CN110257299A - 一种阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阴沟肠杆菌，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)DHT001已于2018年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.15820。相应的，本发明还公开了该阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长的应用、包含该阴沟肠杆菌的饲料和该阴沟肠杆菌分离方法。本发明的阴沟肠杆菌能在反刍动物瘤胃中自主合成半胱氨酸，将该阴沟肠杆菌掺入饲料喂养用于促进反刍动物生长。该株阴沟肠杆菌为反刍动物瘤胃中固有菌种，是一种安全、高效、环保的微生物添加剂。

Description

一种阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长的应用。

背景技术

反刍动物由于瘤胃这一特殊构造的存在，使其能够利用人类无法消化吸收的粗纤维，这大大降低了其饲养成本。随着我国经济的飞速发展，国人对动物性蛋白食品的消费也日渐增加，直至目前，牛肉已成为仅次于猪肉和鸡肉的第三大肉类食品，而这就需要在现有水平上提高牛肉及牛奶的产量。巧妇难为无米之炊，想要牛肉和牛奶等蛋白质产品的产量提高，也就需要满足牛机体对于氨基酸性营养物质的需求。目前针对反刍动物小肠氨基酸营养的技术主要有过瘤胃蛋白保护技术和添加旁路氨基酸两种。但这两种方法在提高了反刍动物饲养成本之余，还存在着一些弊端。首先，过瘤胃保护技术会对饲料中原有的蛋白质成分造成一定程度的破坏，同时也涉及到有毒有害物质的残留问题，进而会对瘤胃内微生物区系造成破坏；其次，在饲粮中添加旁路氨基酸对改善反刍动物营养的效果褒贬不一，当用量超标时甚至还会对动物产生毒害作用。

而牛瘤胃中原本便存在能够合成半胱氨酸的微生物，若能将其分离出来，经过富集培养后再饲喂给反刍动物，不仅能够解决其半胱氨酸的需求，也避免了上述问题。同时，由于该微生物能够很好的适应瘤胃内环境，使其在进入瘤胃后相当长的一段时间内都能够维持活性，为反刍动物机体持续的提供半胱氨酸。

有鉴于此，有必要提供一种能合成半胱氨酸的微生物来解决了人为饲喂氨基酸成分在反刍动物体内降解较快这一问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阴沟肠杆菌及其在促进反刍动物生长中的应用，该阴沟肠杆菌能在反刍动物瘤胃中自主合成半胱氨酸，将该阴沟肠杆菌掺入饲料喂养用于促进反刍动物生长。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种阴沟肠杆菌，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)DHT001已于2018年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCCNo.15820。

上述阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长中的应用。

进一步的，将阴沟肠杆菌加入到反刍动物的饲料中。

进一步的，阴沟肠杆菌以菌液形式添加到饲料中，菌液中的活菌数为(1.8-2.2)×10⁸cfu/ml，菌液的添加量为75-85ml/天·头。

一种反刍动物饲料，含有上述的阴沟肠杆菌。

上述阴沟肠杆菌的分离方法，包括以下步骤：

(1)、取牛瘤胃内容物，加入无菌水制成悬液；

(2)、将悬液涂布于平板培养基，于38-40℃厌氧环境中培养，当平板培养基上出现单一菌落后，挑取单一菌落进行革兰氏染色镜检，将镜检中大比例菌株作为目标菌株，将该单一菌落进行纯化培养，重复进行镜检和纯化培养，直至获得纯培养菌株，将纯培养菌株进行半胱氨酸合成量的检测，得到阴沟肠杆菌；

(3)、将阴沟肠杆菌制成菌液。

进一步的，在步骤(3)中，将步骤(2)分离纯化得到的阴沟肠杆菌接种至液体培养基，培养48h-72h，之后，将菌液按5％的接种量转接到优化后的最适培养基中，33-37℃下培养34-38h，得到标准菌液。

进一步的，优化后培养基配方为：葡萄糖20.0g/L、无氨基酸酵母10.0g/L、NaCl5.0g/L、MgSO₄ 7.0g/L和KH₂PO₄ 5.0g/L。

进一步的，在步骤(2)中，平板培养基和液体培养基均为半胱氨酸缺陷培养基。

本发明的有益效果为：

半胱氨酸为反刍动物的必需氨基酸，只能从饲粮中获得，但反刍动物摄入的半胱氨酸中很大一部分会被瘤胃微生物利用从而丧失了其原有的优势，因此该阴沟肠杆菌的饲喂提高了反刍动物瘤胃中半胱氨酸的水平，将半胱氨酸解放出来，在一定程度上缓解半胱氨酸作为第一或第二限制性氨基酸所带来的氨基酸限制问题。

