CN110268263A - 人体皮肤老化的新生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性老化迹象的体外方法、美容方法以及鉴定能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质的方法。本发明进一步涉及一种包括捕获配体的试剂盒，以及所述试剂盒在皮肤样本中用于确定本发明上下文中鉴定的皮肤老化标志物的表达水平的用途。

Description

人体皮肤老化的新生物标志物
技术领域
本发明涉及一种用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性老化迹象的体外方法、美容治疗方法以及鉴定能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质的方法。本发明进一步涉及一种包括捕获配体的试剂盒，以及所述试剂盒在皮肤样本中用于确定本发明上下文中鉴定的皮肤老化标志物的表达水平的用途。
背景技术
在过去两个世纪中，发达国家的预期寿命大大增加，如果这种趋势持续到21世纪，那么自2000年以来在这些国家出生的大多数婴儿将达到100岁。此外，预计到2030年，全球八分之一的人口将达到65岁或以上，全球人口老龄化将带来一些社会、经济和医疗方面的挑战(Christensen等人，2009，Lancet 374,1196-1208)。
老化是受多种遗传和环境因素影响的复杂过程，其特征在于多种生理功能的逐渐下降。与其他器官一样，皮肤会受到老化的影响，而这种老化可能会由于紫外线辐射等环境因素而加速。在未暴露于阳光的皮肤中观察到内在皮肤老化(也称为时间性老化)，并且其反映了整个生物体的老化过程(Makrantonaki等人，2007，Exp.Gerontol.42,879-886)。因此，与内部器官或组织相比，皮肤是一种有趣的替代途径，可以破译内在的老化过程。皮肤经历多种形态和生理变化，伴随内在老化，如细纹形成、表皮和真皮变薄、易损性和脆弱性增加、干燥、失去弹性、屏障功能受损等等(Zouboulis和Makrantonaki,2011,Clin.Dermatol.29,3-14)。内在老化的潜在机制是多重的：细胞衰老和增殖能力下降；端粒缩短；DNA损伤增加和DNA修复过程减少；线粒体和基因组DNA突变；激素下降和氧化应激(Poljsak等人,2012,Acta Dermatovenerol.Alp.Pannonica Adriat.21,33-36)(Makrantonaki和Zouboulis,2007,Dermatol.Basel Switz.214,352-360)。
皮肤老化是一个复杂的过程，我们已经做了很多努力来更好地了解皮肤老化的生物学，并找出有助于诊断、预防和治疗皮肤老化和相关病理的新的和特定的目标。在过去十年中，一些转录组研究已经研究了老化对几种生物体模型和人类中基因表达的影响(Zahn等人,2007,PLoS Genet.3,e201)(Zahn和Kim,2007,Curr.Opin.Biotechnol.18,355-359)。
关于皮肤老化，仅针对人类进行了四项研究。第一项研究表明，在老年人和年轻人类男性皮肤中不同表达的基因参与各种细胞过程，如代谢、信号转导、细胞凋亡、转录调节(Lener等人,2006,Exp.Gerontol.41,387-397)。最近，一项研究比较了两种性别的未暴露于阳光的皮肤的基因表达谱在老化方面的差异。在两种性别中存在显著不同的老化反应，通常只有39种基因失调，其中4种在两种性别中以相反的方式受到调节。从这些结果来看，WNT信号通路已成为两性中老化的主要下调通路(Makrantonaki等人,2012,PLoS ONE 7)。最近鉴定了根据人表皮中的年龄状态的75个差异表达的基因(Raddatz等人,2013,Epigenetics Chromatin 6,36)。通路分析显示这些基因主要参与细胞迁移、癌症、皮肤病和细胞增殖。参与表皮发育的基因也显著富集，并观察到角质形成细胞分化的整体下调。
蛋白质是细胞的主力和许多细胞过程的主要效应物。基于定量质谱的蛋白质组学已经证明其可用于描述蛋白质动力学，以便破译复杂过程并描述细胞的正常状态和病理状态。那些最近的技术进步，特别是在质谱分析中，已经允许对蛋白质组进行大规模的调查。这些研究改变了对蛋白质表达调节的一般理解，并证明基因转录物的浓度(如mRNA浓度)不一定反映相应蛋白质的浓度和活性。
相对较少的研究中使用蛋白质组学研究皮肤老化，它们都使用了双向凝胶电泳方法，这导致蛋白质组的覆盖率较低。结果，仅鉴定了少数失调的蛋白质，而无凝胶方法可提供老化的蛋白质组学特征(Laimer等人,201,Exp.Dermatol.19,912-918)(Delattre等人,2012,Exp.Dermatol.21,205-210)(Gromov等人,2003)。
皮肤由几个细胞层组成，之前的研究已经研究了整个皮肤或角质层样本中的蛋白质表达水平。但是不同的细胞层可以表现得非常不同并且对老化表现出不同的反应。角质形成细胞是表皮的主要成分，表皮是皮肤最浅表和易接近的层。专注于角质形成细胞的培养有助于深入了解皮肤老化并接近表皮的增殖区。
本发明的发明人研究了源自从年轻和年老白人女性获得的未暴露于阳光的皮肤的人原代角质形成细胞中蛋白质表达谱的变化。考虑到激素是影响老化的一个主要因素，选择年龄类别使得年轻女性的循环激素处于较高水平，而年老女性处于最低水平。
本发明的发明人使用年轻和年老原代人角质形成细胞的定量蛋白质组学方法鉴定了58种表达显著失调的蛋白质，这些蛋白质是用作内在皮肤老化的推定候选生物标志物。
特别地，本发明的发明人将蛋白质TUBB3、HMGA2和HMGN1鉴定为特别适合的生物标志物，以鉴定呈现生理性老化迹象的皮肤。
发明内容
本发明的发明人鉴定了58种蛋白质，其在较老的皮肤中与较年轻的皮肤中显著差异表达(pValue<0.05)。
从这58种生物标志物中，40种随着老化被下调，18种随着老化而上调，如定量蛋白质组学所鉴定的。使用来自其他受试者的皮肤样本通过Western印迹分析进一步证实了这些标志物TUBB3和HMGA2中的两种的诊断价值。
因此，本发明涉及一种用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象的体外方法，其包括以下步骤：
a)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，以及由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)确定皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象。
本发明还涉及一种能够减少或逆转受试者的生理性皮肤老化的可见迹象的美容治疗方法，其包括以下步骤：
a)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，以及由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)根据在步骤a)中确定的该第一蛋白质的表达水平和该至少一种其它蛋白质的表达水平推断该皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象；以及
c)如果该皮肤被确定为呈现生理性老化的迹象，则利用美容组合物治疗该受试者，该美容组合物减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象。
本发明还涉及一种鉴定能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质的方法，其包括以下步骤：
a)利用候选物质处理皮肤样本；
b)在步骤a)的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，以及由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
c)将该第一蛋白质和该至少一种其它蛋白质的表达水平与未利用该候选物质处理的皮肤样本中的该第一蛋白质和该至少一种其它蛋白质的表达水平进行比较；以及
d)将该候选物质鉴定为减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质。
本发明还涉及一种试剂盒，其包括：
-至少一种捕获配体，其用于确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平；和
-至少一种捕获配体，其用于确定由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2*、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平。
本发明还涉及如上文所定义的试剂盒在用于确定皮肤样本中以下蛋白质的表达水平的用途，由选自TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的一种第一蛋白质，以及由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质。
具体实施方式
在本发明的上下文中，“老化”是指老化的皮肤效应，并且在本文中称为“皮肤老化”。
“皮肤老化”也称为“生理性皮肤老化”，临床上可描述为具有诸如皱纹、雀斑、不均匀肤色和松弛皮肤等特征的皮肤。除遗传基因特征外，还有许多其他因素可以改变老化过程，如荷尔蒙状态和气候、工作、社会和文化条件。本领域技术人员将理解，老化对皮肤的影响受内在和外在因素的影响。与其他器官类似，由于分子损伤的累积，人类皮肤经历渐进的功能衰退。氧化应激和分子损伤皆导致内在老化(也称为时间性老化)和环境因素导致的老化(也称为外在老化)。因此，与年轻的皮肤相比，老化的皮肤或“较年老的皮肤”表现出许多差异，并且由于随时间发生的结构和生理变化而对皮肤病具有显著易感性。
本领域技术人员将进一步理解，除了时间性老化和外在老化之外，皮肤病的发生可以诱导皮肤的生理性老化，并且可以称为“皮肤病导致的皮肤老化”。
因此，在本发明的上下文中使用的“皮肤老化”或“生理性皮肤老化”指的是时间性老化、外在老化和/或由于皮肤病导致的老化，优选时间性老化和/或外在老化。
在一个具体实施方式中，皮肤老化是由皮肤病导致的皮肤老化。
“时间性老化”或“内在老化”反映了个体的遗传背景，并随着时间的推移而发生。内在老化的皮肤通常是光滑且无瑕疵的。仅按时间性老化，老年人会呈现皮肤薄、皱纹细、脂肪萎缩、软组织再分布和骨重建。本领域技术人员已知，有色人种表现出较不严重的内在面部老化，其迹象比较浅的皮肤类型晚呈现十年。
