に対して不応性であるもの、放射線療法に不応性のもの、化学療法および放射線の組み合わせ、化学療法およびホルモン療法、またはホルモン療法および放射線に対して難治性のものが含まれる。
療法は、「第１選択」、すなわち以前に抗癌治療を単独でまたは他の治療と組み合わせて受けていない患者の初期治療として、「第２選択」、すなわち、以前に１つの抗癌治療レジメンを単独で、または他の治療と組み合わせて受けた患者における治療として、または「第３選択」、「第４選択」などとして単独で、または他の治療と組み合わせた治療とすることができる。
部分的に成功しているが特定の治療に耐性のない、以前の治療を受けている患者にも療法を施すことができる。療法は、アジュバント治療として、すなわち、現在検出可能な疾患がない患者において、または腫瘍の外科的除去後に、癌の再発を予防するために施されてもよい。
本発明のマウスモデルは、患者の腫瘍を治療するための個別化された治療を提供するためにも使用することができる。したがって、本願において提供されるのは、別の態様では、患者の腫瘍を治療するための個別化された治療を提供する方法であって、前記患者から得られた腫瘍異種移植片を含むヒト化マウスを提供するステップと、前記マウスにおける腫瘍成長阻害に対する前記薬剤の効果を評価するための１つ以上の治療剤を試験するステップと、有効な治療剤を同定するステップと、前記患者の前記腫瘍を治療するステップであって、それにより個別化された治療を提供する、該ステップとを含む。
本明細書に引用されたあらゆる特許、特許出願公開などの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより具体的に説明するために提示する。しかし、その実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
［実施例１］
（治療抗原の前臨床試験のためのヒト化マウスモデル）
疾患組織（例えば、癌組織）は、対応する健常組織と共に患者から採取することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、標準的な方法を用いて両方の試料から抽出することができる。抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡは、患者の健常細胞および癌細胞のゲノムまたはトランスクリプトーム配列を得るために高スループット配列分析に供することができる。次いで２つの配列を分析し、変異、転座、欠失または増幅のような相違を同定する。真の癌関連変化を偽陽性およびアーチファクト（人工的効果）と区別するために、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．が開発したＣａｎｃｅｒＸｏｍｅ（商標）法を使用して同定された差異を更に分析することができる。同定されたゲノムまたはトランスクリプトームにおける癌関連変化のプールを更に分析して、癌特異的抗原として最も有効である可能性の高い配列を同定することができる。したがって、候補突然変異に対応するペプチド配列に対して、予測配列分析アルゴリズムを用いてＭＨＣ Ｉなどの免疫活性化因子と相互作用する能力について分析することができる。そのような分析により、各候補ペプチド配列について数値スコアが生成され、最大の免疫原性ポテンシャルを有する候補配列を選択することが可能となる。
選択されたペプチドを合成することができ、免疫応答を活性化するそれらの能力を、患者の免疫系で再構成されたヒト化マウスにおいて試験することができる。選択されたペプチドの癌に影響を与える能力は、ゲノムまたはトランスクリプトームにおける癌関連変化を同定するために使用されるものと同じ癌組織を異種移植されたヒト化マウスにおいても試験することができる。免疫系を活性化する能力または癌に影響を与える能力のいずれかを示すペプチドは、その後、この癌を治療するために、または再発を予防するべく患者にワクチン接種するために、患者に直接投与することができる。
当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、上述した実施形態に変更を加えられることが理解されよう。したがって、本発明は本明細書に開示された特定の実施形態に限定されず、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲内にある変更した実施形態を包含する意図であることが理解されよう。

Claims (39)

  1. 対象における疾患を治療するための有効な治療分子を同定するための方法であって、
    対象から前記疾患に関連する生物学的な試料を得るステップと、
    前記生物学的試料中の前記疾患に関連する１つ以上の遺伝子改変を決定するステップと、
    １つ以上の疾患特異的エピトープを同定し、それによって前記１つ以上の疾患特異的エピトープをそれぞれ有する１つ以上の抗原性エピトープペプチドを同定するステップと、
