CN110237277A - 一种新的肿瘤标记方法 - Google Patents

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Abstract

一种新的肿瘤标记方法，通过放射性碘131标记血管内皮生长因子VEGF实现，131I标记VEGF抗体通过氯胺‑T法进行，包括用PB液配置氯胺T溶液和Na2S2O5溶液。取一定量VEGF抗体于EP管，置于4℃冰箱中；依次向EP管中加入一定量Na131I溶液、PB液和氯胺T溶液；立即在电磁搅拌器下搅拌一段时间；迅速加入100μl Na2S2O5溶液终止反应。本发明通过放射性碘131标记血管内皮生长因子VEGF实现，131I标记VEGF抗体通过氯胺‑T法进行，简便、准确且高效。

Description

一种新的肿瘤标记方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种新的肿瘤标记方法。
背景技术
研究证实，肿瘤大于2mm时，主要通过新生血管输送足够的养分和排除代谢废物，并为其转移提供便利，血管生成需多种因子的参与，其中血管内皮生长因子信号通路是主要的限速环节。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，能够促进内皮细胞增生、促进血管增生、增加血管通透性、改变细胞外基质。能够通过结合分布于肿瘤血管内皮表面的VEGF抗体，调节肿瘤血管的生成。参与许多血管生成依赖性疾病的发病及其进展，主要是癌症，也包括某些炎性疾病以及风湿、类风湿、糖尿病视网膜病变等。研究证实，VEGF广泛分布于癌症患者体内，其浓度远远超过正常人。因此，可以通过检测人体内VEGF浓度达到癌症早期筛查的目的。此外，癌症患者中VEGF的浓度与肿瘤大小的变化密切相关，肿瘤数量越多，体积越大，VEGF浓度越高；肿瘤数量越少，体积越小，VEGF浓度越低。因此，VEGF的测定对于肿瘤患者病情监测及临床动态追踪有着积极意义。
目前，对于肿瘤的标记方法主要为对特定肿瘤的标志物进行检测，但此方法每种检测一般只能针对一种或几种肿瘤，广谱性较低。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种新的肿瘤标记方法。该方法通过放射性碘131标记血管内皮生长因子VEGF实现，131I标记VEGF抗体通过氯胺-T法进行，简便、准确且高效。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种新的肿瘤标记方法，通过放射性碘131标记血管内皮生长因子VEGF实现，131I标记VEGF抗体通过氯胺-T法进行。具体包括以下步骤：
1)用PB液配置氯胺T溶液和Na2S2O5溶液。取一定量VEGF抗体于EP管，置于4℃冰箱中；依次向EP管中加入一定量Na131I溶液、PB液和氯胺T溶液；立即在电磁搅拌器下搅拌一段时间；迅速加入100μl Na2S2O5溶液终止反应。
2)向Sephadex G50柱中加入一定量PB液平衡柱子，待平衡液全部流入柱中后，加入反应液；待反应液全部流入柱床后，用PB液洗脱，流出液收集于EP管中，收集液逐管在放射性核素活度计内测量。继续用PB液洗脱，直至淋洗流出液在活度计内测量活度接近本底再倒入废液瓶。
3)取一定量反应管内的标记液和131I-VEGF抗体峰产品，采用新华1号层析纸作固定相在生理盐水中展开，在层析纸的原点处用毛细管点样，进行标记率和放化纯的测定。第一峰为131I-VEGF抗体产品峰，第二峰为游离的131I峰。反应管中的标记液用作标记率的测定，标记率＝层析纸中131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率/(131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率+游离131I峰的放射性计数率)×100％。分离纯化的131I-VEGF抗体产品峰洗脱液用作放化纯的测定，放化纯＝层析纸中131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率/(131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率+游离131I峰的放射性计数率)×100％。
作为一种优选的技术方案：所述步骤1)中的氯胺T溶液及Na2S2O5溶液浓度均为0.5～2g/L。
作为一种优选的技术方案：所述步骤1)中的所取VEGF抗体浓度为1～5g/L，体积为1～5μl。
作为一种优选的技术方案：所述步骤1)中的向EP管中加入的Na131I溶液为7.4～22.2M Bq，PB液为50μl(0.05mol/L)，氯胺T溶液为50μl。
作为一种优选的技术方案：所述步骤1)中的电磁搅拌器搅拌时间为0.5～3min。
作为一种优选的技术方案：所述步骤1)中的终止液Na2S2O5为30～100μl。
作为一种优选的技术方案：所述步骤2)中的的加入的PB液为2～4ml。
作为一种优选的技术方案：所述步骤2)中的洗脱速度为5～15滴/min。