“外在老化”涉及与个人习惯相关的环境暴露、健康和生活方式，例如日光暴露、烟草使用、饮食和锻炼，因此包括例如光老化。累积日晒是皮肤衰老中最重要的外在因素。在一些皮肤类型中，色素沉着异常是光老化最常见的特征之一。光老化的常见临床症状包括斑点、皱纹、毛细血管扩张、黑斑和弹性丧失。本领域技术人员已知，有色皮肤不太容易受到阳光诱导的损伤，因此这些老化的临床表现不太严重，并且通常比年龄匹配的白种对应案例晚10至20年。其他外在因素，如吸烟、过量饮酒和营养不良，也可能导致皮肤老化。
可能诱导皮肤生理性衰老的“皮肤病”的非限制性示例是例如特应性皮炎、脂溢性角膜炎、大疱性表皮松解症、牛皮癣、红斑狼疮的皮肤变异、皮肌炎、硬皮病、慢性痤疮、慢性脂肪团、瘙痒症和糖尿病和早衰老化疾病中的疤痕形成异常或缺陷。
“早衰老化疾病”在本文中是指以皮肤过早衰老为特征的疾病，包括但不限于：Hutchinson-Gilford Progeria综合征(HGPS)、非典型早衰综合征(APS)、下颌骨末端发育不良症(MAD)、沃纳综合征(WS)、布卢姆综合征(BS)、Rothmund-Thomson综合征(RTS)、Cockayne综合征(CS)、着色性干皮病(XP)、硫营养不良(TTD)、范科尼贫血(FA)、共济失调毛细血管扩张症(AT)和先天性角化不良症(DC)。
根据上述“皮肤老化的迹象”包括但不限于所有外观明显和触觉可感知的表现以及由于皮肤老化引起的任何其他宏观或微观效果。这些迹象可能来自过程，包括但不限于纹理不连续的发展，如皱纹和粗糙的深纹、细纹、皮肤纹、线纹、肿块、毛孔粗大(例如，与附属结构，例如汗腺导管、皮脂腺或毛囊有关)、或不均匀或粗糙、皮肤弹性丧失(功能性皮肤弹性蛋白的丧失和/或失活)、下垂(包括眼部和下颚的浮肿)、皮肤紧致度丧失、皮肤紧绷度丧失、变形后皮肤回弹的丧失、变色(包括黑眼圈)、脓斑、肤色灰黄、色素沉着过度的皮肤区域，如老年斑和雀斑、角化病、异常分化、角化过度、弹性组织变性、胶原蛋白分解，和角质层、真皮、表皮、皮肤血管系统(如毛细血管扩张或蜘蛛血管)和下层组织(如脂肪和/或肌肉)，特别是那些亲皮肤的其他组织学变化；
“皮肤”是最大的人体器官，占总体重的约六分之一。皮肤在人体生理学中起着复杂的作用：作为环境的屏障，由一些腺体(皮脂腺)产生的皮脂具有抗感染特性。皮肤作为与外界交流的通道，保护我们免受水分流失、摩擦伤和冲击伤的伤害，并使用专门的色素细胞来保护我们免受阳光的紫外线伤害。当皮肤暴露在阳光下时，皮肤会在表皮层中产生维生素D。.皮肤有助于通过汗腺调节体温，并有助于调节新陈代谢。皮肤由三个功能层组成：表皮、真皮(或真皮组织)和皮下组织(或下皮)。因此，在一个实施方式中，皮肤是指表皮、真皮和皮下组织，优选指表皮和真皮，更优选指表皮。
因此，在本发明的上下文中提到的“皮肤样本”优选包括表皮，真皮和皮下组织，优选表皮和真皮，更优选表皮。
如本文所用的“表皮”是指皮肤的外层，并且被分成五个层，其包括：角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层。角质层含有多个死亡的无核角质形成细胞层，其基本上充满了角蛋白。即使在健康的皮肤中，角质层的最外层也不断脱落。透明层含有2至3个无核细胞层。颗粒层含有2至4个细胞层，这些细胞层通过含有角质透明颗粒的桥粒结合在一起。棘层包含8至10个适度活跃的分裂细胞层，它们也通过桥粒结合在一起。基底层包含单个柱状细胞层，其通过有丝分裂主动分裂并提供预定通过上表皮层迁移至角质层的细胞。因此，表皮的主要细胞类型是角质形成细胞。这些细胞在基底层中形成，并通过表皮层存在于颗粒层中，在该颗粒层中它们转化成称为角质细胞或形成角质层的小球的细胞。在这个转化过程中，细胞核被消化，细胞质消失，脂质被释放到细胞间隙中，角蛋白中间细丝聚集形成微纤维，并且细胞膜被由交联蛋白质制成的细胞被膜所取代，其中脂质与其表面共价连接。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括获得皮肤样本的步骤0)。
在一个实施方式中，本发明上下文中的皮肤样本包括皮肤细胞。因此，本发明上下文中的皮肤样本也可称为皮肤样本细胞。
在一个实施方式中，皮肤样本细胞是角质形成细胞，优选原代角质形成细胞。
因此，在一个实施方式中，本发明上下文中的皮肤样本包含角质形成细胞，优选原代角质形成细胞。
获得皮肤样本的方法通常是本领域技术人员已知的。在一个示例中，通常使用重建的皮肤，特别是3D重建的皮肤或皮肤活体组织切片来获得皮肤样本，然后分离和培养包含在该皮肤样本中的皮肤细胞，然后分离和培养原代角质形成细胞。
在一个示例中，在乳腺整形手术后获得通常受保护的、未暴露于阳光下的皮肤的皮肤活体组织切片，并且在补充有25μg/mL BPE和0.9ng/mL EGF的KSFM培养基中培养人原代角质形成细胞。
在一个实施方式中，皮肤样本衍生自受保护的未暴露的皮肤。
在一个实施方式中，本发明的方法包括在确定蛋白质表达水平之前制备皮肤样本的另一个步骤。该制备通常在本发明的上下文中涉及蛋白质提取。
因此，在一个实施方式中，在确定本发明方法的上下文中的蛋白质表达水平之前，从皮肤样本，优选皮肤样本细胞中提取蛋白质。
因此，在一个实施方式中，皮肤样本是指该皮肤样本的蛋白质提取物，优选皮肤样本细胞的蛋白质提取物。
在一个示例中，通常将皮肤样本的皮肤细胞的冷冻颗粒在含有例如40mM HEPESPH 7.4、100mM NaCl、1mM EDTA、0.02％Triton、0.02％脱氧胆酸钠、0.2mM TCEP和来自罗氏(Roche)的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(PhosSTOP)的溶液中在例如4℃下裂解30分钟。通常，通过在冰上进行短暂的超声处理来实现裂解，并且例如通过在4℃下以14,000rpm离心20分钟来清除裂解物。
“角质形成细胞”是表皮(即皮肤的最外层)中的主要细胞类型，占那里发现的细胞的90％。可以通过本领域技术人员已知的方法分离角质形成细胞用于进一步分析。
因此，在一个示例中，皮肤样本包含至少50％的角质形成细胞，例如60％、65％、70％、75％、80％、85％的角质形成细胞。
“原代角质成型细胞”在本文中是指来自人类皮肤样本的分离的角质形成细胞。
通常使用的术语“生物标志物”是指单独或共同反映生物系统的当前或预测未来状态的任何生物分子(基因、蛋白质、脂质、代谢物)。蛋白质作为生物标志物具有以下优点：它们通常具有比m-RNA更长的半衰期，并且因此它们的浓度在给定时间段内更稳定。如本文所用，下文“本发明的方法”部分中列出的不同蛋白质被鉴定为生理标志物，其是生理性皮肤老化的指示物。在本发明的上下文中鉴定的生物标志物的非限制性示例是由基因TUBB3、HMGA2和/或HMGN1编码的蛋白质。以下在本发明方法的上下文中进一步描述本发明的生物标志物。
本文使用的“基因”可以是包含转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(例如内含子，5'-和3'-非翻译序列)的基因组基因。基因的编码区可以是编码氨基酸序列或功能性RNA，例如长和短非编码RNA(例如：tRNA、rRNA、催化性RNA和miRNA)的核苷酸序列。基因也可以是对应于编码区的mRNA或cDNA(例如，外显子和miRNA)，其任选地包含与其连接的5'-或3'-非翻译序列。基因也可以是扩增的或合成的核酸分子，其包含与其连接的全部或部分编码区和/或5'-或3'-非翻译序列。
受试者
在本发明的上下文中，“受试者”是指动物，优选非人类或人类哺乳动物。非人类哺乳动物的示例包括啮齿动物和灵长类动物。最优选地，受试者是人类。
“人类”可以进一步分为不同的种族。人类的三大种族是白种人，包括雅利安人、哈米特人、闪米特人；蒙古族人种，包括蒙古族北部人、中国人和印度支那人、日本人和韩国人、西藏人、马来人、波利尼西亚人、毛利人、密克罗尼西亚人、爱斯基摩人、美洲印第安人；黑人种族包括，例如，非洲人、霍屯督人、美拉尼西亚人/巴布亚人、“矮小黑人”、澳大利亚土着人、德拉威人、僧伽罗人。
如本领域技术人员所知，如上文所定义的老化的皮肤效应受内在和外在因素的影响，并且通常基于种族起源而变化，给出了潜在的结构和功能差异。
因此，在一个实施方式中，人类是白种人、蒙古人或黑人，优选白种人。
因此，在一个优选实施方式中，受试者是白种人
术语“白种人”通常用于指欧洲、北非和西南亚血统的个体的身体属性的组合。
这组“白种人受试者”包括轻度色素沉着的皮肤的那类人，其特征在于少量聚集的黑素体以及少量的黑色素。降低的表皮黑色素成分使得白种人比其他人群更容易发生光老化的早期迹象。与西班牙裔和东亚人相比，具有低组成性色素沉着的欧美人表现出相当高的烧灼反应和较低的晒黑能力。另外，白种人皮肤的例子是角质层较薄且粘性较低、皮肤伸展性降低，以及随着年龄的增加胶原的丧失和真皮中弹性纤维的解体。这些属性导致临床上脆弱的皮肤并促成老化过程。
激素是老化的一个因素，激素的数量和类型在相同年龄范围的男性和女性个体之间是不同的。
因此，在一个实施方式中，本文中的人类指男性或女性，优选女性。
因此，在一个实施方式中，受试者是女性。
在一个实施方式中，受试者的年龄为18至95岁，优选32至80岁，例如45至80岁，更优选45至80岁。
本发明的方法
本发明上下文中的“至少一种其它蛋白质”是指一种其它蛋白质、另两种其它蛋白质、三种其它蛋白质、四种其它蛋白质、五种其它蛋白质、六种其它蛋白质、七种其它蛋白质、八种其它蛋白质、九种其它蛋白质或者十种其它蛋白质，优选一种其它蛋白质、两种其它蛋白质、三种其它蛋白质、四种其它蛋白质。
本发明上下文中的至少一种其它蛋白质由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码。
在本发明的上下文中使用的这58种生物标记的氨基酸序列可以从UniProtKB数据库获得，其登记号如下文所列并且可在2016年1月15日登记。
在一个优选的实施方式中，该至少一种其它蛋白质选自TUBB3、HMGA2或HMGN1。在一个相关的实施方式中，该“至少一种其它蛋白质”在本文中是指一种其它蛋白质或两种其它蛋白质。
因此，在一个实施方式中，本发明上下文中的第一蛋白质由TUBB3编码，并且至少一种其它蛋白质由HMGA2或HMGN1编码。
在另一个实施方式中，本发明上下文中的第一蛋白质由TUBB3编码，并且两种至少一种其它蛋白质由HMGA2和HMGN1编码。
因此，在另一个实施方式中，本发明上下文中的第一蛋白质由HMGA2编码，并且至少一种其它蛋白质由TUBB3或HMGN1编码。
因此，在另一个实施方式中，本发明上下文中的第一蛋白质由HMGN1编码，并且至少一种其它蛋白质由TUBB3或HMGA2编码。
