CN110241045B - 一种巨大芽孢杆菌及其在麻疯籽饼粕发酵脱毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巨大芽孢杆菌，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC NO：M2019448。本发明还公开了巨大芽孢杆菌在麻疯籽饼粕的发酵脱毒中的应用。本发明保藏号为CCTCC NO：M2019448的巨大芽孢杆菌,可以有效降低麻疯籽饼粕有毒成分，提高麻疯籽饼粕的应用价值。

Description

一种巨大芽孢杆菌及其在麻疯籽饼粕发酵脱毒中的应用

技术领域

本发明属于发酵领域，具体涉及一株巨大芽孢杆菌及其在麻疯籽饼粕发酵脱毒中的应用。

背景技术

麻疯树是一种生物能源树种，在我国西南地区种植面积广泛。麻疯籽榨油后的饼粕年产量近百万吨且富含蛋白质，具有很好的开发为新型蛋白饲料资源的潜力。但其中含有佛波醇及其衍生物、麻疯树萜醇等多种难以去除的有毒成分,直接饲喂动物会引发腹泄、脱水、部分器官出血甚至死亡。这些毒性成分的存在使麻疯籽饼粕的利用受到了制约。若能降低其毒性，则可作为饲用蛋白使用，缓解养殖业日益加剧的蛋白质饲料原料紧缺状况。

近年来,为解决麻疯籽饼粕的利用问题，国内外学者就如何对麻疯籽饼粕进行脱毒做了大量的试验研究，常见的有加热、微波处理、超滤去除、碱处理法、醇类溶液浸泡法等理化脱毒方式。理化脱毒只能去除部分毒素，并且干物质损失严重，同时还存在适口性差、处理成本较高、工业化生产污水难以处理易造成污染的问题，所以仅用简单的物理或化学方法处理来脱毒难以达到预期的结果。

微生物固态发酵技术做为一种新型生物学脱毒方法，不仅具有脱毒效率高、成本小、后处理简单、营养成分损失小的优点，还能增加产品的适口性以及进一步提高蛋白质和营养因子的含量。如中国专利CN108102949A公开了一株高效降解佛波酯的阴沟肠杆菌及其在麻疯籽饼粕发酵脱毒中的应用，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) Z11可以有效降低麻疯籽饼粕有毒成分，发酵时间5天，佛波酯的去除率可达51.6%。中国专利CN104082525A公开了一种栖异地克雷伯氏菌在麻疯籽饼粕发酵脱毒中的应用，栖异地克雷伯氏菌（Klebsiella variicola)LY-1可以有效降低麻疯籽饼粕有毒成分，发酵时间48小时，佛波酯的去除率可达84.3%。中国专利CN103509738A公开了一种日沟维肠杆菌及其在麻疯籽饼粕发酵脱毒中的应用，日沟维肠杆菌（Enterobacter gergoviae）zxy-15,可以有效降低麻疯籽饼粕有毒成分，发酵时间8天，佛波酯的去除率最高达到55.6%。这些现有的利用微生物固态发酵脱毒麻疯籽饼粕的方法中有几个关键点还值得探讨和改进:（1）以往人们主要采取液相色谱法测定佛波酯来确定麻疯籽饼粕中毒性成分含量，但佛波酯只是麻疯籽饼粕中的一种毒素，它自身可以衍生出多种结构类似物质，目前已被报道的就有8种以上。而且王兴红等（2013）的研究认为即使饼粕中佛波酯毒素在检测限以下，对动物还是具有相当大的毒性，并通过分离毒素成分及动物模型毒性试验确定了麻疯籽饼粕的主要毒性成分为羟基脂肪类化合物和分子式为C₁₀H₁₈O₄的化合物。这说明采用液相色谱测定佛波酯含量的方法来对麻疯籽饼粕的毒性进行评估存在片面性。（2）未考虑到各种毒性成分在降解过程的毒性联合作用：当原料中同时存在多种毒素时，它们对生物的作用远比单一毒物的作用复杂。不但各种毒素之间存在相加、协同、拮抗等相互作用，而且这些毒素的降解产物还有可能等同或增加原本毒性。已有文献表明，佛波酯的降解无侧链母核结构产物具有与其同等的生物毒性。（3）缺乏对脱毒菌株本身安全性的相应研究：传统的仪器检测分析尽管已较为灵敏,但对于微生物所产毒素的检测仍存在多指标分析、对未发现或难检测物质无法做出鉴定等缺点。仪器未检测到微生物毒素并不一定表明菌株是安全的,难以从根本上排除菌株的潜在危险。综上，相对于孤立的通过理化方法测定单一毒素的含量来评价微生物发酵麻疯籽饼粕的脱毒效果和安全性，利用动物生存率试验法来直接测定饼粕的毒性降解率更为合理。