    ヒト化された非ヒト哺乳動物を提供するステップであって、前記ヒト化された非ヒト哺乳動物が、ヒト免疫系で再構成された免疫不全非ヒト哺乳動物である、該ステップと、
    前記対象における前記疾患を治療する際の前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を試験するステップであって、
    前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドを前記ヒト化された非ヒト哺乳動物に投与し、
    前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を評価し、
    前記対象において前記疾患を治療するのに有効な抗原性エピトープペプチドを同定することによって治療効果を試験する、該試験するステップとを含み、
    それによって前記対象における前記疾患を治療するための前記有効な治療用分子を同定することを特徴とする方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、
    健常組織ＲＮＡおよびＤＮＡ配列および疾患組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を生成するために、健常組織および疾患組織から得られたＲＮＡまたはＤＮＡの少なくとも一部を配列決定し、
    健常組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列と疾患組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列とを比較し、
    前記健常組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列と前記疾患組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列との間の相違を同定して、変異体ＤＮＡマーカーセットを生成することによって、遺伝子改変が決定されることを特徴とする方法。
  3. 請求項１に記載の方法であって、前記疾患特異的エピトープは、前記疾患特異的遺伝子改変に対応することを特徴とする方法。
  4. 請求項２に記載の方法であって、配列決定は、トランスクリプトーム配列決定であることを特徴とする方法。
  5. 請求項２に記載の方法であって、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定は、高スループット配列決であることを特徴とする方法。
  6. 請求項１に記載の方法であって、疾患特異的エピトープを同定することは、予測アルゴリズムを用いることを含むことを特徴とする方法。
  7. 請求項１に記載の方法であって、前記疾患は癌であることを特徴とする方法。
  8. 請求項１に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物はマウスであり、前記マウスはヒト免疫系で再構成された免疫不全マウスであることを特徴とする方法。
  9. 請求項１に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物はマウスであり、前記マウスはヒト免疫系で再構成された免疫不全ヌードマウスであることを特徴とする方法。
  10. 請求項９に記載の方法であって、前記マウスは、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）Ｓｈｉ−Ｓｃｉｄ ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスであることを特徴とする方法。
  11. 請求項１に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物はマウスであり、前記マウスはヒトＣＤ３４＋細胞で再構成されることを特徴とする方法。
  12. 請求項１１に記載の方法であって、再構成後の所定時間、前記マウスは、成熟ヒトＣＤ４５＋細胞を提供することができることを特徴とする方法。
  13. 請求項１２に記載の方法であって、前記マウスは、ｈＣＤ３＋、ｈＣＤ４＋、およびｈＣＤ８＋細胞を含むことを特徴とする方法。
  14. 請求項７に記載の方法であって、前記ヒト化された非ヒト哺乳動物はマウスであり、前記マウスは更に患者の腫瘍の異種移植片を含むことを特徴とする方法。
  15. 請求項１４に記載の方法であって、前記ヒト腫瘍異種移植片を前記マウスに皮下移植することを特徴とする方法。
  16. 請求項１４に記載の方法であって、前記ヒト腫瘍異種移植片は、メラノーマ腫瘍移植片、結腸直腸腫瘍移植片、乳房腫瘍移植片、肺腫瘍移植片、ヒト間葉性軟骨肉腫の異種移植片、ヒト平滑筋肉腫の異種移植片、またはヒト非小細胞肺癌の異種移植片であることを特徴とする方法。
  17. 請求項１４に記載の方法であって、前記マウスは、前記腫瘍の表現型安定性を示すことを特徴とする方法。
  18. 対象における疾患を治療するための方法であって、