本领域技术人员将理解，在本发明的上下文中，当第一蛋白质由TUBB3编码时，至少一种其它蛋白质由选自不包括TUBB3的基因列表的基因所编码，即至少一种其它蛋白质由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码。
类似地，当第一蛋白质由HMGA2编码时，至少一种其它蛋白质由选自不包括HMGA2的基因列表的基因所编码，即至少一种其它蛋白质由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码。
此外，当第一蛋白质由HMGN1编码时，至少一种其它蛋白质由选自不包括HMGN1的基因列表的基因所编码，即至少一种其它蛋白质由选自由HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码。
“表达水平”在本文中是指基因产物的蛋白质水平，并且可以称为价值。
如本文所用，术语“确定”包括定性和/或定量检测(即检测和/或测量表达水平)，在参考或不参考对照或预定的表达水平的情况下。
如本文所用，“检测”是指确定生物标志物，即由上文定义的基因所编码的蛋白质是否存在或不存在于生物样本中，并且“测量”是指确定该生物标志物的量，即在皮肤样本中由如上所定义的基因所编码的蛋白质的量。
第一蛋白质或至少一种其它蛋白质的表达水平可以通过使用能够结合目的蛋白质的任何捕获配体的免疫学方法检测本发明方法中定义的基因的翻译产物(即，蛋白质)来确定。捕获配体可以选自抗体、适体和特异性识别目标氨基酸序列的多肽，通常捕获配体是多克隆或单克隆抗体。因此，合适的免疫学方法包括：免疫组织化学(IHC)、酶联免疫确定(ELISA)、夹心，直接，间接或竞争性ELISA确定、酶联免疫确定(ELIspot)、放射免疫确定(RIA)、流式细胞术确定(FACS)、Western印迹、荧光共振能量转移(FRET)确定、使用例如抗体、抗体片段、受体配体或与由本发明的上下文中定义的基因所编码的蛋白质结合的其他试剂的蛋白质芯片确定。
在一些实施方式中，表达水平还可以使用生物物理化学方法(如质谱法)来确定。
如本领域技术人员已知的，可以在合适的免疫学方法中使用的抗体是可商购的。
例如，TUBB3编码的第一蛋白质的表达水平可以使用合适的免疫学方法(如Western印迹法)，利用可从Thermofisher或Invitrogen购得的β-3微管蛋白抗体(2G10)MA1-118来确定。
例如，HMGA2编码的第一蛋白质的表达水平可以使用合适的免疫学方法(如Western印迹法)，利用例如可从Invitrogen购得的HMGA2抗体PA5-25276来确定。
例如，HMGN1编码的第一蛋白质的表达水平可以使用合适的免疫学方法(如Western印迹法)，利用例如可从Abcam购得的HMGN1抗体ab5212来确定。
在一个实施方式中，使用酶联免疫确定(ELISA)或蛋白质印迹法来确定第一蛋白质和至少一种其它蛋白质的表达水平。
本领域技术人员将理解，由特定基因所编码的第一蛋白质的表达水平以及由本文特定基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平是指由该基因所编码的所有亚型。
本领域技术人员将进一步理解，在本发明方法的步骤a)或b)中的皮肤样本中确定的第一蛋白质和至少一种其它蛋白质的量取决于所用皮肤样本中所含细胞的量、质量和代表性。
因此，在一个实施方式中，本领域技术人员将理解，步骤a)中第一蛋白质和至少一种其它蛋白质的表达水平通常是指标准化的表达水平。
这里的“标准化”是指以这样的方式缩放数据，即：可以对例如针对不同样本获得的不同数据集进行比较。在一个示例中，可以根据在该样本中测量的蛋白质的总量进行标准化。然而，标准化也可以通过本领域技术人员已知的其他方法执行，例如根据由所谓的参考基因或管家基因所编码的蛋白质的量执行。
因此，在一个实施方式案中，在本发明的上下文中提及的“表达水平”是标准化的表达水平。
在一个实施方式中，根据皮肤样本中确定的蛋白质总量对表达水平进行标准化。
确定蛋白质总量的方法是本领域技术人员已知的。在一个示例中，使用BCA蛋白质确定试剂盒(Thermo Fisher Scientific，IL，美国)确定皮肤样本的蛋白质总量。
本发明上下文中的皮肤样本如上文“定义”部分中所定义。
本发明的方法进一步包括以下步骤：将该第一蛋白质的表达水平与参照水平进行比较并将该至少一种其它蛋白质的表达水平与参照水平进行比较。
在一个实施方式中，本发明上下文中的“参照表达水平”是指受试者，优选较年轻受试者，更优选年轻受试者的皮肤样本中由相同基因所编码的蛋白质的参照表达水平。
优选地，参照表达水平在从同一皮肤区域获得的皮肤样本中测量，并且通过与本发明方法的步骤a)的受试者的皮肤样本相同的方法获得。
在一个示例中，那些参照表达水平是预定的参照表达水平，并且可以是特定值或范围。
参照表达水平可以是任何数量的统计学度量，以区分例如指示较年轻皮肤，优选年轻皮肤的特定基因的表达水平。
因此，在一些实施方式中，参照表达水平是从受试者，优选来自较年轻受试者，更优选来自年轻受试者的皮肤样本中的特定基因的蛋白质表达水平。
因此，在一些实施方式中，参照表达水平是从受试者，优选较年轻受试者，更优选年轻受试者或受试者群体，优选较年轻受试者群体，更优选年轻受试者群体获得的皮肤样本中特定基因的中值蛋白质表达水平。
在一个实施方式中，参照表达水平是根据受试者工作特性(ROC)曲线确定的阈值。
在一个实施方式中，可以使用至少2、4、10、30、50或100个样本来确定参照表达水平，该样本优选来自不同的受试者。
在一个实施方式中，可以使用至少两个样本来确定参照表达水平，该样本优选来自不同的受试者。
术语“较年轻”、“年轻”、“年老”和“较年老”在本文中指的是实际年龄。例如，“较年轻”是指参考样本的与实施本发明方法的受试者(即确定受试者的皮肤是否呈现生理性老化的迹象的受试者)的实际年龄相比得出的受试者的实际年龄。
如上文所定义的“皮肤老化”通常以实际年龄32开始，而不考虑加速老化的外在老化因素。
因此，在一个实施方式中，本文的“年轻”是指18至32岁，优选小于32岁，更优选小于30岁。
在一个实施方式中，本文中的“年老”是指40至65岁或更高的年龄，优选超过40岁，超过45岁，超过50岁，超过55岁，更优选超过65岁。
本领域技术人员将理解，当将表达水平与参照表达水平进行比较时，该表达水平高于或低于参照表达水平。优选地，当在本发明的上下文中蛋白质的表达水平高于参照表达水平时，其水平显著高于参照表达水平。优选地，当在本发明的上下文中蛋白质的表达水平低于参照表达水平时，其水平显著低于参照表达水平。
“显著”在本文中是指统计学上的显著。
在一个实施方式中，p<0.05的值被认为是统计学上的显著。
在一个实施方式中，通过使用比率将第一蛋白质的表达水平和至少一种其它蛋白质的表达水平与其参照表达水平进行比较，其中如果没有另外定义，本发明方法的步骤a)或b)中测量的表达水平除以参照表达水平。
因此，在一个实施方式中，当本发明的上下文中的表达比率高于1时，表达的比率显著高于1，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.3、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4。
本领域技术人员将进一步理解，表达比率高于1表示蛋白质与参照表达水平相比上调(过表达)，其中通过将该蛋白质表达水平除以同一蛋白质的参照表达水平来获得该比率。
在相关实施方式中，当本发明上下文中的表达比率小于1时，表达比率显著低于1，例如0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1。
本领域技术人员将进一步理解，表达比率小于1表示蛋白质与参照表达水平相比下调，其中通过将该蛋白质表达水平除以同一蛋白质的参照表达水平来获得该比率。
确定受试者的皮肤是否呈现生理性皮肤老化迹象的方法
在一个实施方式中，用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性皮肤老化迹象的体外方法进一步包括以下步骤：将该第一蛋白质的表达水平与参照水平进行比较并将该至少一种其它蛋白质的表达水平与参照水平进行比较。
因此，在一个实施方式中，用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象的体外方法包括以下步骤：
a)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，和由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)将该第一蛋白质的表达水平与参照水平进行比较并将该至少一种其它蛋白质的表达水平与参照水平进行比较；和
c)确定皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象。
参照水平如上文“本发明的方法”部分中所定义。
在一个特定实施方式中，通过将步骤a)中获得的该第一蛋白质的表达水平除以参照表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率，在步骤b)中将该第一蛋白质的表达水平与参照水平进行比较，以及
通过将步骤a)中获得的该至少一种其它蛋白质的表达水平除以参照表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率，在步骤b)中将该至少一种其它蛋白质的表达水平与参照水平进行比较。
在一个实施方式中，将该第一蛋白质的表达水平与该第一蛋白质的参照水平进行比较，并将该至少一种其它蛋白质的表达水平与该至少一种其它蛋白质的参照水平进行比较。
因此，在一个优选实施方式中，该第一蛋白质和该至少一种其它蛋白质的表达水平通过以下方式与该参照表达水平进行比较：通过将步骤a)中获得的该第一蛋白质的表达水平除以该第一蛋白质的参照表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率和通过将步骤a)中获得的该至少一种其它蛋白质的表达水平除以该至少一种其它蛋白质的参照表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率。
因此，在另一个实施方式中，本发明涉及一种体外方法，用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象，包括以下步骤：
a)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，和由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)通过将步骤a)中获得的该第一蛋白质的表达水平除以该第一蛋白质的参照表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率和通过将步骤a)中获得的该至少一种其它蛋白质的表达水平除以该至少一种其它蛋白质的参照表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率；和
