CN110252802A - 一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，属于土壤修复技术领域。本发明将含摩西管柄囊霉菌丝和孢子的根际土制备出接种菌剂土层；将滇杨枝条培育成滇杨苗；以无菌矿区重金属污染土壤作为滇杨栽培基质，将接种菌剂土层平铺于栽培容器底部的滇杨栽培基质的上方，将滇杨苗的根部灭菌处理后放置于接种菌剂土层表面，再将接种菌剂土层平铺到滇杨苗根部表面，滇杨栽培基质平铺到接种菌剂土层表面至栽培容器顶部；将栽培容器中的滇杨苗进行培养至60天以上，完成矿区重金属污染土壤的植物修复。本发明利用摩西管柄囊霉接种到滇杨根部定殖，增加滇杨的生物量，降低植物体内重金属含量，增强植物防御性能，促进矿区污染土壤的植物复垦。

Description

一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法

技术领域

本发明涉及一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，属于土壤修复技术领域。

背景技术

矿区土壤重金属污染程度严重，主要重金属污染物为镉(Cd)和铅(Pb)，重金属镉污染是其中较为严重且影响较大的一种。尾矿重金属污染严重，矿区土壤表层大面积裸露，采矿活动及其废弃物的排放破坏和占用大量的土地资源，矿山废弃物的排放和堆积也带来环境问题。

植物修复技术作为一种新兴的修复技术，相对于传统的方法有不可替代的优势。但是采矿废弃地基质条件恶劣，土壤元素匮乏、养分贫瘠，再加之重金属污染以及土壤功能微生物活性低等因素使得矿区存在植被破坏严重、植物生长受重金属毒害等问题，从而限制了矿区废弃地植被的自然恢复和演替。而植物修复技术本身也具有其局限性，自然界中超积累植物种属稀少，人们从野外筛选的超富集植物生物量普遍较低、周期长、生长缓慢，且受气候、土壤等地域环境条件的限制，导致修复治理效率低、周期长，制约了大规模的应用。

发明内容

针对植物修复矿区重金属污染土壤存在的技术问题，提供了一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，通过接种摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae增加滇杨生物量、增强滇杨重金属抗性，同时改善污染矿区土壤养分循环和土壤质量的修复方法，具有成本低廉、效果好且不出现二次污染等特点。

一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，具体步骤如下：

(1)将灭菌的园艺蛭石和农田土作为接种剂扩繁的栽培基质，将玉米种子表面消毒后培养至玉米出芽得到无菌玉米苗，将含有摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae菌丝和孢子的根际土平铺于无菌容器中栽培基质的上方，将无菌玉米苗移栽至无菌容器的根际土中，再覆盖栽培基质，进行培养至玉米根部摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率不低于90％，剪去玉米地上部分并去除表层土，将剩余的玉米根际土风干、粉碎并混匀得到接种菌剂土层；

(2)将滇杨枝条培育成滇杨苗；

(3)以无菌矿区重金属污染土壤作为滇杨栽培基质，将步骤(1)接种菌剂土层平铺于栽培容器底部的滇杨栽培基质的上方，将步骤(2)滇杨苗的根部灭菌处理后放置于接种菌剂土层表面，再将接种菌剂土层平铺到滇杨苗根部表面，滇杨栽培基质平铺到接种菌剂土层表面至栽培容器顶部；

(4)将步骤(3)栽培容器中的滇杨苗进行培养至60天以上，完成矿区重金属污染土壤的植物修复。

所述步骤(1)中园艺蛭石和农田土的体积比为1:1～2:1。

所述步骤(2)滇杨枝条培育成滇杨苗的具体步骤为

将滇杨枝条剪成14～16cm的滇杨枝段，滇杨枝段的上切口平切留芽，滇杨枝段的下切口斜切，将滇杨枝段的下部置于萘乙酸溶液中浸泡24～36h，水洗滇杨枝段下部，插入水中培养生根至长出4个以上叶片得到滇杨苗。

进一步地，所述萘乙酸溶液的浓度为1～1.5mg/L。

所述步骤(3)无菌矿区重金属污染土壤为过10～20目筛的无菌矿区重金属污染土壤。

滇杨植株的收获方法：

滇杨温室大棚培养60天后进行样品收取，收样前量取株高，收样时称取鲜重；样品分为根、茎、叶三部分，取新鲜根样用于摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测；摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测采用酸性品红染色法以及十字交叉法统计：分别收集滇杨根段，清洗干净后加入10％KOH溶液至完全浸没根样，于温度为90℃水浴锅中加热解析至根样半透明，冷却后，加入乳酸酸化，浸泡10～20min；把根样裁剪成1cm左右的根段，移至载玻片上面，滴加0.5％的酸性品红染液，对滇杨植株根段进行染色；用乳酸甘油对染色后的根段进行脱色，选取适量的根段于载玻片上进行压片；将压制好的载玻片放在普通光学显微镜下进行观察，使用十字交叉法统计所观察到的摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率；