    前記対象から前記疾患に関連する生物学的試料を得るステップと、
    前記生物学的試料中の前記疾患に関連する遺伝子改変を決定するステップと、
    １つ以上の疾患特異的エピトープを同定し、それによって前記１つ以上の疾患特異的エピトープをそれぞれ有する１つ以上の抗原性エピトープペプチドを同定するステップと、
    ヒト化された非ヒト哺乳動物を提供するステップであって、前記ヒト化された非ヒト哺乳動物が、ヒト免疫系で再構成された免疫不全非ヒト哺乳動物である、該ステップと、
    前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドを前記ヒト化された非ヒト哺乳動物に投与することによって前記対象における前記疾患を治療する際の前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を試験するステップと、
    前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を評価するステップと、
    前記対象において前記疾患を治療するのに有効な抗原性エピトープペプチドを同定するステップと、
    前記有効な治療剤を前記患者に投与し、それによって前記患者における前記疾患を治療するステップとを含むことを特徴とする方法。
  19. 対象における腫瘍を治療するための個別化された治療を提供するための方法であって、
    前記対象から前記疾患に関連する生物学的試料を得るステップと、
    前記生物学的試料中の前記疾患に関連する遺伝子改変を決定するステップと、
    １つ以上の疾患特異的エピトープを同定し、それによって前記１つ以上の疾患特異的エピトープをそれぞれ有する１つ以上の抗原性エピトープペプチドを同定するステップと、
    前記対象の免疫細胞を含むヒト化マウスを提供するステップと、
    前記１つ以上の抗原エピトープペプチドを前記ヒト化マウスに投与することによって前記対象における前記疾患を治療する際の前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を試験するステップと、
    前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドの治療効果を評価するステップと、
    前記対象において前記疾患を治療するのに有効な抗原性エピトープペプチドを同定するステップと、
    前記有効な抗原性エピトープペプチドである有効な治療剤を前記患者に投与し、それによって前記患者における前記疾患を治療するステップとを含むことを特徴とする方法。
  20. 対象において癌を治療するための有効な治療分子を同定する方法であって、
    健常組織試料および前記対象の癌組織試料を得るステップと、
    前記健常組織試料および前記癌組織試料からＲＮＡまたはＤＮＡを単離するステップと、
    健常組織ＲＮＡおよびＤＮＡ配列および癌組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を生成するために、前記健常組織試料および癌組織試料の両方から得られた前記ＲＮＡまたはＤＮＡの少なくとも一部を配列決定するステップと、
    前記健常組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列と前記癌組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列とを比較し、前記健常組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列と前記癌組織ＲＮＡまたはＤＮＡ配列との間の相違を同定して変異マーカーセットを生成するステップと、
    腫瘍特異的エピトープセットを生成するように変異体マーカーセットを分析するステップであって、腫瘍特異的エピトープセットが１つ以上の腫瘍特異的エピトープを含む、該分析するステップと、
    前記腫瘍特異的エピトープセット中の各エピトープの数値スコアを提供するステップと、
    １つ以上の腫瘍特異的抗原エピトープペプチド、または１つ以上の腫瘍特異的エピトープをそれぞれ有する１つ以上の抗原性ペプチドを同定するステップと、
    ヒト免疫系で再構成された免疫不全マウスであるヒト化マウスを提供するステップと、
    前記マウスにおけるヒト免疫系の活性化に対する前記腫瘍特異的エピトープの効果を評価するために前記１つ以上の抗原性ペプチドを試験するステップと、
    前記患者において前記癌を治療するための有効な腫瘍特異的抗原性ペプチドを同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
  21. 疾患のある人のための治療薬を提供するための方法であって、
    前記人からの１つ以上の疾患に冒された細胞から核酸配列を得るステップと、