现有文献报道的对麻疯籽饼粕中的毒性成分进行评估的试验动物有山羊、绵阳、鸡、牛、小鼠、大鼠等，生物评估方法简单直观,但周期过长,所需样品过多,不利于试验快速、有效的进行。Makkar等（l999）发现草鱼、罗非鱼、小鲤鱼对麻疯籽饼粕中的毒性成分非常敏感,且试验时间周期短、样品需求量少、快速、简便,可做为麻疯籽饼粕的毒性评估模型。付亮亮(2011)和刘丽(2016)也分别成功建立了小鲤鱼、食蚊鱼毒性评估模型，用于对麻疯籽饼粕中的毒性成分进行检测和追踪。

斑马鱼(Danio rerio)是国际公认的化学品安全性评价和急性毒性检测的标准鱼类，具有生存能力强、易于饲养、存活率高、生长周期短、对毒物反应敏感等特点。而且斑马鱼与高等哺乳动物的发育进程、基因调控模式等相比均高度保守，这意味着用斑马鱼开展安全性试验所得到的结果在多数情况下也适用于哺乳动物。因此，可以利用斑马鱼的生存试验来综合评估发酵麻疯籽饼粕的脱毒效果,为麻疯籽饼粕的脱毒利用提供基础数据。

发明内容

鉴于上述不足之处，本发明的目的在于提供一种巨大芽孢杆菌及其在麻疯籽饼粕发酵脱毒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种巨大芽孢杆菌，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC NO：M2019448的巨大芽孢杆菌SCYA10（Bacillus megaterium SCYA10）。

进一步的，所述巨大芽孢杆菌SCYA10（Bacillus megaterium SCYA10），其16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还研究了巨大芽孢杆菌SCYA10（Bacillus megaterium SCYA10）在麻疯树饼粕的发酵脱毒中的用途。

本发明还提供了一种麻疯树饼粕的发酵脱毒方法，包括如下步骤：

（1）制备巨大芽孢杆菌菌株SCYA10的发酵种子液；

（2）取麻疯树饼粕粉碎过60目筛，加水混匀，接种步骤(1)制备的发酵种子液，在温度32℃～40℃条件下发酵17-23d。

进一步的，所述巨大芽孢杆菌菌株SCYA10的发酵种子液的是由如下制备方法制得：

①.菌株制备：

将SCYA10的菌种斜面接种1环到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 的恒温振荡培养16h；

②.发酵种子液的制备：

将培养好的菌液以2%的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养16h，制成发酵种子液；

进一步的，所述步骤（2）中料水比为1:0.8～1(w/v)，种子液的接种量为麻疯树饼粕的 15～20％(v/w)。

进一步的，所述步骤（2）中料水比为1:0.8 (w/v)，种子液的接种量为麻疯树饼粕的 15％(v/w)。

进一步的，所述步骤（2）中发酵温度为36℃，发酵时间为17天。

进一步的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸馏水1000 ml， pH为7.4-7.6。

本发明所述的巨大芽孢杆菌SCYA10在最优固态发酵参数下对麻疯籽饼粕的脱毒率达88%，粗蛋白含量较未发酵前提升了12.88个百分点，粗纤维的含量降低了3.88个百分点，显著改善提升了麻疯籽饼粕原料的营养价值。