剩下的样品根茎叶分别装入牛皮信封，置于温度为60℃烘箱72h烘干至恒重，用微型粉碎机粉碎，混匀用于测量总重金属的含量；重金属的测量根据国标GB5009.15-2014中的湿法消化法对样品进行消化处理，用火焰原子吸收分光光度计测定重金属的浓度：分别称取0.5g处理好的滇杨根、茎、叶部分干样，放在100ml的凯式瓶中，加入5ml HNO₃-HClO₄(4:1，V/V)冷消化过夜，然后热消化，电热板加热消化至近干，继续加入HNO₃，直至液体澄清透明；用1％HNO₃定容，混合液用火焰原子吸收分光光度计测定Pb、Zn、Cd的浓度，每组实验处理设置6个重复样品。

本发明摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae为购于北京市农林学院植物营养与资源研究所，保藏编号为BGC YN05,1511C0001BGCAM0013。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae接种滇杨，提高了植物对重金属的抗性及重金属污染土壤的植物修复效率；

(2)本发明可以显著增加植物的生物量，显著降低植物体内重金属的含量，增强植物的防御性能，缓解重金属对植株的毒害，显著减少重金属在植物体内积累，从而促进矿区污染土壤的植物修复，恢复矿区重金属污染土壤的绿色生态环境。

附图说明

图1为大棚种植滇杨根细胞中摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae结构；

图2为不同处理组滇杨生长60天时滇杨净重增长量；其中K：矿区土；Cd浓度(土壤)：mg/kg；a、b、c、d：不同处理组滇杨鲜重/株高净增长量单因素方差分析，不同字母表示p<0.05；*表示相同基质中M-、M+处理组生物量T检验，*:0.01≤p<0.05；**:0.001≤p<0.01；***:p<0.001；

图3为不同处理组滇杨生长60天时滇杨株高增长量；其中K：矿区土；Cd浓度(土壤)：mg/kg；a、b、c、d：不同处理组滇杨鲜重/株高净增长量单因素方差分析，不同字母表示p<0.05；*表示相同基质中M-、M+处理组生物量T检验，*:0.01≤p<0.05；**:0.001≤p<0.01；***:p<0.001；

图4为不同处理组滇杨不同组织中重金属Cd含量；L：叶片T：茎R：根；Cd浓度(土壤):mg/kg；*：滇杨根/茎/叶中相同Cd浓度下M+和M-处理组Cd含量T检验，*：0.01≤p<0.05，**：0.001≤p<0.01，***：p<0.001；小写字母代表不接菌组Cd0，Cd50滇杨根、茎、叶中Cd浓度单因素方差分析；大写字母代表接菌组Cd0，Cd50滇杨根、茎、叶中Cd浓度单因素方差分析；

图5为不同处理组滇杨不同组织中重金属Pb、Zn、Cd含量；L：叶片T：茎R：根；Cd浓度(土壤):mg/kg；*：滇杨根/茎/叶中矿区土培养条件下M+和M-处理组Cd/Pb/Zn含量T检验，*：0.01≤p<0.05，**：0.001≤p<0.01，***：p<0.001；小写字母代表不接菌组矿区土种植条件下滇杨不同组织中Cd/Pb/Zn浓度单因素方差分析；大写字母代表接菌组矿区土种植条件下滇杨不同组织中Cd/Pb/Zn浓度单因素方差分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

本发明摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae来源于北京市农林学院植物营养与资源研究所，保藏编号为BGC YN05,1511C0001BGCAM0013。

实施例1：一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，具体步骤如下：

(1)将灭菌的园艺蛭石和农田土作为接种剂扩繁的栽培基质：园艺蛭石和农田土的体积比为1:1，园艺蛭石和农田土分别过10目筛去除大块蛭石和土壤，混合均匀，再置于高压蒸汽灭菌锅中，在温度121℃条件下灭菌2h，隔天重复灭菌三次，风干，混匀即得接种剂扩繁的栽培基质；

将玉米种子表面消毒后培养至玉米出芽得到无菌玉米苗：选出大小、形状、饱满一致的会单四号玉米种子用酒精表面消毒10min，无菌水冲洗3次；然后用浓度为10％的次氯酸钠消毒10min，再用无菌水冲洗3次，置于无菌的放有双层滤纸的平板中，黑暗条件下培养至玉米出芽；

用75％的酒精彻底擦洗花盆(380×260mm)灭菌，晾干，写上标签，在灭菌花盆底部铺设无菌栽培基质；将500g含有摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae菌丝和孢子的根际土平铺于无菌花盆中栽培基质的上方，将无菌玉米苗移栽至无菌花盆的根际土中，再覆盖3～5cm栽培基质形成“三明治”法扩繁摩西管柄囊霉菌Funneliformis mosseae；培养30天左右，随机抽查玉米根部，在光学显微镜下十字交叉法观察统计玉米根部的摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖情况，观察到摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的菌丝，丛枝，泡囊以及菌丝圈等典型结构，即为定殖成功；