作为一种优选的技术方案：所述步骤2)中的用EP管收集的流出液体积为0.5ml。
作为一种优选的技术方案：所述步骤3)中的所取反应管内的标记液和131I-VEGF抗体峰产品量为3～5μl。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用放射性碘标记法，通过检测体内VEGF的含量及分布，简便、高效地监测体内各肿瘤的变化。本发明广谱性强适用于各种肿瘤标记；本发明灵敏度高通过VEGF抗体将放射性碘富集于病灶器官，实现早期肿瘤的标记；本发明的新颖度高，通过检测VEGF这一指标对肿瘤进行标记，市面上少见
附图说明
图1为正常小鼠尾部注射等量Na131I后位显像图；
图2为实验小鼠注射131I-VEGF抗体后位显像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种新的肿瘤标记方法，通过放射性碘131标记血管内皮生长因子VEGF实现，131I标记VEGF抗体通过氯胺-T法进行。具体包括以下步骤：
1)用PB液配置氯胺T溶液和Na2S2O5溶液。取一定量VEGF抗体于EP管，置于4℃冰箱中；依次向EP管中加入一定量Na131I溶液、PB液和氯胺T溶液；立即在电磁搅拌器下搅拌一段时间；迅速加入100μl Na2S2O5溶液终止反应。
2)向Sephadex G50柱中加入一定量PB液平衡柱子，待平衡液全部流入柱中后，加入反应液；待反应液全部流入柱床后，用PB液洗脱，流出液收集于EP管中，收集液逐管在放射性核素活度计内测量。继续用PB液洗脱，直至淋洗流出液在活度计内测量活度接近本底再倒入废液瓶。
3)取一定量反应管内的标记液和131I-VEGF抗体峰产品，采用新华1号层析纸作固定相在生理盐水中展开，在层析纸的原点处用毛细管点样，进行标记率和放化纯的测定。第一峰为131I-VEGF抗体产品峰，第二峰为游离的131I峰。反应管中的标记液用作标记率的测定，标记率＝层析纸中131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率/(131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率+游离131I峰的放射性计数率)×100％。分离纯化的131I-VEGF抗体产品峰洗脱液用作放化纯的测定，放化纯＝层析纸中131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率/(131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率+游离131I峰的放射性计数率)×100％。
在本实施例中，所述步骤1)中的氯胺T溶液及Na2S2O5溶液浓度均为0.5～2g/L。
在本实施例中，所述步骤1)中的所取VEGF抗体浓度为1～5g/L，体积为1～5μl。
在本实施例中，所述步骤1)中的向EP管中加入的Na131I溶液为7.4～22.2M Bq，PB液为50μl(0.05mol/L)，氯胺T溶液为50μl。
在本实施例中，所述步骤1)中的电磁搅拌器搅拌时间为0.5～3min。
在本实施例中，所述步骤1)中的终止液Na2S2O5为30～100μl。
在本实施例中，所述步骤2)中的的加入的PB液为2～4ml。
在本实施例中，所述步骤2)中的洗脱速度为5～15滴/min。
在本实施例中，所述步骤2)中的用EP管收集的流出液体积为0.5ml。
在本实施例中，所述步骤3)中的所取反应管内的标记液和131I-VEGF抗体峰产品量为3～5μl。
下述实施例为梯度验证后最佳标记方案，是为了更详细的解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。
一、I131标记
①标记方法
用0.05mol/L、pH值7.5的PB液配置氯胺T溶液(1g/L)和Na2S2O5溶液(1g/L)。取2μl的VEGF抗体(3g/L)于EP管，置于4℃冰箱中；依次向EP管中加入14.8M Bq的Na131I溶液、50μl0.05mol/L的PB液和50μl氯胺T溶液；立即在电磁搅拌器搅拌下反应1min；迅速加入100μlNa2S2O5(1g/L)溶液终止反应。
②分离纯化
向Sephadex G50柱中加入0.05mol/L pH值7.5的PB液2ml平衡柱子，待平衡液全部流入柱中后，加入反应液；待反应液全部流入柱床后，用0.05mol/L pH值7.5的PB液洗脱，流速为每滴5s；流出液收集于EP管中，每管收集0.5ml。收集液逐管在放射性核素活度计内测量，合并第1个放射性峰位的溶液即为131I-VEGF抗体产品峰，其余溶液倒入废液回收瓶；继续用0.05mol/L、pH值7.5的PB液洗脱，直至淋洗流出液在活度计内测量活度接近本底再倒入废液瓶。
③标记率测定
