BR112021005702A2 - método para selecionar neoepítopos - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA SELECIONAR NEOEPÍTOPOS. para um indivíduo, selecionando neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou MHC II e classificando-os com relação a suas utilidades clínicas. A presente invenção também fornece vacinas contra câncer obtidas pelos métodos conforme descrito neste documento.
Description
“MÉTODO PARA SELECIONAR NEOEPÍTOPOS” Campo de Aplicação
[001] A presente invenção se refere a um método para selecionar neoepítopos para um indivíduo, selecionando neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou MHC II e classificando-os com relação a suas utilidades clínicas. A presente invenção também fornece vacinas contra câncer obtida pelos métodos conforme descrito neste documento.
Descrição do Estado da Técnica
[002] Embora o tratamento de câncer tenha melhorado nas últimas décadas, em particular devido à detecção e diagnóstico precoce, o que aumentou significativamente a sobrevivência, somente cerca de 60% dos pacientes diagnosticados com câncer estão vivos 5 anos após o diagnóstico.
[003] A maioria dos tratamentos contra câncer em uso são procedimentos cirúrgicos, radiação e produtos quimioterapêuticos tóxicos. Entretanto, eles todos têm sérios efeitos colaterais. Recentemente também, tratamentos usando anticorpos direcionados para antígenos associados ao câncer ou moléculas imunomodulatórias conhecidas foram usados.
[004] Nos últimos anos, terapias imunes contra câncer direcionadas às células cancerígenas com a ajuda do sistema imune do próprio paciente, por exemplo, vacinas contra câncer, atraíram interesse porque essas terapias podem reduzir ou mesmo eliminar alguns dos efeitos colaterais vistos no tratamento tradicional contra câncer.
[005] A base da imunologia é baseada na discriminação entre próprio e não próprio. A maioria dos patógenos que induzem doenças infecciosas contêm assinaturas moleculares que podem ser reconhecidas pelo hospedeiro e desencadeiam respostas imunes. Entretanto, células tumorais são derivadas de células normais e, em geral, não expressam nenhuma assinatura molecular estranha, tornando-as mais difíceis de ser distinguidas das células normais.
[006] Contudo, a maioria das células tumorais expressa diferentes tipos de antígenos tumorais. Uma classe de antígenos tumorais são os assim chamados antígenos associados ao tumor, por exemplo, antígenos expressos em baixos níveis em tecidos normais e expressos em um nível muito mais alto no tecido tumoral. Tais antígenos associados ao tumor foram o alvo para vacinas contra câncer nas últimas décadas. Entretanto, o tratamento imunológico direcionado para antígenos associados ao tumor apresenta vários desafios, em que as células tumorais podem evitar o sistema imune regulando negativamente o antígeno em questão, e o tratamento também pode levar a toxicidades devido à destruição normal de células.
[007] Recentemente, outra classe de antígenos tumorais foi identificada, os assim chamados neoantígenos tumorais, que são antígenos específicos para o tumor. Os neoantígenos tumorais aumentam devido a uma ou mais mutações no genoma do tumor levando a um desafio na sequência de aminoácidos da proteína em questão. Uma vez que estas mutações não estão presentes no tecido normal, os efeitos colaterais do tratamento direcionado para os neoantígenos específicos para o tumor não aumentam com um tratamento imunológico direcionado a neoantígenos tumorais.
[008] Entretanto, para criar vacinas eficientes, é importante que a maioria dos neoepítopos imunogênicos sejam selecionados e usados para a vacina.
Objetivos da Invenção
[009] Os inventores da presente invenção desenvolveram um processo de seleção de neoepítopo para selecionar neoepítopos que têm propriedades comprovadas como importantes para imunogenicidade. Ao usar este método, os neoepítopos altamente imunogênicos preditos para se ligarem ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) podem ser selecionados para vacinas, resultando assim em vacinas capazes de induzir uma resposta imune forte e robusta. As vacinas adequadas para terapia personalizada contra o câncer podem, assim, ser geradas. Neste documento são fornecidos, assim,
métodos para classificar os neoepítopos de acordo com suas utilidades clínicas, que são particularmente adequados no contexto de produzir vacinas personalizadas para terapia contra o câncer.
[010] Desta forma, a presente invenção se refere a um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopo mínimos em cada um dos referidos neoepítopos; c. Selecionar os neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando A neoepítopos com utilização clínica.
[011] Também é fornecido um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência;
b.
Determinar a afinidade de ligação ao MHC I para cada um dos referidos neoepítopos, e determinar o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I para cada um dos referidos neoepítopos;
c.
Classificar os neoepítopos como se segue:
i. priorizar os neoepítopos compreendendo um alto número de epítopos mínimos que se ligam a MHC I e/ou MHC II e selecionar um primeiro grupo de neoepítopos com uma alta classificação;
ii. opcionalmente, priorizar os neoepítopos do primeiro grupo de neoepítopos como se segue:
1) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for igual ou maior que 20, o epítopo mínimo tem a maior classificação;
2) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for igual ou maior que 20, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação para os epítopos mínimos de 1;
3) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e igual ou maior que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 2;
4) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e igual ou maior que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 3;
5) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e igual ou maior que 1, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 4;
6) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e igual ou maior que 1, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 5;
7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor classificação;
em que o diferencial de ligação ao MHC I é dado pela fórmula %Rank de classificação (MHC I) para referência) / %Rank de classificação (MHC I) para epítopo mínimo); e selecionar um segundo grupo de neoepítopos com uma alta classificação;
iii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do segundo grupo com base na sua pontuação %Rank de MHC I e selecionar um terceiro grupo de neoepítopos com uma baixa pontuação %Rank de MHC I;
iv. opcionalmente, selecionar um quarto grupo de neoepítopos do segundo ou do terceiro grupo incluindo epítopos mínimos com alta semelhança com epítopos conhecidos por ser reconhecidos por células T;
v. opcionalmente, priorizar neoepítopos do segundo grupo, do terceiro grupo ou do quarto grupo com base na sua pontuação de BLOSUM, em que uma pontuação de BLOSUM menor que um limiar predeterminado é classificado superior a uma pontuação de BLOSUM igual ou maior que o referido limiar, e selecionar um quinto grupo de neoepítopos com uma pontuação de BLOSUM menor que o referido limiar, em que o referido limiar preferencialmente é 1;
vi. opcionalmente, selecionar neoepítopos do primeiro, segundo, terceiro, quarto ou quinto grupo de neoepítopos com base nos neoepítopos sendo encontrados em duas ou mais amostras, e selecionar um sexto grupo de neoepítopos encontrado em duas ou mais amostras;
vii. opcionalmente, selecionar neoepítopos do primeiro,
segundo, terceiro, quarto, quinto ou sexto grupo de neoepítopos com base na identificação da mutação por pelo menos duas diferentes tipificações de variante, e selecionar um sétimo grupo de neoepítopos compreendendo uma mutação identificada por pelo menos duas diferentes tipificações de variante, em que o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto ou sétimo grupo de neoepítopos compreende os referidos A neoepítopos.
[012] Também é fornecido um método de preparar uma vacina contra câncer compreendendo neoepítopos, o referido método compreendendo uma etapa de selecionar os referidos neoepítopos usando os métodos descritos neste documento.
[013] Também é descrita neste documento uma vacina contra câncer que pode ser obtida pelos métodos descritos neste documento.
[014] Também é fornecido um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência; b. determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para cada um dos referidos neoepítopos; c. selecionar os neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, em que A é um número inteiro e A é pelo menos 3, como pelo menos 4, como pelo menos 5, selecionando assim A neoepítopos capazes de induzir uma resposta de célula T um CD8+ quando administrados em uma quantidade imunologicamente ativa a um indivíduo.
Breve Descrição dos desenhos
[015] Figura 1 – O %Rank da afinidade de ligação predita por NetMHCpan/NetMHC IIpan para moléculas de classe I (A) e de classe II (B) de MHC (moléculas para neoepítopos imunogênicos (esquerda) versus não imunogênicos (direita) (avaliado em camundongos vacinados com VB10.NEO).
[016] Figura 2 – A pontuação de BLOSUM para neoepítopos selecionados com baixo %Rank para moléculas de MHC de classe I (A) e de classe II (B). Peptídeos imunogênicos: esquerda; peptídeos não imunogênicos: direita.
[017] Figura 3 – O número acumulado de pontos de IFN-ɣ para os 20 neoepítopos principais escolhidos usando NeoSELECT no conjunto de dados do modelo de CT26 (A) e B16 (B). O número acumulado médio de pontos de IFN-ɣ para 1.000 neoepítopos aleatoriamente escolhidos para cada conjunto de dados é representado com a linha preta.
[018] Figura 4 – O número acumulado de pontos de IFN-ɣ para os 20 neoepítopos principais (Mutante) e sequência de tipo selvagem destes neoepítopos (WT) de conjunto de dados de CT26 (A), B16 (B) e LL2 (C) usando a estratégia NeoSELECT. O número acumulado médio de pontos de IFN-ɣ para 1.000 neoepítopos aleatoriamente escolhidos de CT26 (A), B16 (B) e LL2(C) é representado com a linha preta.
[019] Figura 5 – As pontuações de BLOSUM são mostradas para neoepítopos imunogênicos e não imunogênicos com uma menor afinidade de ligação ao MHC I (diferencial de ligação ao MHC I abaixo de 1), uma maior afinidade de ligação ao MHC I (diferencial de ligação ao MHC I acima de 3) e sem nenhuma mudança na afinidade de ligação ao MHC I. A figura mostra que os neoepítopos imunogênicos (cinza claro) têm uma pontuação menor de BLOSUM que os neoepítopos não imunogênicos (cinza escuro) quando a afinidade de ligação ao MHC I é alterada (painéis da esquerda e central), enquanto nenhuma mudança na pontuação de BLOSUM é observada para os neoepítopos para os quais a afinidade de ligação ao MHC I é inalterada.
[020] Figura 6 – Dez (10) diferentes neoepítopos (pep1-10) todos preditos de se ligar ao MHC de classe I (resposta da célula T CD8+) foram investigados por Kreiter et al., 2015, e Castle et al., 2012, para investigar se eles poderiam induzir respostas da célula T CD8+ em um modelo de tumor melanoma B16-F10 de camundongo. As respostas induzidas por 6 neoepítopos quando administrados como Vaccibody conforme descrito neste documento (“VB10.NEO”) são mostradas no painel superior. A resposta de CD4 e CD8 quando administrada como peptídeo mais adjuvante poli ICLC, RNA e Vaccibody são sumarizados no painel inferior, onde branco indica nenhuma resposta, cinza claro indica uma resposta fraca, cinza médio uma resposta média e cinza escuro uma resposta forte.
[021] Figura 7 – Visão geral do processo de seleção de neoepítopo.
[022] Figura 8 – O número total de epítopos mínimos preditos para MHCI de classe I e II dentro de neoepítopos de 27 aminoácidos de comprimento (avaliado em camundongos vacinados com VB10.NEO). Im: imunogênico; Non-Im: não imunogênico.
[023] Figura 9 – Uma comparação entre neoepítopos imunogênicos e não imunogênicos com relação aos seus diferenciais de ligação entre WT e MT para moléculas de MHC de classe I para neoepítopos com mutação na posição de ancoramento.
[024] Figura 10 – A pontuação de BLOSUM para neoepítopos selecionados com baixa %Rank para moléculas de MHC de classe I (A) e de classe II (B).
Descrição Detalhada da Invenção Definições
[025] O termo “neoantígeno tumoral” ou “neoantígeno”
conforme usado neste documento se refere a qualquer antígeno específico para o tumor compreendendo uma ou mais mutações como em comparação ao exoma de tecido saudável do hospedeiro. O neoantígeno tumoral usado de forma sinônima com o termo câncer neoantígeno. As referidas uma ou mais mutações também podem ser referidas como “mutações de neoepítopo”. A mutação pode ser qualquer mutação que leva a uma mudança em pelo menos um aminoácido. Desta forma, a mutação pode ser uma das seguintes: - uma mutação de forma não sinônima que leva a uma mudança no aminoácido; - uma mutação que leva a um deslocamento do quadro e, desta forma, um quadro de leitura aberto completamente diferente na direção após a mutação; - uma mutação ininterrupta em que um códon de parada é modificado ou deletado que leva a uma proteína maior com um neoepítopo específico para o tumor; - mutações splice que levam a uma sequência de proteína específica para o tumor exclusiva; - rearranjos cromossômicos que dão origem a uma proteína quimérica com um neoepítopo específico para o tumor na junção das duas proteínas.
[026] Uma mutação conforme entendido neste documento não necessariamente se refere a mutação de um único resíduo, mas geralmente se refere a uma diferença entre uma dada sequência (por exemplo, de um neoepítopo potencial) e uma sequência de referência. Uma mutação pode, assim, se referir a mutação de mais que um resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação imunogênica.
[027] O termo “neoepítopo tumoral” ou “neoepítopo” conforme usado neste documento se refere a qualquer mutação imunogênica em um antígeno tumoral e é usado de forma sinônima com o termo neoepítopo de câncer. A presença de uma mutação é determinada comparando a sequência do neoepítopo derivada de uma amostra de tumor com uma sequência de referência presente em uma amostra de referência, como um tecido saudável do mesmo indivíduo. Ele normalmente se refere a um peptídeo com um comprimento de 27 aminoácidos. Um neoepítopo pode compreender um ou vários epítopos mínimos, conforme definido neste documento. A mutação está normalmente presente no ou próximo ao centro do neoepítopo, isto é, na posição 14 em um 27-mer, mas não necessariamente no centro do epítopo mínimo(s).
[028] O termo “sequência de neoepítopos tumorais” ou “sequência de neoepítopos” conforme usado neste documento se refere à sequência compreendendo o neoepítopo em uma subunidade antigênica, e é usado de forma sinônima com o termo sequência de neoepítopo de câncer.
[029] O termo “peptídeo de neoepítopo tumoral”, “peptídeo de neoepítopo” conforme usado neste documento se refere a uma sequência de peptídeos do neoepítopo em que a referida sequência de peptídeos compreende a mutação.
[030] O termo “epítopo mínimo” se refere a uma subsequência de um neoepítopo predito para se ligar a MHC I ou MHC II, a referida subsequência compreendendo a mutação, que pode ser imunogênica. Em outras palavras, o epítopo mínimo pode ser imunogênico, isto é, capaz de obter uma resposta imune, por exemplo, se ele compreender uma mutação que confere imunogenicidade ao epítopo mínimo ou que aumenta a imunogenicidade do epítopo mínimo. Uma mutação como esta é referida neste documento como uma mutação imunogênica. O termo epítopo mínimo assim pode se referir a subsequências curtas de um neoepítopo, que são preditas para se ligar a MHC I ou MHC II, e que compreendem a mutação encontrada no neoepítopo. Um neoepítopo 27-mer compreendendo uma mutação na posição 14 pode assim englobar vários epítopos mínimos de ligação, isto é, epítopos mínimos de ligação, com um comprimento menor que 27 aminoácidos, mas que cada compreende a mutação. Por exemplo, um epítopo mínimo poderia consistir nos primeiros 14 aminoácidos do neoepítopo, desde que ele seja predito para se ligar a MHC I ou MHC II, ou poderia consistir nos aminoácidos 9 a 18 do neoepítopo, ou dos aminoácidos 7 a 22.
[031] O termo “molécula de MHC” conforme usado neste documento inclui tanto moléculas de MHC de classe I (MHC I) quanto de MHC de classe II (MHC II). O MHC I representa vários loci, como HLA-A (Antígeno do leucócito humano-A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P e HLA-V, enquanto MHC II representa loci, como HLA- DRA, HLA-DRB 1-9, HLA-, HLA-DQA1, HLA- DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, e HLA-DOB. Os termos “molécula de MHC “ e “ molécula de HLA” são usados neste documento indiferentemente.
[032] Os termos “um neoepítopo é selecionado” ou “seleção de um neoepítopo” conforme usado neste documento se referem à seleção de um neoepítopo para potencial uso clínico ou terapêutico, preferencialmente para uso em uma vacina contra câncer. Assim, quando um neoepítopo for selecionado, ele será um candidato potencial para uso clínico ou para uso em uma vacina contra câncer. Os neoepítopos selecionados a classificaram neoepítopos superior ou priorizados anteriores que não são selecionados.
[033] Um nucleotídeo é definido neste documento como um monômero de RNA ou DNA. Um nucleotídeo é uma ribose ou um anel de desoxirribose ligada tanto a uma base quanto a um grupo fosfato. Os nucleosídeos tanto mono-, di-, e tri-fosfato são referidos como nucleotídeos.
[034] O termo “genoma” conforme usado neste documento se refere à quantidade total de informação genética nos cromossomas de um organismo ou uma célula.
[035] O termo “exoma” conforme usado neste documento se refere a parte do genoma formado por éxons, as sequências que, quando transcritas, permanecem dentro do RNA maduro após os íntrons serem removidos por splicing de RNA. Ele consiste em todo DNA que é transcrito para o RNA maduro nas células de qualquer tipo como distinto do transcriptoma, que é o RNA que foi transcrito somente em uma população específica de células.
[036] O termo “mutação” conforme usado neste documento inclui translocações, inversões, deleções, duplicações e mutações pontuais preferencialmente presentes em um nucleotídeo que codifica um neoepítopo. Em uma modalidade preferida, a mutação é uma substituição de aminoácido preferencialmente presente no neoepítopo.
[037] O termo “vacina contra câncer” conforme usado neste documento se refere a uma vacina que tanto trata câncer existente quanto previne o desenvolvimento de um câncer. As vacinas que tratam câncer existente são conhecidas como vacinas terapêuticas contra câncer.
Identificação de neoepítopos
[038] O método de acordo com a presente invenção pode compreender uma etapa de identificar um ou mais neoepítopos ‘identificando mutações específicas para o tumor em sequências de ácidos nucleicos de uma amostra obtida do indivíduo, conforme descrito neste documento. O referido um ou mais neoepítopos é preferencialmente uma pluralidade de neoepítopos; entretanto, em alguns casos mesmo um único neoepítopo pode ser útil no contexto de terapia personalizada, por exemplo, terapia personalizada contra o câncer, desde que ele seja capaz de induzir a resposta imunológica desejada.
[039] Preferencialmente, o referido indivíduo é um paciente com câncer. Uma ou mais amostras podem ser obtidas do paciente com câncer para identificar neoepítopos que podem ser candidatos potenciais para uso clínico, como, por exemplo, uma vacina imunogênica contra câncer personalizada.
[040] Preferencialmente, mutações específicas para o tumor são identificadas comparando sequências de nucleotídeos obtidas de uma amostra de tumor do referido indivíduo com sequências de nucleotídeos normais. As sequências de nucleotídeos normais podem ser obtidas sequenciando ácidos nucleicos obtidos de uma amostra de fluido corporal ou qualquer tecido não tumoral do referido indivíduo. Preferencialmente, as sequências de nucleotídeos normais são obtidas de um tecido saudável do mesmo indivíduo. As sequências de nucleotídeos normais também podem ser obtidas de uma base de dados. O termo “normal” quando aplicado a uma sequência, seja uma sequência de peptídeos ou uma sequência de nucleotídeos, será usado neste documento indiferentemente com o termo “referência” ou “tipo selvagem”. O termo pode, assim, se aplicar à sequência correspondente encontrada em circunstâncias “normais” no mesmo indivíduo ou em uma população normal, saudável. A comparação das sequências específicas de tumor com a sequência correspondente encontrada em outro tecido não tumoral isolado do mesmo indivíduo, pode assim reduzir o número de falsos positivos, porque os neoepítopos resultantes de variação genética entre indivíduos, por exemplo, compreendendo SNPs que pode ser específico para indivíduo, mas não específico para o tumor, serão filtrados dos resultados. A sequência de referência isolada do indivíduo pode ser de uma amostra de células saudáveis obtidas do mesmo indivíduo antes do diagnóstico. A amostra também pode ser obtida antes do início da terapia, ou após o início da terapia.
[041] O termo “amostra de tumor” conforme usado neste documento se refere a uma amostra compreendendo células tumorais. A amostra de tumor pode ser obtida fazendo uma biópsia do referido indivíduo ou paciente com câncer. A biópsia pode ser uma amostra pequena de tecido tumoral que é retirada com uma agulha ou cirurgia menor. A amostra também pode ser uma biópsia de linfonodo. Também, várias biópsias ou biópsias de tumor podem ser feitas.
[042] A amostra de referência pode ser uma amostra de fluido corporal. A amostra de fluido corporal pode, por exemplo, ser uma amostra de urina, uma amostra fecal, uma amostra de soro ou uma amostra de saliva. Em uma modalidade preferida, a amostra de fluido corporal é uma amostra de sangue. Preferencialmente, a amostra de referência é obtida de um tecido saudável do indivíduo em necessidade de tratamento.
[043] Os ácidos nucleicos obtidos das amostras podem ser sequenciados usando qualquer método de sequenciamento conhecido. Por exemplo, sequenciamento da próxima geração pode ser usado. Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos das células tumorais de um indivíduo são em comparação com a sequências de ácidos nucleicos das células normais, como células saudáveis do mesmo indivíduo ou células de referência para identificar diferenças na sequência.
Afinidades de ligação ao MHC I e MHC II
[044] Para selecionar e priorizar os neoepítopos sendo os candidatos mais fortes para vacinas personalizadas contra câncer, os presentes inventores desenvolveram um método para classificar e selecionar neoepítopos que provoca uma resposta imune forte.
[045] Para iniciar uma resposta imune, os neoepítopos deveriam se direcionar para os epítopos restritos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), uma vez que somente os peptídeos que podem ligar molécula de MHCs fornecem alvos de célula T elegíveis. Assim, uma primeira etapa para selecionar os neoepítopos mais promissores pode ser determinar suas afinidades de ligação ao MHC.
[046] O MHC I é encontrado na superfície da célula de todas as células nucleadas no corpo. Uma função do MHC I é exibir peptídeos de dentro da célula para células T citotóxicas. O complexo de MHC I-complexo de peptídeo é inserido na membrana plasmática da célula que apresenta o peptídeo às células T citotóxicas, enquanto uma ativação de células T citotóxicas contra o complexo MHC-peptídeo particular é desencadeada. O peptídeo é posicionado em um sulco na molécula de MHC I, permitindo que o peptídeo seja normalmente de cerca de 8 a 10 aminoácidos de comprimento. O MHC I pode ser usado indiferentemente com MHC de classe I.
[047] As moléculas de MHC II são uma família de moléculas normalmente encontrada somente nas células de apresentação de antígeno, como células dendríticas, fagócitos mononucleares, algumas células endoteliais, células epiteliais tímicas, e células B. O MHC II pode ser usado indiferentemente com o MHC de classe II.
[048] Ao contrário do MHC I, os antígenos apresentados pelos peptídeos de MHC de classe II são derivados de proteínas extracelulares. As proteínas extracelulares são endocitosadas, digeridas em lisossomas, e os peptídeos antigênicos resultantes são carregados sobre as moléculas de MHC de classe II e então apresentados na superfície da célula. O sulco de ligação ao antígeno das moléculas de MHC de classe II é aberto em ambas as extremidades e é capaz de apresentar peptídeos maiores, em geral entre 15 e 24 resíduos de aminoácidos de comprimento. Além do mais, antígenos exógenos, que são normalmente apresentados pelo MHC na superfície das células dendríticas, podem ser apresentados através do caminho do MHC I através de apresentação cruzada. A apresentação cruzada é necessária para a imunidade contra a maioria dos tumores e vírus.
[049] As moléculas de MHC de classe I são reconhecidas pelos receptores de célula T (TCR) e correceptores nas células T CD8+, enquanto as moléculas de MHC de classe II são reconhecidas pelo TCR e correceptores nas células T CD4+.
[050] Os inventores da presente invenção estabeleceram um método para selecionar neoepítopos em que neoepítopos são classificados com relação a suas utilidades clínicas, e em que neoepítopos com afinidade para o MHC, por exemplo, MHC I e/ou MHC II, são selecionados.