c)确定皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象。
在一个实施方式中，当步骤b)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于或低于1时，并且
当步骤b)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率高于或低于1时，该受试者的皮肤呈现老化迹象。
在一个另外的实施方式中，当步骤b)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质表达比率高于1时，或者
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率小于1时，或者
当步骤b)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质表达比率高于1时，或者
当步骤b)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率小于1时，该受试者的皮肤呈现老化的迹象。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种体外方法，用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象，包括以下步骤：
a)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，和由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)通过将步骤a)中获得的该第一蛋白质的表达水平除以该第一蛋白质的参照表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率和通过将步骤a)中获得的该至少一种其它蛋白质的表达水平除以该至少一种其它蛋白质的参照表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率；和
c)确定皮肤是否呈现生理性皮肤老化迹象，其中
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质表达比率高于1时，或者
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率小于1时，或者
当步骤b)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质表达比率高于1时，或者
当步骤b)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率小于1时，该受试者的皮肤呈现老化迹象。
在一个实施方式中，当步骤b中确定的选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的组的至少一种其它蛋白质的比率高于1.4时，该受试者的皮肤呈现生理性老化的迹象。
在另一个实施方式中，当步骤b中确定的选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的组的至少一种蛋白质的比率小于0.7时，该受试者的皮肤呈现生理性老化的迹象。
美容治疗方法
本发明还涉及如上文“发明内容”部分中所定义的美容治疗方法。
本文的美容治疗是指能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的治疗。如上所述，皮肤老化指的是诸如皱纹、雀斑、肤色不均匀和皮肤松弛等特征，这些特征可能受到内在因素的影响(例如时间性老化)和外在因素(例如环境因素)，或者是由于皮肤疾病。
如本领域技术人员已知的，没有明显老化迹象的光滑皮肤可被认为是美丽的。因此，在一个实施方式中，执行减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象以改善人的外貌。因此，在一个实施方式中，本发明涉及为了改善人的外貌而进行的“美容治疗”，因此是非治疗性的。
如上所述，皮肤的生理性老化也可以由上文在“定义”部分中定义的皮肤病诱导，并且可以称为“皮肤疾病导致的皮肤老化”，在这种情况下，可以例如由皮肤科医生开出美容治疗方法。
因此，在一个特定实施方式中，生理性皮肤老化是皮肤病衍生的皮肤老化。
在一个实施方式中，美容治疗方法和如上文所定义的用途进一步包括以下步骤：将该第一蛋白质的表达水平与参照水平进行比较并将该至少一种其它蛋白质的表达水平与参照水平进行比较，如在上文“用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性皮肤老化迹象的方法”部分中所定义的。
参照水平如上文“本发明的方法”部分中所定义。
因此，在一个实施方式中，本发明还涉及一种美容治疗方法，其能够减少或逆转受试者的生理性皮肤老化的可见迹象，包括以下步骤：
a)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，和由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)将该第一蛋白质的表达水平与参照水平进行比较，并将该至少一种其它蛋白质的表达水平与参照水平进行比较；
c)从步骤b)中的比较推断出皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象；和
d)如果该皮肤被确定为呈现生理性老化的迹象，则用美容组合物治疗该受试者，该美容组合物减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象。
“减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的美容组合物”是指本领域技术人员已知的可以减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的任何组合物，例如包含抗氧化剂和/或视黄醇的组合物和它们的衍生物，例如Gancevicuiene R.等人在2012年的所描述的(Dermatoendocrinol.2012年7月1日；4(3):308-19)。
“抗氧化剂”包括但不限于诸如维生素C、白藜芦醇和多酚的抗氧化剂。
“视黄醇”(即本领域技术人员熟知的“维生素A”)用于胶原的生物合成和MMP1(胶原酶1)的表达的降低，因此对外在和内在皮肤老化具有积极作用。
例如，“视黄醇的衍生物”为维甲酸。
步骤b)中的“将该第一蛋白质的表达水平与参照水平进行比较，并将该至少一种其它蛋白质的表达水平与参照水平进行比较”和“参照表达水平”如上文所定义。
在一个特定实施方式中，通过将步骤a)中获得的该第一蛋白质的表达水平除以参照表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率，在步骤b)中将该第一蛋白质的表达水平与参照水平进行比较，以及
通过将步骤a)中获得的该至少一种其它蛋白质的表达水平除以参照表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率，在步骤b)中将该至少一种其它蛋白质的表达水平与参照水平进行比较。
在一个实施方式中，将该第一蛋白质的表达水平与该第一蛋白质的参照水平进行比较，并将该至少一种其它蛋白质的表达水平与该至少一种其它蛋白质的参照水平进行比较。
因此，在一个实施方式中，本发明还涉及一种美容治疗方法，其能够减少或逆转受试者的生理性皮肤老化的可见迹象，包括以下步骤：
a)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，和由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)通过将步骤a)中获得的该第一蛋白质的表达水平除以该第一蛋白质的参照表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率和通过将步骤a)中获得的该至少一种其它蛋白质的表达水平除以该至少一种其它蛋白质的参照表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率；和
c)从步骤b)中的比较推断出皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象；和
d)如果该皮肤被确定为呈现生理性老化的迹象，则用美容组合物治疗该受试者，该美容组合物减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象。
限定该受试者的皮肤何时呈现老化迹象的实施方式如上文“用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性皮肤老化迹象的方法”部分中所定义，并经必要的变更后应用于美容治疗方法。
以上所述，在一个实施方式中，本发明还涉及一种美容治疗方法，其能够减少或逆转受试者的生理性皮肤老化的可见迹象，包括以下步骤：
a)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，和由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)通过将步骤a)中获得的该第一蛋白质的表达水平除以该第一蛋白质的参照表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率和通过将步骤a)中获得的该至少一种其它蛋白质的表达水平除以该至少一种其它蛋白质的参照表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率；和
c)从步骤b)中的比较推断出皮肤是否呈现生理性皮肤老化的迹象，其中
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，优选TUBB3的基因组成的组的基因所编码的第一蛋白质的比率高于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1、ASQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的比率高于1时，或者