继续培养20天左右至玉米根部摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率不低于90％，剪去玉米地上部分并去除表层土，将剩余的玉米根际土风干、粉碎并混匀得到接种菌剂土层；

(2)将滇杨枝条培育成滇杨苗；

将滇杨枝条剪成15cm的小段，上切口平切，下切口斜切，上端留芽得到滇杨枝段；将滇杨枝段下端置于浓度为1mg/L的萘乙酸溶液中浸泡24h促进枝条生根，用水清洗滇杨枝段后插入水中置于温室大棚中培养生根，培养的第一周每天换水，从第二周开始每周换一次水，培养两个月左右至滇杨苗长出4个以上叶片得到滇杨苗；

(3)以市售的园艺蛭石为滇杨的基础栽培基质，园艺蛭石过10目筛除去大块蛭石，混合均匀，在高压蒸汽灭菌锅中温度为121℃条件下，灭菌2h，隔天重复灭菌三次，自然风干；接种菌剂土层平均分为两份，一份作为接菌组，另一份在高压蒸汽灭菌锅中温度为121℃，灭菌2h，隔天重复灭菌三次，自然风干，用于对照组；重金属污染模拟土壤以Cd污染为例，将CdCl₂溶解于1/4Hoagland溶液中形成混合溶液，然后将混合溶液与灭过菌的蛭石混匀使基质中Cd浓度分别为0mg/kg和50mg/kg；挑选粗细一致、生根数和叶片数相近的滇杨苗，根部放入10％的NaClO溶液中消毒5min，然后用去离子水冲洗3次；用75％的酒精彻底擦洗花盆(210×160mm)，晾干，分别标上编号，底层平铺一层灭过菌的蛭石(花盆1/3高度处)，将步骤(1)接种菌剂土层平铺于栽培花盆底部的滇杨栽培基质的上方，将步骤(2)滇杨苗的根部灭菌处理后放置于接种菌剂土层表面，再将接种菌剂土层平铺到滇杨苗根部表面，滇杨栽培基质平铺到接种菌剂土层表面至栽培容器顶部，形成“三明治”法接种摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae到滇杨根部；

(4)将步骤(3)栽培容器中的滇杨苗进行培养至60天以上进行滇杨植株的收获，完成矿区重金属污染土壤的植物修复；

滇杨植株的收获：

滇杨温室大棚培养60天后收取样品，收样前量取株高，收样时称取鲜重；样品分为根、茎、叶三部分，取一部分新鲜根样用于摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测采用酸性品红法染色以及十字交叉法观察统计；分别收集滇杨根段，用自来水清洗滇杨植株根部粘附的蛭石，放入写有对应编号的试管中，加入10％KOH溶液至完全浸没根样，于温度为90℃水浴锅中加热解析15min左右，至根样半透明；冷却后，放入标有对应标号的平板中，加入乳酸酸化，浸泡10～20min；

将浸泡过的根样裁剪成1cm左右的根段，移至载玻片上面，滴加0.5％的酸性品红染液(酸性品红0.5g，乳酸甘油100ml)，对滇杨植株根段进行染色；染色过程中，可以用酒精灯灼烧载玻片背面加速染色，至冒白烟2-3次即可；然后用乳酸甘油对染色后的根段进行脱色，直至流下来的乳酸甘油为无色。选取适量的根段于载玻片上进行压片。将压制好的载玻片放在普通光学显微镜下进行观察，使用十字交叉法统计所观察到的摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率；每一个根样至少检测300个视野，根据下述公式计算摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的总定殖率；

摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率(％)＝(视野总数-空白视野数)/视野总数×100％

剩下的滇杨样品根、茎、叶分别装入牛皮信封，置于温度为60℃烘箱72h烘干至恒重，用微型粉碎机粉碎，混匀用于原子吸收光谱法测量植物各部分的总重金属含量；重金属的测量根据国标GB5009.15-2014中的湿法消化法对样品进行消化处理，用火焰原子吸收分光光度计测定Cd的浓度；分别称取0.5g处理好的滇杨根、茎、叶部分干样，放在100ml的凯式瓶中，加入5ml HNO₃-HClO₄(4:1，V/V)冷消化过夜，然后热消化，电热板加热消化至近干，继续加入HNO₃，直至液体澄清透明；用1％HNO₃定容，混合液用火焰原子吸收分光光度计测定Cd的浓度，每组实验处理设置6-10个重复样品；

在单一重金属Cd胁迫条件下，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae接种到滇杨根部能成功定殖(定殖率为70％以上)，显著增加滇杨的生物量(鲜重和株高)，显著降低植物体内(根、茎、叶)重金属Cd的含量，增强植物防御性能，缓解重金属对植株的毒害，减少重金属在植物体内积累，从而促进矿区污染土壤的植物复垦，恢复矿区重金属污染土壤的绿色生态环境。