取反应管内的标记液和131I-VEGF抗体产品峰各3～5μl，采用新华1号层析纸作固定相在生理盐水中展开，在层析纸的原点处用毛细管点样，进行标记率和放化纯的测定。第一峰为131I-VEGF抗体产品峰，第二峰为游离的131I峰。反应管中的标记液用作标记率的测定，标记率＝层析纸中131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率/(131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率+游离131I峰的放射性计数率)×100％。分离纯化的131I-VEGF抗体产品峰洗脱液用作放化纯的测定，放化纯＝层析纸中131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率/(131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率+游离131I峰的放射性计数率)×100％。
二、I131-VEGF抗体在荷瘤小鼠体内的显像
将得到的131I-VEGF抗体从尾注射入胃癌MFC荷瘤小鼠体内，同时设置对照(向正常小鼠尾部注射等量Na131I)，注射后4h用SPECT仪低能高分辨准直器对对照小鼠(图1)及实验小鼠(图2)进行后位显像。
本发明预期可应用于人或小鼠体内肿瘤的标记，后续将对其他器官肿瘤进行标记试验。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，通过放射性碘131标记血管内皮生长因子VEGF实现，131I标记VEGF抗体通过氯胺-T法进行。具体包括以下步骤：
1)用PB液配置氯胺T溶液和Na2S2O5溶液。取一定量VEGF抗体于EP管，置于4℃冰箱中；依次向EP管中加入一定量Na131I溶液、PB液和氯胺T溶液；立即在电磁搅拌器下搅拌一段时间；迅速加入100μl Na2S2O5溶液终止反应。
2)向Sephadex G50柱中加入一定量PB液平衡柱子，待平衡液全部流入柱中后，加入反应液；待反应液全部流入柱床后，用PB液洗脱，流出液收集于EP管中，收集液逐管在放射性核素活度计内测量。继续用PB液洗脱，直至淋洗流出液在活度计内测量活度接近本底再倒入废液瓶。
3)取一定量反应管内的标记液和131I-VEGF抗体峰产品，采用新华1号层析纸作固定相在生理盐水中展开，在层析纸的原点处用毛细管点样，进行标记率和放化纯的测定。第一峰为131I-VEGF抗体产品峰，第二峰为游离的131I峰。反应管中的标记液用作标记率的测定，标记率＝层析纸中131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率/(131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率+游离131I峰的放射性计数率)×100％。分离纯化的131I-VEGF抗体产品峰洗脱液用作放化纯的测定，放化纯＝层析纸中131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率/(131I-VEGF抗体产品峰的放射性计数率+游离131I峰的放射性计数率)×100％。
2.根据权利要求1所述的一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，所述步骤1)中的氯胺T溶液及Na2S2O5溶液浓度均为0.5～2g/L。
3.根据权利要求1所述的一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，所述步骤1)中的所取VEGF抗体浓度为1～5g/L，体积为1～5μl。
4.根据权利要求1所述的一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，所述步骤1)中的向EP管中加入的Na131I溶液为7.4～22.2M Bq，PB液为50μl(0.05mol/L)，氯胺T溶液为50μl。
5.根据权利要求1所述的一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，所述步骤1)中的电磁搅拌器搅拌时间为0.5～3min。
6.根据权利要求1所述的一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，所述步骤1)中的终止液Na2S2O5为30～100μl。
7.根据权利要求1所述的一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，所述步骤2)中的的加入的PB液为2～4ml。
8.根据权利要求1所述的一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，所述步骤2)中的洗脱速度为5～15滴/min。
9.根据权利要求1所述的一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，所述步骤2)中的用EP管收集的流出液体积为0.5ml。
10.根据权利要求1所述的一种新的肿瘤标记方法，其特征在于，所述步骤3)中的所取反应管内的标记液和131I-VEGF抗体峰产品量为3～5μl。
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