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，优选TUBB3的基因组成的组的基因所编码的第一蛋白质的比率高于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的比率小于1时，或者
当步骤b)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质表达比率高于1时，或者
当步骤b)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1时，以及
当步骤b)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率小于1时，皮肤呈现生理性皮肤老化的迹象，和
d)如果该皮肤被确定为呈现生理性老化的迹象，则用美容组合物治疗该受试者，该美容组合物减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象。
在一个实施方式中，当步骤b中确定的选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的组的至少一种其它蛋白质的比率高于1.4时，该受试者的皮肤呈现生理性老化的迹象。
在另一个实施方式中，如果步骤b)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、 SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的组中的至少一种蛋白质的比率小于0.7时，该受试者的皮肤呈现生理性老化的迹象。
识别物质的方法
发明人证实，在老化时，与较年轻皮肤中相同蛋白质的表达相比，不同蛋白质的表达发生变化并且上调/下调。
因此，与较年轻的皮肤相比，能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质能够重新校准蛋白质表达的这些差异或减少这些蛋白质中的一些蛋白质的上调/下调。
本文步骤a)中的撚“用候选物质处理皮肤样本”是指例如使皮肤样本，优选皮肤样本细胞与候选物质接触1分钟至48小时，优选1至30小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、6至24小时、7至24小时、8至24小时、8至12小时，例如2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、24小时。
本领域技术人员知道，将皮肤样本，优选皮肤样本细胞与候选物质接触的时间取决于诸如候选物质的浓度和皮肤样本，特别是皮肤样本细胞的培养条件的因素。
在一个实施方式中，使皮肤样本与候选物质接触至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少40分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时。
“确定该皮肤样本的表达水平”在本文的步骤b)中是指例如在将皮肤样本与候选物质接触至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少14小时、至少18小时、至少24小时后确定如上文所定义的表达水平。
本领域技术人员将理解，“在将皮肤样本与候选物质接触后”中的“后”一词是指皮肤样本和物质接触的时间点。例如，如果在将皮肤样本与候选物质接触8小时后确定表达，并且使物质与细胞接触6小时，则在步骤b)中确定表达是在步骤a)的接触6小时后的2小时。
本领域技术人员将理解，优选地，在步骤a)之前，用候选物质处理的步骤a)的皮肤样本和未用候选物质处理的步骤c)的皮肤样本是相同的。本文中“相同”是指通常通过一次活组织检查获得的皮肤样本，其中样本和其中包含的细胞已经历相同的处理，包括最终冷冻样本并最终经历细胞分离和细胞培养。通常，在本发明方法的步骤a)之前，将皮肤样本，特别是皮肤样本细胞分成两部分。
本领域技术人员将进一步理解，优选地，在鉴定物质的方法的上下文中的皮肤样本是重建的皮肤，优选3D重建的皮肤。
在一个实施方式中，利用候选物质处理的步骤a)的皮肤样本和未用候选物质处理的步骤c)的皮肤样本进一步暴露于诱导皮肤老化的环境中。
在相关实施方式中，鉴定候选物质的方法进一步包括步骤a2)：将皮肤样本暴露于诱导皮肤老化的环境中。在同一实施方式中，未用该候选物质处理的皮肤样本暴露于诱导皮肤老化的相同环境中作为步骤a)的皮肤样本。
“皮肤老化的环境”在本文中是指例如对氧化应激诱导剂、促炎细胞因子、污染物和UV辐射，更特别是UV-A辐射的暴露。
“促炎细胞因子”是本领域技术人员已知的，包括但不限于IL1β和TNF。
“生理性皮肤老化的可见迹象”如上文所定义。
在一个特定实施方式中，步骤b)中确定的该第一蛋白质和该至少一种其它蛋白质的表达水平与在步骤c)中未利用该候选物质处理的皮肤样本中该第一蛋白质和该至少一种其它蛋白质的表达水平进行通过以下方式进行比较：将未利用步骤c)中的候选物质处理的皮肤样本中确定的第一蛋白质的表达水平除以步骤b)中获得的第一蛋白质的表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率，以及通过将步骤c)中获得的至少一种其它蛋白质的表达水平除以步骤b)中获得的表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种鉴定能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质的方法，包括以下步骤：
a)用候选物质处理皮肤样本；
b)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，和由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
c)通过将未经处理的皮肤样本中确定的该第一蛋白质的表达水平除以步骤b)中获得的该第一蛋白质的表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率，和通过将未经处理的皮肤样本中确定的该至少一种其它蛋白质的表达水平除以步骤b)中获得的该至少一种其它蛋白质的表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率；
d)将该候选物质鉴定为减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质。
在一个实施方式中，如果步骤c)中确定的由选自TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3的基因组成的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于或低于1时，以及
当步骤c)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率高于或低于1时，在步骤d)中物质被鉴定为能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象。
在另一个实施方式中，如果步骤d)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，优选TUBB3的基因组成的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于1，以及
步骤c)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质表达比率高于1，或者
步骤c)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，优选TUBB3的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于1，以及
步骤c)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率小于1，或者
步骤c)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1，以及
步骤c)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质表达比率高于1，或者
步骤c)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1，以及
步骤c)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率小于1，则在步骤d)中物质被鉴定为能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种鉴定能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质的方法，包括以下步骤：
a)用候选物质处理皮肤样本；
b)在该受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平，和由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
c)通过将未经处理的皮肤样本中确定的该第一蛋白质的表达水平除以步骤b)中获得的该第一蛋白质的表达水平来确定该第一蛋白质的表达比率，和通过将未经处理的皮肤样本中确定的该至少一种其它蛋白质的表达水平除以步骤b)中获得的该至少一种其它蛋白质的表达水平来确定该至少一种其它蛋白质的表达比率；
d)如果步骤c)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，优选TUBB3的基因组成的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于1，以及
步骤c)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质表达比率高于1，或者
步骤c)中确定的由选自由TUBB3和HMGA2，优选TUBB3的基因组成的组的基因所编码的第一蛋白质的表达比率高于1，以及
步骤c)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率小于1，或者
步骤c)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1，以及
步骤c)中确定的由选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质表达比率高于1，或者