附图说明

图1为麻疯籽饼粕甲醇提取物对斑马鱼的毒性试验模型曲线图。

图2为SCYA10菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上24h的生长形态照片图。

图3为SCYA10培养16h的革兰氏染色图。

图4为SCYA10的扫描电镜观察图。

图5为SCYA10基因组16S rDNA扩增产物电泳结果图。

图6为菌株SCYA10基于16S rDNA序列构建的系统发育树示意图。其中，图中所涉及到的拉丁种名中文释义如下：Bacillus megaterium巨大芽孢杆菌；Bacillus firmus坚强芽孢杆菌；Bacillus licheniformis地衣芽孢杆菌；Bacillus cereus蜡样芽孢杆菌；Brevibacillus laterosporus侧孢短芽孢杆菌；Serratia fonticola居泉沙雷氏菌。

图7为SCYA10菌株的生长曲线图。

图8为SCYA10接种量对斑马鱼生存率的影响图。

图9为SCYA10初始含水量对斑马鱼生存率的影响图。

图10为SCYA10发酵温度对斑马鱼生存率的影响图。

图11为SCYA10发酵时间对斑马鱼生存率的影响图。

图12为各发酵因素对斑马鱼生存率影响的极差图。

具体实施方式

实施例1

麻疯籽饼粕发酵脱毒菌株的筛选

一．材料与仪器

1. 材料

麻疯籽饼粕：将购于云南神宇新能源有限公司的物理压榨麻疯籽饼粕粉碎过60目筛，即得。

斑马鱼(Danio rerio)：购于成都郫县鼎犀名城锦城水族馆。

初筛和驯化平板培养基：麻疯籽饼粕100g、琼脂15g、蒸馏水1000毫升、自然pH。

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸馏水1000 ml，pH7.4-7.6。

固态发酵培养基：称取30g麻疯籽饼粕于250mL三角瓶中,按试验设定的不同筛选条件调节初始含水量。

试验中所配制培养基均采用高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min。

2.主要仪器和试剂

哈东联超洁净工作台FLC-3、SHENAN手提式高压蒸汽灭菌锅DSX-30L、荣华气浴恒温振荡器SHZ-82、Thermo Scientific恒温培养箱 3111、超声波清洗仪KQ-250B、FW135植物粉碎机、电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240A、SIEMENS冰箱BCD-232、紫外分光光度计（UV1100)、RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、METTLER (AE200型）十万分之一天平、离心机、10ml容量瓶、可调式移液器、三角瓶、接种环、烧杯、鱼缸。

二．试验方法与步骤

1．麻疯籽饼粕中毒性成分粗提物的提取

将麻疯籽饼粕于60℃烘箱烘干后，称取20g于250ml三角瓶中中，加入120ml甲醇超声提取1h，离心分离上清，再加入120ml甲醇重复超声提取2次，合并3次的上清液，置于旋转蒸发仪下浓缩，得到黄褐色黏稠物。

