CN110241169A - 一种蛋氨酸产生菌的平板快速筛选方法 - Google Patents

Abstract

蛋氨酸产生菌的筛选，通常采用调取平板上出现的单菌落到摇瓶中，培养一段时间，采用分光光度法、层析或氨基酸分析仪等方法分析发酵液中是否含有蛋氨酸来分析，此方法较费时。本发明简化了此流程，待平板中长出菌落，并培养一定时间后，将一系列硝普钠试剂，按时按量直接加入到菌落表面，反应后，观察颜色是否出现红色，得出此菌落是否可能产生蛋氨酸。此发明减少了蛋氨酸产生菌的筛选耗时，提高了筛选效率。

Description

一种蛋氨酸产生菌的平板快速筛选方法

技术领域

本发明涉及一种蛋氨酸产生菌的快速筛选鉴定。农业科技领域。

背景技术

蛋氨酸是一种含硫氨基酸，是人和家畜的必须氨基酸。蛋氨酸在代谢过程中为人体或家畜提供硫源。缺乏蛋氨酸会引起亚健康。市场中会利用牛磺酸、谷胱甘肽等物质的代谢提供所需含硫氨基酸。

蛋氨酸的来源，目前市场中主要以化学合成的为主，发酵法合成蛋氨酸因其能产生纯L-蛋氨酸、降低成本、降低污染等而备受青睐。

为了获得可产生蛋氨酸的菌株，常用的筛选方法为：通过平板划线获得单菌落，将其单菌落接种到液体培养基中，发酵一段时间后，离心获得发酵上清液，再对上清液中蛋氨酸含量进行分析。

发酵液中蛋氨酸含量的测定多数采用氨基酸分析仪测定，这种测定方法较为准确，缺点是耗时长，一个样品的测定大约需要1.5 h。分光光度法测定蛋氨酸含量因其操作简单而被大家追寻，但分光光度法大多采用茚三酮法，而其它氨基酸也有类似的反应，因此，会干扰蛋氨酸含量的测定。

在文献1中，有提到硝普钠法测定氨基酸含量，能与硝普钠试剂反应的氨基酸种类较少，且能反应的氨基酸获得的颜色也不同，所以这种方法在操作流程处理得当时，是可以推广的。

本发明的目的是利用硝普钠法的实验原理，在平板筛选时，迅速选定蛋氨酸产生菌。

现有技术文献

文献1：Optimization of fermentation conditions of Bacillus thuringiensisEC1 for Enhanced methionine production, V.N.Anakwenze; Greenstein and Wintz；

文献2：生物化学实验 第五版 陈钧辉 李俊主编 北京:科学出版社2014.05

发明内容

本发明主要基于硝普钠反应的实验原理：在碱性条件下硝普钠与氨基酸反应，酸性条件下不同氨基酸显示出不同的颜色。

通过文献中提供的方法，确定是否其它氨基酸硝普钠法测定后颜色与蛋氨酸颜色反应结果不同。结果为蛋氨酸与硝普钠试剂反应后呈现红色，而且发酵液中含有蛋氨酸时，反应结束后也形成红色。组氨酸经硝普钠反应后出现深红色，其最大吸收峰与蛋氨酸接近，但这并不影响硝普钠法的使用。虽然组氨酸与蛋氨酸经硝普钠反应后的颜色接近，但还是能观察出其颜色的差异。如果还是不能确定，可利用氨基酸分析仪分析进一步判断。但其它几种发酵液中可能出现的氨基酸，颜色变化不明显。确定可以用硝普钠法测定发酵液中蛋氨酸含量，基本不会受到代谢过程中其它氨基酸的影响，且反应现象明显。