[051] Assim, um aspecto da presente invenção se refere a um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos; c. Selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica.
[052] Os neoepítopos com uma alta probabilidade de utilização clínica são neoepítopos que são imunogênicos e provavelmente são adequados para uso em uma vacina contra câncer. Assim, o método da presente invenção é um método para selecionar a maioria dos neoepítopos imunogênicos que são altamente adequados para uso em uma vacina contra câncer.
[053] Os alelos de MHC dentro da população humana apresentam um polimorfismo extremo. Cada lócus genético compreende um grande número de haplótipos compreendendo alelos distintos que codificam diferentes peptídeos. Desta forma, as afinidades de ligação ao MHC I e MHC II são preferencialmente determinadas entre as sequências de neoepítopos e sequências de MHC I e/ou MHC II obtidas do mesmo indivíduo.
[054] Para determinar a afinidade de ligação ao MHC de um neoepítopo identificado em um indivíduo, é necessário realizar uma tipagem de HLA do referido indivíduo. Assim, o método da presente invenção também pode compreender uma etapa em que a afinidade de ligação ao MHC é determinada determinando o genótipo de HLA do referido indivíduo. Por exemplo, o referido genótipo de HLA é determinado a partir de uma amostra de sangue do referido indivíduo.
[055] Técnicas para determinar o tipo de HLA de um indivíduo são bem conhecidas. A tipagem de HLA pode ser realizada usando qualquer método de sequenciamento adequado. Preferencialmente, sequenciamento da próxima geração é usado.
[056] Por exemplo, o DNA isolado das amostras de sangue do referido indivíduo pode ser sequenciado em uma plataforma de sequenciamento da próxima geração, como, por exemplo, a plataforma Illumina.
[057] As afinidades de ligação ao MHC I e MHC II podem ser determinadas ou preditas usando programas de computador que preveem as afinidades de ligação entre um peptídeo e moléculas de MHC I e MHC II.
[058] Assim, em uma modalidade, a afinidade de ligação ao MHC é determinada por predição in silico. Preferencialmente, a referida predição in silico é realizada usando um programa de computador que prevê a ligação de peptídeos às Moléculas de MHC de classe I e/ou de MHC de classe II. Os valores de afinidade de ligação preditos são traduzidos para uma pontuação de percentil comparando-os às afinidades de ligação preditas de um conjunto de 100.000 peptídeos 9 mer naturais aleatórios. Preferencialmente, a pontuação %Rank usada para prever as afinidades de ligação de neoepítopos às moléculas de MHC I e MHC II é calculada usando o NetMHCpan descrito em Nielsen et al 2016 (Nielsen, M. et al. (2016) “NetMHCpan-3.0: improved prediction of binding to MHC class I molecules integrating information from multiple receptor and peptide length data sets” Genome Medicine: 8:33) and Vannessa, J. et al (2017) “NetMHCpan-4.0: Improved Peptide–MHC Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data.” Vanessa Jurtz, Sinu Paul, Massimo Andreatta, Paolo Marcatili, Bjoern Peters and Morten Nielsen. The Journal of Immunology (2017)) e programas de computador NetMHC IIpan conforme descrito em Andreatta et al. 2015 (Andreatta M. et al. Accurate pan-specific prediction of peptide-MHC class II binding affinity with improved binding core identification. Immunogenetics. 2015;67(11-12):641–650). A pontuação %Rank conforme referido neste documento é calculada usando as bases de dados anteriores de 30.03.2016 para NetMHCpan e 29.09.2015 para NetMHCIIpan.
[059] Uma baixa pontuação %Rank indica uma forte afinidade de ligação enquanto uma maior pontuação %Rank indica uma afinidade de ligação mais fraca. Assim, os neoepítopos com uma baixa pontuação %Rank são preferencialmente classificados anteriormente neoepítopos com uma pontuação %Rank superior.
[060] A pontuação %Rank (MHC I) se refere à pontuação %Rank que prevê a afinidade de ligação ao MHC I para um peptídeo, um epítopo mínimo ou um neoepítopo.
[061] A pontuação %Rank (MHC II) se refere à pontuação %Rank que prevê a afinidade de ligação ao MHC II para um peptídeo, um epítopo mínimo ou um neoepítopo.
[062] Conforme explicado anteriormente, cada neoepítopo pode compreender um ou mais epítopos mínimos. A pontuação %Rank (MHC I) ou a pontuação %Rank (MHC II) para cada epítopo mínimo dentro de um dado neoepítopo também pode ser determinada. Preferencialmente, a pontuação %Rank do neoepítopo é então igual à pontuação %Rank do epítopo mínimo que ele compreende que é a menor, isto é, a afinidade de ligação do neoepítopo é considerada como a mesma que a afinidade de ligação do melhor ligante entre os epítopos mínimos que ele compreende.
[063] Em algumas modalidades, os neoepítopos ou epítopos mínimos com uma pontuação %Rank (MHC I) menor ou igual a 2 são considerados para se ligar ao MHC I. No geral, uma pontuação %Rank (MHC I) inferior é indicativa de uma afinidade de ligação superior. Por exemplo, um neoepítopo ou epítopo mínimo com uma pontuação %Rank (MHC I) compreendida entre 0,5 e 2 (0,5 < pontuação %Rank (MHC I) ≤ 2) pode, em algumas modalidades, ser considerado um ligante de MHC I fraco, enquanto uma pontuação %Rank (MHC I) igual ou abaixo de 0,5 indica que o neoepítopo ou epítopo mínimo é um ligante de MHC I forte. Em algumas modalidades, os neoepítopos ou epítopos mínimos com uma pontuação %Rank > 2 são considerados como não capazes de se ligar ao MHC I. Em modalidades preferidas, os neoepítopos que não compreendem nenhum epítopo mínimo preditos para se ligar ao MHC I são considerados como não capazes de utilização clínica e são excluídos ou subpriorizados. Em outras palavras, a etapa e dos presentes métodos pode compreender ou consistir na etapa de excluir ou subpriorizar neoepítopos que são preditos não se ligar ao MHC I. A subpriorização de um neoepítopo significa que o neoepítopo é considerado de relevância remota para uso clínico. A exclusão de um neoepítopo significa que o neoepítopo não é selecionado para uso clínico e/ou que o neoepítopo não é selecionado para uso em uma vacina.
[064] No geral, os neoepítopos incluindo epítopos mínimos com uma alta afinidade de ligação ao MHC I, isto é, uma baixa pontuação %Rank (MHC I), são classificados anteriormente neoepítopos compreendendo epítopos mínimos com uma menor afinidade de ligação ao MHC I, isto é, uma maior pontuação %Rank (MHC I). Os neoepítopos compreendendo epítopos mínimos com uma alta afinidade de ligação ao MHC I, isto é, uma baixa pontuação %Rank (MHC I), são classificados anteriormente neoepítopos compreendendo epítopos mínimos com uma menor afinidade de ligação ao MHC I, isto é, uma maior pontuação %Rank (MHC I).
[065] Em algumas modalidades, os neoepítopos ou epítopos mínimos com uma pontuação %Rank (MHC II) menor ou igual a 10 são considerados para se ligar ao MHC I. Por exemplo, um neoepítopo ou epítopo mínimo com uma pontuação %Rank (MHC II) compreendida entre 2 e 10 (2 < pontuação %Rank (MHC II) ≤ 10) pode, em algumas modalidades, se considerado um ligante de MHC II fraco, enquanto uma pontuação %Rank (MHC II) igual ou abaixo de 2 indica que o neoepítopo ou epítopo mínimo é um ligante de MHC II forte. Em algumas modalidades, os neoepítopos ou epítopos mínimos com uma pontuação %Rank > 10 são considerados como não capazes de se ligar ao MHC II. Em modalidades preferidas, os neoepítopos que não compreendem nenhum epítopo mínimo de ligação são considerados como não sendo de utilização clínica e são excluídos ou subpriorizados. Em outras palavras, as etapas dos presentes métodos, por exemplo, a etapa c ou e dos presentes métodos, podem compreender ou consistir na etapa de excluir os neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos que são preditos para não se ligar ao MHC II. A subpriorização de um neoepítopo significa que o neoepítopo é considerado de relevância remota para uso clínico. A exclusão de um neoepítopo significa que o neoepítopo não é selecionado para uso clínico e/ou que o neoepítopo não é selecionado para uso em uma vacina.
[066] No geral, os neoepítopos ou epítopos mínimos com uma alta afinidade de ligação ao MHC II, isto é, uma baixa pontuação %Rank (MHC II), são classificados anteriormente neoepítopos ou epítopos mínimos com uma menor afinidade de ligação ao MHC I, isto é, uma maior pontuação %Rank (MHC II). Os neoepítopos compreendendo epítopos mínimos com uma alta afinidade de ligação ao MHC II, isto é, uma baixa pontuação %Rank (MHC II), são classificados anteriormente neoepítopos compreendendo epítopos mínimos com uma menor afinidade de ligação ao MHC II, isto é, uma maior pontuação %Rank (MHC II).
[067] Em uma modalidade preferida, os epítopos mínimos de ligação ao MHC II têm uma pontuação %Rank (MHC II) abaixo de 10. Assim, os epítopos mínimos de ligação ao MHC II compreendidos nos neoepítopos selecionados na etapa b do método de acordo com a presente invenção preferencialmente têm uma pontuação %Rank (MHC II) abaixo de 10. Isto significa que neoepítopos compreendendo epítopos mínimos preditos ou determinados para se ligar ao MHC II com uma pontuação %Rank abaixo de 10 são selecionados para uso clínico potencial e constituem candidatos de vacina potenciais. Os neoepítopos compreendendo epítopos mínimos preditos para se ligar ao MHC II com uma pontuação %Rank (MHC II) maior que 10 são preferencialmente subpriorizados ou excluídos.
[068] No geral, os neoepítopos de ligação ao MHC II compreendendo epítopos mínimos com uma alta afinidade de ligação ao MHC II são classificados anteriormente neoepítopos compreendendo epítopos mínimos com uma menor afinidade de ligação ao MHC II.
Número de epítopos mínimos
[069] Pode-se esperar que os neoepítopos compreendendo mais que um epítopo mínimo tenham utilização clínica maior que os neoepítopos compreendendo somente um epítopo mínimo. Desta forma, em algumas modalidades, o número de epítopos mínimos compreendendo a mutação imunogênica e capazes de se ligar às moléculas de MHC é o parâmetro mais importante na etapa d do método anterior. Entretanto, também é possível que os neoepítopos provavelmente tenham utilização clínica e sejam selecionados pelos presentes métodos somente compreendam um único epítopo mínimo; tais neoepítopos pode ser clinicamente relevante se nenhum outro estiver disponível, e/ou se o epítopo mínimo conferir ligação ou forte ligação às moléculas de MHC.
[070] Em uma modalidade, os neoepítopos compreendendo um maior número de epítopos mínimos são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo um menor número de epítopos mínimos. Os neoepítopos compreendendo um menor número de epítopos mínimos incluem neoepítopos compreendendo somente um epítopo mínimo.
[071] Assim, em uma modalidade, o método da presente invenção compreende ainda uma etapa de determinar o número de epítopos mínimos compreendido nos neoepítopos de ligação ao MHC I, em que os neoepítopos de ligação ao MHC I compreendendo um maior número de epítopos mínimos de ligação são classificados anteriormente neoepítopos de ligação ao MHC I compreendendo um menor número de epítopos mínimos de ligação.
[072] Em uma outra modalidade, o método da presente invenção compreende ou compreende ainda uma etapa de determinar o número de epítopos mínimos presente nos neoepítopos de ligação ao MHC II, em que os neoepítopos de ligação ao MHC II compreendendo um maior número de epítopos mínimos de ligação são classificados anteriormente neoepítopos de ligação ao MHC II compreendendo um menor número de epítopos mínimos de ligação.
[073] Em algumas modalidades, o presente método compreende uma etapa de determinar tanto o número de epítopos mínimos que são capazes de se ligar às moléculas de MHC I quanto o número de epítopos mínimos que são capazes de se ligar às moléculas de MHC II.
[074] Para classificar os neoepítopos como uma função do número total de epítopos mínimos que eles compreendem, o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I é, em algumas modalidades, ponderado superior, por exemplo, duplo, em comparação ao número de epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Isto significa que a pontuação para o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I é maior que a pontuação para o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC II, como o dobro. Por exemplo, um neoepítopo com 14 epítopos mínimos de ligação ao MHC I e 13 epítopos mínimos de ligação ao MHC II é predito para ser mais imunogênico que um neoepítopo compreendendo 12 epítopos mínimos de ligação ao MHC I e 15 neoepítopos mínimos de MHC II.
[075] Uma pontuação de ligação para cada neoepítopo é assim determinada. Na prática, o número de epítopos (de ligação) mínimos compreendidos em um neoepítopo é determinado, identificando assim x epítopos mínimos de ligação ao MHCI e/ou y epítopos mínimos de ligação ao MHCII.
[076] Um esquema de pontuação adequado para determinar a pontuação de ligação de um neoepítopo pode ser: a*2x + b*y; em que uma maior pontuação de ligação é indicativa de uma maior probabilidade de utilização clínica conforme explicado anteriormente.
[077] Por exemplo, a=1 se y > 0, e a=0 se y=0, e b=1 se x > 0, e b=0 se x=0.
[078] Outro esquema de pontuação adequado pode ser: a*x + b*y; em que uma maior pontuação de ligação é indicativa de uma maior probabilidade de utilização clínica conforme explicado anteriormente.
[079] Por exemplo, a=2 e b=1, ou a=2 se y>0, e a=0 se y=0, e b=1 se x > 0, e b=0 se x=0.
[080] Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo de ligação ao MHC I e pelo menos um epítopo mínimo de ligação ao MHC II são classificados superior aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC I ou somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em outras modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo somente os epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em outras modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo de ligação ao MHC II são classificados superiores a neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC I.
[081] Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 2 epítopos mínimos de ligação ao MHC são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo somente um epítopo mínimo de ligação ao MHC. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 3 epítopos mínimos de ligação ao MHC são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 3 epítopos mínimos de ligação ao MHC. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 4 epítopos mínimos de ligação ao MHC são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 4 epítopos mínimos de ligação ao MHC. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 5 epítopos mínimos de ligação ao MHC são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 5 epítopos mínimos de ligação ao MHC. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 6 epítopos mínimos de ligação ao MHC são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 6 epítopos mínimos de ligação ao MHC. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 7 epítopos mínimos de ligação ao MHC são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 7 epítopos mínimos de ligação ao MHC. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 8 epítopos mínimos de ligação ao MHC são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 8 epítopos mínimos de ligação ao MHC. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 9 epítopos mínimos de ligação ao MHC são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 9 epítopos mínimos de ligação ao MHC. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 10 epítopos mínimos de ligação ao MHC são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 10 epítopos mínimos de ligação ao MHC. O epítopo mínimo de ligação ao MHC pode ser um epítopo mínimo de ligação ao MHC I ou um epítopo mínimo de ligação ao MHC II.
[082] Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 2 epítopos mínimos de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo somente um epítopo mínimo de ligação ao MHC I ou aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 3 epítopos mínimos de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 3 epítopos mínimos de ligação ao MHC I ou aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 4 epítopos mínimos de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 4 epítopos mínimos de ligação ao MHC I ou aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 5 epítopos mínimos de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 5 epítopos mínimos de ligação ao MHC I ou aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 6 epítopos mínimos de ligação ao
MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 6 epítopos mínimos de ligação ao MHC I ou aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 7 epítopos mínimos de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 7 epítopos mínimos de ligação ao MHC I ou aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 8 epítopos mínimos de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 8 epítopos mínimos de ligação ao MHC I ou aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 9 epítopos mínimos de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 9 epítopos mínimos de ligação ao MHC I ou aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 10 epítopos mínimos de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 10 epítopos mínimos de ligação ao MHC I ou aos neoepítopos compreendendo somente epítopos mínimos de ligação ao MHC II.
[083] Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 2 epítopos mínimos de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo somente um epítopo mínimo de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 3 epítopos mínimos de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 3 epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 4 epítopos mínimos de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 4 epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 5 epítopos mínimos de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 5 epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 6 epítopos mínimos de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 6 epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 7 epítopos mínimos de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 7 epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 8 epítopos mínimos de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 8 epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 9 epítopos mínimos de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 9 epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo pelo menos 10 epítopos mínimos de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo menos que 10 epítopos mínimos de ligação ao MHC II.
Diferencial de ligação
[084] Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo epítopos mínimos que têm uma afinidade de ligação ao MHC I que é maior ou muito maior em comparação à afinidade de ligação ao MHC I do peptídeo de referência correspondente são priorizados sobre os neoepítopos compreendendo epítopos mínimos para os quais a afinidade de ligação ao MHC I é somente ligeiramente melhor em comparação à afinidade de ligação de referência ao MHC I correspondente.
[085] Desta forma, a razão da pontuação %Rank (MHC I) entre neoepítopo e o peptídeo de referência correspondente pode ser usada para selecionar neoepítopos para uso clínico potencial. Neste documento, a razão da pontuação %Rank para ligação ao MHC I também é referida como o diferencial de ligação ao MHC I.
[086] Da mesma maneira, em algumas modalidades, os neoepítopos que têm uma afinidade de ligação ao MHC II que é maior ou muito maior em comparação à afinidade de ligação ao MHC II do peptídeo de referência correspondente são priorizados sobre os neoepítopos que expressam peptídeos para os quais a afinidade de ligação ao MHC II é somente ligeiramente melhorada em comparação à afinidade de ligação ao MHC II de referência correspondente.
[087] Desta forma, a razão da pontuação %Rank (MHC II) entre neoepítopo e o peptídeo de referência correspondente pode ser usada para selecionar os neoepítopos para uso clínico potencial. Neste documento, a razão da pontuação %Rank para a ligação ao MHC II também é referida como o diferencial de ligação ao MHC II.
[088] O diferencial de ligação ao MHC I entre o peptídeo de referência e o neoepítopo é dado pela seguinte fórmula: pontuação %Rank (MHC I) para referência) / %Rank de classificação (MHC I) para o neoepítopo), em que a pontuação %Rank (MHC I) para referência é a afinidade de ligação predita entre i peptídeo de referência e as moléculas de MHC I e a pontuação %Rank (MHC I) para o neoepítopo é a afinidade de ligação predita entre o peptídeo de neoepítopo e as moléculas de MHC I.
[089] Em uma modalidade da presente invenção, a etapa b ou c do método descrito anteriormente compreende ainda determinar o diferencial de ligação ao MHC I dado pela fórmula %Rank de classificação (MHC I) para referência) / %Rank de classificação (MHC I) para o neoepítopo), em que os neoepítopos com um alto diferencial de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos com um diferencial de ligação ao MHC I inferior.
[090] Em uma modalidade, os neoepítopos são subpriorizados se o diferencial de ligação ao MHC I, %Rank de classificação (MHC I) para referência) / %Rank de classificação (MHC I) para o neoepítopo) for abaixo de 2.
[091] Em uma modalidade, os neoepítopos são subpriorizados se o diferencial de ligação ao MHC I, %Rank de classificação (MHC I) para referência) / %Rank de classificação (MHC I) para o neoepítopo) for abaixo de 20, como abaixo de 3, como abaixo de 1. Os neoepítopos são considerados de relevância clínica potencial se o diferencial de ligação for igual ou maior que 1, como igual ou maior que 3, como igual ou maior que 20.
[092] De uma maneira semelhante, o diferencial de ligação ao MHC I entre o peptídeo de referência e um epítopo mínimo é dado pela seguinte fórmula: %Rank de classificação (MHC I) para referência) / %Rank de classificação (MHC I) para epítopo mínimo), em que o pontuação %Rank (MHC I) para referência é a afinidade de ligação predita entre o peptídeo de referência e as moléculas de MHC I e a pontuação %Rank (MHC I) para o epítopo mínimo é a afinidade de ligação predita entre o epítopo mínimo peptídeo e as moléculas de MHC I.
[093] Em uma modalidade da presente invenção, a etapa b ou c do método descrito anteriormente compreende ainda determinar o diferencial de ligação ao MHC I dado pela fórmula %Rank de classificação (MHC I) para referência) / %Rank de classificação (MHC I) para epítopo mínimo), em que os neoepítopos compreendendo os epítopos mínimos com um alto diferencial de ligação ao MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo epítopos mínimos com um menor diferencial de ligação ao MHC I.
[094] Em uma modalidade, os neoepítopos são subpriorizados se o diferencial de ligação ao MHC I, %Rank de classificação (MHC I) para a sequência de referência do epítopo mínimo) / %Rank de classificação (MHC I) para o epítopo mínimo) for abaixo de 20, como abaixo de 3, como abaixo de 1. Os neoepítopos são considerados de relevância clínica potencial se o diferencial de ligação dos epítopos mínimos que eles compreendem for igual ou maior que 1, como igual ou maior que 3, como igual ou maior que 20.
[095] Se um neoepítopo compreender somente um epítopo mínimo de ligação ao MHC I, o diferencial de ligação ao MHC I do neoepítopo é igual ao diferencial de ligação ao MHC I do referido epítopo mínimo. Se um neoepítopo compreender dois ou mais epítopos mínimos de ligação ao MHC I, o diferencial de ligação ao MHC I do neoepítopo é considerado igual ao maior diferencial de ligação ao MHC I entre os referidos dois ou mais epítopos mínimos de ligação ao MHC I. Da mesma forma, se um neoepítopo compreender somente um epítopo mínimo de ligação ao MHC II, o diferencial de ligação ao MHC II do neoepítopo é igual ao diferencial de ligação ao MHC II do referido epítopo mínimo. Se um neoepítopo compreender dois ou mais epítopos mínimos de ligação ao MHC II, o diferencial de ligação ao MHC II do neoepítopo é considerado igual ao maior diferencial de ligação ao MHC II entre os referidos dois ou mais epítopos mínimos de ligação ao MHC II. Isto é verdade em relação aos peptídeos de referência também.
[096] Em algumas modalidades, a posição da mutação também é considerada. Em outras palavras, a utilização clínica de um neoepítopo ou epítopo mínimo é determinada não somente na luz do exposto anteriormente, mas também como uma função da posição da mutação. Em modalidades preferidas, a mutação é imunogênica. O sulco de ligação ao peptídeo das moléculas de MHC acomoda os peptídeos ou fragmentos dos peptídeos, em geral de 9 aminoácido de comprimento, isto é, os epítopos mínimos. O contato entre o epítopo mínimo e a molécula de MHC é mediado por meio das cadeias laterais dos resíduos de âncora. Tomando como exemplo um epítopo mínimo de 9 aminoácido de comprimento, as posições de ancoramento de um epítopo mínimo a uma molécula de MHC I são posições 2 e 9. Para a ligação às moléculas de MHC II, as posições de ancoramento são posições 1, 4 e 9.
[097] Em algumas modalidades, os neoepítopos compreendendo os epítopos mínimos nos quais a mutação está em uma posição de não ancoramento são excluídos ou subpriorizados independentemente de seu diferencial de ligação. Para os epítopos mínimos de ligação ao MHC I, isto significa que, em algumas modalidades, os neoepítopos são excluídos ou subpriorizados se a mutação for na posição 1, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 do epítopo mínimo ou da parte do epítopo mínimo que é acomodada no sulco de ligação da molécula de MHC, não importa o quão alto o diferencial de ligação é. Os neoepítopos preferidos compreendem os epítopos mínimos com uma mutação em uma posição de ancoramento e um diferencial de ligação igual ou maior que 2, como igual ou maior que 4, como igual ou maior que 6, como igual ou maior que 8, como igual ou maior que 10, como igual ou maior que 12, como igual ou maior que 14, como igual ou maior que 16, como igual ou maior que 18, o mais preferencialmente, como igual ou maior que 20,
[098] O diferencial de ligação ao MHCII também pode ser usado como um critério de seleção. O diferencial de ligação ao MHC II entre o peptídeo de referência e o neoepítopo é dado pela seguinte fórmula: %Rank de classificação (MHC II) para a sequência de referência do epítopo mínimo) / %Rank de classificação (MHC II) para o epítopo mínimo), em que o pontuação %Rank (MHC II) para o epítopo mínimo é a afinidade de ligação predita para o melhor epítopo mínimo de classificação no neoepítopo, e a pontuação %Rank (MHC II) para a referência é a afinidade de ligação predita para o peptídeo correspondente na sequência de referência.