步骤c)中确定的由HMGN1基因所编码的第一蛋白质的比率小于1，以及
步骤c)中确定的由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达比率小于1，则将该候选物质识别为减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质。
在另一个实施方式中，当步骤b)中确定的选自由TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的至少一种其它蛋白质的比率高于1.4时，在步骤d)中物质被鉴定为能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象。
在另一个实施方式中，如果步骤c)中确定的选自由HMGN1、HIST1、H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的组的至少一种蛋白质的比率小于0.7，则在步骤d)中物质被鉴定为能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象。
试剂盒
“捕获配体”是指能够结合由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1、优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的配体，或能够结合由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的配体。
因此，捕获配体特异性结合由上文提及的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列。“特异性结合由上文列出的基因之一编码的蛋白质的氨基酸序列”意指通常特异性结合该氨基酸序列的表位。
优选地，捕获配体选自由抗体、适体和多肽组成的组，其特异性识别由上文列出的基因之一编码的蛋白质的氨基酸序列。
在该上下文中，术语“抗体”是指任何多克隆或单克隆抗体。
片段scFv、Fab、Fab'、F(ab')2以及骆驼科动物单链抗体是抗体片段的示例，其特异性识别由上文列出的基因之一编码的蛋白质的氨基酸序列。
“适体”是本领域技术人员所熟知的。适体是核苷酸，特别是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的化合物，或能够特异性结合靶标，特别是蛋白质靶标的肽种类。特别地，描述了核苷酸种类的适体及其产生(Ellington等人(1990)Nature 346:818-22and Bock等人(1992)Nature 355:564-6)。特别地，描述了肽种类的适体及其产生(Hoppe-Seyler等人(2000)J.Mol Med.78:426-30)。
配体也可以通过化学合成或通过基因工程获得。
在一个优选的实施方式中，捕获配体是抗体。
针对由上文列出的基因之一编码的蛋白质的氨基酸序列的抗体是可商购的。
例如，针对由TUBB3编码的蛋白质的抗体是可从Thermofisher或Invitrogen购得的β-3微管蛋白抗体(2G10)MA1-118。
例如，针对由HMGA2编码的蛋白质的抗体是例如可从Invitrogen购得的HMGA2抗体PA5-25276。
例如，针对由HMGN1编码的蛋白质的抗体是例如可从Abeam购得的HMGN1抗体ab5212。
本发明上下文中的“至少一种捕获配体”是指一种捕获配体、两种捕获配体、三种捕获配体、四种捕获配体、五种捕获配体、六种其他捕获配体、七种捕获配体、八种捕获配体、九种捕获配体或十种捕获配体，优选一种捕获配体、两种捕获配体、三种捕获配体、四种捕获配体。
“至少一种其它蛋白质”如上文所定义。
在一个特定实施方式中，试剂盒包含：
-至少一种捕获配体，用于确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1，优选TUBB3和HMGA2，更优选TUBB3组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平；和
-至少一种捕获配体，用于确定由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平。
在一些特定实施方式中，试剂盒包含：
-至少一种捕获配体，用于确定由TUBB3编码的一种其它蛋白质的表达水平，和
-至少一种捕获配体，用于确定由HMGA2编码的一种其它蛋白质的表达水平，和/或
-至少一种捕获配体，用于确定由HMGN1编码的一种其它蛋白质的表达水平。
在一个实施方式中，捕获配体固定在固相上。
作为固相的非限制性示例，可以使用微孔板，特别是聚苯乙烯微孔板，例如丹麦Nunc出售的微孔板。固体颗粒或珠子、顺磁珠子，例如由Dynal，Merck-Eurolab(法国)(商标为EstaporTM)和Polymer Laboratories生产的那些，或者甚至聚苯乙烯或聚丙烯试管、玻璃、塑料或硅芯片等也可以使用。
在一个实施方式中，这些试剂盒可另外包含其他组分，例如，试剂和/或说明书。
在整个本申请中，术语“和/或”是语法连接词，其被解释为包含其连接的一个或多个案例可能发生。例如，在短语“确定”中的“定性和/或定量检测”中一词包括“定性和/或定量检测”，其表示该术语“确定”可以是指定性检测或定量检测，或定性检测和定量检测。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数引用，例如所指的多个对象，除非内容另有明确说明。
在整个本申请中，术语“包括”应被解释为包含所有具体提到的特征以及可选的、附加的、未指定的特征。如本文所用，术语“包括”的使用还公开了其中不存在除特别提及的特征之外的特征(即“由......组成”)的实施方式。
现在将参考以下实施方式更详细地描述本发明。本文引用的所有文献和专利文献均通过引用并入本文。虽然已经在前面的描述中详细说明和描述了本发明，但是这些实施方式应被认为是说明性或示例性的而非限制性的。
附图
图1：使用可从Thermofisher或Invitrogen购得的β-3微管蛋白抗体(2G10)MA1-118，利用蛋白质印迹分析确定老年人和年轻人个体中的TUBB3表达。A)使用β-3微管蛋白抗体(2G10)MA1-118的老年人和年轻个体中TUBB3表达的蛋白质印迹；B)在SDS页面上可视化的总蛋白质含量；C)显示由TUBB3编码的蛋白质的标准化量的图表。根据总蛋白质浓度进行标准化。
图2：使用可从Thermofisher或Invitrogen购得的β-3微管蛋白抗体(2G10)MA1-118，利用蛋白质印迹分析确定老年人和年轻个体中的TUBB3表达。D)显示年轻和老年患者中β-3微管蛋白的标准化量的图表。E)相应的受试者工作特性(ROC)曲线(GraphPad Prism版本7.00for Windows，La Jolla California美国，www.graphpad.com)，曲线下面积(AUC)为0.9048。
图3：使用HMGA2抗体PA5-25276，利用蛋白质印迹分析确定老年人和年轻人个体中的HMGA2表达。A)使用HMGA2抗体PA5-25276在老年人和年轻人个体中HMGA2表达的蛋白质印迹；B)在SDS页面上可视化的总蛋白质含量；C)显示由HMGA2编码的蛋白质的标准化量的图表。使用总蛋白质浓度进行标准化。
图4：通过使用HMGA2抗体PA5-25276，利用蛋白质印迹分析确定老年人和年轻人个体中的HMGA2表达。D)显示年轻和老年患者中HMGA2的标准化量的图表。E)相应的受试者工作特性(ROC)曲线(GraphPad Prism版本7.00for Windows，La Jolla California美国，www.graphpad.com)，曲线下面积(AUC)为0.8776。
图5：A)相应的受试者工作特性(ROC)曲线(GraphPad Prism版本7.00forWindows，La Jolla California USA，www.graphpad.com)，对应于年轻和老年患者中β-微管蛋白的表达，曲线下面积(AUC)为0.806。B)对应于年轻和老年患者中β-微管蛋白的表达的受试者工作特性(ROC)曲线(GraphPad Prism版本7.00for Windows，La JollaCalifornia美国，www.graphpad.com)，曲线下面积(AUC)为0.939。C)对应于年轻和老年患者中HMGN1的表达的受试者工作特性(ROC)曲线(GraphPad Prism版本7.00for Windows，LaJolla California美国，www.graphpad.com)，曲线下面积(AUC)为0.592。
图6：对应于β-微管蛋白、HMGA2和HMGN1表达的组合的受试者工作特性(ROC)曲线(GraphPad Prism版本7.00for Windows，La Jolla California USA，www.graphpad.com)，曲线下面积(AUC)为1。模型方程式如下：预测＝83.76-(992.91ⅹβ-微管蛋白)-(4936.61xHMGA2)+(273.40x HMGB1)
示例
示例1
1.材料与方法
1.1细胞培养
原代角质形成细胞的分离和培养：在健康人的书面同意后，在乳腺整形手术后获得皮肤活体组织切片。捐赠者为欧洲高加索女性，年龄分别为60岁和65岁(人数为2人)，和27岁和32岁(人数为2人)分为两个年龄组，分别为老年人和年轻人设计(来自Codecoh的协议编号DC-2008-444)(Conservation D'Elements du Corps Humain))。皮肤活体组织切片是受保护的不暴露于阳光的皮肤。在补充有25μg/mL BPE和0.9ng/mL EGF的KSFM培养基中培养人原代角质形成细胞。
1.2蛋白质提取
将冷冻细胞颗粒在含有40mM HEPES PH 7.4、100mM NaCl、1mM EDTA、0.02％Triton、0.02％脱氧胆酸钠、0.2mM TCEP和来自罗氏(Roche)的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(PhosSTOP)的溶液中在4℃下裂解30分钟。通过在冰上进行短暂的超声处理来实现裂解，并且通过在4℃以14,000rpm离心20分钟来清除裂解物。使用BCA蛋白质确定试剂盒(ThermoFisher Scientific，IL，美国)确定蛋白质提取物的浓度。
1.3蛋白质消化和iTRAQ标记