实施例2：一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，具体步骤如下：

(1)将灭菌的园艺蛭石和农田土作为接种剂扩繁的栽培基质：园艺蛭石和农田土的体积比为1:1，园艺蛭石和农田土分别过10目筛去除大块蛭石和土壤，混合均匀，再置于高压蒸汽灭菌锅中，在温度121℃条件下灭菌2h，隔天重复灭菌三次，风干，混匀即得接种剂扩繁的栽培基质；

将玉米种子表面消毒后培养至玉米出芽得到无菌玉米苗：选出大小、形状、饱满一致的会单四号玉米种子用酒精表面消毒10min，无菌水冲洗3次；然后用浓度为10％的次氯酸钠消毒10min，再用无菌水冲洗3次，置于无菌的放有双层滤纸的平板中，黑暗条件下培养至玉米出芽；

用75％的酒精彻底擦洗花盆(380×260mm)灭菌，晾干，写上标签，在灭菌花盆底部铺设无菌栽培基质；将500g含有摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae菌丝和孢子的根际土平铺于无菌花盆中栽培基质的上方，将无菌玉米苗移栽至无菌花盆的根际土中，再覆盖3～5cm栽培基质形成“三明治”法扩繁摩西管柄囊霉菌Funneliformis mosseae；培养30天左右，随机抽查玉米根部，在光学显微镜下十字交叉法观察统计玉米根部的摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖情况，观察到摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的菌丝，丛枝，泡囊以及菌丝圈等典型结构，即为定殖成功；

继续培养20d左右至玉米根部摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率不低于90％，剪去玉米地上部分并去除表层土，将剩余的玉米根际土风干、粉碎并混匀得到接种菌剂土层；

(2)将滇杨枝条培育成滇杨苗；

将滇杨枝条剪成15cm的小段，上切口平切，下切口斜切，上端留芽得到滇杨枝段；将滇杨枝段下端置于浓度为1mg/L的萘乙酸溶液中浸泡36h促进枝条生根，用水清洗滇杨枝段后插入水中置于温室大棚中培养生根，培养的第一周每天换水，从第二周开始每周换一次水，培养两个月左右至滇杨苗长出4个以上叶片得到滇杨苗；

(3)以云南个旧老厂尾矿区采得的土壤作为滇杨的基础栽培基质，将土壤风干后过10目筛除去大块土壤杂质，混合均匀，在高压蒸汽灭菌锅中温度为121℃条件下，灭菌2h，隔天重复灭菌三次，自然风干；接种菌剂土层平均分为两份，一份作为接菌组菌剂，另一份在高压蒸汽灭菌锅中温度为121℃条件下，灭菌2h，隔天重复灭菌三次，自然风干，用于对照组；重金属污染模拟生境地个旧尾矿区复合重金属污染土壤；挑选粗细一致、生根数和叶片数相近的滇杨苗，根部放入10％的NaClO溶液中消毒5min，然后用去离子水冲洗3次；用75％的酒精彻底擦洗花盆(210×160mm)，晾干，分别标上编号，底层平铺一层灭过菌的矿区土(花盆1/3高度处)，将步骤(1)接种菌剂土层平铺于栽培花盆底部的滇杨栽培基质的上方，将步骤(2)滇杨苗的根部灭菌处理后放置于接种菌剂土层表面，再将接种菌剂土层平铺到滇杨苗根部表面，滇杨栽培基质平铺到接种菌剂土层表面至栽培容器顶部，形成“三明治”法接种摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae到滇杨根部；

(4)将步骤(3)栽培容器中的滇杨苗培养至60天以上进行滇杨植株的收获，完成矿区重金属污染土壤的植物修复；

滇杨植株的收获：

滇杨温室大棚培养60天后收取样品，收样前量取株高，收样时称取鲜重；样品分为根、茎、叶三部分，取一部分新鲜根样用于摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测采用酸性品红法染色以及十字交叉法观察统计；分别收集滇杨根段，用自来水清洗滇杨植株根部粘附的土壤，放入写有对应编号的试管中，加入10％KOH溶液至完全浸没根样，于温度为90℃水浴锅中加热解析15min左右，至根样半透明；冷却后，放入标有对应标号的平板中，加入乳酸酸化，浸泡10～20min；

将浸泡过的根样裁剪成1cm左右的根段，移至载玻片上面，滴加0.5％的酸性品红染液(酸性品红0.5g，乳酸甘油100ml)，对滇杨植株根段进行染色；染色过程中，可以用酒精灯灼烧载玻片背面加速染色，至冒白烟2-3次即可；然后用乳酸甘油对染色后的根段进行脱色，直至流下来的乳酸甘油为无色。选取适量的根段于载玻片上进行压片；将压制好的载玻片放在普通光学显微镜下进行观察，使用十字交叉法统计所观察到的摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率；每一个根样至少检测300个视野，根据下述公式计算摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的总定殖率；

摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率(％)＝(视野总数-空白视野数)/视野总数×100％