    メモリサブシステムに接続された少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータシステムを使用することによって複数のエピトープを同定するステップであって、各エピトープは、ヒト由来の健康な細胞からの対応する配列と少なくとも１つの変異体によって異なる配列の一部によってコードされている、該ステップと、
    そのエピトープの予測されるＭＨＣ結合親和性に基づいて前記複数のエピトープのなかの少なくとも１つを選択するステップと、
    ヒト免疫系の一部を含むように操作された非ヒト動物に対する選択されたエピトープの治療効果を観察するステップと、
    前記選択されたエピトープを前記人の疾患を治療するための治療薬として同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
  22. 請求項２１に記載の方法であって、前記核酸配列を得るステップは、１つ以上の疾患に冒された細胞からの核酸を配列決定するステップを含むことを特徴とする方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であって、
    健常細胞由来の追加の核酸を配列決定して健常型配列を得るステップを更に含むことを特徴とする方法。
  24. 請求項２３に記載の方法であって、複数のエピトープを同定するステップは、その配列を前記健常型配列と比較して、少なくとも１つの変異体を同定するステップを含むことを特徴とする方法。
  25. 請求項２１に記載の方法であって、
    前記複数のエピトープのなかの少なくとも１つを選択する前記ステップは、
    ペプチド：ＭＨＣ親和性測定データに関して訓練された人工ニューラルネットワークを用いて親和性を予測するプログラムへの入力としての前記複数のエピトープを提供するステップを含むことを特徴とする方法。
  26. 請求項２１に記載の方法であって、
    前記複数のエピトープを同定する前記ステップは、
    健常細胞からの対応する配列と完全に一致する配列の部分を除いて、前記核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、前記アミノ酸配列をメモリシステム内の有形の記憶装置に格納するステップを含むことを特徴とする方法。
  27. 請求項２１に記載の方法であって、
    前記疾患が癌であることを特徴とする方法。
  28. 請求項２１に記載の方法であって、
    前記非ヒト動物は、ヒト免疫系で再構成された免疫不全マウスであることを特徴とする方法。
  29. 請求項２１に記載の方法であって、
    前記非ヒト動物は、ヒト免疫系で再構成された免疫不全ヌードマウスであることを特徴とする方法。
  30. 請求項２９に記載の方法であって、
    前記マウスは、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）Ｓｈｉ−Ｓｃｉｄ ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスであることを特徴とする方法。
  31. 請求項２１に記載の方法であって、
    前記非ヒト動物はマウスであり、ヒトＣＤ３４＋細胞で再構成されることを特徴とする方法。
  32. 請求項３１に記載の方法であって、
    再構成後の所定時間、前記マウスは成熟ヒトＣＤ４５＋細胞を提供することができることを特徴とする方法。
  33. 請求項３２に記載の方法であって、
    前記マウスは、ｈＣＤ３＋、ｈＣＤ４＋、およびｈＣＤ８＋細胞を含むことを特徴とする方法。
  34. 請求項２７に記載の方法であって、
    前記非ヒト動物はマウスであり、前記マウスは更にヒト腫瘍の異種移植片を含むことを特徴とする方法。
  35. 請求項３４に記載の方法であって、
    前記ヒト腫瘍異種移植片を前記マウスに皮下移植することを特徴とする方法。
  36. 請求項３４に記載の方法であって、
    前記ヒト腫瘍異種移植片は、黒色腫腫瘍移植片、結腸直腸腫瘍移植片、乳房腫瘍移植片、肺腫瘍移植片、ヒト間葉性軟骨肉腫の異種移植片、ヒト平滑筋肉腫の異種移植片、ヒト非小細胞肺癌の異種移植片からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。
  37. 請求項３４に記載の方法であって、
    前記マウスは前記腫瘍の表現型安定性を示すことを特徴とする方法。
  38. 請求項１、１８〜２０、および２１のいずれか一項に記載の方法であって、
    抗原性を最大にするために前記１つ以上の抗原エピトープペプチドを修飾するステップを更に含むことを特徴とする方法。
  39. 請求項１、１８〜２０、および２１のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記１つ以上の抗原性エピトープペプチドをベクターまたは担体に入れるステップを更に含むことを特徴とする方法。
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