[099] Em uma modalidade da presente invenção, a etapa b ou c do método descrito anteriormente compreende ainda determinar o diferencial de ligação ao MHC II dado pela fórmula %Rank de classificação (MHC II) para a sequência de referência do epítopo mínimo) / %Rank de classificação (MHC II) para o epítopo mínimo), em que os neoepítopos com um alto diferencial de ligação ao MHC II são classificados superiores aos neoepítopos com um menor diferencial de ligação ao MHC II.
[100] De uma maneira semelhante, o diferencial de ligação ao MHC II entre o peptídeo de referência e um epítopo mínimo é dado pela seguinte fórmula: %Rank de classificação (MHC II) para referência) / %Rank de classificação (MHC II) para epítopo mínimo), em que a pontuação %Rank (MHC II) para referência é a afinidade de ligação predita entre o peptídeo de referência e as moléculas de MHC II e a pontuação %Rank (MHC II) para epítopo mínimo é a afinidade de ligação predita entre peptídeo de epítopo mínimo e as moléculas de MHC II.
[101] Os métodos para determinar a afinidade de ligação ao MHC II são descritos anteriormente.
[102] Em uma modalidade da presente invenção, os neoepítopos compreendendo os epítopos mínimos de ligação ao MHC II preditos para se ligar ao MHC II com uma pontuação %Rank (MHC II) abaixo de 20, como abaixo de 15, como abaixo de 14, como, por exemplo, abaixo de 13, abaixo de 12 ou, por exemplo, abaixo de 11 são excluídos ou subpriorizados.
[103] Em uma modalidade preferida, os neoepítopos compreendendo epítopos mínimos de ligação ao MHC II com uma pontuação %Rank (MHC II) abaixo de 10 são excluídos ou subpriorizados.
[104] Em uma outra modalidade, os neoepítopos compreendendo epítopos mínimos de ligação ao MHC II com uma pontuação %Rank (MHC II) em 9 ou abaixo disso, como em 8 ou abaixo disso, como por exemplo, em 7 ou abaixo disso, em 6 ou abaixo disso, como em 5, ou abaixo disso como, por exemplo, em 4 ou abaixo disso, em 3 ou abaixo disso ou, por exemplo, em 2 ou abaixo disso são excluídos ou subpriorizados.
[105] Um exemplo de um esquema de pontuação que pode ser usado em uma etapa do método anterior, como na etapa d, é dado a seguir: - epítopo mínimo com uma mutação com um diferencial de ligação < 1 independentemente da posição da mutação: pontuação igual a 1; - epítopo mínimo com uma mutação em uma posição de não ancoramento, e 1≤ diferencial de ligação < 3: pontuação igual a 2; - epítopo mínimo com uma mutação em uma posição de ancoramento e 1 ≤ diferencial de ligação < 3: pontuação igual a 3; - epítopo mínimo com uma mutação em uma posição de não ancoramento e 3 ≤ diferencial de ligação < 20: pontuação igual a 4;
- epítopo mínimo com uma mutação em uma posição de ancoramento e 3 ≤ diferencial de ligação < 20: pontuação igual a 5; - epítopo mínimo com uma mutação em uma posição de não ancoramento e um diferencial de ligação > 20: pontuação igual a 6; - epítopo mínimo com uma mutação em uma posição de ancoramento e um diferencial de ligação > 20: pontuação igual a 7.
[106] O diferencial de ligação pode ser o diferencial de ligação ao MHCI ou ao MHCII.
[107] Será compreendido que as pontuações dadas anteriormente são valores arbitrários e poderiam ser substituídos por outros valores arbitrários, desde que a pontuação aumente, conforme exemplificado anteriormente. No geral, conforme pode ser visto, os epítopos mínimos ou epítopos com um baixo diferencial de ligação (por exemplo, menor que 1) são classificados inferiores, independentemente da posição da mutação. Para os epítopos mínimos ou epítopos com diferenciais de ligação na mesma faixa (por exemplo, 1≤ diferencial de ligação < 3; ou 3 ≤ diferencial de ligação < 20; ou diferencial de ligação > 20), os epítopos mínimos ou neoepítopos compreendendo uma mutação em uma posição de ancoramento são classificados superiores aos epítopos mínimos ou neoepítopos compreendendo uma mutação em uma posição de não ancoramento. No geral, quanto maior o diferencial de ligação, maior a pontuação. Para pontuações semelhantes, uma mutação em uma posição de ancoramento dá uma pontuação maior que uma mutação em uma posição de não ancoramento.
[108] No esquema de pontuação anterior, os epítopos mínimos classificados inferiores tanto têm uma mutação em uma posição de não ancoramento, ou têm uma mutação em uma posição de ancoramento e um diferencial de ligação < 1.
Comprimento dos neoepítopos
[109] A sequência de neoepítopos preferencialmente tem um comprimento adequado para o processamento e apresentação de epítopos mínimos compreendidos dentro de um neoepítopo nas moléculas de MHC. Assim, em uma modalidade, os neoepítopos apresentam um comprimento de 7 a 40 aminoácidos, como de 10 a 35 aminoácidos, ou mais preferencialmente de 15 a 30 aminoácidos, como de 25 a 30 aminoácidos. Em uma modalidade preferida, o neoepítopo tem 27 aminoácidos. Os comprimentos dos neoepítopos incluem comprimentos de neoepítopos de ligação tanto ao MHC I quanto ao MHC II.
[110] É preferido que a mutação seja posicionada essencialmente no centro da sequência de neoepítopos.
[111] Em algumas modalidades, os epítopos mínimos para um dado neoepítopo consistem em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo. Em casos ondo neoepítopo é o epítopo mínimo, o neoepítopo e o epítopo mínimo têm o mesmo comprimento. Em tais modalidades, o epítopo mínimo apresenta um comprimento de 7 a 40 aminoácidos, como de 10 a 35 aminoácidos, ou mais preferencialmente de 15 a 30 aminoácidos, como de 25 a 30 aminoácidos. Em uma modalidade, o comprimento do epítopo mínimo é de 27 aminoácidos. Os comprimentos dos epítopos mínimos incluem comprimentos dos neoepítopos de ligação tanto ao MHC I quanto ao MHC II.
[112] Em outras modalidades, os epítopos mínimos compreendidos dentro de um neoepítopo são menores que o neoepítopo. Por exemplo, o neoepítopo apresenta um comprimento de 7 a 40 aminoácidos e o(s) epítopo(s) mínimo(s) correspondente(s) tem um comprimento de 6 a 39 aminoácidos, ou têm um comprimento menor que o comprimento do neoepítopo em pelo menos um aminoácido, como em pelo menos 2 aminoácidos, como em pelo menos 3 aminoácidos, como em pelo menos 4 aminoácidos, como em pelo menos 5 aminoácidos, como em pelo menos 6 aminoácidos, como em pelo menos 7 aminoácidos, como em pelo menos 8 aminoácidos, como em pelo menos 9 aminoácidos, como em pelo menos 10 aminoácidos, como em pelo menos 11 aminoácidos, como em pelo menos 12 aminoácidos, como em pelo menos 13 aminoácidos, como em pelo menos 15 aminoácidos, como em pelo menos 16 aminoácidos, como em pelo menos 17 aminoácidos, como em pelo menos 18 aminoácidos, como em pelo menos 19 aminoácidos, como em pelo menos 20 aminoácidos. Em uma modalidade preferida, o neoepítopo tem 27 aminoácidos, e o epítopo mínimo tem um comprimento de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 aminoácidos.
[113] Em algumas modalidades, o epítopo mínimo se liga ou é predito para se ligar a MHC I, e o epítopo mínimo tem um comprimento de entre 5 e 20 aminoácidos, como entre 6 e 19 aminoácidos, como entre 7 e 18 aminoácidos, como entre 7 e 17 aminoácidos, como entre 7 e 16 aminoácidos, como entre 8 e 15 aminoácidos, como entre 8 e 14 aminoácidos. Normalmente, tais epítopos mínimos têm um comprimento entre 8 e 14 aminoácidos.
[114] Em algumas modalidades, o epítopo mínimo se liga ou é predito para se ligar a MHC II, e o epítopo mínimo tem um comprimento de entre 5 e 20 aminoácidos, como entre 6 e 19 aminoácidos, como entre 7 e 18 aminoácidos, como entre 7 e 17 aminoácidos, como entre 8 e 16 aminoácidos, como entre 9 e 15 aminoácidos. Normalmente, tais epítopos mínimos têm um comprimento entre 9 e 15 aminoácidos.
Semelhança com epítopos reconhecidos por células T conhecidos
[115] Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de selecionar um grupo de neoepítopos que compreende epítopos mínimos com alta semelhança com epítopos que são conhecidos por ser reconhecidos por células T. Os versados sabem onde encontrar listas de tais epítopos. Por exemplo, os epítopos que são conhecidos por ser reconhecidos por células T podem ser obtidos na Base de Dados de Epítopos Imunes e Recurso de Análise (IEDB), onde epítopos infecciosos humanos são listados (https://www.iedb.org/). As sequências dos epítopos mínimos compreendidos nos neoepítopos considerados prováveis de ter utilização clínica podem ser, assim,
executadas na base de dados para determinar se os epítopos mínimos têm alta semelhança com epítopos conhecidos por ser reconhecidos por células T.
[116] O termo “alta semelhança” quando aplicado a duas sequências significa que as sequências compartilham semelhança significativa, isto é, a soma das combinações idênticas e semelhantes é alta. A semelhança pode ser determinada calculando uma pontuação de alinhamento, por exemplo, usando BLOSUM62. Os versados sabem que o limiar de pontuações de alinhamento pode ser usado para determinar se as duas sequências têm alta semelhança uma com a outra. Por exemplo, para epítopos 9-mer, uma pontuação de alinhamento > 26 pode ser adequadamente usada como limiar para selecionar epítopos com alta semelhança.
[117] As pontuações de alinhamento normalizadas também podem ser usadas para avaliar se duas sequências de peptídeos têm alta semelhança uma com a outra. Por exemplo, uma pontuação de alinhamento normalizada pode ser a pontuação de alinhamento BLOSUM62 obtida para um dado epítopo mínimo e um dado epítopo na base de dados IEDB, dividida pela pontuação de alinhamento entre o referido epítopo mínimo e em si (correspondendo à pontuação de alinhamento máxima para este epítopo mínimo). Para obter uma medição para a semelhança, o resultado é então subtraído de 1. Em outras palavras, o seguinte cálculo pode ser realizado: Semelhança com epítopo conhecido = 1 – (pontuação de alinhamento epítopo mínimo)/(pontuação de alinhamento epítopo conhecido)
[118] Quanto maior a pontuação, maior a semelhança com o epítopo conhecido.
Número de epítopos mínimos totais
[119] Os neoepítopos úteis compreendem pelo menos um epítopo mínimo compreendendo uma mutação, por exemplo, uma mutação imunogênica, e com um comprimento de entre 5 e 20 aminoácidos, preferencialmente entre 6 e 19 aminoácidos, como entre 7 e 18 aminoácidos, por exemplo, entre 8 e 17 aminoácidos, como entre 9 e 16 aminoácidos, por exemplo, entre 10 e 15 aminoácidos, como entre 11 e 14 aminoácidos, por exemplo, 12 ou 13 aminoácidos, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 aminoácidos. Preferencialmente, o epítopo mínimo tem um comprimento de 8 a 14 aminoácidos. Um neoepítopo pode compreender vários epítopos mínimos, que podem se sobrepor. Um neoepítopo podem assim, compreender entre 1 e 100 epítopos mínimos, como entre 1 e 90 epítopos mínimos, como entre 1 e 80 epítopos mínimos, como entre 1 e 70 epítopos mínimos, como entre 1 e 60 epítopos mínimos, como entre 1 e 50 epítopos mínimos, como entre 1 e 40 epítopos mínimos, como entre 1 e 30 epítopos mínimos, como entre 1 e 20 epítopos mínimos, como entre 2 e 19 epítopos mínimos, por exemplo, entre 3 e 18 epítopos mínimos, como entre 4 e 17 epítopos mínimos, por exemplo, entre 5 e 16 epítopos mínimos, como entre 6 e 15 epítopos mínimos, por exemplo, entre 7 e 14 epítopos mínimos, como entre 8 e 13 epítopos mínimos, por exemplo, entre 9 e 12 epítopos mínimos, como 10 ou 11 epítopos mínimos, todos compreendendo a mutação imunogênica. Um epítopo mínimo tem afinidade para uma molécula de MHC, como uma molécula de MHC I ou uma molécula MHC II. A mutação compreendida no neoepítopo não é necessariamente centralizada no epítopo mínimo, mas pode, em algumas modalidades, ser centralizada no epítopo mínimo. Assim, a mutação pode ser no primeiro ou último resíduo do epítopo mínimo, ou qualquer outro resíduo entre eles. Conforme descrito anteriormente, em modalidades preferidas, a mutação está em uma posição de ancoramento. Em algumas modalidades, os epítopos mínimos com uma mutação em uma posição de não ancoramento são excluídos ou subpriorizados.
[120] No geral, um neoepítopo pode compreender n diferentes epítopos mínimos com um comprimento de k aminoácidos, todos compreendendo a mutação. Um dado neoepítopo pode compreender epítopos mínimos de diferentes comprimentos.
Probabilidade de uma mutação ocorrer na natureza
[121] Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção compreende ainda uma etapa de determinar uma probabilidade de uma mutação presente nos neoepítopos ocorrer na natureza. A mudança de um aminoácido em uma proteína pode reduzir sua capacidade de realizar sua função, ou ainda mudar a função. As mudanças nas proteínas com importantes funções na célula podem potencialmente fazer com que a célula morra. Ao contrário, a mudança pode permitir que a célula continue funcionando, apesar de em uma maneira diferente, e pode ainda levar a modificações eficientes/vantajosas em comparação a proteína original, permitindo que a mutação seja passada para os descendentes do organismo. Se a mudança não resultar em nenhuma desvantagem física significativa ao descendente, a possibilidade de a mutação persistir na população, no entanto, existe. Uma vez que aminoácidos variam muito nas propriedades físicas e químicas, eles são divididos em grupos com propriedades semelhantes. A substituição de um aminoácido por outro do mesmo grupo é mais provável de ter um impacto menor na estrutura e função de uma proteína que a substituição com um aminoácido de uma categoria diferente. Assim, os neoepítopos compreendendo um aminoácido mutado que é de um grupo físico-químico diferente do aminoácido de referência são, em algumas modalidades, priorizados sobre os neoepítopos compreendendo um aminoácido mutado que é do mesmo grupo físico-químico que o aminoácido de referência.
[122] Preferencialmente, a mutação dá origem a uma substituição de aminoácido. O termo “par de substituição” conforme usado neste documento se refere ao par consistindo no aminoácido sendo substituído e do aminoácido que ele substitui.
[123] Assim, em uma modalidade preferida da presente invenção, a etapa d do método descrita neste documento e anteriormente compreende ainda determinar uma pontuação que reflete a semelhança entre a sequência de aminoácidos mutada e a sequência de aminoácidos de referência.
[124] Para calcular a pontuação para uma substituição de aminoácido específica, as matrizes de substituição podem ser usadas. As matrizes de substituição contêm uma probabilidade ou uma pontuação log com base nas frequências de mutação observadas em todas as sequências de proteínas disponíveis. Quanto menor a pontuação de probabilidade log, menos provável é observar esta substituição de aminoácido ao se comparar sequências de aminoácidos que ocorrem naturalmente umas com as outras. Também foi mostrado que a pontuação de probabilidade log baixa se correlaciona bem com alta diferença nas propriedades físico-químicas entre o par de substituição de aminoácido. Por exemplo, uma substituição com uma baixa pontuação de probabilidade log, ou uma menor probabilidade/frequência desta mutação ocorrer em uma perspectiva evolucionária, tem uma melhor chance de ser descoberta por um receptor de célula T que uma substituição com uma alta pontuação de probabilidade log devido a uma maior diferença nas propriedades físico-químicas entre o peptídeo mutado recém-formado (epítopo) em comparação ao peptídeo de referência. Os receptores de célula T têm a capacidade de tolerar não somente autopeptídeos, mas também peptídeos com semelhança alta aos autopeptídeos, isto é, peptídeos com mutações com uma alta pontuação de probabilidade log. Este mecanismo é conhecido como tolerância central.
[125] As probabilidades usadas no cálculo da matriz são calculadas considerando “blocos” de sequências conservadas encontrados em múltiplos alinhamentos de proteína. Supõe-se que estas sequências conservadas são de importância funcional dentro das proteínas relacionadas e, desta forma, terão menores taxas de substituição que as regiões menos conservadas. Para reduzir os desvios das sequências intimamente relacionadas nas taxas de substituição, segmentos em um bloco com uma identidade de sequência acima de um determinado limiar foram agrupados, reduzindo o peso de cada tal agrupamento (Henikoff, S; Henikoff, J. G. (1992). “Amino acid substitution matrices from protein blocks”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22): 10915–9.). Para a matriz BLOSUM62, este limiar foi ajustado a 62%. Frequências em pares foram então contadas entre os agrupamentos, assim os pares foram contados somente entre segmentos menores que 62% idênticos. Poderia se usar uma matriz BLOSUM de numeração superior para alinhar duas sequências intimamente relacionadas e um número inferior para sequências mais divergentes.
[126] Assim, em uma modalidade preferida da presente invenção, uma pontuação que reflete a probabilidade de uma substituição de aminoácido presente nos neoepítopos ocorrer aleatoriamente é determinada usando uma matriz de pontuação de base evolucionária. Em uma modalidade mais preferida, a referida matriz de pontuação é uma matriz de probabilidade log. Em uma modalidade particularmente preferida, a referida matriz é a matriz BLOSUM, preferencialmente a matriz BLOSUM62.
[127] Para calcular uma matriz BLOSUM, a seguinte equação é usada: Sij = (1/) * log(ij/(qi*qj)); em que ij é a probabilidade de dois aminoácidos i e j substituírem um ao outro em uma sequência homóloga, e qi e qj são as probabilidades de fundo de encontrar os aminoácidos i e j em qualquer sequência de proteína. O fator é um fator de escala, ajustado de maneira tal que a matriz contenha valores de número inteiro facilmente calculáveis.
[128] Os neoepítopos compreendendo uma mutação onde a substituição de par de aminoácidos tem uma baixa pontuação de BLOSUM62 são classificados anteriormente como neoepítopos com uma substituição de par de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 superior.
[129] Em uma modalidade, os neoepítopos que não compreendem mutações ligadas a uma substituição de par de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 3, como, por exemplo, abaixo de 2 são subpriorizados ou excluídos.
[130] Em uma modalidade preferida da presente invenção, os neoepítopos que não compreendem substituição de pares de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 1 são subpriorizados ou excluídos. Assim, preferencialmente, os neoepítopos compreendendo pelo menos uma substituição de par de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 1 são priorizados ou selecionados para uso clínico.
[131] Em uma outra modalidade da presente invenção, os neoepítopos que não compreendem substituição de pares de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 1 são subpriorizados ou excluídos. Assim, em uma modalidade, os neoepítopos compreendendo pelo menos uma substituição de par de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 1 são priorizados ou selecionados para uso clínico.
[132] Para os neoepítopos de ligação ao MHC I serem selecionados para uso clínico potencial, é preferido que o neoepítopo atenda a pelo menos um dos seguintes dois critérios i e ii: i. um alto diferencial de ligação ao MHC I; ii. uma baixa pontuação de BLOSUM62.
[133] Em uma modalidade, os neoepítopos de ligação ao MHC I que atendem a pelo menos um dos seguintes dois critérios i e ii: i. o diferencial de ligação ao MHC I para o neoepítopo é acima de 1; ii. o neoepítopo compreende uma substituição de aminoácido com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 3, como abaixo de 2, preferencialmente abaixo de 1; são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC I que não atendem a nenhum dos critérios i e ii.
[134] Em uma modalidade preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC I que atendem a pelo menos um dos seguintes dois critérios i e ii: i. o diferencial de ligação ao MHC I para o neoepítopo é acima de 3; ii. o neoepítopo compreende uma substituição de aminoácido com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 3, como abaixo de 2, preferencialmente abaixo de 1; são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC I que não atendem a nenhum dos critérios i e ii.
[135] Em uma modalidade ainda mais preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC I que atendem a pelo menos um dos seguintes dois critérios i e ii: i. o diferencial de ligação ao MHC I para o neoepítopo é acima de 2; ii. o neoepítopo compreende uma substituição de par de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 3, como abaixo de 2, preferencialmente abaixo de 1; são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC I que não atendem a nenhum dos critérios i e ii.
[136] Em algumas modalidades, os neoepítopos de ligação ao MHC I que não atendem a nenhum dos critérios i e ii anteriores são preferencialmente excluídos ou subpriorizados. Além do mais, em algumas modalidades, os neoepítopos de ligação ao MHC I que atendem ao critério i, mas em que a mutação está uma posição de não ancoramento são excluídos ou subpriorizados, conforme descrito neste documento a seguir.
[137] Para os neoepítopos de ligação ao MHC II serem selecionados para uso clínico potencial, é preferido que pelo menos um dos seguintes dois critérios i e ii seja atendido: i. um alto diferencial de ligação ao MHC II; ii. uma baixa pontuação de BLOSUM62.
[138] Em uma modalidade, os neoepítopos de ligação ao MHC II que atendem a pelo menos um dos seguintes dois critérios i e ii: i. o diferencial de ligação ao MHC II para o neoepítopo é acima de 2; ii. o neoepítopo compreende uma substituição de par de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 3, como abaixo de 2 ou preferencialmente abaixo de 1; são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC II que não atendem a nenhum dos critérios i e ii.
[139] Em uma modalidade preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC II que atendem a pelo menos um dos seguintes dois critérios i e ii: i. o diferencial de ligação ao MHC II para o neoepítopo é acima de 3; ii. o neoepítopo compreende uma substituição de par de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 3, como abaixo de 2 ou preferencialmente abaixo de 1; são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC II que não atendem a nenhum dos critérios i e ii.
[140] Em uma modalidade ainda mais preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC II que atendem a pelo menos um dos seguintes dois critérios i e ii: i. o diferencial de ligação ao MHC II para o neoepítopo é acima de 2; ii. o neoepítopo compreende uma substituição de par de aminoácidos com uma pontuação de BLOSUM62 abaixo de 1; são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC II que não atendem a nenhum dos critérios i e ii.
[141] Os neoepítopos de ligação ao MHC II que não atendem a nenhum dos critérios i e ii anteriores são preferencialmente excluídos ou subpriorizados. Além do mais, em algumas modalidades, os neoepítopos de ligação ao MHC II que atendem ao critério i, mas em que a mutação está uma posição de não ancoramento são excluídos ou subpriorizados, conforme descrito neste documento anteriormente.
Nível de expressão de RNA
[142] O nível de expressão de RNA do gene da fonte onde uma mutação é encontrada pode ser um fator importante para a imunogenicidade de um neoepítopo. Um maior nível de expressão de RNA normalmente levará a uma maior expressão da proteína e apresentação do neoepítopo nas moléculas de MHC nas células tumorais e, assim, um maior potencial para indução de imunogenicidade específica contra câncer.
[143] Assim, em uma modalidade preferida, o método da presente invenção compreende ainda uma etapa de determinar o nível de expressão de RNAs dos neoepítopos.
[144] No geral, os neoepítopos com um alto nível de expressão de RNA são classificados superiores aos neoepítopos com um menor nível de expressão de RNA.