根据制造商的说明书(iTRAQ Reagents 8plex Applications kit；AB Sciex，Framingham，MA，USA)，用8-plex组中的iTRAQ试剂标记蛋白质样本。简而言之，合并从源自年轻供体的细胞获得的等量蛋白质提取物，以达到总共100μg。对来自老年供体的细胞应用相同的程序。将样本在20mM TCEP(三-(2-羧乙基)膦)中在37℃下还原1小时，在室温下用10mM MMTS(甲基甲硫基磺酸盐)将半胱氨酸残基阻断10分钟，然后用胰蛋白酶(Promega)以1：10(胰蛋白：酶蛋白)的比例在37℃下消化过夜。每种肽溶液用一种iTRAQ试剂标记：针对年轻人采用m/z 113.1iTRAQ报告离子和针对老年人采用m/z 117.1iTRAQ报告离子。对所有反应验证iTRAQ标记，并将样本以1：1的比例合并，并在OFFGEL肽分级分离之前通过真空离心干燥。
1.4肽OFFGEL等电聚焦
根据制造商的说明书，使用3100OFFGEL Fractionator和OFFGEL Kit线性pH 3-10(Agilent Technology)在24孔装置中进行根据其pI的肽分级分离。通过使用24厘米长的IPG凝胶条带设置该装置用于24个级分分离，线性pH梯度范围为3-10。通过真空离心干燥iTRAQ标记的肽混合物，并重新悬浮在聚焦OFFGEL缓冲液中，然后加载到24个孔中的每个孔中。以50μA的恒定电流聚焦肽直至达到50kVh。在完全分级分离后，从每个孔中回收肽样本，在真空浓缩器中干燥，然后使用C18ZipTips(Millipore，MA，美国)脱盐。
1.5反相纳米液相色谱
在由Chromeleon v.6.80软件(Dionex/Thermo Scientific/LC Packings，Amsterdam，荷兰)控制的Ultimate 3000C18反相纳米液相色谱(RP-nanoLC)系统(Ultimate3000，Dionex/Thermo Scientific)上进行进一步的肽分离，并且与由μΟπβΓ2.0软件(Dionex/Thermo Scientific/LC Packings，Amsterdam，荷兰)控制的PROBOT MALDI点样装置偶联。
将真空干燥的级分重悬浮于缓冲液A(98％水、2％ACN和0.05％TFA)中，然后在2％ACN和0.05％TFA中以20μL/min的流速注射在纳米捕获柱(C18,3μm，孔径；LC填料)5分钟。然后，通过反相色谱法(Acclaim PepMap300 75μm，15cm，nanoViper C18,3μm，孔径；Thermo Scientific)，利用二元梯度的缓冲液A(2％ACN和0.05％TFA)和缓冲液B(80％ACN和0.04％TFA)以0.3μL/min的流速分离捕获的肽。整个运行持续60分钟，nanoLC梯度设置如下：5-35分钟，8-42％B；35-40分钟，42-58％B；40-50分钟，58-90％B和50-60分钟，90％B。收集洗脱溶液的级分并在MALDI样本板(AB Sciex，Les Ulis，法国)上以每15秒一个点的频率点样。将α-氰基-4-羟基-肉桂酸基质(HCCA，在70％ACN和0.1％TFA中2mg/mL)以0.9μL/min的流速连续加入到柱流出物中，因此，在每个点中整合MALDI样本板。
1.6MALDI-TOF/TOF分析
使用由4000系列探索者软件v.3.5控制的4800MALDI-TOF/TOF分析仪(AB Sciex，Les Ulis，法国)进行nanoLC-离线斑点肽样本的MS和MS/MS分析。质谱仪以正反射器模式操作。使用肽校准用标准II(Bruker Daltonics，不来梅港市，德国)对每个光谱进行外部校准，并将肽质量耐受性设定为50ppm。MS光谱在m/z 700-4000范围内获得。选择每个斑点位置多达30个最强离子，其特征在于S/N(信号/噪声)比率高于40，用于MS/MS分析。通过使用CID(碰撞诱导解离)激活模式将选择的离子片段化，以获得确定这些肽的序列并量化它们所必需的相应MS/MS谱。
1.7iTRAQ数据分析
MS和MS/MS谱用于通过使用ParagonTM算法(AB Sciex，Les Ulis，France)和Mascot的ProteinPilotTM软件v 4.0进行鉴定和相对定量。使用UniProtKB发布2015_06-2015年6月/Swiss-Prot(European Bioinformatics Institute，Hinxton，英国)的人类数据库进行分析。关于ProteinPilot搜索，搜索工作设置为“整个ID”并且应用了1％的错误发现率分析(FDR)。为了定量，应用偏差和背景校正，并且仅包括具有至少1个肽的95％肽置信水平的定量蛋白质。对于Mascot搜索，FDR设定低于1％，仅考虑得分高于30的肽。在ProteinPilot和Mascot分析后，数据在肽水平下合并。为了获得高质量的定量分析，本发明人用R包Isobar分析了数据(Breitwieser等人，2011，J.Proteome Res.10,2758-2766)，其实现了蛋白质/肽调节的统计学显著性的确定。使用正常拟合，然后仅根据年龄将具有pValueRatio和pValueSample<0.05的比例的蛋白质视为显著差异表达。对于我们的定量iTRAQ结果的输出，所有蛋白质比率均针对年轻人(117：113)进行表达以显示相对蛋白质定量比率。应用于质量数据分析的参数的总结在下面的表1中给出。
表1应用于生物信息学分析的参数的总结
1.8基因本体论和途径分析
使用PANTHER(http://www.pantherdb.org/)通过输入失调蛋白质列表进行基因本体论和途径分析(Mi等人，2013，Nucleic Acids Res.41，D377-D386)，并且针对PANTHER家族；蛋白质类；GO-Slim分子功能、生物进程和细胞成分以及途径(数据未显示)将蛋白质分为一类或几类。
1.9蛋白质印迹分析
从8名年轻人的皮肤活体组织切片(年龄：18；21；24；26；27(2个供体)；30；32)和10名老年供体(57；59；60；62(2个供体)；65(2个供体)；66；68；71)中收获和培养人原代角质形成细胞。在早期传代(2代或3代，当细胞仍在增殖时)时，通过在含有蛋白酶抑制剂(Complete Mini蛋白酶抑制剂混合物，Roche，瑞士)、1mM DTT和100μMPMSF的RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich)中涡旋裂解细胞。然后将样本以14,000rpm离心15分钟并收集上清液。用MicroBC Assay(Interchim)确定蛋白质浓度，并将20μg总蛋白质加载到TGX Stain-FreeTMFastCastTM 12％丙烯酰胺凝胶(Biorad)上。使用Trans-TurboTM转移系统(Bio Rad)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用含有5％脱脂乳的TBS-Tween 0.5％阻断膜。将一抗在以下稀释度下在含有5％脱脂乳的TBS-Tween 0.5％中于4℃孵育过夜：对于Tubulinβ-3链抗体(MA1-118；Thermoscientific)稀释度为1/1000，并且对于Cornifin-B抗体(PA5-26062；Thermoscientific)为1/1000。在TBS-Tween 0.5％中洗涤后，将膜与HRP缀合的第二抗体(Amersham ECL抗小鼠和抗兔IgG HRP连接的完整抗体，GE Healthcare)在室温下孵育1小时。然后将膜在TBS-Tween 0.5％中洗涤，并在Molecular Imager Gel Doc XR+和Chemidoc XRS+Systems(Biorad)上获得印迹图像。用Image LAb 2.0软件(Biorad)将特异性检测的条带定量，并用总蛋白质含量将相应的强度标准化并表示为比率。
通过箱形图说明TUBB3和HMGA2的Western印迹结果，并且通过使用GraphPadPrism版本7.00for Windows(GraphPad软件，La Jolla California美国，www.graphpad.com)创建受试者工作特性曲线(ROC曲线)。
2.结果
2.1通过蛋白质组学分析鉴定根据年龄状态差异表达的58种蛋白质
为了获得年老和年轻供体来源的角质形成细胞的定量蛋白质组图谱，如前所述使用iTRAQ标记结合OFFGEL分级分离和离线nanoLC/MS/MS(Martin-Bernabe等人，2014，J.Proteome Res.13,4695-470)。使用ProteinPilot和Mascot进行的生物信息学分析使用1％FDR鉴定了517种独特蛋白质，并且仅考虑具有至少1种置信水平≥95％且评分>30的肽的蛋白质。用Isobar包进行统计学分析并定量446种蛋白质。老年人细胞用iTRAQ m/z 117标签标记并且年轻人细胞用iTRAQ m/z 113标签标记。因此，比率117：113(老年人：年轻人)表示老年人和年轻人细胞样本之间的相对蛋白质丰度。已鉴定的蛋白质的完整列表，包括UniProtKB登录号、ID、蛋白质和基因名称、肽计数、光谱计数、序列覆盖率、iTRAQ比率和p值比率以及老年人与年轻人细胞的p值样本在补充数据中提供(数据未显示)。
当p值比和p值样本均<0.05时，认为蛋白质表达显著不同。应用这些标准，根据年龄状况鉴定出显著差异表达的58种蛋白质。在58中蛋白质中，40个被下调，18个通过老化上调(表2和表3)。
表2在老年人细胞与年轻人细胞中显著下调的蛋白质列表(iTRAQ比率为117/113)。下调的蛋白质的统计学上显著的iTRAQ比率(p值比和p值样本<0.05)
表3:在老年人细胞与年轻人细胞中显著上调的蛋白质列表(iTRAQ比率为117/113)。上调的蛋白质的统计学上显著的iTRAQ比率(p值比和p值样本<0.05)
2.2基因本体分析
使用PANTHER分析先前鉴定的58种蛋白质(Mi等人，2013，Nucleic Acids Res.41，D377-D386)并将其分为以下基因本体和PANTHER类别：蛋白质家族；蛋白质类；分子功能；生物进程；细胞成分和途径(数据未显示)。主要代表的生物进程类别是代谢(30％)、细胞进程(21％)、细胞成分组织和生物调节(10％)、定位和发育进程(8％)、对刺激的反应(4％)、多细胞有机体进程和免疫系统进程(3％)和生物粘附(1％)。关于蛋白质类别、失调的蛋白质属于以下主要蛋白质类别：核酸结合(25％)、细胞骨架蛋白(13％)、酶调节剂(12％)、氧化还原酶和信号分子(8％)、伴侣蛋白(6％)、转移酶和转录因子(4％)、细胞外基质蛋白、水解酶、载体蛋白、膜交通蛋白、细胞连接蛋白、激酶、异构酶和受体(2％)(图示未显示)。
2.3候选蛋白的Western印迹分析验证了蛋白质组学分析