2. 麻疯籽饼粕甲醇提取物对斑马鱼的急性毒理实验

称取0.6g的麻疯籽饼粕甲醇提取物，加入1.8ml的DMSO溶液助溶后备用。实验养鱼容器为方形玻璃鱼缸(240mm×140mm×180mm)，每个鱼缸加入2L经太阳曝晒3d的脱氯自来水。根据预实验结果，设置9个梯度的麻疯籽饼粕甲醇提取物添加水平，其在水中的终浓度分别为：6、12、18、24、30、36、42、48、54mg/L，同时设清水空白对照组和最大DMSO浓度溶液对照组(162μL)，每组设置3个平行，数据取平均值。各缸的溶质和水经超声波震荡10min充分混匀后，分别加入10尾健康的30±5mm的斑马鱼,控制水温在23±1℃。试验开始后连续观察中毒症状、死亡时间、数量,并及时用网勺捞出死鱼,记录96h各组斑马鱼的存活和死亡情况。试验期间不投饵,每24h更换试验液1次,换水量100%,以使实验期间溶质的浓度尽量保持一致。试验对死鱼的判断标准为：以呼吸停止及对外界刺激无反应作为死亡的判断依据，即当试验鱼中毒后鳃盖完全停止活动,用玻璃棒轻轻刺激鱼体 5 min无反应,即确定为死亡。

3. 发酵脱毒菌株的富集和筛选

将麻疯树籽饼粕掩埋于地下5-10cm深处的腐蚀质土壤中，一个月后采集周围土壤样品，经麻疯树籽饼粕固态培养基进行5轮驯化筛选培养，将获得的菌株于37℃、180r/min进行液体摇瓶培养16h后，以10%的接种量(v/w)接种到高压灭菌后的麻疯籽饼粕：水=1:1的半固体培养基（其中饼粕30g、水30ml）中，于37℃恒温培养箱中发酵5d,参照“1．麻疯籽饼粕中毒性成分粗提物的提取”将每个发酵饼粕的甲醇提取物按44mg/L（LC₉₉值）的量加入到鱼缸中，超声波使其充分溶解达到饱和状态,溶解后每缸放入10条斑马鱼,记录斑马鱼96h的生存率。

4.菌株的鉴定

（1）菌株形态及生理生化特征

参照《伯杰鉴定细菌学手册》(第9版)( Holt et al.,1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等,2001)等相关文献,按常规方法鉴定菌株的形态、生理生化特性。

（2）分子生物学特征

采用菌落PCR技术扩增菌株16S rDNA基因序列，具体操作：将细菌接种在平板上，37℃培养24h。取单一菌落悬浮于50μl无菌蒸馏水中,100℃水浴加热5min,上清液为PCR模板DNA。用Omega细菌DNA提取试剂盒( E.Z.N.A.® Bacterial DNA Kit)DNA抽提试剂盒，提取菌株的总DNA。用细菌16S rDNA扩增引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TTGGTTACCTTGTTACGACTT)为上下游引物扩增16S rDNA片段，并进行电泳。凝胶电泳检测扩增效果合格后,将PCR产物送至南昌科畅生物公司进行Sanger测序，并利用ContigExpress拼接程序进行拼接。将序列提交NCBI数据库进行Blast比对分析，鉴定种属信息。

三、试验结果

1. 斑马鱼毒性曲线的绘制

清水对照组和DMSO最高浓度对照组在96h试验期内均无个体死亡情况。将不同浓度甲醇提取物对斑马鱼的致死率做如图1的毒性曲线，可见麻疯籽饼粕的甲醇提取物的添加浓度与96h斑马鱼死亡率呈密切相关关系。当添加浓度在42mg/L及以上时,对斑马鱼的致死率达到100%。根据每组的总斑马鱼个数和死亡个数，利用SPSS 24.0软件中的Probit 模块（概率单位回归），求出96 h甲醇提取物对斑马鱼的半数致死浓度LC₅₀和极端高效应致死浓度LC₉₉值分别为21.137mg/L和43.945mg/L。根据鱼类急性毒性实验毒性分级标准，麻疯籽饼粕的甲醇提取物属于中度毒性物质（10-100mg/L）。后续的发酵脱毒效果验证比对试验取极端高效应致死浓度LC₉₉值43.945mg/L作为添加浓度。

2.发酵脱毒菌株的筛选和鉴定

（1）菌株的筛选

经多轮富集和驯化获得一株能耐受麻疯籽饼毒素且生长速度较快的细菌菌株，经该菌株固态发酵5d麻疯籽饼粕的甲醇提取物对斑马鱼的生存率相比未发酵组提升43.33%，命名为SCYA10。