[145] Em uma modalidade particular, na etapa d dos presentes métodos, os neoepítopos de ligação ao MHC I com um alto nível de expressão de RNA são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC I com um menor nível de expressão de RNA. Em outra modalidade particular, os neoepítopos de ligação ao MHC II com um alto nível de expressão de RNA são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC II com um menor nível de expressão de RNA.
[146] Preferencialmente, os neoepítopos para os quais RNA do gene da fonte não é detectado são excluídos ou subpriorizados. Em particular, os neoepítopos com uma expressão no nível do transcrito normalizada de 0 transcrito por milhão (TPM) são excluídos ou subpriorizados. Os transcritos com uma expressão no nível do transcrito normalizada detectável, como uma expressão no nível do transcrito acima de 0 TPM, não são excluídos.
[147] O nível de expressão de RNAs pode ser determinado por sequenciamento de RNA de ácidos nucleicos obtidos de amostras de tumor conforme definido anteriormente. O sequenciamento de RNA pode ser realizado por técnicas conhecidas na técnica. Os métodos para determinar o nível de expressão de RNAs são bem conhecidos por versados. Por exemplo, o nível de expressão de RNAs pode ser determinado usando tecnologias de sequenciamento de próxima geração como, por exemplo, a plataforma Illumina.
Risco de autoimunidade
[148] Para minimizar o risco de reatividade cruzada, é preferido que os neoepítopos compreendendo um peptídeo de núcleo que ocorre naturalmente (como um peptídeo de 9 aa de comprimento incluindo a mutação) que coincida com uma sequência de peptídeos no proteoma humano sejam excluídos ou subpriorizados. Assim, os métodos da presente invenção podem compreender ainda uma etapa de comparar as sequências de peptídeo de neoepítopo com sequências de peptídeos do proteoma humano.
[149] O proteoma humano é definido neste documento como todas as traduções que resultam de genes conhecidos do genoma humano. Os genes conhecidos são publicados em www.ensembl.org. Assim, para determinar se a sequência de peptídeos de núcleo do neoepítopo corresponde com uma sequência de peptídeos no proteoma humano, as sequências podem ser comparadas com sequências de peptídeos do genoma humano obtidas a parit de uma base de dados.
[150] As sequências de peptídeos de núcleo de neoepítopo são compostas dos neoepítopos conforme descrito anteriormente. Os neoepítopos compreendendo uma sequência de peptídeos incluindo uma mutação, que corresponde com uma sequência de peptídeos que ocorre naturalmente no proteoma humano preferencialmente serão excluídos ou subpriorizados.
[151] Isto é porque, sem ficar preso a nenhuma teoria, espera-se que mutações que correspondem com uma sequência de peptídeos que ocorrem naturalmente estão em maior risco de ser toleradas por receptores de célula T como uma consequência da tolerância central e, assim, espera-se que sejam menos imunogênicas que as mutações que não correspondem a uma sequência que ocorre naturalmente.
[152] Em uma modalidade, a sequência de peptídeos de núcleo de neoepítopo, que é comparada com as sequências de peptídeos do genoma humano, compreende ou consiste em 9 a 27 aminoácidos como, por exemplo, 10 a 25 aminoácidos, como 11 a 15 aminoácidos ou, como 12, 13 ou 14 aminoácidos.
[153] Em uma modalidade, a sequência de peptídeo de neoepítopo, que é comparada com sequências de peptídeos do genoma humano, compreende ou consiste em 5 a 15 aminoácidos como, por exemplo, 6 a 12 aminoácidos, preferencialmente 7 a 11 aminoácidos ou mais preferencialmente 8 a 10 aminoácidos.
[154] Em uma modalidade preferida, a referida sequência de peptídeo de neoepítopo, que é comparada com sequências de peptídeos do genoma humano, compreende ou consiste em 9 aminoácidos.
[155] Em uma outra modalidade, a referida sequência de peptídeo de neoepítopo, que é comparada com sequências de peptídeos do genoma humano, compreende ou consiste em 15 aminoácidos, 14 aminoácidos, 13 aminoácidos, 12 aminoácidos, 11 aminoácidos ou por exemplo, 10 aminoácidos.
[156] A sequência de peptídeo de neoepítopo compreende a mutação do neoepítopo. Em uma modalidade preferida, a referida mutação é uma substituição de aminoácido. Será evidente para os versados que em vez de comparar a sequência de um dado neoepítopo às sequências de peptídeos do genoma humano, é possível comparar a sequência dos epítopos mínimos compreendida no referido neoepítopo às sequências de peptídeos do genoma humano.
[157] Para minimizar ainda o risco de autoimunidade específica para o órgão, os neoepítopos que são encontrados em genes que são altamente expressos em órgãos/tecidos específicos serão excluídos ou subpriorizados em algumas modalidades.
[158] Em uma modalidade, os neoepítopos ou epítopos mínimos presentes nos genes, em que os referidos genes apresentam nível de expressão de RNA pelo menos 3 vezes, como pelo menos 4 vezes superior em qualquer órgão em comparação com outros tecidos são excluídos ou subpriorizados.
[159] Em uma modalidade preferida, os neoepítopos ou epítopos mínimos, como neoepítopos de ligação ao MHC I e /ou MHC II, presentes nos genes, em que os referidos genes apresentam nível de expressão de RNA pelo menos 5 vezes superior em qualquer órgão em comparação com outros tecidos são excluídos ou subpriorizados.
[160] Em uma outra modalidade, os neoepítopos ou epítopos mínimos, como neoepítopos de ligação ao MHC I e /ou MHC II ou epítopos mínimos, presentes nos genes, em que os referidos genes apresentam nível de expressão de RNA pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes ou, como pelo menos 8 vezes superior em qualquer órgão em comparação com outros tecidos são excluídos ou subpriorizados.
[161] Prefere-se que o órgão e o tecido sejam da mesma espécie, como um humano. O nível de expressão de RNAs pode, por exemplo, ser obtido de bases de dados, como, por exemplo, www.gtexportal.org. O nível de expressão de RNAs também é descrito em Uhlén, M. et al. (2015) (Uhlén, M. et al. (2015) “Proteomics. Tissue-based map of the human proteome.” Science; 347(6220)). Alternativamente, os níveis de expressão de RNA são obtidos de indivíduos dos quais os neoepítopos são derivados.
[162] O órgão pode, por exemplo, ser selecionado de coração e cérebro. Em uma outra modalidade, o referido órgão é selecionado de fígado, pulmões, estômago, rim, baço, cólon e intestino.
Frequência do alelo
[163] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção compreendem uma etapa de determinar a frequência do alelo da mutação presente em cada neoepítopo. O termo frequência do alelo conforme usado neste documento se refere à frequência relativa de uma sequência de alelos contendo uma mutação genômica específica em um lócus particular em comparação com o número total de sequências para todos os alelos nesta região genômica específica. O termo frequência do alelo mutante se refere à frequência de alelos compreendendo a mutação ou mutação do neoepítopo e é usado neste documento indiferentemente com o termo frequência do alelo variante (VAF). No geral, uma alta frequência do alelo mutante ou VAF é indicativa de uma maior utilização clínica. Uma alta frequência do alelo mutante ou VAF é indicativa de uma maior proporção de células de câncer contendo a mesma mutação. Assim, sem ficar preso a nenhuma teoria, pode-se esperar que os neoepítopos com uma alta frequência do alelo ou VAF estejam presentes em uma maior proporção de células de câncer que os neoepítopos com uma baixa frequência do alelo mutante ou VAF.
[164] Em uma modalidade particular, os neoepítopos de ligação ao MHC I com uma alta frequência do alelo mutante ou VAF são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC I com uma menor frequência do alelo mutante ou VAF. Em outra modalidade particular, os neoepítopos de ligação ao MHC II com uma alta frequência do alelo mutante ou VAF são classificados superiores aos neoepítopos de ligação ao MHC II com uma menor frequência do alelo mutante ou VAF.
[165] A frequência do alelo de uma mutação pode, por exemplo, ser determinada analisando os dados de sequenciamento das amostras de tumor e comparando as frequências do alelo mutante com outros alelos presentes no mesmo gene.
[166] Em algumas modalidades, uma frequência do alelo mutante ou VAF maior que 0,05 é indicativa de utilização clínica para o epítopo mínimo ou neoepítopo compreendendo a referida mutação. Assim, em algumas modalidades, um neoepítopo ou epítopo mínimo compreendendo uma mutação com um VAF maior que 0,05, como maior que 0,06, como maior que 0,07, como maior que 0,08, como maior que 0,09, como maior que 0,1, como maior que 0,15, como maior que 0,20, é classificado superior a um neoepítopo ou epítopo mínimo compreendendo uma mutação com um VAF igual ou menor que 0,05, como igual ou menor que 0,06, como igual ou menor que 0,07, como igual ou menor que 0,08, como igual ou menor que 0,09, como igual ou menor que 0,1, como igual ou menor que 0,15, como igual ou menor que 0,20, respectivamente.
Tipificação de variante
[167] Muitos tipos de software de identificação de mutação somática (tipificação de variante) são disponíveis na técnica. Em algumas modalidades, os neoepítopos ou epítopos mínimos são considerados prováveis de ter utilização clínica se as mutações que eles compreendem forem identificadas em pelo menos duas diferentes tipificações de variante. Assim, em algumas modalidades, do neoepítopos ou epítopos mínimos são classificados dependendo de quantas tipificações de variante identificam a(s) mutação(ões) que eles contêm. Os neoepítopos ou epítopos mínimos compreendendo mutação(ões) que são identificados em pelo menos duas diferentes tipificações de variante são classificados superiores aos neoepítopos ou epítopos mínimos compreendendo mutação(ões) que são identificados por somente um tipificador de variante. Em algumas modalidades, a mutação é identificada em pelo menos 3 diferentes tipificações de variante, como pelo menos 4 diferentes tipificações de variante, como pelo menos 5 diferentes tipificações de variante, como pelo menos 6 diferentes tipificações de variante, como pelo menos 7 diferentes tipificações de variante, como pelo menos 8 diferentes tipificações de variante, como pelo menos 9 diferentes tipificações de variante, como 10 diferentes tipificações de variante ou mais.
Semelhança com gene relacionado ao câncer conhecido
[168] Em algumas modalidades, os neoepítopos que surgem de um gene relacionado ao câncer conhecido são priorizados.
[169] Um gene relacionado ao câncer é definido como um gene que está envolvido no desenvolvimento de câncer. Os genes relacionados ao câncer podem ser encontrados, por exemplo, na base de dados da Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), ou outras bases de dados contendo uma lista de curadoria de mutações e/ou genes associados ao câncer, conforme é conhecido por versados. Assim, uma correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido pode ser encontrada comparando o gene de fonte do neoepítopo, posição genômica ou posição da variante (nomenclatura HGVS) com as informações correspondentes na base de dados da COSMIC.
[170] Em algumas modalidades, os neoepítopos são considerados prováveis de serem de utilização clínica se o gene no qual eles estão compreendidos for um gene que é conhecido por estar associado com câncer. Tais neoepítopos são, assim, priorizados sobre os neoepítopos compreendidos nos genes que não são conhecidos por estar associados com câncer.
Clonalidade
[171] O termo “clonalidade” conforme usado neste documento se refere à ocorrência do neoepítopo através das amostras de tumor. Se, por exemplo, um neoepítopo ou um epítopo mínimo for encontrado em mais de uma biópsia de tumor, ele é indicativo de uma alta clonalidade e, assim, uma maior probabilidade de estar presente na maioria das células de câncer e, assim, uma maior probabilidade de ser de utilização clínica.
[172] A clonalidade de um neoepítopo pode ser determinada obtendo pelo menos duas amostras de tumor do mesmo indivíduo e determinando se uma mutação está presente em mais de uma biópsia. Preferencialmente, os neoepítopos encontrados em mais de uma amostra de tumor são priorizados sobre os neoepítopos que são encontrados em somente uma biópsia. Por “mais de uma amostra de tumor” entende-se várias amostras que originam do mesmo indivíduo, seja da mesma lesão ou de lesões diferentes.
[173] Em algumas modalidades, os epítopos mínimos ou neoepítopos com uma mutação encontrada em pelo menos duas diferentes amostras do mesmo indivíduo são prováveis de ter uma maior utilização clínica que os epítopos mínimos ou neoepítopos com uma mutação encontrada em somente uma amostra de tumor. Em algumas modalidades, as pelo menos duas diferentes amostras são amostras de: - o mesmo tumor ou lesão, por exemplo, biópsias multianguladas do mesmo tumor ou lesão; - pelo menos dois diferentes tumores ou lesões;
- pelo menos um tumor ou lesão e pelo menos um material de tumor de arquivo, como uma biópsia de arquivo ou material do tumor ou lesão ressecado de arquivo; onde encontrar epítopos mínimos ou neoepítopos compreendendo a mutação em pelo menos duas diferentes amostras é indicativo de uma maior utilização clínica. O termo “material de tumor de arquivo” se refere a material amostrado em pontos de tempo precoces do tecido tumoral do mesmo indivíduo, por exemplo, uma biópsia de arquivo ou material do tumor ou lesão ressecado de arquivo.
[174] Em algumas modalidades, as pelo menos duas diferentes amostras é pelo menos três diferentes amostras, como pelo menos quatro diferentes amostras, como pelo menos cinco diferentes amostras, como pelo menos seis diferentes amostras, como pelo menos sete diferentes amostras, como pelo menos oito diferentes amostras, como pelo menos nove diferentes amostras, como pelo menos dez diferentes amostras ou mais. Em algumas modalidades, pelo menos uma das pelo menos duas diferentes amostras é material de tumor de arquivo do individual e pelo menos uma das pelo menos duas diferentes amostras é uma amostra de um tumor ou uma lesão.
Biópsias líquidas
[175] Pode ser vantajoso, ao selecionar neoepítopos compreendendo epítopos mínimos que são prováveis de ter utilização clínica, determinar se os neoepítopos ou epítopos mínimos também são encontrados no plasma do indivíduo. Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem o sequenciamento das sequências de ácidos nucleicos do DNA sem célula, por exemplo, DNA tumoral circulante no plasma a partir de uma biópsia líquida obtida do indivíduo. Isto pode ser útil para identificar, confirmar e/ou rastrear neoepítopos e pode ser feito, por exemplo, sequenciando o DNA sem célula.
[176] Em algumas modalidades, um neoepítopo que é encontrado no DNA tumoral circulante em uma amostra de plasma do individual é classificado superior a um neoepítopo que não é encontrado na referida amostra.
O indivíduo
[177] O indivíduo de acordo com o método da presente invenção é preferencialmente um humano. Preferencialmente o indivíduo ou o humano é um paciente com câncer. Assim, o indivíduo é preferencialmente um humano com câncer. O câncer pode ser de todos os tipos de câncer. Preferencialmente, o indivíduo tem pelo menos um tumor.
[178] O câncer pode ser qualquer câncer em que as células de câncer compreendem pelo menos uma mutação. O câncer pode ser um tumor primário, metástase ou ambos. O tumor examinado para mutações pode ser um tumor primário ou uma metástase. O câncer a ser tratado pode ser um câncer conhecido por ter uma alta carga de mutação, como melanomas ou câncer de pulmão. O câncer a ser tratado também pode ser um câncer caracterizado por somente uma mutação específica para câncer.
Critérios adicionais
[179] Prefere-se que os Neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II preencham pelo menos um dos seguintes critérios i a vii: i. um alto nível de expressão de RNA; ii. uma alta frequência do alelo; iii. uma alta clonalidade; iv. correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido; v. compreenda uma mutação identificada em pelo menos duas diferentes tipificações de variante; vi. também sejam encontrados no plasma do indivíduo conforme determinado, por exemplo, sequenciando DNA sem célula;
vii. sejam encontrados em pelo menos duas amostras do mesmo indivíduo, como duas amostras da mesma lesão ou de duas diferentes lesões, ou pelo menos um tumor ou lesão e pelo menos uma amostra do material de tumor de arquivo do tumor ou lesão.
[180] O nível de expressão de RNA, frequência do alelo, clonalidade, correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido, identificação em pelo menos duas diferentes tipificações de variante, presença no plasma do indivíduo, e presença em pelo menos duas amostras do mesmo indivíduo são conforme definidos neste documento anteriormente.
[181] Em uma modalidade mais preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II preenchem pelo menos dois dos seguintes critérios i a vii: i. um alto nível de expressão de RNA; ii. uma alta frequência do alelo; iii. uma alta clonalidade; iv. correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido; v. compreendem uma mutação identificada em pelo menos duas diferentes tipificações de variante; vi. também sejam encontrados no plasma do indivíduo conforme determinado, por exemplo, sequenciando DNA sem célula; vii. sejam encontrados em pelo menos duas amostras do mesmo indivíduo, como duas amostras da mesma lesão ou de duas diferentes lesões, ou pelo menos um tumor ou lesão e pelo menos uma amostra do material de tumor de arquivo do tumor ou lesão.
[182] Em uma modalidade ainda mais preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II preenchem pelo menos três dos seguintes critérios i a vii:
i. um alto nível de expressão de RNA; ii. uma alta frequência do alelo; iii. uma alta clonalidade; iv. correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido; v. compreendem uma mutação identificada em pelo menos duas diferentes tipificações de variante; vi. também sejam encontrados no plasma do indivíduo conforme determinado, por exemplo, sequenciando DNA sem célula; vii. sejam encontrados em pelo menos duas amostras do mesmo indivíduo, como duas amostras da mesma lesão ou de duas diferentes lesões, ou pelo menos um tumor ou lesão e pelo menos uma amostra do material de tumor de arquivo do tumor ou lesão.
[183] Em uma modalidade preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II preenchem pelo menos quatro dos seguintes critérios i a vii: i. um alto nível de expressão de RNA; ii. uma alta frequência do alelo; iii. uma alta clonalidade; iv. correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido; v. compreendem uma mutação identificada em pelo menos duas diferentes tipificações de variante; vi. também sejam encontrados no plasma do indivíduo conforme determinado, por exemplo, sequenciando DNA sem célula; vii. sejam encontrados em pelo menos duas amostras do mesmo indivíduo, como duas amostras da mesma lesão ou de duas diferentes lesões, ou pelo menos um tumor ou lesão e pelo menos uma amostra do material de tumor de arquivo do tumor ou lesão.
[184] Em uma outra modalidade preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II preenchem pelo menos cinco dos seguintes critérios i a vii: i. um alto nível de expressão de RNA; ii. uma alta frequência do alelo; iii. uma alta clonalidade; iv. correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido; v. compreendem uma mutação identificada em pelo menos duas diferentes tipificações de variante; vi. também sejam encontrados no plasma do indivíduo conforme determinado, por exemplo, sequenciando DNA sem célula; vii. sejam encontrados em pelo menos duas amostras do mesmo indivíduo, como duas amostras da mesma lesão ou de duas diferentes lesões, ou pelo menos um tumor ou lesão e pelo menos uma amostra do material de tumor de arquivo do tumor ou lesão.
[185] Em uma outra modalidade preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II preenchem seis dos seguintes critérios i a vii: i. um alto nível de expressão de RNA; ii. uma alta frequência do alelo; iii. uma alta clonalidade; iv. correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido; v. compreendem uma mutação identificada em pelo menos duas diferentes tipificações de variante;
vi. também sejam encontrados no plasma do indivíduo conforme determinado, por exemplo, sequenciando DNA sem célula; vii. sejam encontrados em pelo menos duas amostras do mesmo indivíduo, como duas amostras da mesma lesão ou de duas diferentes lesões, ou pelo menos um tumor ou lesão e pelo menos uma amostra do material de tumor de arquivo do tumor ou lesão.
[186] Em uma outra modalidade preferida, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II preenchem todos dos seguintes critérios i a vii: i. um alto nível de expressão de RNA; ii. uma alta frequência do alelo; iii. uma alta clonalidade; iv. correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido; v. compreendem uma mutação identificada em pelo menos duas diferentes tipificações de variante; vi. também sejam encontrados no plasma do indivíduo conforme determinado, por exemplo, sequenciando DNA sem célula; vii. sejam encontrados em pelo menos duas amostras do mesmo indivíduo, como duas amostras da mesma lesão ou de duas diferentes lesões, ou pelo menos um tumor ou lesão e pelo menos uma amostra do material de tumor de arquivo do tumor ou lesão.
[187] Os critérios i a vii anteriores não estão listados em qualquer ordem preferida e pode ser priorizados de qualquer maneira. O nível de expressão de RNA, frequência do alelo, clonalidade, correspondência com um gene relacionado ao câncer conhecido, identificação em pelo menos duas diferentes tipificações de variante, presença no plasma do indivíduo, e presença em pelo menos duas amostras do mesmo indivíduo são conforme definidos neste documento anteriormente.
[188] Assim, preferencialmente os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II com um maior nível de expressão de RNA são classificados anteriormente neoepítopos com um menor nível de expressão de RNA.
[189] Preferencialmente, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II com uma maior frequência do alelo são classificados anteriormente neoepítopos com uma menor frequência do alelo.
[190] Preferencialmente, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II com uma maior clonalidade são classificados anteriormente neoepítopos com uma menor clonalidade.
[191] Preferencialmente, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II que correspondem com um gene relacionado ao câncer conhecido são classificados anteriormente neoepítopos que não correspondem com um gene relacionado ao câncer conhecido.
[192] Preferencialmente, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II compreendendo uma mutação identificada em pelo menos duas diferentes tipificações de variante são classificados anteriormente neoepítopos compreendendo uma mutação identificada por somente um tipificador de variante.
[193] Preferencialmente, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II que são encontrados no plasma do indivíduo são classificados anteriormente neoepítopos que não são encontrados no plasma do indivíduo.
[194] Preferencialmente, os neoepítopos de ligação ao MHC I e/ou de ligação ao MHC II que são encontrados em duas ou mais amostras do mesmo indivíduo são classificados anteriormente neoepítopos que são encontrados em somente uma amostra do indivíduo. As duas ou mais amostras podem ser amostras da mesma lesão ou de diferentes lesões, ou de pelo menos um tumor ou lesão e pelo menos uma amostra do material de tumor de arquivo do tumor ou lesão.
Número de neoepítopos selecionados
[195] Os neoepítopos que são selecionados para o indivíduo são preferencialmente usados em uma vacina contra câncer, como um construto de vacina contra câncer, preferencialmente um construto de vacina de nucleotídeo. A vacina também é referida como uma vacina contra câncer personalizada. A vacina é imunogênica.
[196] No método de acordo com a presente invenção, A neoepítopos com utilização clínica são selecionados. Os A neoepítopos são preferencialmente usados em uma vacina contra câncer ou em um construto de vacina contra câncer. Assim, os A neoepítopos são preferencialmente incluídos no mesmo construto de vacina. O construto de vacina é preferencialmente um construto de nucleotídeo. O construto de nucleotídeo pode ser um construto de RNA e/ou um construto de DNA. Preferencialmente, a vacina é um construto de DNA, também referido como uma vacina de DNA de Vaccibody.
[197] A é um número inteiro. Por exemplo, A é pelo menos 1, como pelo menos 3, como pelo menos 5, como pelo menos 7, ou por exemplo, pelo menos 10, por exemplo, pelo menos 20, como pelo menos 30, como 40 ou mais. A pode ser um número predeterminado.
[198] Além do mais, os inventores da presente invenção observaram que aumentando os números de neoepítopos no construto de vacinas de 1 para 3 neoepítopos ou de 3 neoepítopos para 10 neoepítopos leva a um aumento surpreendente na resposta imune. Além do mais, foi observado que o aumento no número de neoepítopos no construto de vacinas de 10 neoepítopos para 15 ou 20 neoepítopos leva a um aumento adicional na resposta imune. Em algumas modalidades, o número de neoepítopos no construto de vacina é entre 20 e 40, como 30. Em algumas modalidades, o número de neoepítopos no construto de vacina é 40 ou mais.
[199] Em uma modalidade, A é um número inteiro de 3 a 100, como de 3 a 75, como de 3 a 50, como de 3 a 30, como de 3 a 20, como de 3 a 15 ou como, por exemplo, de 3 a 10 neoepítopos.