本发明的阴沟肠杆菌能在反刍动物瘤胃中自主合成半胱氨酸，该株阴沟肠杆菌为反刍动物瘤胃中固有菌种，是一种安全、高效、环保的微生物添加剂。

具体实施方式

下面结合附具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。

本发明的一种阴沟肠杆菌，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)DHT001已于2018年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCCNo.15820。

该阴沟肠杆菌从牛瘤胃内容物中分离得到，其16SrRNA序列全长1379bp，经Genbank比对，其与阴沟肠杆菌的相似性达99.8％，可以确定其为阴沟肠杆菌。

上述阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长中的应用。将阴沟肠杆菌加入到反刍动物的饲料中。阴沟肠杆菌以菌液形式添加到饲料中，菌液中的活菌数为(1.8-2.2)×10⁸cfu/ml，菌液的添加量为75-85ml/天·头。将阴沟肠杆菌加入到反刍动物的饲料中得到一种反刍动物饲料。优选的，菌液中的活菌数为1.8×10⁸cfu/ml、2.0×10⁸cfu/ml或2.2×10⁸cfu/ml，相对应的，菌液的添加量为85ml/天·头、80ml/天·头或75ml/天·头；进一步优选的，菌液中的活菌数为2.0×10⁸cfu/ml，菌液的添加量为80ml/天·头。

阴沟肠杆菌及其培养液成分随饲料一同进入反刍动物瘤胃后，能够在瘤胃环境中存活一段时间(24h以上)，期间该菌在分泌半胱氨酸的同时合成一部分菌体蛋白，这部分菌体蛋白连同菌体本身在进入后续消化阶段时，均能为反刍动物机体提供数量可观的半胱氨酸及其他氨基酸成分。反刍动物小肠中所需氮素成分的30％-100％均由瘤胃内微生物合成的菌体蛋白及微生物自身结构蛋白提供，因此该阴沟肠杆菌的饲喂能够弥补高产反刍动物在生产阶段蛋白质的不足的问题。

半胱氨酸为生物体内一种极为常见的含硫氨基酸，具有良好的解毒性，能够参与细胞的还原过程以及肝脏内磷脂的代谢、保护肝细胞不受损害，同时能够促进肝脏功能的恢复，能够很好的预防放射性药物中毒、重金属中毒，并能够预防肝炎、肝坏死以及血清类疾病。同时具有促进生长发育、改善胴体品质的功效。

半胱氨酸在体内代谢过程中能够转变成胱氨酸，而胱氨酸能够协助皮肤形成，借由降低身体吸收铜的能力进而达到保护机体免于铜中毒，而胱氨酸在代谢过程中会释放硫酸，在与其他物质产生化学作用的同时增加代谢系统的解毒能力，此外，半胱氨酸还能够辅助胰岛素的供给，维持机体内环境糖代谢的稳定和平衡，并且胱氨酸能够在一定程度上刺激白细胞的增长，杀灭病原微生物，达到提高机体免疫力的功效。

半胱氨酸为反刍动物的必需氨基酸，只能从饲粮中获得，但反刍动物摄入的半胱氨酸中很大一部分会被瘤胃微生物利用从而丧失了其原有的优势，因此该阴沟肠杆菌的饲喂提高了反刍动物瘤胃中半胱氨酸的水平，将半胱氨酸解放出来，在一定程度上缓解半胱氨酸作为第一或第二限制性氨基酸所带来的氨基酸限制问题。

上述阴沟肠杆菌的分离方法，包括以下步骤：

a、样品采集

将源于黑龙江伊春经天然牧草饲喂的荷斯坦奶牛宰杀后，取适量瘤胃内容物装入事先准备好的洁净密封袋中，液氮中保存。

b、菌种筛选

取瘤胃内容物1g与9mL无菌水放入装有灭菌小玻璃珠的无菌离心管中，充分混合10min后再静置5min，取上层悬液1mL添加到装有9mL无菌水的试管中，振荡混匀，并依此法分别制得梯度稀释倍数依次为10^-2、10^-3和10^-4的瘤胃内容物悬液。