剩下的滇杨样品根、茎、叶分别装入牛皮信封，置于温度为60℃烘箱72h烘干至恒重，用微型粉碎机粉碎，混匀用于原子吸收光谱法测量植物各部分的总重金属含量；重金属的测量根据国标GB5009.15-2014中的湿法消化法对样品进行消化处理，用火焰原子吸收分光光度计测定Cd/Pb/Zn的浓度；分别称取0.5g处理好的滇杨根、茎、叶部分干样，放在100ml的凯式瓶中，加入5ml HNO₃-HClO₄(4:1，V/V)冷消化过夜，然后热消化，电热板加热消化至近干，继续加入HNO₃，直至液体澄清透明；用1％HNO₃定容，混合液用火焰原子吸收分光光度计测定Cd/Pb/Zn的浓度，每组实验处理设置6-10个重复样品；

大棚种植滇杨根细胞中摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae结构见图1，从图1可看出滇杨根细胞内和细胞间具有大量摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的经典结构菌丝和丛枝，而且具有摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae特有结构泡囊和菌丝圈，说明在不同培养条件下摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae均能成功定殖于滇杨根内，且定殖率都能达到70％左右，说明定殖情况良好；

不同处理组滇杨生长60天时滇杨净重增长量见图2；其中K：矿区土；Cd浓度(土壤)：mg/kg；a、b、c、d：不同处理组滇杨鲜重净增长量单因素方差分析，不同字母表示p<0.05；*表示相同基质中M-、M+处理组生物量T检验，*:0.01≤p<0.05；**:0.001≤p<0.01；***:p<0.001；结果发现在无重金属胁迫的条件下，摩西管柄囊霉促进滇杨的鲜重净增长量但不显著，说明在正常生长条件下，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae对滇杨的生长没有显著促进作用，而在单一重金属Cd和复合重金属Cd、Pb、Zn等胁迫条件下，接种摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae均显著增加了滇杨的鲜重净增长量，说明在重金属胁迫条件下，摩西管柄囊霉能显著促进滇杨的生长；

不同处理组滇杨生长60天时滇杨株高增长量见图3；其中K：矿区土；Cd浓度(土壤)：mg/kg；a、b、c、d：不同处理组滇杨株高净增长量单因素方差分析，不同字母表示p<0.05；*表示相同基质中M-、M+处理组生物量T检验，*:0.01≤p<0.05；**:0.001≤p<0.01；***:p<0.001；结果发现在无重金属胁迫的条件下，摩西管柄囊霉促进滇杨的株高增长但不显著，说明在正常生长条件下，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae对滇杨的生长没有显著促进作用。而在单一重金属Cd和复合重金属Cd、Pb、Zn等胁迫条件下，接种摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae均显著增加了滇杨的株高净增长量，说明在重金属胁迫条件下，摩西管柄囊霉能显著促进滇杨的生长；

不同处理组滇杨不同组织中重金属Cd含量见图4；L：叶片T：茎R：根；Cd浓度(土壤):mg/kg；*：滇杨根/茎/叶中相同Cd浓度下M+和M-处理组Cd含量T检验，*：0.01≤p<0.05，**：0.001≤p<0.01，***：p<0.001；小写字母代表不接菌组Cd0，Cd50滇杨根、茎、叶中Cd浓度单因素方差分析；大写字母代表接菌组Cd0，Cd50滇杨根、茎、叶中Cd浓度单因素方差分析；在无重金属胁迫条件下，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae降低了滇杨根、茎、叶中的Cd含量，在单一重金属Cd胁迫条件下，接种摩西管柄囊霉显著降低了滇杨根、茎、叶中Cd含量，说明在重金属Cd胁迫条件下，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae能够显著降低滇杨体内重金属含量，缓解重金属对植株的毒害，从而促进矿区污染土壤的植物复垦；

不同处理组滇杨不同组织中重金属Pb、Zn、Cd含量见图5；L：叶片T：茎R：根；Cd/Pb/Zn浓度:mg/kg；*：滇杨根/茎/叶中相同培养条件下(矿区土)M+和M-处理组Cd(Pb/Zn)含量T检验，*：0.01≤p<0.05，**：0.001≤p<0.01，***：p<0.001；小写字母代表不接菌组矿区土种植条件下滇杨不同组织中Cd/Pb/Zn浓度单因素方差分析；大写字母代表接菌组矿区土种植条件下滇杨不同组织中Cd/Pb/Zn浓度单因素方差分析，在生境土壤复合重金属Cd、Pb、Zn胁迫条件下，根部接种摩西管柄囊霉能降低或显著降低滇杨根、茎、叶中的Cd、Pb、Zn的含量；说明在矿区土壤复合重金属污染条件下，根部接种摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae能够显著降低滇杨体内重金属含量，缓解重金属对植株的毒害；

在复合重金属(Cd、Pb、Zn等)胁迫条件下，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae接种到滇杨根部能成功定殖(定殖率为70％以上)，显著增加滇杨的生物量(鲜重和株高)，减少或显著性减少滇杨根、茎、叶中重金属Cd、Pb、Zn含量；摩西管柄囊霉Funneliformismosseae的接种能显著增强重金属污染尾矿区植物的防御性能，缓解重金属对植株的毒害，从而促进矿区污染土壤的植物复垦，恢复矿区重金属污染土壤的绿色生态环境。