[200] Em uma outra modalidade, A é um número inteiro de 5 a 50, como de 5 a 30 como, por exemplo, de 5 a 25, como de 5 a 20, como de 5 a 15, como de 5 a 10.
[201] Em uma modalidade adicional, A é um número inteiro de 10 a 50, como de 10 a 40, como de 10 a 30, como de 10 a 20, como de 10 a 25, como de 10 a 20 ou como, por exemplo, de 10 a 15.
[202] Os neoepítopos selecionados pelos presentes métodos podem ser usados para projetar vacinas de Vaccibody, que são descritas em detalhes a seguir. Vacinas de Vaccibody compreendem pelo menos uma unidade antigênica, uma unidade de direcionamento e uma unidade de dimerização. Os neoepítopos são preferencialmente compreendidos na unidade antigênica.
[203] Os inventores da presente invenção mostraram que as vacinas de DNA de Vaccibody compreendendo 10 neoepítopos induzem uma resposta imune total mais forte e mais ampla que as vacinas de DNA de Vaccibody compreendendo somente 3 neoepítopos. De forma semelhante, as vacinas de DNA de Vaccibody compreendendo 20 neoepítopos induzem uma resposta imune total mais forte e mais ampla que as vacinas compreendendo somente 10 neoepítopos. Entretanto, o câncer a ser tratado pode ser associado com somente um neoepítopo específico para o câncer, e pode não ser possível construir uma vacina de DNA de Vaccibody compreendendo mais que um epítopo.
[204] Em uma modalidade preferida, A é um número inteiro de 10 a 20.
[205] Em uma outra modalidade, A é um número inteiro de 15 a 50, como de 15 a 30 ou, como de 15 a 20.
[206] Em uma modalidade específica, A é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40.
[207] Em uma modalidade, a unidade antigênica compreende uma cópia de cada neoepítopo de câncer, de maneira tal que quando 10 neoepítopos forem incluídos na vacina, uma resposta imune mediada por célula contra 10 diferentes neoepítopos pode ser gerada.
[208] No método da presente invenção, x neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC I de maior classificação são selecionados, enquanto que y neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC II de maior classificação são selecionados, em que x+y=A. A é o número total de neoepítopos selecionado. A é conforme definido neste documento anteriormente.
[209] Tanto x quanto y são números inteiros.
[210] Em uma modalidade preferida, x>y. Por exemplo, x 2y. Em uma outra modalidade x > 2,5y. I uma modalidade x 3y.
[211] Em uma modalidade, 0,5A<x<A, em que A é conforme definido anteriormente. Preferencialmente A é um número inteiro de 10 a 20.
[212] Em uma outra modalidade, 0,6A<x<A, como 0,7A<x<A como, por exemplo, 0,8A<x<A em que A é conforme definido anteriormente. Preferencialmente A é um número inteiro de 10 a 20.
Métodos específicos
[213] Em uma modalidade particular, o método é um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação imunogênica em comparação a sequência de referências; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, e determinar o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I para cada um dos referidos neoepítopos; identificando assim x neoepítopos de ligação ao MHC I;
c.
Classificar o neoepítopos como se segue:
i. priorizar os neoepítopos compreendendo um alto número de epítopos mínimos e selecionar um primeiro grupo de neoepítopos com uma alta classificação;
ii. opcionalmente, priorizar os neoepítopos do primeiro grupo de neoepítopos como se segue:
1) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for igual ou maior que 20, o epítopo mínimo tem a maior classificação;
2) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for igual ou maior que 20, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação para os epítopos mínimos de 1);
3) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e igual ou maior que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 2);
4) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e igual ou maior que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 3);
5) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 4);
6) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 5); 7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor classificação, em que o diferencial de ligação ao MHC I é dado pela fórmula %Rank de classificação (MHC I) para referência) / %Rank de classificação (MHC I) para epítopo mínimo); e selecionar um segundo grupo de neoepítopos com uma alta classificação; iii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do segundo grupo com base na sua pontuação %Rank de MHC I e selecionar um terceiro grupo de neoepítopos com uma baixa pontuação %Rank de MHC I; iv. opcionalmente, selecionar um quarto grupo de neoepítopos incluindo epítopos mínimos com alta semelhança com epítopos conhecidos por ser reconhecidos por células T; v. opcionalmente, priorizar neoepítopos do terceiro grupo ou do quarto grupo com base na sua pontuação de BLOSUM, em que uma pontuação de BLOSUM menor que um limiar predeterminado é classificado superior a uma pontuação de BLOSUM igual ou maior que o referido limiar, e selecionar um quinto grupo de neoepítopos com uma pontuação de BLOSUM menor que o referido limiar, em que o referido limiar preferencialmente é 1; em que o primeiro, segundo, terceiro, quarto ou quinto grupo de neoepítopos compreende os referidos A neoepítopos.
[214] Em uma modalidade particular, o método é um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação imunogênica em comparação a sequência de referências;
b.
Determinar a afinidade de ligação ao MHC I para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, e determinar o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I para cada um dos referidos neoepítopos; identificando assim x neoepítopos de ligação ao MHC I;
c.
Classificar os neoepítopos como se segue:
i. priorizar os neoepítopos compreendendo um alto número de epítopos mínimos e selecionar um primeiro grupo de neoepítopos com uma alta classificação;
ii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do primeiro grupo de neoepítopos como se segue:
1) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for igual ou maior que 20, o epítopo mínimo tem a maior classificação;
2) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for igual ou maior que 20, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação para os epítopos mínimos de 1);
3) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e igual ou maior que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 2);
4) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e igual ou maior que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 3);
5) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 4);
6) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 5);
7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor classificação;
em que o diferencial de ligação ao MHC I é dado pela fórmula %Rank de classificação (MHC I) para referência) / %Rank de classificação (MHC I) para epítopo mínimo); e selecionar um segundo grupo de neoepítopos com uma alta classificação;
iii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do segundo grupo com base na sua pontuação %Rank de MHC I e selecionar um terceiro grupo de neoepítopos com uma baixa pontuação %Rank de MHC I;
iv. opcionalmente, selecionar um quarto grupo de neoepítopos incluindo epítopos mínimos com alta semelhança com epítopos conhecidos por ser reconhecidos por células T;
v. opcionalmente, priorizar neoepítopos do terceiro grupo ou do quarto grupo com base na sua pontuação de BLOSUM, em que uma pontuação de BLOSUM menor que um limiar predeterminado é classificado superior a uma pontuação de BLOSUM igual ou maior que o referido limiar, e selecionar um quinto grupo de neoepítopos com uma pontuação de BLOSUM menor que o referido limiar, em que o referido limiar preferencialmente é 1;
vi. opcionalmente, selecionar neoepítopos do primeiro, segundo, terceiro, quarto ou quinto grupo de neoepítopos com base nos neoepítopos sendo encontrados em duas ou mais amostras, e selecionar um sexto grupo de neoepítopos encontrado em duas ou mais amostras;
vii. opcionalmente, selecionar neoepítopos do primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto ou sexto grupo de neoepítopos com base na identificação da mutação em pelo menos duas diferentes tipificações de variante, e selecionar um sétimo grupo de neoepítopos compreendendo uma mutação identificada em pelo menos duas diferentes tipificações de variante; em que o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto ou sétimo grupo de neoepítopos compreende os referidos A neoepítopos.
[215] O método também pode compreender classificar os neoepítopos de acordo com qualquer dos parâmetros adicionais descritos neste documento, como clonalidade, níveis de expressão de RNA e frequência do alelo.
[216] Em algumas modalidades, o segundo grupo é um subgrupo do primeiro grupo. Em algumas modalidades, o terceiro grupo é um subgrupo do segundo grupo e/ou do primeiro grupo. Em algumas modalidades, o quarto grupo é um subgrupo do terceiro grupo e/ou do segundo grupo e/ou do primeiro grupo. Em algumas modalidades, o quinto grupo é um subgrupo do quarto grupo e/ou do terceiro grupo e/ou do segundo grupo e/ou do primeiro grupo. Em algumas modalidades, o sexto grupo é um subgrupo do quinto grupo e/ou do quarto grupo e/ou do terceiro grupo e/ou do segundo grupo e/ou do primeiro grupo. Em algumas modalidades o sétimo grupo é um subgrupo do sexto grupo e/ou do quinto grupo e/ou do quarto grupo e/ou do terceiro grupo e/ou do segundo grupo e/ou do primeiro grupo. Os subgrupos podem ser de tamanhos idênticos.
[217] Em uma modalidade, o método compreende etapa i. anterior. Em uma outra modalidade, o método compreende as etapas i. e ii. anteriores. Em uma outra modalidade, o método compreende as etapas i. e iii. anteriores. Em uma outra modalidade, o método compreende as etapas i. e iv. anteriores. Em uma outra modalidade, o método compreende as etapas i., ii. e iii. anteriores. Em uma outra modalidade, o método compreende as etapas i., ii. e iv. anteriores. Em uma outra modalidade, o método compreende as etapas i.,
iii. e iv. anteriores. Em uma outra modalidade, o método compreende as etapas i., ii., iii. e iv. anteriores. Em algumas modalidades, o método compreende ainda etapa v. e/ou etapa vi. e/ou etapa vii. anteriores.
[218] Em uma modalidade, o método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo que sofrem ou são suspeitos de sofrer de câncer compreende as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência, em que o epítopo mínimo consiste em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo e compreende a referida pelo menos uma mutação; em que preferencialmente obter os neoepítopos compreende a etapa de identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos que são específicas para o tumor; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, opcionalmente em que a afinidade de ligação é determinada por predição in silico; c. Selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica conforme descrito neste documento; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação; selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica, em que a etapa d compreende ainda classificar os neoepítopos como se segue:
i) determinar se a mutação está em uma posição de ancoramento ou uma posição de não ancoramento do neoepítopo mínimo para cada epítopo mínimo compreendido no neoepítopo;
ii) priorizar os neoepítopos, opcionalmente em que a priorização dos neoepítopos na etapa ii) é realizada atribuindo para cada neoepítopo a maior classificação dos epítopos mínimos que eles compreendem, e em que a priorização dos neoepítopos é realizada como se segue:
1) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for igual ou maior que 20, o epítopo mínimo tem a maior classificação;
2) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for igual ou maior que 20, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação para os epítopos mínimos de 1);
3) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e igual ou maior que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 2);
4) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e igual ou maior que 3, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 3);
5) se a mutação for em uma posição de ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e igual ou maior que 1, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 4);
6) se a mutação for em uma posição de não ancoramento e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e igual ou maior que 1, a classificação do epítopo mínimo é menor que a classificação dos epítopos mínimos de 5); 7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor classificação.
[219] Em uma modalidade, o método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo que sofre ou é suspeito de sofrer de câncer compreende as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência, em que o epítopo mínimo consiste em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo e compreende a referida pelo menos uma mutação; em que obter preferencialmente os neoepítopos compreende a etapa de identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos que são específicas para o tumor; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, opcionalmente em que a afinidade de ligação é determinada por predição in silico; c. Selecionar os neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica; em que a etapa d compreende classificar os neoepítopos com relação ao número de epítopos mínimos que eles compreendem, onde um maior número de epítopos mínimos dá uma classificação superior.
[220] Em uma outra modalidade, o método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo que sofre ou é suspeito de sofrer de câncer compreende as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência, em que o epítopo mínimo consiste em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo e compreende a referida pelo menos uma mutação; em que obter preferencialmente os neoepítopos compreende a etapa de identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos que são específicas para o tumor; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, opcionalmente em que a afinidade de ligação é determinada por predição in silico; c. Selecionar os neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica, em que a etapa d compreende classificar os neoepítopos com relação ao número de amostras em que eles são encontrados, em que os neoepítopos encontrados em um maior número de amostras são classificados superiores aos neoepítopos encontrados em um número menor de amostras,
preferencialmente em que as amostras são amostras de diferentes lesões.
[221] Cada das etapas anteriores dos métodos específicos descritos nesta seção pode ser conforme descrito neste documento em outro local.
Vacina
[222] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método de preparar uma vacina contra câncer compreendendo neoepítopos, o referido método compreendendo uma etapa de selecionar os referidos neoepítopos usando os métodos para selecionar neoepítopos conforme definido neste documento.
[223] Em algumas modalidades, 10 a 40 neoepítopos são selecionados. Isto é, A é um número inteiro de 10 a 40. Em outra modalidade, 10 a 30 ou 10 a 20 neoepítopos são selecionados.
[224] Em uma modalidade, a referida vacina contra câncer compreende um construto de nucleotídeo compreendendo: - uma unidade de direcionamento - uma unidade de dimerização - um primeiro ligante - uma unidade antigênica, em que a referida unidade antigênica compreende A-1 subunidades antigênicas, cada subunidade compreendendo uma sequência que codifica pelo menos um dos referidos neoepítopos e um segundo ligante e a referida unidade antigênica compreendendo ainda uma sequência final que codifica um dos referidos neoepítopos, em que A é um número inteiro de 1 a 100, como de 3 a 50; em que o referido construto de nucleotídeo é aplicado à vacina anticâncer em uma quantidade imunologicamente eficaz.
[225] O número inteiro A é conforme descrito neste documento e anteriores. A vacina de DNA anterior também é denominada uma vacina de DNA de Vaccibody.
[226] A presente invenção se refere a uma vacina preparada pelo método conforme descrito anteriormente.
[227] Assim, as vacinas de neoantígeno providas pelos métodos descritos neste documento podem compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo três unidades, isto é, uma unidade de direcionamento, uma unidade de dimerização e uma unidade antigênica. Devido à unidade de dimerização, o polipeptídeo forma uma proteína dimérica denominada um Vaccibody.
[228] Os genes que codificam as três unidades são geneticamente modificados para ser expressos como um gene. Quando expressos in vivo, as proteínas de polipeptídeos/diméricas direcionam para células de apresentação de antígeno (APCs), o que resulta em potência melhorada da vacina em comparação com os antígenos não direcionados idênticos.
Unidade antigênica
[229] A unidade antigênica compreende uma pluralidade de neoepítopo tumorais, em que cada neoepítopo corresponde a uma mutação identificada em um neoantígeno tumoral. A referida mutação pode ser uma ou mais mutações, conforme explicado anteriormente.
[230] Na unidade antigênica, todos menos o último dos neoepítopos tumorais são dispostos em subunidades antigênicas, em que cada subunidade consiste em uma sequência de neoepítopos tumorais e um segundo ligante, enquanto a última subunidade compreende um neoepítopo somente, isto é, nenhum segundo ligante como este. Devido à separação das sequências de neoepítopos tumorais pelo referido segundo ligante, cada neoepítopo é apresentado de uma maneira ideal ao sistema imune, por meio do qual a eficiência da vacina é garantida conforme discutido a seguir.
[231] A sequência de neoepítopo de câncer preferencialmente tem um comprimento adequado para a apresentação pelas moléculas de MHC discutidas anteriores. Os comprimentos de neoepítopo preferidos são descritos anteriormente.
[232] Para evitar que tumores escapem do sistema imune interrompendo a expressão de um gene mutado se a vacina for direcionada para o produto de expressão do referido gene, é preferido incluir uma pluralidade de diferentes neoepítopos na unidade antigênica. No geral, quanto mais genes o tumor tem que interromper, menos provável é que o tumor seja capaz de interromper todos eles e ainda seja capaz de proliferar ou mesmo sobreviver. Além do mais, o tumor pode ser heterogêneo em que nem todos e todo neoantígeno é expresso por todas as células tumorais. Desta forma, de acordo com a presente invenção, a abordagem é para incluir muitos neoepítopos na vacina para atrair o tumor de forma eficaz. Preferencialmente, a pluralidade de neoepítopos direciona a expressão de uma pluralidade de genes. Também, para garantir que todos os neoepítopos sejam carregados de forma eficaz para a mesma célula de apresentação de antígeno, eles são dispostos como uma cadeia de aminoácidos em vez de peptídeos diferentes.
[233] O número de neoepítopos que são selecionados e incluídos no construto de vacina é conforme descrito anteriormente.
[234] Em uma modalidade, a unidade antigênica compreende uma cópia de cada neoepítopo de câncer, de forma que uma resposta possa ser gerada contra o máximo de diferentes neoepítopos que estão incluídos na vacina. Por exemplo, quando 10 neoepítopos estão incluídos na vacina, uma resposta imune mediada por célula contra 10 diferentes neoepítopos pode ser gerada, ou quando 20 neoepítopos estão incluídos na vacina, uma resposta imune mediada por célula contra 20 diferentes neoepítopos pode ser gerada. Em algumas modalidades, a vacina pode compreender mais que 20 neoepítopos, gerando assim uma resposta contra o máximo de neoepítopos.
[235] Entretanto, se somente poucas mutações antigênicas relevantes forem identificadas, então a unidade antigênica pode compreender pelo menos duas cópias de pelo menos um neoepítopo para reforçar a resposta imune para estes neoepítopos. Também, por questões de fabricação e regulatórios, pode ser uma vantagem manter o comprimento de plasmídeo, isto é, a unidade antigênica constante ou de comprimento semelhante e, desta forma, pode ser vantajoso incluir mais que uma cópia do mesmo neoepítopo na unidade antigênica.
[236] Conforme discutido anteriores, pode ser uma vantagem manter o comprimento da unidade antigênica constante e, desta forma, é preferido em uma modalidade que todas as sequências de neoepítopo de câncer tenham comprimento idêntico. Entretanto, se um ou mais do neoepítopos resultarem de uma mutação que leva a um deslocamento do quadro ou códon de parada mutação, o neoepítopo pode ter têm um comprimento substancial, como consistindo em pelo menos a parte mutada da proteína, a porção mais antigênica da proteína mutada ou talvez da proteína mutada total, enquanto o comprimento de pelo menos um dos neoepítopos é substancialmente maior que os neoepítopos que surgem de uma mutação pontual não sinônima.
[237] O comprimento da unidade antigênica é principalmente determinado pelo comprimento do neoepítopos e o número de neoepítopos dispostos na unidade antigênica e é de cerca de 21 a 1.500, preferencialmente de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1.000 aminoácidos, mais preferencialmente de cerca de 50 a cerca de 500 aminoácidos, como de cerca de 100 a cerca de 400 aminoácidos, de cerca de 100 a cerca de 300 aminoácidos.
[238] A sequência de neoepítopo de câncer inserida na vacina pode compreender a mutação flanqueada em ambos os lados por uma sequência de aminoácidos. Preferencialmente, a mutação é posicionada essencialmente no meio de uma sequência de neoepítopo de câncer, para garantir que a mutação imunogênica seja apresentada pelas células de apresentação de antígeno após o processamento. As sequências de aminoácidos que flanqueiam a mutação são preferencialmente as sequências de aminoácidos que flanqueiam a mutação no neoantígeno, enquanto a sequência de neoepítopo de câncer é uma subsequência verdadeira da sequência de aminoácidos de neoantígeno de câncer.
[239] O segundo ligante é projetado para ser não imunogênico e é preferencialmente também um ligante flexível, enquanto os neoepítopos tumorais, apesar dos altos números de subunidades antigênicas presentes na unidade antigênica, são apresentados de uma maneira ideal para as células T. Preferencialmente, o comprimento do segundo ligante é de 4 a 20 aminoácidos para garantir a flexibilidade. Em uma outra modalidade preferida, o comprimento do segundo ligante é de 8 a 20 aminoácidos, como de 8 a 15 aminoácidos, por exemplo, 8 a 12 aminoácidos ou como, por exemplo, de 10 a 15 aminoácidos. Em uma modalidade particular, o comprimento do segundo ligante é 10 aminoácidos.
[240] Em uma modalidade específica, a vacina da presente invenção compreende 10 neoepítopos, em que os segundos ligantes têm um comprimento de 8 a 20 aminoácidos, como de 8 a 15 aminoácidos, por exemplo, 8 a 12 aminoácidos ou como, por exemplo, de 10 a 15 aminoácidos. Em uma modalidade particular, a vacina da presente invenção compreende 10 neoepítopos e em que os segundos ligantes têm um comprimento de 10 aminoácidos.
[241] O segundo ligante é preferencialmente um ligante serina-glicina, como um ligante GGGGS flexível, como GGGSS, GGGSG, GGGGS ou múltiplas variantes dos mesmos, como GGGGSGGGGS ou (GGGGS)m, (GGGSS)m, (GGGSG)m, onde m é um número inteiro de 1 a 5, de 1 a 4 ou de 1 a 3. Em uma modalidade preferida m é 2.
Unidade de direcionamento
[242] Por causa da unidade de direcionamento, o polipeptídeo/proteína dimérica leva a atração de células dendríticas (DCs), neutrófilos e outras células imunes. Assim, o polipeptídeo/proteína dimérica compreendendo o módulo de direcionamento não apenas direcionará os antígenos para células específicas, mas, além do mais, facilitará um efeito de amplificação de resposta (efeito adjuvante) recrutando células específicas imunes para o local de administração da vacina. Esse mecanismo exclusivo é de grande importância em um ambiente clínico onde pacientes podem receber a vacina sem nenhum adjuvante adicional, uma vez que a própria vacina dá o efeito de adjuvante.
[243] A expressão “unidade de direcionamento” da maneira usada neste documento se refere a uma unidade que administra o polipeptídeo/proteína com seu antígeno a uma célula apresentadora de antígeno para apresentação restrita de MHC classe Il a células T CD4+ ou para fornecer apresentação cruzada a células T CD8+ por restrição de MHC classe I.
[244] A unidade de direcionamento é conectada através da unidade de dimerização à unidade antigênica, em que essa está tanto na extremidade COOH-terminal quanto NH2-terminal do polipeptídeo/proteína dimérica. É preferido que a unidade antigênica esteja na extremidade COOH- terminal do polipeptídeo/proteína dimérica.
[245] A unidade de direcionamento é projetada para direcionar o polipeptídeo/proteína dimérica da invenção para moléculas de superfície expressas nas células apresentadoras de antígenos relevantes, tais como moléculas expressas exclusivamente em subconjuntos de células dendríticas (DC).
[246] Exemplos de tais moléculas de superfície direcionadas em APC são antígeno do leucócito humano (HLA), grupamento de diferenciação 14 (CD14), grupamento de diferenciação 40 (CD40), receptores de quimiocina e receptores tipo Toll (TLRs). HLA é um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em seres humanos. Os receptores tipo Toll podem, por exemplo, incluir TLR-2, TLR-4 e/ou TLR-5.
[247] O polipeptídeo/proteína dimérica da invenção pode ser direcionado para as referidas moléculas de superfície por meio de unidades de direcionamento compreendendo, por exemplo, regiões de ligação de anticorpo com especificidade para CD14, CD40, ou receptor tipo Toll; ligantes, por exemplo, ligante CD40 solúvel; ligantes naturais como quimiocinas, por exemplo, RANTES ou MIP-1a; ou antígenos bacterianos como, por exemplo, flagelina.
[248] Em uma modalidade, a unidade de direcionamento tem afinidade para uma proteína MHC classe II. Assim, em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica a unidade de direcionamento codifica os domínios variáveis de anticorpo (VL e VH) com especificidade para Proteínas MHC classe II, selecionadas a partir do grupo que consiste em anti-HLA-DP, anti- HLA-DR e anti-HLA-II.
[249] Em outra modalidade, a unidade de direcionamento tem afinidade para uma molécula de superfície selecionada a partir do grupo que consiste em CD40, TLR-2, TLR-4 e TLR-5. Assim, em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica a unidade de direcionamento codifica os domínios variáveis de anticorpo (VL e VH) com especificidade para anti-CD40, anti-TLR-2, anti-TLR-4 e anti-TLR-5. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica a unidade de direcionamento codifica Flagelina. Flagelina tem afinidade para TLR-5.
