CN110241180A - 一种基于dsDNA-SYBR Green I光敏催化的化学发光传感方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于dsDNA‑SYBR Green I光敏催化的化学发光传感方法，主要将dsDNA‑SYBR Green I光敏产生的短寿命、强氧化能力的单线态氧的氧化能力用K4Fe(CN)6进行储存，将其氧化成K3[Fe(CN)6]。通过该简单的储存步骤，可使光敏氧化鲁米诺化学发光的强度提高约30倍，从而显著地提高检测DNA的灵敏度，对BRCA1、BRCA2、p53基因的检出限分别可达3 pM、6pM和5pM。而且，该法操作简便，无需分离、标记等步骤，并可拓展至其它任意序列DNA的检测，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用光敏催化化学发光对DNA进行定性、定量测定的方法，属于生物传感技术领域。
背景技术
核酸是组成生命体最主要的生物大分子之一，也是基因表达的基础，指导和调控着蛋白质的合成以及有机体细胞的相关机能。迄今为止，核酸已被作为一种重要的生物标志物用于生物研究和医学诊断。核酸检测的方法有很多，主要有荧光法（Anal. Chem.,2010, 82: 1921-1927）、电化学法（Acc.Chem.Res., 2010, 43: 496-505）、比色法（Chem.Commun., 2015, 51: 14465-14468）和化学发光法（Anal.Chem., 2013, 82: 5511-5517）。相比之下，化学发光法具有设备简单、分析快速、线性范围宽和灵敏度高等显著优点而被分析工作者广泛应用。
鲁米诺是最广泛使用的化学发光试剂之一，但其化学发光反应较为缓慢，因此在实际操作中需要加入酶类等催化剂，以加速其反应进程。生物酶如辣根过氧化物酶在用于核酸分析时需要标记、分离等步骤，操作复杂。Winner等发现Hemin能够与富含G碱基的G-四聚体结合形成DNAzyme，它具有类似过氧化物酶的催化活性，能够催化luminol-H2O2体系产生化学发光（Anal. Chem., 2004, 76: 2152-2156），通过测定体系的化学发光强度，来确定靶标DNA的浓度。但是这种方法在没有目标存在时，往往也会形成DNAzyme，背景高。因此，有必要开发一种新型催化信号放大检测靶标DNA的方法。
发明内容
本发明的目的在于构建dsDNA-SYBR Green I（SG）光敏催化的化学发光检测体系，以用于低背景、高灵敏且无标记的检测核酸。
本发明通过引入氧化还原介质K4[Fe(CN)6]将dsDNA-SG的光敏作用产生的活性物种单线态氧储存起来，使K4[Fe(CN)6]氧化成K3[Fe(CN)6]来进一步提高单线态氧的氧化能力，使K3[Fe(CN)6]氧化鲁米诺产生化学发光。该简单的储存步骤不仅避免了光照对化学发光的影响，而且消除了化学发光碱性条件对dsDNA-SG造成的解离，进一步提高检测DNA的灵敏度，产生的K3[Fe(CN)6]可使鲁米诺化学发光的强度提高约30倍，并建立了一种无标记、无分离检测pM级别的DNA方法。
本发明的技术方案如下：
（1）在96微孔板中加入目标基因及其互补链、NaH2PO4缓冲溶液，室温孵育60 min后，加入SG染料孵育15 min使之形成dsDNA-SG复合物；
（2）在上述孵育后的溶液中加入K4[Fe(CN)6]溶液，用蓝色LED灯（3W）光照30min，将K4[Fe(CN)6]氧化为K3[Fe(CN)6]。
（3）取该光照后溶液加入鲁米诺（pH = 11.5）中，室温条件下，用化学发光仪测定其化学发光强度，通过化学发光信号定量检测DNA。
发明效果
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）灵敏度高。该法可检测pM级的DNA，是目前无外加信号放大技术中最灵敏的方法之一。
（2）成本低。本方法无需标记，降低了检测成本。
（3）操作简便。无需分离等过程，能在短时间内完成样品的检测。
具体实施方式
实施例1
取一定体积的BRCA1基因（5’-GAG CAT ACA TAG GGTTTCTCTTGGTTT-3’），15 μL浓度为200 nM的BRCA1互补链（CS-BRCA1：5’-AAA CCA AGA GAAACC CTA TGTATG CTC-3’）于体积为300 μL的多孔板中，加入一定体积的NaH2PO4缓冲溶液孵育60 min后，加入2.4 μL浓度为250×的SG染料孵育15 min；然后再加入15 μL浓度为1 mM的K4[Fe(CN)6]溶液，置于蓝色LED灯下（3W）光照30 min。最后取光照后样品100 μL加入100 μL浓度为2.0 mM的鲁米诺（pH =11.5），室温条件下，用化学发光仪测定化学发光强度，依据所得信号强度检测BRCA1基因的浓度。