实施例3：一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，具体步骤如下：

(1)将灭菌的园艺蛭石和农田土作为接种剂扩繁的栽培基质：园艺蛭石和农田土的体积比为1.5:1，园艺蛭石和农田土分别过10目筛去除大块蛭石和土壤，混合均匀，再置于高压蒸汽灭菌锅中，在温度121℃条件下灭菌2h，隔天重复灭菌三次，风干，混匀即得接种剂扩繁的栽培基质；

将玉米种子表面消毒后培养至玉米出芽得到无菌玉米苗：选出大小、形状、饱满一致的会单四号玉米种子用酒精表面消毒10min，无菌水冲洗3次；然后用浓度为10％的次氯酸钠消毒10min，再用无菌水冲洗3次，置于无菌的放有双层滤纸的平板中，黑暗条件下培养至玉米出芽；

用75％的酒精彻底擦洗花盆灭菌，晾干，写上标签，在灭菌花盆底部铺设无菌栽培基质；将500g含有摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae菌丝和孢子的根际土平铺于无菌花盆中栽培基质的上方，将无菌玉米苗移栽至无菌花盆的根际土中，再覆盖3～5cm栽培基质形成“三明治”法扩繁摩西管柄囊霉菌Funneliformis mosseae；培养30天左右，随机抽查玉米根部，在光学显微镜下十字交叉法观察玉米根部的摩西管柄囊霉Funneliformismosseae的定殖情况，观察到摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的菌丝，丛枝，泡囊以及菌丝圈等典型结构，即为定殖成功；

继续培养20d左右至玉米根部摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率不低于90％，剪去玉米地上部分并去除表层土，将剩余的玉米根际土风干、粉碎并混匀得到接种菌剂土层；

(2)将滇杨枝条培育成滇杨苗；

将滇杨枝条剪成14-16cm的小段，上切口平切，下切口斜切，上端留芽得到滇杨枝段；将滇杨枝段下端置于浓度为1.2mg/L的萘乙酸溶液中浸泡28h促进枝条生根，用水清洗滇杨枝段后插入水中置于温室大棚中培养生根，培养的第一周每天换水，从第二周开始每周换一次水，培养两个月左右至滇杨苗长出4个以上叶片得到滇杨苗；

(3)以云南个旧老厂尾矿区采得的土壤作为滇杨的基础栽培基质，将土壤风干后过15目筛除去大块颗粒土壤及杂质，混合均匀，在高压蒸汽灭菌锅中在温度为121℃，灭菌2h，隔天重复灭菌三次，自然风干；接种菌剂土层平均分为两份，一份作为接菌组，另一份在高压蒸汽灭菌锅中温度为121℃，灭菌2h，隔天重复灭菌三次，自然风干，用于对照组；挑选粗细一致、生根数和叶片数相近的滇杨苗，根部放入10％的NaClO溶液中消毒5min，然后用去离子水冲洗3次；用75％的酒精彻底擦洗花盆(210×160mm)，晾干，分别标上编号，底层平铺一层灭过菌的矿区土(花盆1/3高度处)，将步骤(1)接种菌剂土层平铺于栽培花盆底部的滇杨栽培基质的上方，将步骤(2)滇杨苗的根部灭菌处理后放置于接种菌剂土层表面，再将接种菌剂土层平铺到滇杨苗根部表面，滇杨栽培基质平铺到接种菌剂土层表面至栽培容器顶部，形成“三明治”法接种摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae到滇杨根部；

(4)将步骤(3)栽培容器中的滇杨苗进行培养至60天以上进行滇杨植株的收获，完成矿区重金属污染土壤的植物修复；

滇杨植株的收获：

滇杨温室大棚培养60天后收取样品，收样前量取株高，收样时称取鲜重；样品分为根、茎、叶三部分，取一部分新鲜根样用于摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测采用酸性品红法染色以及十字交叉法观察统计；分别收集滇杨根段，用自来水清洗滇杨植株根部粘附的土壤，放入写有对应编号的试管中，加入10％KOH溶液至完全浸没根样，于温度为90℃水浴锅中加热解析15min左右，至根样半透明；冷却后，放入标有对应标号的平板中，加入乳酸酸化，浸泡10～20min；

将浸泡过的根样裁剪成1cm左右的根段，移至载玻片上面，滴加0.5％的酸性品红染液(酸性品红0.5g，乳酸甘油100ml)，对滇杨植株根段进行染色；染色过程中，可以用酒精灯灼烧载玻片背面加速染色，至冒白烟2-3次即可；然后用乳酸甘油对染色后的根段进行脱色，直至流下来的乳酸甘油为无色。选取适量的根段于载玻片上进行压片；将压制好的载玻片放在普通光学显微镜下进行观察，使用十字交叉法统计所观察到的摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率；每一个根样至少检测300个视野，根据下述公式计算摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的总定殖率；

摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率(％)＝(视野总数-空白视野数)/视野总数×100％

剩下的滇杨样品根、茎、叶分别装入牛皮信封，置于温度为60℃烘箱72h烘干至恒重，用微型粉碎机粉碎，混匀用于原子吸收光谱法测量植物各部分的总重金属含量；重金属的测量根据国标GB5009.15-2014中的湿法消化法对样品进行消化处理，用火焰原子吸收分光光度计测定Cd/Pb/Zn的浓度；分别称取0.5g处理好的滇杨根、茎、叶部分干样，放在100ml的凯式瓶中，加入5ml HNO₃-HClO₄(4:1，V/V)冷消化过夜，然后热消化，电热板加热消化至近干，继续加入HNO₃，直至液体澄清透明；用1％HNO₃定容，混合液用火焰原子吸收分光光度计测定Cd/Pb/Zn的浓度，每组实验处理设置6-10个重复样品；

在复合重金属(Cd、Pb、Zn等)胁迫条件下，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae接种到滇杨根部能成功定殖(定殖率为70％以上)，显著增加滇杨的生物量(鲜重和株高)，减少或显著性减少滇杨根、茎、叶中重金属Cd、Pb、Zn含量；摩西管柄囊霉Funneliformismosseae的接种能显著增强重金属污染尾矿区植物的防御性能，缓解重金属对植株的毒害，从而促进矿区污染土壤的植物复垦，恢复矿区重金属污染土壤的绿色生态环境。

实施例4：一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，具体步骤如下：

(1)将灭菌的园艺蛭石和农田土作为接种剂扩繁的栽培基质：园艺蛭石和农田土的体积比为2:1，园艺蛭石和农田土分别过15目筛去除大块蛭石和土壤，混合均匀，再置于高压蒸汽灭菌锅中，在温度121℃条件下灭菌2h，隔天重复灭菌三次，风干，混匀即得接种剂扩繁的栽培基质；

将玉米种子表面消毒后培养至玉米出芽得到无菌玉米苗：选出大小、形状、饱满一致的会单四号玉米种子用酒精表面消毒10min，无菌水冲洗3次；然后用浓度为10％的次氯酸钠消毒10min，再用无菌水冲洗3次，置于无菌的放有双层滤纸的平板中，黑暗条件下培养至玉米出芽；

用75％的酒精彻底擦洗花盆灭菌，晾干，写上标签，在灭菌花盆底部铺设无菌栽培基质；将500g含有摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae菌丝和孢子的根际土平铺于无菌花盆中栽培基质的上方，将无菌玉米苗移栽至无菌花盆的根际土中，再覆盖3～5cm栽培基质形成“三明治”法扩繁摩西管柄囊霉菌Funneliformis mosseae；培养30天左右，随机抽查玉米根部，在光学显微镜下十字交叉法观察玉米根部的摩西管柄囊霉Funneliformismosseae的定殖情况，观察到摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的菌丝，丛枝，泡囊以及菌丝圈等典型结构，即为定殖成功；

继续培养20d左右至玉米根部摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率不低于90％，剪去玉米地上部分并去除表层土，将剩余的玉米根际土风干、粉碎并混匀得到接种菌剂土层；

(2)将滇杨枝条培育成滇杨苗；

将滇杨枝条剪成14-16cm的小段，上切口平切，下切口斜切，上端留芽得到滇杨枝段；将滇杨枝段下端置于浓度为1.5mg/L的萘乙酸溶液中浸泡24h促进枝条生根，用水清洗滇杨枝段后插入水中置于温室大棚中培养生根，培养的第一周每天换水，从第二周开始每周换一次水，培养两个月左右至滇杨苗长出4个以上叶片得到滇杨苗；

(3)以云南个旧老厂尾矿区采得的土壤作为滇杨的基础栽培基质，将土壤风干后过20目筛除去大块颗粒土壤及杂质，混合均匀，在高压蒸汽灭菌锅中在温度为121℃，灭菌2h，隔天重复灭菌三次，自然风干；接种菌剂土层平均分为两份，一份作为接菌组，另一份在高压蒸汽灭菌锅中温度为121℃，灭菌2h，隔天重复灭菌三次，自然风干，用于对照组；挑选粗细一致、生根数和叶片数相近的滇杨苗，根部放入10％的NaClO溶液中消毒5min，然后用去离子水冲洗3次；用75％的酒精彻底擦洗花盆(210×160mm)，晾干，分别标上编号，底层平铺一层灭过菌的矿区土(花盆1/3高度处)，将步骤(1)接种菌剂土层平铺于栽培花盆底部的滇杨栽培基质的上方，将步骤(2)滇杨苗的根部灭菌处理后放置于接种菌剂土层表面，再将接种菌剂土层平铺到滇杨苗根部表面，滇杨栽培基质平铺到接种菌剂土层表面至栽培容器顶部，形成“三明治”法接种摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae到滇杨根部；