[250] Preferencialmente, a unidade de direcionamento tem afinidade para um receptor de quimiocina selecionado a partir de CCR1, CCR3 e CCR5. Mais preferencialmente, a sequência de nucleotídeos que codifica a unidade de direcionamento codifica a quimiocina hMIP-1alfa (LD78beta), que se liga aos seus receptores cognatos, CCR1, CCR3 e CCR5 expressos na superfície da célula de APCs. hMIP-1alfa (MIP-1alfa de humano) é também conhecida como ligante 3 de quimiocina (motivo C-C) (CCL3), que, em seres humanos, é codificado pelo gene CCL3. CCL3, também conhecido como proteína inflamatória de macrófago-1α (MIP-1α), é uma citocina pertencente à família de quimiocina CC que está envolvida no estado inflamatório agudo no recrutamento e ativação de leucócitos polimorfonuclear. Embora CCL3 de camundongo seja um gene de uma única cópia que codifica para uma quimiocina madura de 69 aminoácidos, o homólogo de humano foi duplicado e mutado para gerar duas variantes não alélicas, LD78α (CCL3) e LD78β (CCL3-L1), ambas apresentando uma homologia de 74% com a CCL3 de camundongo.
[251] A ligação do polipeptídeo/proteína dimérica da invenção aos seus receptores cognatos leva a internalização na APC e degradação das proteínas em pequenos peptídeos incluindo os epítopos mínimos – e consequentemente a mutação – que são carregados nas moléculas de MHCs e apresentados às células T CD4+ e CD8+ para induzir respostas imunes específicas do tumor. Uma vez estimulados e com a ajuda de Células T ativadas CD4+, células T CD8+ direcionarão e exterminarão células tumorais que expressam os mesmos neoantígenos.
[252] Em uma modalidade da presente invenção, a unidade de direcionamento compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 5-70 de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferida, a unidade de direcionamento compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 5-70 de SEQ ID NO: 1, como pelo menos 86%, como pelo menos 87%, como pelo menos 88%, como pelo menos 89%, como pelo menos 90%, como pelo menos 91%, como pelo menos 92%, como pelo menos 93%, como pelo menos 94%, como pelo menos 95%, como pelo menos 96%, como pelo menos 97%, como pelo menos 98%, como pelo menos 99% de identidade de sequência.
[253] Em uma modalidade mais preferida, a unidade de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 5-70 de SEQ ID NO: 1, como pelo menos 85%, como pelo menos 86%, como pelo menos 87%, como pelo menos 88%, como pelo menos 89%, como pelo menos 90%,
como pelo menos 91%, como pelo menos 92%, como pelo menos 93%, como pelo menos 94%, como pelo menos 95%, como pelo menos 96%, como pelo menos 97%, como pelo menos 98%, como pelo menos 99%, como pelo menos 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos 5-70 de SEQ ID NO: 1.
Unidade de dimerização
[254] A expressão “unidade de dimerização” conforme usada neste documento se refere a uma sequência de aminoácidos entre a unidade antigênica e a unidade de direcionamento. Assim, a unidade de dimerização serve para conectar a unidade antigênica e a unidade de direcionamento, e facilita a dimerização de dois polipeptídeos monoméricos em uma proteína dimérica. Além disso, a unidade de dimerização também fornece a flexibilidade no polipeptídeo/proteína dimérica para permitir ligação ideal da unidade de direcionamento para as moléculas de superfície nas células apresentadoras de antígeno (APCs), mesmo se elas forem localizadas a distâncias variáveis. A unidade de dimerização pode ser qualquer unidade que satisfaz essas exigências.
[255] Desta forma, em uma modalidade, a unidade de dimerização pode compreender uma região de dobradiça e opcionalmente outro domínio que facilita a dimerização, e a região de dobradiça e o outro domínio podem ser conectados através de um terceiro ligante.
[256] A expressão “região de dobradiça” se refere a uma sequência de peptídeos da proteína dimérica que facilita a dimerização. A região de dobradiça funciona como um espaçador flexível entre as unidades que permitem que duas unidades de direcionamento se liguem simultaneamente a duas moléculas alvos em APCs, mesmo se elas forem expressas com distâncias variáveis. A região de dobradiça pode ser derivada de Ig, como derivada de IgG3. A região de dobradiça pode contribuir para a dimerização pela formação de ligação(ões) covalente(s), por exemplo, ligação(ões) de dissulfeto. Assim, em uma modalidade, a região de dobradiça tem a capacidade de formar um ou mais ligações covalentes. A ligação covalente pode, por exemplo, ser uma ligação de dissulfeto.
[257] Em uma modalidade, o outro domínio que facilita a dimerização é um domínio de imunoglobulina, como um domínio carboxiterminal C, ou uma sequência que é substancialmente idêntica ao domínio C ou uma variante do mesmo. Preferencialmente, o outro domínio que facilita a dimerização é um domínio do carboxiterminal C derivado de IgG.
[258] O domínio de imunoglobulina contribui para a dimerização através de interações não covalente, por exemplo, interações hidrofóbicas. Por exemplo, o domínio de imunoglobulina tem a capacidade de formar dímeros por meio de interações não covalentes. Preferencialmente, as interações não covalentes são interações hidrofóbicas.
[259] É preferido que a unidade de dimerização não compreenda um domínio CH2 capaz de ligar a receptores de célula F. Em algumas modalidades, a unidade de dimerização é desprovida do domínio CH2 por completo. Em outras modalidades, o domínio CH2 é mutado de forma que ele perdeu a capacidade de se ligar aos receptores de célula F.
[260] Em uma modalidade preferida, a unidade de dimerização consiste em éxons de dobradiça h1 e h4 conectados através de um terceiro ligante a um domínio CH3 de IgG3 de humano.
Resposta da célula T CD8+
[261] As vacinas descritas aqui, obtidas pelos presentes métodos de classificação, podem induzir um deslocamento da resposta imune de uma resposta de célula T CD4+ para uma resposta de célula T CD8+ para um dado neoepítopo. Dessa forma, em um aspecto, é provido um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos; c. Selecionar neoepítopos preditos para se ligarem a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, em que A é um número inteiro e A é pelo menos 3, como pelo menos 4, como pelo menos 5, selecionando assim A neoepítopos capazes de induzir uma resposta de célula T CD8+ quando administrados como uma vacina conforme descrito neste documento.
[262] Em algumas modalidades, as vacinas compreendendo os neoepítopos selecionados pelos métodos descritos neste documento são dessa forma capazes de induzir uma resposta de célula T CD8+. Em modalidades particulares, tais vacinas são capazes de induzir uma resposta dominante da célula T CD8+ ao contrário de outros formatos de vacina. Por exemplo, um neoepítopo que induz uma resposta de célula T CD4+ quando administrado como uma vacina de peptídeo e/ou como uma vacina de RNA pode induzir uma resposta de célula T CD8+ quando administrado como uma vacina de DNA Vaccibody conforme descrito neste documento. Em particular, os neoepítopos selecionados pelos presentes métodos podem não ter sido previamente considerados capazes de induzir uma resposta de célula T CD8+. Os inventores observaram que esse é o caso para diversos neoepítopos, como mostrado no exemplo 13 e figura 6.
[263] Em algumas modalidades, A é um número inteiro como de outra forma descrito aqui.
Exemplos Exemplo 1 – Fonte, história e geração das linhagens celulares hospedeiras específicas de paciente VB10.NEO
[264] O projeto do módulo antigênico de neoepítopo é baseado em sequências exclusivas específicas de tumor identificadas para cada paciente. A fim de predizer os neoepítopos mais imunogênicos, um fluxo de trabalho otimizado é estabelecido como sumarizado a seguir e ilustrado na Figura 7.
1) A primeira etapa de seleção de neoepítopo é a identificação de todas as mutações específicas para o tumor. Os neoepítopos que não são expressos no tumor ou podem, por exemplo, compreender 9 peptídeos aa (incluindo o sítio de mutação) que têm uma correspondência de sequência idêntica em algum lugar no proteoma são excluídos ou infrapriorizados. Além disso, neoepítopos em genes que mostram pelo menos que cinco vezes maior nível de expressão de RNA em um órgão/tecido específico em comparação a todos outros tecidos são também excluídos ou infrapriorizados.
2) A etapa seguinte é a construção dos neoepítopos (27 aminoácidos de comprimento, a mutação sendo no meio) e classificação desses com base em uma combinação ideal de afinidade de ligação de peptídeo com as moléculas de HLAs e suas propriedades de resíduo.
3) Em algumas modalidades, a finalização do conjunto de neoepítopo inclui uma avaliação de neoepítopos com base em critérios de avaliação cuidadosamente selecionados que consistem em propriedades dos neoepítopos e/ou seus genes fontes reportados como potencialmente importantes para definir neoepítopos imunogênicos. Essa avaliação é feita por um quadro de seleção alvejado que consiste em um médico (CMO), imunologista (CSO) e um biofarmacêutico.
Exemplo 2 – Coleta e Manuseio de Tecido de Paciente
[265] Amostras de tecido tumoral sólido bem como de sangue são coletadas de pacientes elegíveis durante triagem.
[266] Pelo menos uma biópsia de núcleo é coletada para sequenciamento de exoma e sequenciamento de RNA. Criopreservação é ideal para manter a integridade do corpo de prova para sequenciamento de exoma e transcriptoma e dessa forma esse material é preferencialmente usado para efeitos de sequenciamento. Em caso de material de tumor fresco não poder ser obtido na classificação, material de tumor preservado em FFPE antes da classificação pode ser aceito para sequenciamento.
[267] Amostras de sangue são coletadas. Para amostras de biópsia de tumor criopreservadas, as amostras são submersas em nitrogênio líquido para congelamento rápido e armazenadas em nitrogênio líquido. Para material de tumor FFPE, amostras de tecido são fixadas em formalina tamponada neutra 4–10%. As amostras são então desidratadas antes do embutimento e armazenamento à temperatura ambiente.
Exemplo 3 - Sequenciamento de Exoma e RNA de Paciente e tipagem HLA
[268] Dados de sequenciamento de Exoma e RNA são obtidos de sangue e tumor bem como de tipo HLA de paciente. Sequenciamentos de amostra de tumor e sangue são realizadas usando comprimento de leitura de pelo menos 2x100 bp. A saída de dados brutos é pelo menos 24 gigabases (Gbs).
[269] Sequenciamento de RNA é realizado a partir de amostras de tumor com comprimento de leitura de pelo menos 2x100 bp. A saída de dados total é pelo menos 100 milhões de leituras.
[270] Para tipagem HLA, DNA isolado de amostras de sangue é sequenciado com comprimento de leitura de pelo menos 2x150 bp em plataforma da Illumina com mais que 100x cobertura.
Exemplo 4 – Processamento bioinformático e identificação de mutações em tumor
[271] Os dados de expressão de exoma e RNA são providos como arquivos FASTQ para transferência do servidor seguro interno do provedor de sequenciamento. A análise das sequências de exoma bruto QC- aprovado (arquivos FASTQ) segue o fluxo de trabalho das melhores práticas definidas pela moderna tecnologia e algoritmos otimizados para processamento FASTQ e variante que procura pares de amostras de tumor e normais (por exemplo, Miller et al., 2015; Van der Auwera et al., 2013).
[272] Os arquivos FASTQ brutos do sequenciamento de RNA são mapeados usando as práticas mais avançadas na análise de sequenciamento de RNA (por exemplo, Dobin et al., 2013; Dutton G. 2016).
[273] Os HLA-alelos dos pacientes são identificados a partir de EDTA-amostra de sangue usando a plataforma de sequenciamento da Illumina.
[274] Todas as mutações (variantes identificadas em arquivos vcf) encontradas nos genes codificadores de proteína para os quais a expressão de RNA é detectada em tecido tumoral (TPM > 0, definido em Gubin et al., 2015) são investigadas quanto a sua utilidade potencial como um neoepítopo.
[275] Uma sequência de peptídeos cobrindo 13 aminoácidos em cada lado da mutação é extraída, formando a sequência de neoepítopos com um comprimento total de 27 aminoácidos. Para as mutações não sinonímias localizadas mais próximas que 13 aminoácidos da proteína C- terminal ou N-terminal, a sequência de flanqueamento da mutação é menor que 13 aminoácidos em um lado, assim, o comprimento total da sequência de neoepítopos será menor que 27 aminoácidos.
Exemplo 5 – Os critérios de exclusão para minimizar o risco de autoimunidade
[276] Para minimizar o risco de reatividade cruzada, todos os neoepítopos com um peptídeo núcleo de 9 aminoácidos (incluindo a mutação) que correspondem a qualquer sequência de peptídeos no proteoma humano normal são preferencialmente excluídos ou infrapriorizados nesse estágio. Além disso, neoepítopos em genes que apresentam pelo menos nível de expressão de RNA 5 vezes maior em um tecido ou órgão específico em comparação a todos os outros tecidos ou órgãos (como definido pelo Human Proteome Atlas, Uhlén et al., 2015) são excluídos ou infrapriorizados igualmente.
Exemplo 6 - Desenvolvimento de modelo computacional para priorização de neoepítopo em modelos de tumor de camundongo
[277] A fim de identificar os neoepítopos mais imunogênicos, os dados e resultados de dois modelos de tumor de camundongo in vivo foram utilizados para desenvolver um modelo computacional para predição de priorização de neoepítopo.
[278] Usando múltiplos conjuntos de dados de experimentos pré-clínicos in vivo em camundongos, características relevantes para predição de neoepítopos imunogênicos foram coletadas e seu potencial de predição foi avaliado. Neoepítopos identificados no modelo de carcinoma do cólon CT26 e sal imunogenicidade observados em camundongos BALB/c VB10.NEO vacinados (H-2d) foram usados para desenvolver uma estratégia para priorizar neoepítopos baseada em imunogenicidade predita. A capacidade de predição dessa estratégia foi validada usando dados de imunogenicidade coletados para neoepítopos identificados no modelo de melanoma B16 e no modelo de câncer de pulmão LL2 e sua imunogenicidade observada em camundongos VB10.NEO vacinados C57Bl/6 (H-2b). Os neoepítopos foram classificados como imunogênicos se o número de IFN-ɣ > o controle negativo + 2xSD e número de pontos > 25 analisados por ensaios IFN-ɣ ELIPoint realizados internamente. A afinidade de ligação (%Rank) para a molécula de MHCs de classe I e II usando as ferramentas de predição NetMHCpan (Nielsen et al., 2016) e NetMHCIIpan (Andreatta et al., 2015), o número total de epítopos mínimos de ligação, a diferença entre afinidade de ligação entre o epítopo mutado e tipo selvagem (diferencial de ligação) e a pontuação Blocks Substitution Matrix (BLOSUM) (Henikoff et al., 1992) mostraram um padrão distinto entre neoepítopos imunogênicos e não imunogênicos.
Exemplo 7 - Afinidade de ligação (%Rank), o número total de epítopos de ligação, diferencial de ligação e pontuação de BLOSUM.
[279] Em camundongos, apenas peptídeos que têm uma afinidade para MHC classe I ou II (em HLA de seres humanos de classe I ou II) fornecem células T alvos elegíveis. Uma estratégia para selecionar vacinas alvos é escolher neoepítopos candidatos com base nas suas afinidades preditas para as moléculas de MHC classe I e II usando NetMHCpan e NetMHCIIpan, respectivamente. Para todos os neoepítopos de 27 aminoácidos, esses servidores fornecem pontuações de afinidade de ligação para as moléculas de MHC selecionadas. Os servidores de predição de afinidade de ligação fornecem diversos valores de pontuação para afinidade MHC, dos quais o %Rank é altamente recomendada (Nielsen et al., 2016 e Andreatta. et al., 2015). Uma baixa pontuação de %Rank indica forte afinidade de ligação.
[280] A Figura 2 ilustra a distribuição do %Rank para os neoepítopos imunogênicos e não imunogênicos testados em camundongos vacinados com VB10.NEO, para MHC classe I e MHC classe II.
[281] Em um neoepítopo de 27 aminoácidos de comprimento, é possível ter mais que um epítopo mínimo (8-14 aminoácidos para MHC classe I e 9 -15 aminoácidos para MHC classe II, respectivamente) predito para se ligar à molécula de MHC relevante. Os neoepítopos contendo o mais alto número de epítopos mínimos preditos têm uma maior chance de processar e apresentar um ou mais peptídeo(s) imunogênico(s) na(s) molécula de MHC do paciente e dessa forma elicitar uma resposta imune específica do tumor mais efetiva. A Figura 8 mostra uma comparação do número total de epítopos mínimos entre os neoepítopos imunogênicos e não imunogênicos nos dados de B16 e CT26.
[282] Se o neoepítopo tiver uma maior afinidade de ligação para as moléculas de MHC do que a sequência de tipo selvagem correspondente
(alto diferencial de ligação), é provável que o tipo selvagem seja insuficientemente apresentado, ou não apresentado, em tecido saudável e dessa forma as células T específicas de neoepítopo devem ter um baixo risco de reconhecimento de células saudáveis e um alto potencial de reconhecimento de células cancerígenas que expressam o neoepítopo. Para medir o diferencial de ligação entre as sequências de neoepítopos de referência e a mutante, pode-se usar a razão entre seus valores de %Rank (referência/mutante) e agrupá-los pelo tipo de resíduo: âncora (P2 ou P8/P9) e não âncora (todas as outras posições de resíduo). A Figura 9 ilustra que, se um epítopo tiver uma mutação em uma posição de ancoragem e um alto diferencial de ligação, ele tem uma maior chance de ser imunogênico.
[283] A pontuação de BLOSUM descreve a probabilidade de ocorrência de uma substituição de aminoácido em pares. Em nosso caso, os aminoácidos encontrados em proteínas expressas em tecido saudável foram substituídos pelo aminoácido mutado. Quanto menor a pontuação, tanto menor a probabilidade de que essa substituição ocorra no alinhamento de proteínas relacionadas. A pontuação de BLOSUM para os neoepítopos no conjunto de dados do modelo de melanoma CT26 com alta afinidade de ligação é em geral menor para neoepítopos imunogênicos (Figura 10).
[284] Para predizer os neoepítopos mais imunogênicos, uma combinação de todos os cinco fatores: os valores de %Rank para MHCI e MHCII, o número de epítopos mínimos em um neoepítopo, o diferencial de ligação em posição de ancoragem e pontuação de BLOSUM são incluídos. A estratégia para priorização de neoepítopos, denominada NeoSELECT, pondera esses cinco fatores e gera uma lista classificada de neoepítopos. A classificação de NeoSELECT foi testada em neoepítopos dos modelos de tumor LL2, CT26 e B16 e sua imunogenicidade observada é exibida na Figura 3.
[285] A reatividade cruzada observada contra a sequência de peptídeos de referência do 20 neoepítopos superiores predita pela estratégia NeoSELECT é mostrada juntamente com a resposta à sequência de peptídeos mutada na Figura 4 para modelos(A) CT26, (B) B16 e (C) LL2. Para o modelo CT26, as medições de reatividade cruzada foram obtidas para 12 dos 20 neoepítopos; para o modelo B26, medições de reatividade cruzada foram obtidas para 17 dos 20 neoepítopos. Para o modelo LL2, medições de reatividade cruzada foram obtidas para todos os 20 neoepítopos. Assim, usando a estratégia NeoSELECT, o risco de induzir célula T reativa cruzada é limitado.
Exemplo 8 – Processo de predição de neoepítopo empregado no experimento clínico VB N-01
[286] Se mais que 20 neoepítopos potenciais forem encontrados para um paciente, esses são classificados de acordo com a estratégia de priorização NeoSELECT para predição de neoepítopo supradescrita. Para dados de paciente, os alelos HLA específicos do paciente são usados no processo de obtenção de valores de %Rank para referência e neoepítopo WT de NetMHCpan e NetMHCIIpan. Os diferenciais de ligação são calculados e as posições de ancoragem são determinada. O número de epítopos mínimos para MHC classe I e II é calculado usando a lista completa de epítopos mínimos preditos para todos os alelos HLA. A pontuação de BLOSUM para cada mutação é extraída da pontuação de matriz BLOSUM. Esses fatores são subsequentemente usados na estratégia NeoSELECT para obter uma lista classificada dos neoepítopos imunogênicos preditos. A afinidade de ligação medida em %Rank, diferencial de ligação, número de epítopos mínimos bem como a pontuação de BLOSUM são valores padronizados, não afetados pelo organismo no qual o neoepítopo foi identificado. Assim, o modelo de predição desenvolvido em dados de camundongos não exige que customização adicional seja utilizada para predição de neoepítopo em seres humanos.
Exemplo 9 - Controle de qualidade e seleção de neoepítopo final
[287] Finalmente, informação adicional para todos os neoepítopos que são aprovados nesses critérios de exclusão é coletada para servir como critérios de seleção. Esses critérios incluem:
- Clonalidade (isto é, o neoepítopo encontrado em mais que uma amostra de biópsia do paciente é priorizado, por exemplo, o neoepítopo é encontrado em material de tumor de arquivo, em biópsias multianguladas da mesma lesão, ou em célula sem DNA);
- Alto nível de expressão de RNAs (em TPM);
- baixa %Rank (alta afinidade de ligação) para MHC classe I e II para o neoepítopo;
- alto diferencial de ligação (%Rank de neoepítopo versus referência);
- baixa pontuação de BLOSUM: características de resíduo do aminoácido substituído no neoepítopo em comparação ao tipo selvagem;
- alta frequências de alelo (AFs) ou frequências de alelo variante (VAFs) na posição das mutações estimadas de arquivos VCF;
- o gene fonte é gene relacionado a câncer conhecido na base de dados do Catálogo de Mutações Somáticas em Câncer (COSMIC);
- os neoepítopos têm alta semelhança com epítopos que se sabe são reconhecidos por células T, por exemplo, obtidos da base de dados de epítopos imunes e recursos de análise (base de dados IEDB);
- alto número de epítopos mínimos (8-15 aminoácidos) no neoepítopo de 27 aminoácidos;
- posição da mutação no complexo HLA-TCR descrito em Fritsch et al., 2014;
- alta pontuação de estabilidade de ligação para moléculas MHC classe I / MHC classe II estimada usando NetMHCstabpan (Rasmussen et al., 2016) ou similar;
- alta pontuação de clivagem de proteassoma predita por NetChop (Nielsen et al., 2005) ou similar.
[288] Esses critérios, além da priorização predita pela estratégia NeoSELECT, formam a base para a seleção do conjunto final de 10 – 20 neoepítopos e são avaliados por um quadro de seleção alvo. Os critérios de decisão são registrados e analisados com relação à resposta imune do paciente a cada neoepítopo na vacina e na resposta clínica do paciente.
[289] O conjunto recomendado de neoepítopos é combinado e separado por ligantes ricos em glicina/serina flexíveis não imunogênicos (vide exemplo 11). A ordem dos neoepítopos depende das sequências juncionais entre cada neoepítopo e o ligante, onde todas as sequências juncionais de comprimento 9 aminoácidos com correspondência idêntica em algum lugar no proteoma são evitadas.
Exemplo 10 – Armazenamento e análise de dados
[290] O armazenamento de dados brutos, bem como os resultados de análise de sequência exoma e RNA, é realizada em uma plataforma de ambiente de grupamento por computador controlada segura para processar e armazenar dados sensíveis. Todos os pacientes são atribuídos com um código de dígito-d exclusivo no alistamento para oferecer salvaguardas para a identidade do paciente.
Exemplo 11 – Síntese de Módulo Antigênico de Neoepítopo
[291] Cada Módulo Antigênico de Neoepítopo específico do paciente é ativado por Vaccibody AS com base nos 10-20 neoepítopos de 27 aminoácidos de comprimento conectados com ligantes ricos em glicina/serina de 10 aminoácidos de comprimento. O Módulo Antigênico de Neoepítopo é sintetizado de novo por um provedor de síntese de DNA e clonado no plasmídeo para gerar VB10.NEO.