取各梯度稀释倍数的瘤胃内容物悬液200μL加至平板培养基的中央，使用无菌的三角形玻璃涂布器由内至外轻轻涂布均匀。将培养皿做好标记后，连同厌氧产气包和厌氧指示剂一同放入厌氧培养袋中，38-40℃培养，优选的，培养温度为39℃。

平板培养基为半胱氨酸缺陷固体培养基。该半胱氨酸缺陷固体培养基的制备方法如下：

取葡萄糖4.0g、无氨基酸酵母氮源1.5g、琼脂3.0g、NaCl 1.0g、MgSO₄ 1.0g以及维生素B1 10.0mg置于200mL去离子水中，调整pH值至6.5，待充分溶解后放入高压灭菌锅中灭菌20min，取出后待温度降至50-60℃时加入半胱氨酸缺陷混合物溶液800μL，充分混合均匀后倒入培养皿中制成平板培养基，待彻底冷却后4℃冷藏备用。

其中，无氨基酸酵母氮源购自北京索莱宝科技有限公司。半胱氨酸缺陷混合物溶液由购于青岛海博生物技术有限公司的半胱氨酸缺陷混合物粉末0.51g加入到10mL去离子水中充分混合均匀而得，经过滤除菌后冷藏待用。半胱氨酸缺陷混合物粉末的营养成分如下表所示。

表1半胱氨酸缺陷混合物成分表

c、分离纯化

待平板培养基上有单一菌落出现后，用接种环挑取单一菌落，将其一部分用于革兰氏染色镜检，另一部分进行三区划线分离培养。将镜检中所占比例较大的菌株作为目标菌株，将划线后的培养基12个为一组，做好标记，连同厌氧产气包与厌氧指示剂一同装入厌氧培养袋中39℃培养，期间每天观察生长情况和厌氧指示剂的颜色变化。待划线的第三区有单一菌落出现后，重复进行镜检与纯化培养，直至得到纯培养菌株。

将分离得到的菌株接种到半胱氨酸缺陷液体培养基中，39℃条件下厌氧培养48h-72h，并以空白培养基作为对照，委托青岛科标检测研究院有限公司对样品中游离半胱氨酸的含量进行检测。若检测结果表明培养基中游离半胱氨酸的含量升高，则该菌留作目标菌，继续进行后续试验；若培养基中游离半胱氨酸的含量没有升高或升高不明显，则将该菌株视为无效菌株，弃置不用，重新进行上述筛选试验，直至找到能够使培养基中游离半胱氨酸含量升高的菌株为止。

而试验之所以选择测定游离半胱氨酸的含量而非水解半胱氨酸的含量，是为了排除微生物自身的结构蛋白及其合成的菌体蛋白中半胱氨酸成分对试验结果造成的影响。这样做虽然使得半胱氨酸检测水平较低，但能够保证结果的真实准确。

上述半胱氨酸缺陷液体培养基的制备方法为：取葡萄糖4.0g、无氨基酸酵母氮源1.5g、NaCl 1.0g、MgSO₄ 1.0g以及维生素B110.0mg置于200mL去离子水中，调整pH值至6.5，待充分溶解后以10mL的量分装到试管中，经高压灭菌锅灭菌20min后取出，冷却后储存备用。使用前每只试管中添加半胱氨酸缺陷混合物溶液40μL。

d、菌种鉴定

结合革兰氏染色镜检结果、菌落的形态、16SrDNA测序结果，可以确定，以牛瘤胃内容物为样品，经半胱氨酸缺陷培养基筛选得到的菌株为阴沟肠杆菌。

e、标准菌液制备

将分离纯化得到的阴沟肠杆菌从斜面中挑一环接种至液体培养基中，39℃条件下厌氧培养48h-72h，将菌液按5％的接种量转接到优化后的最适培养基中。优化后培养基配方为：葡萄糖20.0g/L、无氨基酸酵母10.0g/L、NaCl 5.0g/L、MgSO₄ 7.0g/L和KH₂PO₄ 5.0g/L；培养条件为：发酵温度33-37℃、发酵时间34-36h，得到标准菌液。优选的，发酵温度35℃、发酵时间36h，得标准菌液。

以下通过试验检测阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长中的作用。

1、试验设计

随机选择体重相近的3月龄荷斯坦奶公犊48头，采用单因素设计随机分为3组，分为对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ、试验组Ⅲ。每组12头犊牛。对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ每天上午分别在其基础日粮中添加阴沟肠杆菌DHT001标准菌液0mL、40mL、80mL和100mL。预饲期7天，实验期3个月。