通过western印迹在来自相同供体以及其他10个供体的人原代角质形成细胞上进行两种目的候选蛋白的进一步分析，以验证更多供体的蛋白质组学结果以排除个体间变异性。通过蛋白质组学实验获得所选蛋白质的相应比例：微管蛋白β-3链(TBB3_HUMAN)比例为2.6和高迁移率族蛋白HMGI-C(HMGA2_HUMAN)比例为0.52。Western印迹图像和定量结果分别显示在图2和4中。
3.讨论
皮肤老化是一个复杂的过程，具有多因素来源，可以使用定量蛋白质组学等新技术方法进行破译。进行iTRAQ-MALDI-TOF/TOF MS和MS/MS分析以鉴定和量化来自年轻和老年供体的人原代角质形成细胞蛋白质组的变化。鉴定了517种蛋白质，包括主要存在于角质形成细胞中的蛋白质，例如Cornifin-B和角蛋白-2e，其与角质形成细胞活化、增殖和角质化有关(Collin等人，1992，Exp.Cell Res.202,132-141)。在应用稳健的统计分析后，发现58种蛋白质显著差异表达，这取决于年龄状态，其中40种被下调，18种通过老化而上调。
本发明人发现，通过老化，更多蛋白质被下调(40)而不是上调(18)，这与之前女性基因表达研究的结果一致(Makrantonaki等人，2012，PLoS ONE 7)。表达受年龄影响的大多数蛋白质参与代谢(30％)和核酸结合(25％)。在先前的转录组学研究中已经观察到类似的结果(Lener等人，2006，Exp.Gerontol.41,387-397)。
在这项工作中，已发现角质蛋白-B随着老化而下调，如先前在使用女性表皮(Raddatz等人，2013，Epigenetics Chromatin 6,36)和皮肤活体组织切片(McGrath等人，2012，Br.J.Dermatol.166Suppl 2,9-15)的两项转录组学研究中所报道的。角质蛋白-B是角质形成细胞分化的标志物(Tesfaigzi和Carlson，1999，Cell Biochem.Biophys.30，243-256)并且随着老化已经观察到角质形成细胞分化的下调(Raddatz等人，2013，EpigeneticsChromatin 6,36)。
过氧化物酶3(Prxlll)是硫氧还蛋白(Trx)过氧化物酶抗氧化剂家族的线粒体成员，在我们的研究中发现其随着老化而上调。另外两个家庭成员，过氧化物酶1和2也在之前的一份报告中被上调(Laimer等人，2010，Exp.Dermatol.19,912-918)。过氧化物酶是重要的细胞抗氧化剂，实际上它们充当过氧化氢和有机氢过氧化物清除剂(Nystrom等人，2012，Genes，12月26日,2001-2008)。已经确定，随着年龄的增长，活性氧(ROS)产生的增加和抗氧化活性的降低都会导致时间性老化(Poljsak等人，2012，ActaDermatovenerol.Alp.Pannonica Adriat.21,33-36)。在氧化应激条件下，PrxIII经历过氧化和随后的不可逆失活。并且已经表明，在大鼠中，这种修饰的PrxIII形式随着老化而累积(Musicco等人，2009)。在本分析中，未鉴定出含有过氧化成磺酸的半胱氨酸的肽，因此没有对这两种形式进行区分，这解释了为什么观察到该蛋白质的整体上调。
在我们的研究中，6-磷酸果糖激酶，血小板类型(PFKAP_HUMAN)随着老化而上调。这种酶通过ATP催化D-果糖6-磷酸磷酸化为果糖1,6-二磷酸，这是糖酵解的第一个实施步骤。已经表明，来自老年供体的人原代角质形成细胞显示出更高的葡萄糖摄取和乳酸产生的增加，这是代谢向糖酵解增加的指标(Prahl等人，2008，BioFactors Oxf.Engl.32,245-255)。因此，观察到的PFKAP上调与原代角质形成细胞中的糖酵解增加相关。
将我们的结果与旨在鉴定皮肤老化生物标志物的其他研究进行比较，显示出一些差异，可以通过不同类型/来源的皮肤样本、性别、整个工作流程中样本处理的差异以及mRNA和蛋白质表达水平之间的变量相关性来解释(Schwanhausser等人，2011，Nature 473,337-342)。
用老化来定义差异蛋白质特征(即使这些变化可能是启动、适应性或补偿性事件)对于进一步了解皮肤老化至关重要。这项研究带来了新的成就，以更好地了解皮肤老化的生物学，并确定新的和具体的目标，有助于诊断、预防和治疗皮肤老化和相关的病理。
示例2
使用上述实施方式1中公开的方法，发明人进一步证明了当使用本发明的标志物的组合时能够获得改善的灵敏度和特异性。
图5A、B和C分别显示了β-微管蛋白、HMGA2和HMGN1的曲线下面积分别为0.806、0.939和0.592。
然而，如图6所示，当组合使用β-微管蛋白、HMGA2和HMGN1时，可以实现100％的灵敏度和特异性，对应于曲线下面积1。用于获得这种敏感性和特异性的模型方程式如下：
预测值＝83.76-(992.91xβ-微管蛋白)-(4936.61x HMGA2)+(273.40x HMGN)。

Claims (15)

1.一种用于确定受试者的皮肤是否呈现生理性皮肤老化迹象的体外方法，其包括以下步骤：
a)在所述受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平以及由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)确定皮肤是否呈现生理性皮肤老化迹象。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：将所述第一蛋白质的表达水平与参照水平进行比较，以及将所述至少一种其它蛋白质的表达水平与参照水平进行比较。
3.一种能够减少或逆转受试者的生理性皮肤老化的可见迹象的美容治疗方法，其包括以下步骤：
a)在所述受试者的皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平以及由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
b)由在步骤a)中确定的所述第一蛋白质的表达水平和所述至少一种其它蛋白质的表达水平推断皮肤是否呈现生理性皮肤老化迹象；以及
c)如果所述皮肤被确定为呈现生理性老化迹象，则利用美容组合物治疗所述受试者，所述美容组合物减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象。
4.一种用于鉴定物质的方法，所述物质能够减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象，所述方法包括以下步骤：
a)利用候选物质处理皮肤样本；
b)在步骤a)的所述皮肤样本中确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平以及由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平；
c)将所述第一蛋白质和所述至少一种其它蛋白质的表达水平与未利用所述候选物质处理的皮肤样本中的第一蛋白质和至少一种其它蛋白质的表达水平进行比较；以及
d)将所述候选物质鉴定为减少或逆转生理性皮肤老化的可见迹象的物质。
5.根据权利要求4所述的方法，其中将步骤a)的所述皮肤样本和步骤c)的未利用所述候选物质处理的皮肤样本暴露于诱导皮肤老化的环境。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述皮肤样本包括角质形成细胞，优选原代角质形成细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者是白种人。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述受试者是女性。
9.根据权利要求1至2和4至8中任一项所述的方法，其中，将第一蛋白质和至少一种其它蛋白质的表达水平通过以下方式与参照表达水平进行比较：通过将所述第一蛋白质的表达水平除以所述第一蛋白质的参照表达水平来确定所述第一蛋白质的表达比率，以及通过将所述至少一种其它蛋白质的表达水平除以所述至少一种其它蛋白质的参照表达水平来确定所述至少一种其它蛋白质的表达比率。
10.根据权利要求9所述的方法，其中当由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1组成的基因的组的基因所编码的所述第一蛋白质的表达比率高于或低于1时，所述受试者的皮肤呈现生理性老化迹象。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中当由选自TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的所述至少一种其它蛋白质的表达比率高于1时，所述受试者的皮肤呈现生理性老化迹象。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其中当由选自HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7组成的基因的组的基因所编码的所述至少一种其它蛋白质的表达比率小于1时，所述受试者的皮肤呈现生理性老化迹象。
13.一种试剂盒，其包括：
-至少一种捕获配体，其用于确定由选自由TUBB3、HMGA2和HMGN1组成的基因的组的基因所编码的第一蛋白质的表达水平；和
-至少一种捕获配体，其用于确定由选自HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质的表达水平。
14.根据权利要求13的试剂盒，其中所述捕获配体是抗体。
15.如权利要求13和14所定义的试剂盒用于确定皮肤样本中以下蛋白质的表达水平的用途，由选自TUBB3、HMGA2和HMGN1组成的基因的组的基因所编码的一种第一蛋白质；以及
由选自由HMGN1、HIST1H2BK、PPFIA2、COX5A、MT1E、HMGN2、EEA1、CDV3、ZC3H11A、HMGA1、PTMA、SERBP1、PDAP1、TMSB10、PSMD9、CALM1、MT1G、TPM4、SPRR1B、GBF1、HDGF、HSPE1、DBI、TRIM6、PTMS、IMUP、SH3BGRL3、RPS28、STMN1、AHSG、PFDN6、SUMO2、PFDN2、NEB、HMGB1、TMSB4X、CLTB、MYH11、SRSF7、TUBB3、HMGA2、ATP6V1A、SQRDL、IDH3A、PFKP、PRDX3、RPS13、PDIA4、GSTO1、GSTP1、ACTR3、SLC2A1、CCT5、PSMB2、PLS3、PSMD2、IGHG4、RPL13组成的基因的组的基因所编码的至少一种其它蛋白质。
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