在硝普钠反应过程中，提出要加入甘氨酸、磷酸。那么甘氨酸和磷酸的加入是否会影响颜色的变化，以及它们的添加量对颜色变化的影响程度如何，利用紫外-可见分光光度计对加或不加甘氨酸和磷酸的反应液扫描最大吸收峰。结果显示为不加入甘氨酸与磷酸时，试管中溶液颜色不发生变化。反应中只有加入磷酸后，溶液颜色才会出现红色。溶液颜色为红色时，其最大吸收峰在490-560nm之间。通过测定最大吸收峰，加入磷酸后最大吸收峰出现在512nm处。甘氨酸的加入降低了整个吸收光谱的吸收值，对于吸收光谱曲线形态没有改变。这种方式，同时也降低了蛋氨酸的检测限。所以，通过添加甘氨酸来消除其它试剂的干扰，对于平板筛选没有影响。

具体实施方式

种子培养基：葡萄糖50 g 蛋白胨 30 g 酵母浸膏 5 g 尿素 3 g KH₂PO₄ 1.5 gK₂HPO₄ 0.5 g MgSO₄·7H₂O 0.5 g H₂O 1 L pH 7.0-7.2。

发酵培养基：葡萄糖110 g 尿素 8 g KH₂PO₄ 1 g MgSO₄·7H₂O 0.2 g FeSO₄·7H₂O 0.2 g MnSO₄·H₂O 0.2 g (NH₄)₂SO₄ 2 g 生物素 5 μg/100mL 硫胺素200 μg/100mL(分消) 琼脂粉 20 g H₂O 1 L pH 6.5。

将诱变后的某菌悬液取100μL，涂布到含发酵培养基的平板中，30 ℃培养1-2 d。待菌株在平板培养基上明显长出，将菌落用无菌牙签一一平行接种到两个发酵培养基平板中，做好标记。30 ℃培养4 d，向每个菌落滴加10μL 10 % NaOH，滴加1μL 10 %硝普钠，静置20 min，滴加10μL浓磷酸，反应5 min。观察菌落本身与菌落周围颜色。菌落出现微红（图1），甚至菌落周围出现粉红色，说明此菌落可能产生蛋氨酸。

将可能产生蛋氨酸的菌接种到种子培养基中，24 h后，以10%（v/v）接种量，接种到发酵培养基中，30 ℃，200 r/min摇床培养4 d，取出发酵液，准备分析。

小离心管中放入400 µL上清液，100 µL 10% 磺基水杨酸；置冰箱中2 - 8°C 冷藏静置60 min；置离心机中以14.500 rpm 离心15 min；取上层清液再次以14.500rpm 离心5min； 经0.22-0.45um过滤器过滤后，在AA300氨基酸分析仪上分析。结果如图2。

分析图2中样品与标准品的蛋氨酸的峰面积，蛋氨酸的含量约为0.672 g/L。说明与平板分析结果一致。此平板筛选方法可靠。

附图说明：

图1 在固体发酵液平板中，长出的菌落，经硝普钠试剂反应后的结果；

图2 图1中31号菌经接种到种子培养基，之后发酵液中培养后，发酵液经处理，于氨基酸分析仪中分析的结果。

Claims (6)

1.待菌株在平板培养基上明显长出，向每个菌落滴加10 % NaOH，滴加硝普钠，静置20min，滴加浓磷酸，反应5 min，观察菌落本身与菌落周围颜色，菌落出现微红，甚至菌落周围出现粉红色，说明此菌落可能产生蛋氨酸。

2.如权利要求1中，准备分析的平板菌株需要事先在另一个相同平板中培养，以便分析结束后，对相应的菌株扩增、分析与保存。

3.如权利要求1中，10% NaOH滴加量为10μL。

4.如权利要求1所述的硝普钠浓度为10 %，滴加量为1μL；此试剂最好现配现用。

5.如权利要求1所述的浓磷酸滴加量为10μL。

6.如权利要求1中，所用平板培养基，葡萄糖单独灭菌后加入其培养基中，以免灭菌过程中产生羰氨等会对分析有影响的有色物质。