（2）菌株形态学鉴定

将SCYA10点种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，37℃培养48h,其菌落呈圆形或不规则（详见图2），革兰氏染色阳性（详见图3），孢子囊不明显膨大（详见图4）。

（3）菌株分子生物学鉴定

对本发明分离株的总DNA进行PCR扩增，得到约1.5kb的扩增产物（详见图5）。

SCYA10的16S rDNA扩增产物碱基序列如下：

1 TAGGCATTGG GGGGGGTGCC TATACATGCA AGTCGAGCGA ACTGATTAGA AGCTTGCTTC

61 TATGACGTTA GCGGTGAGGG TGAGTAACAC GTGGGCAACC TGCCTGTAAG ACTGGGAAGC

121 TTCGGGAAAC CGAAGCTAAT ACCGGATAGG ATCTTCTCCT TCATGGGAGA TGATTGAAAG

181 ATGGTTTCGG CTATCACTTA CAGATGGGCC CGCGGTGCAT TAGCTAGTTG GTGAGGTAAC

241 GGCTCACCAA GGCAACGATG CATAGCCGAC CTGAGAGGGT GATCGGCCAC ACTGGGACTG

301 AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA TCTTCCGCAA TGGACGAAAG

361 TCTGACGGAG CAACGCCGCG TGAGTGATGA AGGCTTTCGG GTCGTAAAAC TCTGTTGTTA

421 GGGAAGAACA AGTACGAGAG TAACTGCTTG TACCTTGACG GTACCTAACC CCAAAGCCAC

481 GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG CAAGCGTTAT CCGGAATTAT

541 TGGGCGTAAA GCGCGCGCAG GCGGTTTCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCA CGGCTCAACC

601 GTGGAGGGTC ATTGGAAACT GGGGAACTTG AGTGCAGAAG AGAAAAGCGG AATTCCACGT

661 GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATGTGGAGG AACACCAGTG GCGAAGGCGG CTTTTTGGTC

721 TGTAACTGAC GCTGAGGCGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT

781 CCACGCCGTA AACGATGAGT GCTAAGTGTT AGAGGGTTTC CGCCCTTTAG TGCTGCAGCT

841 AACGCATTAA GCACTCCGCC TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA AAGGAATTGA

901 CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG AAGCAACGCG AAGAACCTTA

961 CCAGGTCTTG ACATCCTCTG ACAACTCTAG AGATAGAGCG TTCCCCTTCG GGGGACAGAG

1021 TGACAGGTGG TGCATGGTTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA

1081 ACGAGCGCAA CCCTTGATCT TAGTTGCCAG CATTTAGTTG GGCACTCTAA GGTGACTGCC

1141 GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC GTCAAATCAT CATGCCCCTT ATGACCTGGG

1201 CTACACACGT GCTACAATGG ATGGTACAAA GGGCTGCAAG ACCGCGAGGT CAAGCCAATC

1261 CCATAAAACC ATTCTCAGTT CGGATTGTAG GCTGCAACTC GCCTACATGA AGCTGGAATC

1321 GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC

1381 CCGTCACACC ACGAGAGTTT GTAACACCCG AAGTCGGTGG AGTAACCGTA AGGAGCTAGC

1441 CGCCTTAAGT TGACCAGATT T

根据16S rDNA基因序列在NCBI网站上进行Blast比对，得出该菌株与巨大芽孢杆菌属（Bacillus megaterium）序列相似性达到99%。将GenBank中的相近菌株序列作为参比序列，用MEGA软件以邻位相接法建树，构建系统进化树如图6所示，菌株SCYA10与Bacillus megaterium的同源性较高。