2、犊牛体重测量方法

体重测定：预饲期结束后，对犊牛进行称重，试验开始后每个月称重一次，称重均在早上饲喂之前进行，对结果进行记录。

3、试验数据统计方法

实验数据采用Excel2003软件初步整理，使用SPSS19.0软件中的方差分析(ANOVA)进行统计分析，采用最小显著性差异(LSD)检验确定组间平均值的显著性差异，结果以平均值±标准差表示。

4、试验结果

表2阴沟肠杆菌DHT001菌液的添加对犊牛体重的影响

同行小写字母不同者，表示差异显著(P＜0.05)

由此表可见，与对照组相比，试验组饲喂阴沟肠杆菌DHT001标准菌液1个月后即犊牛4月龄时，犊牛体重并无显著差异(P＞0.05)。但是到试验第2个月和第3个月时(即犊牛5月龄和6月龄)，试验组Ⅱ和试验组Ⅲ犊牛体重显著高于对照组(P＜0.05)。

5、结论

在犊牛基础日粮中添加阴沟肠杆菌DHT001标准菌液对犊牛体重的增长有显著影响。其最佳添加量以80mL/天·头。

以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110>锦州医科大学

<120>一种阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长的应用

<160>1

<210>1

<211>1379

<212>DNA

<213>阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)

<400>1

aacaggaagcagcttgctgcttcgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaa60

actgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaa120

gaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagcta180

gtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccag240

ccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgc300

acaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgta360

aagtactttcagcggggaggaaggcgacagggttaataaccctgtcgattgacgttaccc420

gcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcg480

ttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaat540

ccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggg600

gtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaag660

gcggcccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggatt720

agataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcg780

tggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaa840

ctcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaa900

cgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttagcagagatgctttggtgcct960

tcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttggg1020

ttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactc1080

aaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcc1140

cttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcga1200

gagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactcca1260

tgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggcc1320

ttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaac1379

<110>锦州医科大学

<120>一种阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长的应用

<160>1

<210>1

<211>1379

<212> DNA

<213>阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）

<400>1

aacaggaagcagcttgctgcttcgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaa60

actgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaa120

gaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagcta180

gtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccag240

ccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgc300

acaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgta360

aagtactttcagcggggaggaaggcgacagggttaataaccctgtcgattgacgttaccc420

gcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcg480

ttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaat540

ccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggg600

gtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaag660

gcggcccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggatt720

agataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcg780

tggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaa840

ctcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaa900

cgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttagcagagatgctttggtgcct960

tcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttggg1020

ttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactc1080

aaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcc1140

cttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcga1200

gagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactcca1260

tgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggcc1320

ttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaac1379

Claims (9)

1.一种阴沟肠杆菌，其特征在于，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)DHT001已于2018年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.15820。

2.权利要求1所述阴沟肠杆菌在促进反刍动物生长的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述阴沟肠杆菌加入到反刍动物的饲料中。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述阴沟肠杆菌以菌液形式添加到饲料中，所述菌液中的活菌数为(1.8-2.2)×10⁸cfu/ml，所述菌液的添加量为75-85ml/天·头。

5.一种反刍动物饲料，其特征在于，含有权利要求1所述的阴沟肠杆菌。

6.权利要求1所述阴沟肠杆菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、取牛瘤胃内容物，加入无菌水制成悬液；

(2)、将悬液涂布于平板培养基，于38-40℃厌氧环境中培养，当平板培养基上出现单一菌落后，挑取单一菌落进行革兰氏染色镜检，将镜检中大比例菌株作为目标菌株，将该单一菌落进行纯化培养，重复进行镜检和纯化培养，直至获得纯培养菌株，将纯培养菌株进行半胱氨酸合成量的检测，得到阴沟肠杆菌；

(3)、将阴沟肠杆菌制成菌液。

7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，将步骤(2)分离纯化得到的阴沟肠杆菌接种至液体培养基，培养48h-72h，之后，将菌液按5％的接种量转接到优化后的最适培养基中，33-37℃下培养34-38h，得到标准菌液。

8.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，优化后培养基配方为：葡萄糖20.0g/L、无氨基酸酵母10.0g/L、NaCl 5.0g/L、MgSO₄ 7.0g/L和KH₂PO₄5.0g/L。

9.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述平板培养基和液体培养基均为半胱氨酸缺陷培养基。