Exemplo 12 – Vaccibody induz forte resposta dominante da célula T CD8+s em comparação com outros formatos de vacina
[292] Dez diferentes neoepítopos (pep1-10) todos preditos para se ligarem a MHC de classe I (resposta da célula T CD8+) foram investigados por Kreiter et al., 2015, e Castle et al., 2012, para investigar se eles poderiam induzir resposta da célula T CD8+s em um modelo de tumor de melanoma de camundongo B16-F10. As respostas induzidas por 6 dos 10 neoepítopos quando administrados como peptídeo, como RNA ou como Vaccibody conforme descrito neste documento (“VB10.NEO”) são mostradas na figura 6.
[293] Quando neoepítopos foram administrados como peptídeos sintéticos 1 de 6 induziu uma resposta de célula T CD8+ e como mRNA 2 de 6 induziram uma resposta de célula T CD8+.
[294] Entretanto, durante entrega dos mesmos 6 neoepítopos como Vaccibody alvejando MIP1α de humano, todos os neoepítopos induziram uma resposta de célula T CD8+ demonstrando claramente a importância do formato da vacina para induzir fortes respostas de células T CD8+ Exterminadora contra neoepítopos.
Exemplo 13 – Imunogenicidade de neoepítopos selecionados
[295] Neoepítopos foram selecionados usando os métodos descritos para 4 pacientes que sofrem de carcinoma de célula renal ou carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço. Vacinas personalizadas foram construídas e administradas aos pacientes. A imunogenicidade foi medida em células mononuclear de sangue periférico colhidas 3 a 9 meses após a administração da primeira dose da vacina personalizada. As respostas de célula T foram medidas em um ensaio ELISPOT de pré-estimulação do dia 10 (o fundo foi subtraído). Resposta induzida por vacina: > 30 SFU maior resposta pós-vacinação. Neoepítopos imunogênicos: > 30 SFU em pelo menos um ponto de tempo.
Percentual de No de neoepítopos No de Percentual de neoepítopos com com maior resposta Paciente ID Indicação neoepítopos epítopos maior resposta imune após imunogênicos imunogênicos imune após vacinação vacinação 01-001 RCC 20 100 % 17 85 % 01-002 SCCHN 20 100 % 19 95 % 01-004 SCCHN 19 95 % 12 60 % 01-005 RCC 17 85 % 14 70 %
[296] RCC: carcinoma de célula renal; SCCHN: carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço.
[297] Em média, 95% dos neoepítopos selecionados pelo método nesses 4 pacientes foram imunogênicos, isto é, capazes de ativar uma resposta de célula T nos pacientes que hospedam as sequências mutadas correspondentes em seu tumor. Quando os neoepítopos selecionados foram incorporados em uma vacina personalizada e administrados aos pacientes, uma maior resposta de célula T foi induzida em comparação à vacinação anterior em 78% dos neoepítopos em média.
[298] O exemplo mostra que o método de seleção de neoepítopos resulta em seleção de neoepítopos que são capazes de aumentar as respostas de célula T quando administrados ao paciente.
SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1
[299] Precursor 1 de quimiocina motivo C-C tipo 3 incluindo peptídeo sinal e peptídeo maduro (LD78-beta), aa 24-93:
Referências
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1. Um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos; c. Selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica.
2. O método de acordo com o item 1, em que alguns ou todos os A neoepítopos se ligam pelo menos a MHC I.
3. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que pelo menos um epítopo mínimo está entre 1 e 50 epítopos mínimos, como entre 1 e 40 epítopos mínimos, como entre 1 e 30 epítopos mínimos, como entre 1 e 20 epítopos mínimos.
4. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que cada epítopo mínimo compreende a mutação.
5. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa b é realizada determinando a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para cada dos referidos epítopos mínimos, por meio disso identificando x epítopos mínimos de ligação ao MHC I e/ou y epítopos mínimos de ligação ao MHC II.
6. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a afinidade de ligação a MHC I e MHC II para cada um dos referidos neoepítopos é calculada como a mais alta afinidade de ligação a MHC I e MHC II dos epítopos mínimos compreendidos em cada um dos referidos neoepítopos.
7. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa c compreende ou consiste em selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC.
8. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa c compreende selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC II.
9. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende o etapa de determinar o número de MHC I e/ou MHC II epítopos mínimos de ligação em cada um dos referidos neoepítopo, e em que um maior número de Epítopos mínimos de ligação a MHC I e/ou MHC II é indicativo de uma maior probabilidade de utilidade clínica do neoepítopo.
10. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende etapa de determinar uma pontuação de ligação para o neoepítopo, em que a pontuação de ligação é a * 2x + b * y, em que preferencialmente a = 0 se y = 0 e b = 0 se x = 0 e onde a = 1 se y > 0 e b = 1 se x > 0, e em que uma maior pontuação de ligação é indicativa de uma maior probabilidade de utilidade clínica do neoepítopo.
11. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende a etapa de determinar uma pontuação de ligação para o neoepítopo, em que a pontuação de ligação é a * x + b * y, em que preferencialmente a = 2 e b = 1, ou a = 0 se y = 0 e b = 0 se x = 0 e onde a = 1 se y > 0 e b = 1 se x > 0, e em que uma maior pontuação de ligação é indicativa de uma maior probabilidade de utilidade clínica do neoepítopo.
12. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende adicionalmente a etapa de determinar o diferencial de ligação de neoepítopo de ligação a MHC I do MHC I da etapa c, em que o diferencial de ligação a MHC I é dado pela fórmula pontuação %Rank (MHC I) para referência) / pontuação %Rank (MHC I) para neoepítopo), em que neoepítopos com um alto diferencial de ligação a MHC I são classificados superiores aos neoepítopos com um menor diferencial de ligação a MHC I.
13. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende a etapa de determinar o diferencial de ligação do epítopo mínimo de ligação a MHC I do MHC I da etapa c, em que o diferencial de ligação a MHC I é dado pela fórmula (pontuação %Rank(MHC I) para referência) / pontuação %Rank (MHC I) para epítopo mínimo), em que neoepítopos compreendendo um epítopo mínimo com um alto diferencial de ligação a MHC I são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo um epítopo mínimo com um menor diferencial de ligação a MHC I.
14. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o diferencial de ligação a MHC I de cada neoepítopo é igual ao máximo diferencial de ligação a MHC I dos epítopos mínimos que ele compreende.
15. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende adicionalmente a etapa de determinar o diferencial de ligação a MHC II do neoepítopo de ligação a MHC II da etapa c, em que o diferencial de ligação a MHC II é dado pela fórmula (pontuação %Rank(MHC II) para referência) / pontuação %Rank (MHC II) para neoepítopo), em que neoepítopos com um alto diferencial de ligação a MHC II são classificados superiores aos neoepítopos com um menor diferencial de ligação a MHC II.
16. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende adicionalmente a etapa de determinar o diferencial de ligação ao epítopo mínimo de ligação a MHC II do MHC II da etapa c, em que o diferencial de ligação a MHC II é dado pela fórmula (pontuação %Rank(MHC II) para referência) / pontuação %Rank (MHC II) para epítopo mínimo), em que neoepítopos compreendendo um epítopo mínimo com um alto diferencial de ligação a MHC II são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo um epítopo mínimo com um menor diferencial de ligação a MHC II.
17. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o diferencial de ligação a MHC II de cada neoepítopo é igual ao máximo diferencial de ligação a MHC II dos epítopos mínimos que ele compreende.
18. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os neoepítopos selecionados na etapa c se ligam a MHC II.
19. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que neoepítopos que se ligam a MHC I são selecionados na etapa e apenas se a pluralidade de neoepítopos não compreender nenhuma ligação de neoepítopo a MHC II.
20. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende adicionalmente classificar os neoepítopos como se segue: i) determinar se a mutação é em uma posição de ancoragem ou uma posição de não ancoragem do neoepítopo mínimo para cada epítopo mínimo compreendido no neoepítopo; ii) priorizar os neoepítopos, preferencialmente em que neoepítopos com maior diferencial de ligação são priorizados em relação a neoepítopos com menor diferencial de ligação.
21. O método de acordo com o item 20, em que a priorização dos neoepítopos na etapa ii) é realizada atribuindo aos referidos neoepítopos a maior pontuação do epítopos mínimos que eles compreendem.
22. O método de acordo com qualquer um de itens 20 ou 21, em que neoepítopos com maior diferencial de ligação são pontuados mais altos do que neoepítopos com menor diferencial de ligação, e em que neoepítopos compreendendo uma mutação em uma posição de ancoragem são pontuados mais altos do que neoepítopos compreendendo uma mutação em uma posição de não ancoragem.
23. O método de acordo com qualquer um dos itens 19 a 21, em que a priorização dos neoepítopos é realizada como se segue: 1) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, o epítopo mínimo tem a maior pontuação; 2) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação para os epítopos mínimos de 1); 3) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 2); 4) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 3);
5) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 4); 6) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 5); 7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor pontuação.
24. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende adicionalmente a etapa de priorizar os neoepítopos com relação a sua classificação de MHC I.
25. O método de acordo com o item 24, em que a pontuação %Rank (MHC I) de um neoepítopo compreendendo um ou mais epítopos mínimos preditos para se ligarem a MHC I é igual à menor pontuação %Rank (MHC I) dos referidos um ou mais epítopos mínimos.
26. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa e compreende selecionar neoepítopos com uma pontuação %Rank (MHC I) abaixo de 2,0, como abaixo de 1,5, como abaixo de 1, preferencialmente igual a ou abaixo de 0,5.
27. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que neoepítopos de ligação a MHC I com uma pontuação %Rank (MHC I) acima de 2, são excluídos ou infrapriorizados.
28. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende adicionalmente a etapa de priorizar os neoepítopos com relação a sua classificação MHC II.
29. O método de acordo com qualquer um dos itens 24 a 28, em que a pontuação %Rank (MHC II) de um neoepítopo compreendendo um ou mais epítopos mínimos preditos para se ligarem a MHC II é igual à menor pontuação %Rank (MHC II) dos referidos um ou mais epítopos mínimos.
30. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa e compreende selecionar neoepítopos com uma pontuação %Rank (MHC II) abaixo de 10, como abaixo de 2.
31. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que neoepítopos de ligação a MHC I com uma pontuação %Rank (MHC I) acima de 10, como acima de 2, são excluídos ou infrapriorizados.
32. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende adicionalmente a etapa de priorizar os neoepítopos com relação a sua pontuação de BLOSUM em uma ordem descendente, onde a pontuação de BLOSUM de um neoepítopo é igual à pontuação de BLOSUM do epítopo mínimo de melhor classificação que ele compreende, em que um epítopo mínimo com uma pontuação de BLOSUM < 1 é classificado superior a um epítopo mínimo com uma pontuação de BLOSUM ≥ 1.
33. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d de acordo com o item 1 compreende adicionalmente determinar uma probabilidade de que uma substituição de aminoácido presente no neoepítopo ocorre aleatoriamente, e em que neoepítopos compreendendo uma substituição de aminoácido que ocorre aleatoriamente com uma baixa probabilidade são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo uma substituição de aminoácido que ocorre aleatoriamente com uma maior probabilidade.
34. O método de acordo com o item 33, em que a referida probabilidade de que uma substituição de aminoácido presente nos neoepítopos ocorra aleatoriamente é determinada usando um matriz de pontuação de base evolucionária.
35. O método de acordo com o item 34, em que a referida matriz de pontuação é uma matriz log-ímpar.
36. O método de acordo com o item 35, em que a referida matriz log-ímpar é a matriz BLOSUM.
37. O método de acordo com o item 36, em que a referida matriz BLOSUM é a matriz BLOSUM62.
38. O método de acordo com o item 37, em que neoepítopos desprovidos de mutações ligadas a um par de substituição de aminoácidos com uma pontuação BLOSUM62 abaixo de 1 são excluídos ou infrapriorizados.
39. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, compreendendo adicionalmente determinar os níveis de expressão de RNA dos referidos neoepítopos, em que neoepítopos para os quais a expressão de RNA não é detectada são excluídos ou infrapriorizados.
40. O método de acordo com o item 39, em que neoepítopos com um alto nível de expressão de RNA são classificados superiores aos neoepítopos com um menor nível de expressão de RNA.
41. O método de acordo com qualquer um dos itens 39 ou 40, em que os referidos níveis de expressão de RNA são determinados para Neoepítopos de ligação a MHC I e/ou de ligação a MHC II.
42. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, compreendendo adicionalmente uma etapa de comparar sequências de peptídeo de neoepítopo com sequências de peptídeos do proteoma de humano, em que neoepítopos compreendendo uma sequência de peptídeos que corresponde a uma sequência de peptídeos no proteoma de humano são excluídos ou infrapriorizados.
43. O método de acordo com o item 42, em que o referido peptídeo de neoepítopo compreende ou consiste em 5 a 15 aminoácidos.
44. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, compreendendo adicionalmente uma etapa de identificar a referida pluralidade de neoepítopos identificando uma ou mais mutações específicas para o tumor no referido indivíduo.
45. O método de acordo com o item 44, em que as referidas uma ou mais mutações específicas para o tumor são identificadas por sequenciamento de exoma de DNA do tumor do referido indivíduo.
46. O método de acordo com qualquer um de qualquer um dos itens 44 a 45, em que as referidas uma ou mais mutações específicas para o tumor resultam em substituições de aminoácidos.
47. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a referida afinidade de ligação a MHC compreende determinar o genótipo de HLA do referido indivíduo.
48. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o referido genótipo de HLA é determinado a partir de uma amostra de sangue do referido indivíduo.
49. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que as referidas afinidades de ligação a MHC I e/ ou MHC II são determinadas por predição in silico.
50. O método de acordo com o item 49, em que a referida predição in silico é realizada usando um programa de computador que prediz ligação de peptídeos a moléculas de MHC classe I e/ou MHC classe II.
51. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que neoepítopos presentem em genes mostrando pelo menos níveis de expressão de RNA 5 vezes mais altos em um dado órgão ou tecido em comparação a outros órgãos ou tecidos, é excluído ou infrapriorizado.
52. O método de acordo com o item 51, em que o referido órgão é selecionado a partir de coração e cérebro.
53. O método de acordo com o item 52, em que o referido órgão é selecionado a partir de fígado, pulmões, estômago, rim, baço, cólon e intestino.
54. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a etapa d compreende adicionalmente uma etapa de determinar a frequência de alelo de mutações presentes nos neoepítopos de ligação ao MHC, em que neoepítopos de ligação ao MHC com uma alta frequência de alelo são classificados acima de neoepítopos de ligação ao MHC com uma menor frequência de alelo.
55. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que neoepítopos de ligação ao MHC compreendendo uma mutação que é encontrada em mais que uma biópsia é classificada acima de neoepítopos de ligação ao MHC compreendendo uma mutação que são encontradas em apenas uma biópsia.
56. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os referidos neoepítopos apresentam um comprimento de 7 a 40 aminoácidos.
57. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os referidos neoepítopos têm um comprimento de 15 a 30 aminoácidos.
58. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os referidos neoepítopos têm um comprimento de 25 a 30 aminoácidos, como 27 aminoácidos.
59. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a referida mutação é posicionado essencialmente no meio da sequência de neoepítopos.
60. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o referido indivíduo é um paciente com câncer.
61. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os neoepítopos, que são para o referido indivíduo, são usados em uma vacina contra câncer.
62. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que A é um número inteiro de 1 a 100, como de 5 a 50, como de 5 a 30.
63. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que A é um número inteiro de 10 a 20.
64. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que x>y.
65. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que x 2y.
66. 66. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que x > 2,5y.
67. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que A≥3.
68. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que pelo menos alguns dos A neoepítopos, como A/2 dos A neoepítopos, como entre A/2 e A dos A neoepítopos são capazes de induzir uma resposta de célula T CD8+.
69. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter uma pluralidade de neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos 3 epítopos mínimos, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação imunogênica em comparação a sequências de referência; b. Determinar a afinidade de ligação a MHC I e MHC II para cada um dos referidos neoepítopos, por meio disso identificando x neoepítopos de ligação a MHC I e y neoepítopo de ligação a MHC II, em que x + y ≥ 3; c. Selecionar neoepítopos preditos para se ligarem pelo menos a MHC I e opcionalmente a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; em que a classificação é realizada como se segue: i. Neoepítopos são classificados de acordo com o número de epítopos mínimos de ligação a MHC I e opcionalmente a MHC II que eles compreendem, onde um maior número dá uma maior classificação; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica.
70. O método de acordo com o item 69, em que o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I compreendidos em um neoepítopo é ponderado mais que o número de epítopos mínimos de ligação a MHC II compreendido no referido neoepítopo, como duas vezes mais.
71. O método de acordo com qualquer um dos itens 69 a 70, em que a etapa i. da etapa d é seguida pela etapa ii em que: ii. A pontuação de diferencial de ligação a MHC I e/ou MHC II do neoepítopo é determinada, em que o diferencial de ligação a MHC I é dado pela fórmula (pontuação %Rank (MHC I) para referência) / pontuação %Rank (MHC I) para neoepítopo) e o diferencial de ligação a MHC II é dado pela fórmula (pontuação %Rank (MHC II) para referência) / pontuação %Rank (MHC II) para neoepítopo); em que neoepítopos com um alto diferencial de ligação são classificados superiores aos neoepítopos com um menor diferencial de ligação.
72. O método de acordo com o item 70, em que os neoepítopos são classificados em uma ordem descendente como se segue: 1) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, o epítopo mínimo tem a maior pontuação; 2) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação para os epítopos mínimos de 1); 3) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 2); 4) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 3); 5) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 4); 6) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 5; 7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor pontuação.
73. O método de acordo com qualquer um dos itens 69 a 72, em que a etapa i. ou etapa ii. da etapa d é seguida pela etapa iii em que: iii. Os neoepítopos são classificados de acordo com sua pontuação %Rank, em que neoepítopos com uma baixa pontuação %Rank são classificados superiores aos neoepítopos com uma alta pontuação %Rank.
74. O método de acordo com o item 73, em que a pontuação %Rank de um neoepítopo é igual à menor pontuação %Rank do epítopos mínimos que ele compreende.
75. O método de acordo com qualquer um dos itens 73 a 74, em que um neoepítopo ou epítopo mínimo é predito ser: - um forte ligante a MHC se ele tiver uma pontuação %Rank (MHC I) ≤ 0,5; - um fraco ligante a MHC se 0,5 < pontuação %Rank (MHC I) ≤ 2; - um ligante não a MHC se ele tiver uma pontuação %Rank (MHC I) > 2;
76. O método de acordo com qualquer um dos itens 73 a 75, em que um neoepítopo ou epítopo mínimo é predito ser: - um forte ligante a MHC se ele tiver uma pontuação %Rank (MHC II) ≤ 2; - um fraco ligante a MHC se 2 < pontuação %Rank (MHC
II) ≤ 10; - um ligante não a MHC se ele tiver uma pontuação %Rank (MHC II) > 10.
77. O método de acordo com qualquer um dos itens 69 a 76, em que a etapa i., ii. ou iii. é seguida pela etapa iv, em que: iv. O neoepítopos são pontuados de acordo com sua pontuação de BLOSUM, em que uma baixa pontuação de BLOSUM dá uma maior classificação.
78. O método de acordo com qualquer um dos itens 69 a 77, em que os neoepítopos com uma pontuação de BLOSUM <3, com a pontuação de BLOSUM <2, com a pontuação de BLOSUM <1, com a pontuação de BLOSUM <0, são priorizados.
79. Um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, e determinar o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I para cada um dos referidos neoepítopos; c. Classificar os neoepítopos como se segue: i. priorizar neoepítopos compreendendo um alto número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I e selecionar um primeiro grupo de neoepítopos com uma alta pontuação; ii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do primeiro grupo de neoepítopos como se segue: 1) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, o epítopo mínimo tem a maior pontuação; 2) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação para os epítopos mínimos de 1);
3) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 2);
4) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 3);
5) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 4);
6) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 5);
7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor pontuação;
em que o diferencial de ligação a MHC I é dado pela fórmula (pontuação %Rank (MHC I) para referência) / pontuação %Rank (MHC I) para epítopo mínimo); e selecionar um segundo grupo de neoepítopos com uma alta pontuação;
iii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do segundo grupo com base na sua pontuação %Rank de MHC I e selecionar um terceiro grupo de neoepítopos com uma baixa pontuação %Rank de MHC I; iv. opcionalmente, selecionar um quarto grupo de neoepítopos do segundo ou o terceiro grupo incluindo epítopos mínimos com alta semelhança com epítopos conhecidos por ser reconhecidos por células T; v. priorizar neoepítopos do segundo grupo, do terceiro grupo ou do quarto grupo com base na sua pontuação de BLOSUM, em que uma pontuação de BLOSUM menor que um limiar predeterminado é classificado superior a uma pontuação de BLOSUM maior ou igual a o referido limiar, e selecionar um quinto grupo de neoepítopos com uma pontuação de BLOSUM menor que o referido limiar, em que o referido limiar preferencialmente é 1; em que os primeiro, segundo, terceiro, quarto ou quinto grupo de neoepítopos compreende os referidos A neoepítopos.
80. O método de acordo com o item 79, em que a etapa c compreende as etapas i. e ii., ou i. e iii., ou i. e iv., ou i. e v., ou i., ii. e iii., ou i., ii. e iv., ou i., iii. e iv., ou i., ii. e v., ou i., iii. e v., ou i., iv. e v., ou i., ii., iii. e iv., ou i., ii., iii. e v., ou i., ii., iv. e v., ou i., iii., iv. e v., ou i., ii., iii., iv. e v.
81. O método de acordo com qualquer um dos itens 79 a 80, em que o método compreende adicionalmente qualquer uma das características do método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 78.
82. Método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, e determinar o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I para cada um dos referidos neoepítopos;
c.
Classificar os neoepítopos como se segue:
i. priorizar neoepítopos compreendendo um alto número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I e selecionar um primeiro grupo de neoepítopos com uma alta pontuação;
ii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do primeiro grupo de neoepítopos como se segue:
1) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, o epítopo mínimo tem a maior pontuação;
2) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação para os epítopos mínimos de 1);
3) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 2);
4) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 3);
5) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 4);
6) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 5);
7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor pontuação;
em que o diferencial de ligação a MHC I é dado pela fórmula (pontuação %Rank (MHC I) para referência) / pontuação %Rank (MHC I) para epítopo mínimo); e selecionar um segundo grupo de neoepítopos com uma alta pontuação;
iii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do segundo grupo com base na sua pontuação %Rank de MHC I e selecionar um terceiro grupo de neoepítopos com uma baixa pontuação %Rank de MHC I;
iv. opcionalmente, selecionar um quarto grupo de neoepítopos do segundo ou o terceiro grupo incluindo epítopos mínimos com alta semelhança com epítopos conhecidos por ser reconhecidos por células T;
v. priorizar neoepítopos do segundo grupo, do terceiro grupo ou do quarto grupo com base na sua pontuação de BLOSUM, em que uma pontuação de BLOSUM menor que um limiar predeterminado é classificado superior a uma pontuação de BLOSUM maior ou igual ao referido limiar, e selecionar um quinto grupo de neoepítopos com uma pontuação de BLOSUM menor que o referido limiar, em que o referido limiar preferencialmente é 1;
vi. opcionalmente, selecionar neoepítopos dos primeiro, segundo, terceiro, quarto ou quinto grupo de neoepítopos com base nos neoepítopos sendo encontrados em duas ou mais amostras, e selecionar um sexto grupo de neoepítopos encontrado em duas ou mais amostras;
vii. opcionalmente, selecionar neoepítopos dos primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto ou sexto grupo de neoepítopos com base nos identificação da mutação por pelo menos dois diferentes chamadores de variante, e selecionar um sétimo grupo de neoepítopos compreendendo uma mutação identificada por pelo menos dois diferentes chamadores de variante,
em que os primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto ou sétimo grupo de neoepítopos compreende os referidos A neoepítopos.