（4）菌株生理生化特征鉴定

由表1可见,本发明菌株产芽孢、接触酶阳性、V-P测定阴性、淀粉水解试验阳性、干酪素分解试验阳性、能利用柠檬酸盐,符合巨大芽孢杆菌的特征。

表1 菌株的生理生化特征

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结合菌体形态特征、生理生化特征鉴定结果以及分子生物学特征,将本发明分离菌株鉴定为巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium),命名为巨大芽孢杆菌SCYA10 (Bacillus megaterium SCYA10),并于2019年6月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号为CCTCC NO: M2019448，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。

实施例2

巨大芽孢杆菌SCYA10固态发酵麻疯籽饼粕的单因素考察

一． 试验方法与步骤

1.菌株制备

将SCYA10的菌种斜面接种1环到牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、180r/min 的恒温振荡培养16h。

2.生长曲线的测定及接种时间的确定

以未接种的液体培养基作空白，在600nm波长下测定不同的培养时间下菌液的吸光度值。以培养时间为横坐标，以菌液的吸光度值作纵坐标绘制SCYA10的生长曲线。后续固态发酵的接种菌取对数生长期的培养物。

具体操作如下:

（1）取63个250ml无菌锥形瓶,分别标记培养时间,即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40h，每个时间点做三个重复。

（2）接种用可调式移液器吸取1ml培养了16h的SCYA10菌悬液分别转入63个盛有50ml牛肉膏蛋白胨细菌培养液的锥形瓶中,置于37℃、180rpm恒温振荡器中,分别培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40h，按照培养时间将标有相应的时间的锥形瓶取出,置于冰箱(4℃)中储存,最后一同比浊测定其光密度值。

（3）比浊测定用未接种的细菌培养液作为空白对照,选用600nm波长进行测定。

（4）绘制生长曲线以培养时间为横坐标,以所测定的OD值为纵坐标绘制SCYA10菌的生长曲线。

3. 发酵种子液的制备

将培养好的菌液以2%的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养16h，制成发酵种子液。

4. 固态发酵各单因素适宜水平考察

称取30g麻疯籽饼粕于250mL三角瓶中,用8层无菌纱布封口，121℃灭菌20min。选择不同固态发酵条件进行试验，搅拌均匀，静置培养，发酵过程中定时采样，发酵后于60℃烘干、粉碎。

（1）接种量对斑马鱼生存率的影响

将种子菌液设定为10%、15%、20%、25%，30%等5个总接种量(v/w)水平，每个处理5个重复。料水比设为1:1，分别对麻疯籽饼粕进行发酵，于37℃恒温培养箱中培养10d，测定各发酵水平组的甲醇提取物对斑马鱼的生存率的影响。

（2）料水比对斑马鱼生存率的影响

设置料水比为1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4这5个水平，每个处理5个重复。接种量20%，于37℃恒温培养箱中分别培养10d后，测定各发酵水平组的甲醇提取物对斑马鱼的生存率的影响。

（3）发酵温度对斑马鱼生存率的影响

设置28℃、32℃、36℃、40℃、44℃这5个发酵温度，每个处理5个重复。接种量20%，料水比设为1:1，分别对麻疯籽饼粕进行发酵，恒温培养箱中培养10d后，测定各发酵水平组的甲醇提取物对斑马鱼生存率的影响。

（4）发酵时间对斑马鱼生存率的影响

发酵时间分别设定为5d、10d、15d、20d、25d，每个处理5个重复。接种量为20%，料水比为1:1，37℃恒温条件下分别对麻疯籽饼粕进行发酵，测定各发酵水平组的甲醇提取物对斑马鱼生存率的影响。

二． 试验结果

1.SCYA10生长曲线的测定

SCYA10 菌株培养液不同时间点的OD值测定结果见图7，从图7可以看出，经过一级活化后的菌种转接到新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，菌株从第12h进入对数生长期，生长快速，16h达到对数生长末期，22h进入衰亡期。因此，为了保证发酵菌株的生长活力，后续发酵选择培养14-16h作为SCYA10的接种时间，经平板计数活菌数达至10⁶-10⁸个/ml，达到接种要求。