(4)将步骤(3)栽培容器中的滇杨苗进行培养至60天以上进行滇杨植株的收获，完成矿区重金属污染土壤的植物修复；

滇杨植株的收获：

滇杨温室大棚培养60天后收取样品，收样前量取株高，收样时称取鲜重；样品分为根、茎、叶三部分，取一部分新鲜根样用于摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率的检测采用酸性品红法染色以及十字交叉法观察统计；分别收集滇杨根段，用自来水清洗滇杨植株根部粘附的土壤，放入写有对应编号的试管中，加入10％KOH溶液至完全浸没根样，于温度为90℃水浴锅中加热解析15min左右，至根样半透明；冷却后，放入标有对应标号的平板中，加入乳酸酸化，浸泡10～20min；

将浸泡过的根样裁剪成1cm左右的根段，移至载玻片上面，滴加0.5％的酸性品红染液(酸性品红0.5g，乳酸甘油100ml)，对滇杨植株根段进行染色；染色过程中，可以用酒精灯灼烧载玻片背面加速染色，至冒白烟2-3次即可；然后用乳酸甘油对染色后的根段进行脱色，直至流下来的乳酸甘油为无色。选取适量的根段于载玻片上进行压片；将压制好的载玻片放在普通光学显微镜下进行观察，使用十字交叉法统计所观察到的摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率；每一个根样至少检测300个视野，根据下述公式计算摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的总定殖率；

摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae定殖率(％)＝(视野总数-空白视野数)/视野总数×100％

剩下的滇杨样品根、茎、叶分别装入牛皮信封，置于温度为60℃烘箱72h烘干至恒重，用微型粉碎机粉碎，混匀用于原子吸收光谱法测量植物各部分的总重金属含量；重金属的测量根据国标GB5009.15-2014中的湿法消化法对样品进行消化处理，用火焰原子吸收分光光度计测定Cd/Pb/Zn的浓度；分别称取0.5g处理好的滇杨根、茎、叶部分干样，放在100ml的凯式瓶中，加入5ml HNO₃-HClO₄(4:1，V/V)冷消化过夜，然后热消化，电热板加热消化至近干，继续加入HNO₃，直至液体澄清透明；用1％HNO₃定容，混合液用火焰原子吸收分光光度计测定Cd/Pb/Zn的浓度，每组实验处理设置6-10个重复样品；

在复合重金属(Cd、Pb、Zn等)胁迫条件下，摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae接种到滇杨根部能成功定殖(定殖率为70％以上)，显著增加滇杨的生物量(鲜重和株高)，减少或显著性减少滇杨根、茎、叶中重金属Cd、Pb、Zn含量；摩西管柄囊霉Funneliformismosseae的接种能显著增强重金属污染尾矿区植物的防御性能，缓解重金属对植株的毒害，从而促进矿区污染土壤的植物复垦，恢复矿区重金属污染土壤的绿色生态环境。

Claims (5)

1.一种促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将灭菌的园艺蛭石和农田土作为接种剂扩繁的栽培基质，将玉米种子表面消毒后培养至玉米出芽得到无菌玉米苗，将含有摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae菌丝和孢子的根际土平铺于无菌容器中栽培基质的上方，将无菌玉米苗移栽至无菌容器的根际土中，再覆盖栽培基质，进行培养至玉米根部摩西管柄囊霉Funneliformis mosseae的定殖率不低于90％，剪去玉米地上部分并去除表层土，将剩余的玉米根际土风干、粉碎并混匀得到接种菌剂土层；

(2)将滇杨枝条培育成滇杨苗；

(3)以无菌矿区重金属污染土壤作为滇杨栽培基质，将步骤(1)接种菌剂土层平铺于栽培容器底部的滇杨栽培基质的上方，将步骤(2)滇杨苗的根部灭菌处理后放置于接种菌剂土层表面，再将接种菌剂土层平铺到滇杨苗根部表面，滇杨栽培基质平铺到接种菌剂土层表面至栽培容器顶部；

(4)将步骤(3)栽培容器中的滇杨苗进行培养至60天以上，完成矿区重金属污染土壤的植物修复。

2.根据权利要求1所述促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，其特征在于：步骤(1)中园艺蛭石和农田土的体积比为1:1～2:1。

3.根据权利要求1所述促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，其特征在于：步骤(2)滇杨枝条培育成滇杨苗的具体步骤为

将滇杨枝条剪成14～16cm的滇杨枝段，滇杨枝段的上切口平切留芽，滇杨枝段的下切口斜切，将滇杨枝段的下部置于萘乙酸溶液中浸泡24～36h，水洗滇杨枝段下部，插入水中培养生根至长出4个以上叶片得到滇杨苗。

4.根据权利要求3所述促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，其特征在于：萘乙酸溶液的浓度为1～1.5mg/L。

5.根据权利要求1所述促进植物修复矿区重金属污染土壤的方法，其特征在于：步骤(3)无菌矿区重金属污染土壤为过10～20目筛的无菌矿区重金属污染土壤。