83. O método de acordo com o item 82, em que a etapa c compreende as etapas i. e ii., ou i. e iii., ou i. e iv., ou i. e v., ou i. e vi., ou i. e vii., ou i., ii. e iii., ou i., ii. e iv., ou i., ii. e v., ou i., ii. e vi., ou i., ii. e vii., ou i., iii. e iv., ou i., iii. e v., ou i., iii. e vi., ou i., iii. e vii., ou i., iv. e v., ou i., iv. e vi., ou i., iv. e vii., ou i., v. e vi., ou i., v. e vii., ou i., vi. e vii., ou ii., iii. e iv., ou ii., iii. e v., ou ii., iii. e vi., ou ii., iii. e vii., ou ii., iv. e v., ou ii., iv. e vi., ou ii., iv. e vii., ou ii., v. e vi.. ou ii., v. e vii., ou ii., vi. e vii., ou iii., iv. e v., ou iii., iv. e vi., ou iii., iv. e vii., ou iii., v. e vi., ou iii., v. e vii., ou iii., vi. e vii., ou iv., v. e vi., ou iv., v. e vii., ou iv., vi. e vii., ou v., vi. e vii.
84. O método de acordo com qualquer um dos itens 82 a 83, em que o método compreende adicionalmente qualquer uma das características do método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 78.
85. Um método de preparar uma vacina contra câncer compreendendo neoepítopos, o referido método compreendendo uma etapa de selecionar os referidos neoepítopos usando o método de acordo com qualquer um dos itens 1-78 ou 79 a 84.
86. O método de acordo com o item 85, em que 10-20 neoepítopos são selecionados.
87. O método de acordo com qualquer um dos itens 85 a 86, em que a referida vacina contra câncer compreende um construto de nucleotídeo compreendendo: - uma unidade de direcionamento; - uma unidade de dimerização; - um primeiro ligante ; - uma unidade antigênica, em que a referida unidade antigênica compreende A-1 subunidades antigênicas, cada subunidade compreendendo uma sequência que codifica pelo menos um dos referidos neoepítopos e um segundo ligante e a referida unidade antigênica compreendendo adicionalmente uma sequência final que codifica um dos referidos neoepítopos, em que A é um número inteiro de 1 a 100,
preferencialmente A é um número inteiro de 3 a 50; em que o referido construto de nucleotídeo é aplicado à vacina contra câncer em uma quantidade imunologicamente eficaz.
88. O método de acordo com qualquer um dos itens 85 a 87, em que o segundo ligante é um ligante Serina-Glicina.
89. O método de acordo com qualquer um dos itens 85 a 88, em que a unidade de direcionamento tem afinidade para um receptor de quimiocina selecionado a partir de CCR1, CCR3 e CCR5.
90. O método de acordo com o item 89, em que a unidade de direcionamento compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80 % de identidade de sequência para os aminoácidos 5-70 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 (MIP1a).
91. Uma vacina contra câncer que pode ser obtida pelo método de acordo com qualquer um dos itens 85 a 90.
92. A vacina contra câncer de acordo com o item 91, em que a referida vacina contra câncer compreende um construto de nucleotídeo compreendendo: - uma unidade de direcionamento - uma unidade de dimerização - um primeiro ligante - uma unidade antigênica, em que a referida unidade antigênica compreende n-1 subunidades antigênicas, cada subunidade compreendendo uma sequência que codifica pelo menos um dos referidos neoepítopos e um segundo ligante e a referida unidade antigênica compreendendo adicionalmente um sequência final que codifica um dos referidos neoepítopos, em que n é um número inteiro de 1 a 100, como de 3 a 50.
em que o referido construto de nucleotídeo é aplicado à vacina contra câncer em uma quantidade imunologicamente eficaz.
93. A vacina contra câncer de acordo com qualquer um dos itens 91 a 92, em que o segundo ligante é um ligante Serina-Glicina.
94. A vacina contra câncer de acordo com qualquer um dos itens 91 a 93, em que a unidade de direcionamento tem afinidade para um receptor de quimiocina selecionado a partir de CCR1, CCR3 e CCR5.
95. A vacina contra câncer de acordo com qualquer um dos itens 91 a 94, em que a unidade de direcionamento compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80 % de identidade de sequência para os aminoácidos 5-70 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 (MIP1a).
96. Um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para cada um dos referidos neoepítopos; c. Selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, em que A é um número inteiro e A é pelo menos 3, como pelo menos 4, como pelo menos 5, selecionando assim A neoepítopos capazes de induzir uma resposta de célula T CD8+ quando administrados em uma quantidade imunologicamente ativa a um indivíduo.
97. O método de acordo com o item 96, em que o método compreende adicionalmente qualquer uma das características do método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 78.
98. Um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo que sofre ou é suspeito de sofrer de câncer, o referido método compreendendo as etapas de: a.
Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência, em que o epítopo mínimo consiste em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo e compreende a referida pelo menos uma mutação; em que preferencialmente obter os neoepítopos compreende a etapa de identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos que são específicas para o tumor;
b.
Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, opcionalmente em que a afinidade de ligação é determinada por predição in silico;
c.
Selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC;
d.
Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica;
e.
Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica, em que a etapa d compreende adicionalmente classificar os neoepítopos como se segue:
i) determinar se a mutação é em uma posição de ancoragem ou uma posição de não ancoragem do neoepítopo mínimo para cada epítopo mínimo compreendido no neoepítopo;
ii) priorizar os neoepítopos;
opcionalmente em que priorizar os neoepítopos na etapa ii) é realizada atribuindo a cada neoepítopo a maior pontuação dos epítopos mínimos que eles compreendem, e em que a priorização dos neoepítopos é realizada como se segue:
1) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, o epítopo mínimo tem a maior pontuação;
2) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação para os epítopos mínimos de 1);
3) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 2);
4) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 3);
5) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 4);
6) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 5);
7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor pontuação.
99. Um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo que sofre ou é suspeito de sofrer de câncer, o referido método compreendendo as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência, em que o epítopo mínimo consiste em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo e compreende a referida pelo menos uma mutação; em que preferencialmente obter os neoepítopos compreende a etapa de identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos que são específicas para o tumor; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, opcionalmente em que a afinidade de ligação é determinada por predição in silico; c. Selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica; em que a etapa d compreende classificar os neoepítopos com relação ao número de epítopos mínimos que eles compreendem, onde um maior número de epítopos mínimos dá uma maior classificação.
100. Um método para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo que sofre ou é suspeito de sofrer de câncer, o referido método compreendendo as etapas de:
a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência, em que o epítopo mínimo consiste em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo e compreende a referida pelo menos uma mutação; em que preferencialmente obter os neoepítopos compreende a etapa de identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos que são específicas para o tumor; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, opcionalmente em que a afinidade de ligação é determinada por predição in silico; c. Selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica, em que a etapa d compreende classificar os neoepítopos com relação ao número de amostras nas quais eles são encontrados, em que neoepítopos encontrados em um maior número de amostras são classificados superiores aos neoepítopos encontrados em um menor número de amostras, preferencialmente em que as amostras são amostras de diferentes lesões.
101. O método de acordo com qualquer um dos itens 99 a 100, em que o método compreende adicionalmente qualquer uma das características do método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 78.
Claims (44)
1. MÉTODO PARA SELECIONAR UM NÚMERO A DE
NEOEPÍTOPOS PARA UM INDIVÍDUO QUE SOFRE OU É SUSPEITO DE SOFRER DE CÂNCER, sendo o referido método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência, em que o epítopo mínimo consiste em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo e compreende a referida pelo menos uma mutação; em que preferencialmente obter os neoepítopos compreende a etapa de identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos que são específicas para o tumor; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, opcionalmente em que a afinidade de ligação é determinada por predição in silico; c. Selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação; selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de alguns ou todos os A neoepítopos se ligarem pelo menos a MHC I.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que A é um número inteiro de 1 a 100, como de 5 a 50, como de 5 a 30, como de 10 a 20, como 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa a compreender identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos em uma ou mais amostras derivadas do indivíduo em comparação a uma amostra de referência, preferencialmente em que uma ou mais amostras é uma amostra derivada de células tumorais do indivíduo.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de as mutações serem encontradas em pelo menos duas amostras derivadas de células tumorais do indivíduo.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de pelo menos um epítopo mínimo estar entre 1 e 50 epítopos mínimos, como entre 1 e 40 epítopos mínimos, como entre 1 e 30 epítopos mínimos, como entre 1 e 20 epítopos mínimos.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa c compreender selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC II.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa d compreender a etapa de determinar o número de epítopos mínimos de ligação a MHC I e/ou MHC II em cada um dos referidos neoepítopos, e em que um maior número de epítopos mínimos de ligação a MHC I e/ou MHC II é indicativo de uma maior probabilidade de utilidade clínica do neoepítopo.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa b ser realizada determinando a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para cada dos referidos epítopos mínimos, por meio disso identificando x epítopos mínimos de ligação ao MHC I e/ou y epítopos mínimos de ligação ao MHC II.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa d compreende a etapa de determinar uma pontuação de ligação para o neoepítopo, em que a pontuação de ligação é (a * 2x + b * y) em que a e b são fatores de ponderação, em que preferencialmente a = 0 se y = 0 e b = 0 se x = 0, em que a = 1 se y > 0 e b = 1 se x > 0, ou em que a pontuação de ligação é (um * x + b * y), em que preferencialmente a = 2 e b = 1, ou a = 0 se y = 0 e b = 0 se x = 0 e onde a = 1 se y > 0 e b = 1 se x > 0, e em que uma maior pontuação de ligação é indicativa de uma maior probabilidade de utilidade clínica do neoepítopo.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 e 10, caracterizado pelo fato de x > y, como x 2y, como x > 2,5y.
12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa d compreender determinar o número de epítopos mínimos compreendidos nos neoepítopos, e em que neoepítopos compreendendo um alto número de epítopos mínimos são classificados superiores aos neoepítopos compreendendo um menor número de epítopos mínimos, preferencialmente em que o epítopo mínimo é um epítopo mínimo de ligação a MHC I.
13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa d compreender adicionalmente a etapa de determinar o diferencial de ligação de neoepítopo de ligação a MHC I do MHC I da etapa c, em que o diferencial de ligação a MHC I é dado pela fórmula (pontuação %Rank (MHC I) para referência) / (pontuação %Rank (MHC I) para neoepítopo), em que neoepítopos com um alto diferencial de ligação a MHC I são classificados superiores aos neoepítopos com um menor diferencial de ligação a MHC I, e/ou em que neoepítopos que se ligam a MHC I são selecionados na etapa e apenas se a pluralidade de neoepítopos não compreender nenhum neoepítopo que se liga a MHC II.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de os neoepítopos encontrados em mais que uma amostra derivada de células tumorais serem classificados superiores aos neoepítopos encontrados em apenas uma amostra derivada de células tumorais.
15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de as mutações serem identificadas por pelo menos dois diferentes chamadores de variante.
16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa d compreender adicionalmente classificar os neoepítopos como se segue: i) determinar se a mutação está em uma posição de ancoragem ou uma posição de não ancoragem do neoepítopo mínimo para cada epítopo mínimo compreendido no neoepítopo; ii) priorizar os neoepítopos; opcionalmente em que a priorização dos neoepítopos na etapa ii) é realizada atribuindo a cada neoepítopo a maior pontuação do epítopos mínimos que eles compreendem, e em que a priorização dos neoepítopos é realizada como se segue: 1) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, o epítopo mínimo tem a maior pontuação; 2) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação para os epítopos mínimos de 1);
3) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 2); 4) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 3); 5) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 4); 6) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 5); 7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor pontuação.
17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa d compreender adicionalmente a etapa de priorizar os neoepítopos com relação a sua classificação de MHC I.
18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a pontuação %Rank (MHC I) de um neoepítopo compreendendo um ou mais epítopos mínimos preditos para se ligarem a MHC I ser igual à menor pontuação %Rank (MHC I) dos referidos um ou mais epítopos mínimos.
19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa e compreender selecionar neoepítopos com uma pontuação %Rank (MHC I) abaixo de 2,0, como abaixo de 1,5, como abaixo de 1, preferencialmente igual a ou abaixo de 0,5.
20. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de os neoepítopos de ligação a MHC I com uma pontuação %Rank (MHC I) acima de 2, serem excluídos ou infrapriorizados, e/ou em que neoepítopos de ligação a MHC I com uma pontuação %Rank (MHC I) acima de 10, como acima de 2, serem excluídos ou infrapriorizados.
21. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa d compreender adicionalmente a etapa de priorizar os neoepítopos com relação a sua classificação MHC II.
22. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a pontuação %Rank (MHC II) de um neoepítopo compreendendo um ou mais epítopos mínimos preditos para se ligarem a MHC II ser igual à menor pontuação %Rank (MHC II) dos referidos um ou mais epítopos mínimos.
23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa e compreender selecionar neoepítopos com uma pontuação %Rank (MHC II) abaixo de 10, como abaixo de 2.
24. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa d compreender adicionalmente a etapa de priorizar os neoepítopos com relação a sua pontuação de BLOSUM em uma ordem descendente, onde a pontuação de BLOSUM de um neoepítopo é igual à pontuação de BLOSUM do epítopo mínimo de melhor classificação que ele compreende, em que um epítopo mínimo com uma pontuação de BLOSUM < 1 é classificado superior a um epítopo mínimo com uma pontuação de BLOSUM ≥ 1.
25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a determinação dos níveis de expressão de RNA dos referidos neoepítopos, em que neoepítopos para os quais a expressão de RNA não é detectada são excluídos ou infrapriorizados e/ou em que neoepítopos com um alto nível de expressão de RNA são classificados superiores aos neoepítopos com um menor nível de expressão de RNA, preferencialmente em que os referidos níveis de expressão de RNA são determinados para neoepítopos de ligação a MHC I e/ou de ligação a MHC II.
26. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de os neoepítopos presentes em genes que apresentam pelo menos níveis de expressão de RNA 5 vezes mais altos em um dado órgão ou tecido em comparação a outros órgãos ou tecidos, serem excluídos ou infrapriorizados, em que o referido órgão é preferencialmente selecionado a partir de coração, cérebro, fígado, pulmões, estômago, rim, baço, cólon e intestino.
27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a etapa d compreender adicionalmente uma etapa de determinar a frequência de alelo de mutações presentes nos neoepítopos de ligação ao MHC, em que neoepítopos de ligação ao MHC com uma alta frequência de alelo são classificados acima de neoepítopos de ligação ao MHC com uma menor frequência de alelo.
28. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de os referidos neoepítopos apresentarem um comprimento de 7 a 40 aminoácidos, como de 15 a 30 aminoácidos, como de 25 a 30 aminoácidos, como 27 aminoácidos.
29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que os neoepítopos serem classificados em uma ordem descendente como se segue:
1) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, o epítopo mínimo tem a maior pontuação; 2) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação para os epítopos mínimos de 1); 3) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 2); 4) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 3); 5) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 4); 6) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 5; 7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor pontuação.
30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de o referido método compreender as etapas de: a. Obter uma pluralidade de neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos 3 epítopos mínimos, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação imunogênica em comparação a sequência de referências;
b. Determinar a afinidade de ligação a MHC I e MHC II para cada um dos referidos neoepítopos, por meio disso identificando x neoepítopos de ligação a MHC I e y neoepítopos de ligação a MHC II, em que x + y ≥ 3; c. Selecionar neoepítopos preditos para se ligarem a pelo menos a MHC I e opcionalmente a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC; d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; em que a classificação é realizada como se segue: i. Neoepítopos são classificados, de acordo com o número de epítopos mínimos de ligação a MHC I e opcionalmente a MHC II que eles compreendem, onde um maior número dá uma maior classificação; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, selecionando assim A neoepítopos que provavelmente têm utilidade clínica.
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de a etapa i. da etapa d ser seguida ou substituída por uma etapa de classificação dos neoepítopos, de acordo com sua clonalidade, onde uma maior clonalidade dá uma maior classificação.
32. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 ou 31, caracterizado pelo fato de a etapa i. da etapa d ser seguida ou substituída por uma etapa de classificar os neoepítopos, de acordo com o VAF da mutação que eles compreendem, onde uma maior VAF dá uma maior classificação.
33. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 32, caracterizado pelo fato de a etapa i. da etapa d ser seguida ou substituída por uma etapa de classificar os neoepítopos, de acordo com sua pontuação %Rank, em que neoepítopos com uma baixa pontuação %Rank são classificados superiores aos neoepítopos com uma alta pontuação %Rank.
34. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 33, caracterizado pelo fato de a etapa i. da etapa d ser seguida ou substituída por uma etapa de classificar neoepítopos, de acordo com o número de diferentes chamadores de variante que identificam a mutação que eles contêm, onde um maior número de diferentes chamadores de variante dá uma maior classificação.
35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 34, caracterizado pelo fato de a etapa i. da etapa d ser seguida ou substituída por uma etapa de classificar neoepítopos, de acordo com o número de amostras compreendendo os referidos neoepítopos, em que um maior número de amostras compreendendo os neoepítopos dá uma maior classificação.
36. MÉTODO para selecionar um número A de neoepítopos para um indivíduo, o referido método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência, em que o epítopo mínimo consiste em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo e compreende a referida pelo menos uma mutação; em que preferencialmente obter os neoepítopos compreende a etapa de identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos que são específicas para o tumor; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I para pelo menos um epítopo mínimo, como pelo menos dois, três ou quatro epítopos mínimos em cada um dos referidos neoepítopos, e determinar o número de epítopos mínimos de ligação ao MHC I para cada um dos referidos neoepítopos, opcionalmente em que a afinidade de ligação é determinada por predição in silico;
c.
Classificar os neoepítopos como se segue:
i. priorizar neoepítopos compreendendo um alto número de epítopos mínimos que se ligam a MHC I e/ou MHC II e selecionar um primeiro grupo de neoepítopos com uma alta pontuação;
ii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do primeiro grupo de neoepítopos como se segue:
1) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, o epítopo mínimo tem a maior pontuação;
2) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for maior ou igual a 20, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação para os epítopos mínimos de 1);
3) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 2);
4) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 20 e maior ou igual a 3, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 3);
5) se a mutação for em uma posição de ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 4);
6) se a mutação for em uma posição de não ancoragem e o diferencial de ligação do epítopo mínimo for menor que 3 e maior ou igual a 1, a pontuação do epítopo mínimo é menor que a pontuação dos epítopos mínimos de 5);
7) se o epítopo mínimo tiver uma mutação com um diferencial de ligação menor que 1, independentemente da posição da mutação, o epítopo mínimo tem a menor pontuação;
em que o diferencial de ligação a MHC I é dado pela fórmula (pontuação %Rank (MHC I) para referência) / pontuação %Rank (MHC I) para epítopo mínimo); e selecionar um segundo grupo de neoepítopos com uma alta pontuação;
iii. opcionalmente, priorizar neoepítopos do segundo grupo com base na sua pontuação %Rank de MHC I e selecionar um terceiro grupo de neoepítopos com uma baixa pontuação %Rank de MHC I;
iv. opcionalmente, selecionar um quarto grupo de neoepítopos incluindo epítopos mínimos com alta semelhança com epítopos conhecidos por ser reconhecidos por células T;
v. opcionalmente, priorizar neoepítopos do terceiro grupo ou do quarto grupo com base na sua pontuação de BLOSUM, em que uma pontuação de BLOSUM menor que um limiar predeterminado é classificado superior a uma pontuação de BLOSUM maior ou igual a o referido limiar, e selecionar um quinto grupo de neoepítopos com uma pontuação de BLOSUM menor que o referido limiar, em que o referido limiar preferencialmente é 1;
vi. opcionalmente, selecionar neoepítopos dos primeiro, segundo, terceiro, quarto ou quinto grupo de neoepítopos com base nos neoepítopos sendo encontrados em duas ou mais amostras, e selecionar um sexto grupo de neoepítopos encontrado em duas ou mais amostras;
vii. opcionalmente, selecionar neoepítopos dos primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto ou sexto grupo de neoepítopos com base na identificação da mutação por pelo menos dois diferentes chamadores de variante, e selecionar um sétimo grupo de neoepítopos compreendendo uma mutação identificada por pelo menos dois diferentes chamadores de variante;
em que os primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto ou sétimo grupo de neoepítopos compreende os referidos A neoepítopos.
37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de o indivíduo sofrer ou ser suspeito de sofre de câncer.
38. MÉTODO DE PREPARAR UMA VACINA CONTRA CÂNCER COMPREENDENDO NEOEPÍTOPOS, o referido método caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de selecionar os referidos neoepítopos usando o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 35 ou 36, opcionalmente em que a referida vacina contra câncer compreende um construto de nucleotídeo compreendendo: a. uma unidade de direcionamento; b. uma unidade de dimerização; c. um primeiro ligante; d. uma unidade antigênica, em que a referida unidade antigênica compreende A-1 subunidades antigênicas, cada subunidade compreendendo uma sequência que codifica pelo menos um dos referidos neoepítopos e um segundo ligante e a referida unidade antigênica compreendendo adicionalmente um sequência final que codifica um dos referidos neoepítopos, em que A é um número inteiro de 1 a 100, preferencialmente A é um número inteiro de 3 a 50; em que o referido construto de nucleotídeo é aplicado à vacina contra câncer em uma quantidade imunologicamente eficaz.
39. MÉTODO DE PREPARAR UMA VACINA CONTRA CÂNCER COMPREENDENDO NEOEPÍTOPOS, o referido método caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de selecionar os referidos neoepítopos usando o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 35 ou 36.
40. VACINA CONTRA CÂNCER, caracterizada pelo fato de poder ser obtida pelo método de acordo com a reivindicação 39, opcionalmente em que a referida vacina contra câncer compreende um construto de nucleotídeo compreendendo:
a. uma unidade de direcionamento; b. uma unidade de dimerização; c. um primeiro ligante; d. uma unidade antigênica, em que a referida unidade antigênica compreende n-1 subunidades antigênicas, cada subunidade compreendendo uma sequência que codifica pelo menos um dos referidos neoepítopos e um segundo ligante e a referida unidade antigênica compreendendo adicionalmente um sequência final que codifica um dos referidos neoepítopos, em que n é um número inteiro de 1 a 100, como de 3 a 50; em que o referido construto de nucleotídeo é aplicado à vacina contra câncer em uma quantidade imunologicamente eficaz.
41. MÉTODO PARA SELECIONAR UM NÚMERO A DE NEOEPÍTOPOS PARA UM INDIVÍDUO, o referido método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a. Obter um ou mais neoepítopos do referido indivíduo, cada neoepítopo compreendendo pelo menos um epítopo mínimo, em que cada neoepítopo compreende pelo menos uma mutação, como uma mutação imunogênica em comparação a uma sequência de referência, em que o epítopo mínimo consiste em um número de aminoácidos menor ou igual ao número de aminoácidos do neoepítopo e compreende a referida pelo menos uma mutação; em que preferencialmente obter os neoepítopos compreende a etapa de identificar mutações em sequências de ácidos nucleicos que são específicas para o tumor; b. Determinar a afinidade de ligação ao MHC I e/ou MHC II para cada um dos referidos neoepítopos, opcionalmente em que a afinidade de ligação é determinada por predição in silico; c. Selecionar neoepítopos compreendendo pelo menos um epítopo mínimo predito para se ligar a MHC I e/ou a MHC II, obtendo assim neoepítopos de ligação ao MHC;
d. Classificar os neoepítopos de ligação ao MHC com relação à sua probabilidade de utilidade clínica; e. Selecionar A neoepítopos entre os neoepítopos de ligação ao MHC de maior classificação, em que A é um número inteiro e A é pelo menos 3, como pelo menos 4, como pelo menos 5, selecionando assim A neoepítopos capazes de induzir uma resposta de célula T CD8+ quando administrados em uma quantidade imunologicamente ativa a um indivíduo.
42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de as etapas a, b, c, d e/ou e serem como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 36.
43. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 ou 42, caracterizado pelo fato de os neoepítopos, o epítopo mínimo e/ou os A neoepítopos serem como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 36.
44. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 41 a 43, caracterizado pelo fato de o indivíduo sofrer ou ser suspeito de sofrer de câncer.
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Owner name: NYKODE THERAPEUTICS AS (NO) |
|
| B06W | Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette] |