实施例2
取一定体积的BRCA2基因（5’-AAA GGGCTTCTG ATT-3’），15 μL浓度为200 nM的BRCA2互补链（CS-BRCA2：5’-AAT CAG AAG CCC TTT-3’）于体积为300 μL的多孔板中，加入一定体积的NaH2PO4缓冲溶液孵育60 min后，加入2.4 μL浓度为250 ×的SG染料孵育15 min；然后再加入15 μL浓度为1 mM的K4[Fe(CN)6]溶液，置于蓝色LED灯下（3W）光照30 min。最后取光照后样品100 μL加入100 μL浓度为2.0 mM的鲁米诺（pH = 11.5），室温条件下，用化学发光仪测定化学发光强度，依据所得信号强度检测BRCA2基因的浓度。
实施例3
取一定体积的p53基因（5’-TTC CTC TGTGCGCCGGTCTCTCCT-3’），15 μL浓度为200 nM的p53互补链（CS-p53：5’-AGG AGA GACCGGCGCACA GAG GAA-3’）于体积为300 μL的多孔板中，加入一定体积的NaH2PO4缓冲溶液孵育60 min后，加入2.4 μL浓度为250 ×的SG染料孵育15min；然后再加入15 μL浓度为1 mM的K4[Fe(CN)6]溶液，置于蓝色LED灯下（3W）光照30 min。最后取光照后样品100 μL加入100 μL浓度为2.0 mM的鲁米诺（pH = 11.5），室温条件下，用化学发光仪测定化学发光强度，依据所得信号强度检测p53基因的浓度。
采用实施例1、2、3检测BRCA1、BRCA2、p53基因的检出限分别为3.0 pM、6.0 pM和5.0 pM。通过改变识别探针该体系可应用于任何靶标核酸的检测。
Claims (5)
1.一种基于dsDNA-SYBR Green I光敏催化的化学发光传感方法，其特征在于包括以下三个步骤：
（1）将目标基因和相应的互补链（即识别探针）在室温下孵育一段时间形成双链DNA，继而与SYBR Green I (SG) 孵育形成dsDNA-SG复合物,（2）在上述的溶液中加入一定量的K4[Fe(CN)6]，在蓝色LED灯照射下，染料SG的光敏作用产生1O2，1O2具有较高的反应活性，可将K4[Fe(CN)6]氧化为K3[Fe(CN)6],（3）取光照后的溶液，加入碱性鲁米诺溶液，K3[Fe(CN)6]氧化鲁米诺产生化学发光，并根据化学发光的信号对目标DNA进行定量分析。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于孵育形成dsDNA的时间为1h，孵育dsDNA-SG复合物时间为15 min。
3.按权利要求1所述的方法，所采用储存1O2氧化能力的试剂为K4[Fe(CN)6] 。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于LED灯颜色为蓝色，光照时间为30 min。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于光照时溶液的pH为7.4，测化学发光时鲁米诺的pH为11.5。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN114341627A (zh) * | 2019-11-13 | 2022-04-12 | 李峰 | 核酸检测方法及装置 |
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| US20050153285A1 (en) * | 2001-03-13 | 2005-07-14 | Yoshio Umezawa | Electrochemical detection method of complementarity to nucleic acid bases |
| CN106868118A (zh) * | 2017-02-10 | 2017-06-20 | 成都理工大学 | 一种基于两端锁定DNA酶的分子信标识别miRNA新方法 |
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