2. 固态发酵各单因素的适宜水平

（1）接种量对斑马鱼生存率的影响

菌种在固态发酵中只能自我增殖扩散汲取营养物，接种量的大小在固态发酵过程中直接影响到饼粕的发酵。为了考察麻疯籽饼粕发酵脱毒过程中适宜的接种量，分别选取10%、15%、20%、25%，30% 这5个接种量水平，用发酵饼粕的甲醇提取物对斑马鱼进行生存率测试，结果如图8。由图8可知：斑马鱼生存率在接种量为15%达到66%，继续增大接种量对斑马鱼的生存率提升效果不显著。

（2）料水比对斑马鱼生存率的影响

培养基湿度是固态发酵必需考虑的一个重要参数，干燥或过湿都会引起渗透压不平衡，抑制微生物的生命活动。为了考察麻疯籽饼粕发酵脱毒适宜的料水比，分别选取1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4这5个料水比水平，用发酵饼粕的甲醇提取物对斑马鱼进行生存率测试，结果如图9。由图9可知：当料水比为1:0.8时斑马鱼的生存率最高，达到76.0%，水分过高或过低均不利于菌株对饼粕的发酵脱毒。

（3）发酵温度对斑马鱼生存率的影响

微生物都具有最适的发酵温度。当发酵温度较低时，微生物的代谢活动较弱，而发酵温度过高则对微生物的生长和代谢活动有影响。为了考察发酵温度对麻疯籽饼粕发酵的影响，分别选取28℃、32℃、36℃、40℃、44℃作为发酵温度，用发酵饼粕的甲醇提取物对斑马鱼进行生存率测试，结果如图10。菌株SCYA10对饼粕进行固态发酵后，斑马鱼的生存率随着发酵温度的升高，呈现先升高后降低的趋势，发酵温度为36℃时，斑马鱼的生存率最高，达到 82%。

（4）发酵时间对斑马鱼生存率的影响

微生物不可无限期的繁殖，发酵时间是影响发酵的重要参数。微生物具有较强的繁殖能力，由于微生物的生长都遵循典型生长曲线的四个时期，因此，选择最佳发酵时间既不会造成资源的浪费，也不会因发酵周期延长导致更易染菌。本试验选择了5d、10d、15d、20d和25d五个梯度进行考察，用发酵饼粕的甲醇提取物对斑马鱼进行生存率测试，结果见图11。菌株SCYA10对饼粕进行固态发酵后，毒性的下降幅度随着发酵时间的延长而增加，发酵时间为20天时斑马鱼的生存率可达84%,但发酵时间继续增加时，斑马鱼的生存率提升不明显。

实施例3

正交试验优化发酵条件

在单因素试验的基础上，对接种量、料水比、发酵温度、发酵时间四个因素进行4因素3水平的正交设计，进一步优化发酵条件，每组5个重复。正交试验因素水平表见表2。发酵结束后，用各组发酵饼粕的甲醇提取物对斑马鱼进行生存率测试。正交试验分析结果见表3,4和图12。

表2 正交试验因素水平表

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表3发酵正交试验极差分析表

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表4发酵正交试验方差分析表

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由极差分析（表3）斑马鱼生存率的R值可知，影响结果因素的先后顺序为料水比＞发酵温度＞接种量＞发酵时间。从图12的极差图可得最佳组合为：料水比2发酵温度2接种量2发酵时间1。

由方差分析（表4）可以看出，影响斑马鱼生存率的因素依次为：料水比、发酵温度、接种量、发酵时间，其中料水比和发酵温度对结果影响显著。

因此，SCYA10对麻疯籽饼粕脱毒的最佳条件为料水比1:0.8、发酵温:36℃、接种量15%-20%、发酵时间17-23d。

实施例4

最优发酵条件验证及发酵脱毒前后麻疯籽饼粕主要营养成分分析

根据各因素的优化值结合实际试验条件，设置试验组即料水比1:0.8(w/v)、接种量15% (v/w)、发酵温度36℃、发酵时间17d，对最优发酵条件进行验证。同时设置一个对照组（不接种菌液），其他条件与实验组一致，每组设5个重复。发酵结束后，将饼粕于60℃烘干，粉碎过60目筛，部分用于测定饼粕甲醇提取物对斑马鱼生存率的影响，测得斑马鱼的平均生存率为88%，与理论预测值相近，相对偏差为2%。剩余部分用于测定干物质、粗灰分、粗脂肪、粗蛋白含量，采用GB/T 6432-1994测定粗蛋白含量，采用GB/T 6433-2006测定粗脂肪含量，采用GB/T 6434-2006测定粗纤维含量，采用GB/T50094-2010测定灰分含量。测定结果见表5。

表5发酵脱毒前后麻疯籽饼粕主要营养成分分析

。

由表5可知：发酵后麻疯籽饼粕中粗蛋白含量提升了12.88个百分点，粗纤维的含量降低了3.88个百分点，营养成分变化明显，巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)固态发酵麻疯籽饼粕显著改善了麻疯籽饼粕的潜在饲用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种巨大芽孢杆菌及其在麻疯籽饼粕发酵脱毒中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1461

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium SCYA10 16S rDNABacillus megaterium)

<400> 1

taggcattgg ggggggtgcc tatacatgca agtcgagcga actgattaga agcttgcttc 60

tatgacgtta gcggtgaggg tgagtaacac gtgggcaacc tgcctgtaag actgggaagc 120

ttcgggaaac cgaagctaat accggatagg atcttctcct tcatgggaga tgattgaaag 180

atggtttcgg ctatcactta cagatgggcc cgcggtgcat tagctagttg gtgaggtaac 240

ggctcaccaa ggcaacgatg catagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300

agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 360

tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgtta 420

gggaagaaca agtacgagag taactgcttg taccttgacg gtacctaacc ccaaagccac 480

ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggaattat 540

tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagccca cggctcaacc 600

gtggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag agaaaagcgg aattccacgt 660

gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcgg ctttttggtc 720

tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag tgctgcagct 840

aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960

ccaggtcttg acatcctctg acaactctag agatagagcg ttccccttcg ggggacagag 1020

tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080

acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag catttagttg ggcactctaa ggtgactgcc 1140

ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200

ctacacacgt gctacaatgg atggtacaaa gggctgcaag accgcgaggt caagccaatc 1260

ccataaaacc attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agctggaatc 1320

gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380

ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtgg agtaaccgta aggagctagc 1440

cgccttaagt tgaccagatt t 1461

Claims (8)

1.一种巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO：M2019448的巨大芽孢杆菌SCYA10。

2.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌在麻疯树饼粕的发酵脱毒中的用途。

3.一种麻疯树饼粕的发酵脱毒方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）制备权利要求1所述巨大芽孢杆菌的发酵种子液；

（2）取麻疯树饼粕粉碎过60目筛，加水混匀，接种步骤(1)制备的发酵种子液，在温度32℃～40℃条件下发酵17-23d。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌发酵种子液是由如下制备方法制得：

① .菌株制备：

将SCYA10的菌种斜面接种1环到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 恒温振荡培养16h；

② .发酵种子液的制备：

将培养好的菌液以2%的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养16h，制成发酵种子液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中料水比为1:0 .8～1(w/v)，种子液的接种量为麻疯树饼粕的 15～20%(v/w)。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中发酵温度为36℃，发酵时间为17天。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中料水比为1:0 .8 (w/v)，种子液的接种量为麻疯树饼粕的 15%(v/w)。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、蒸馏水1000毫升，pH为7 .4-7 .6。

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