CN103330952A - 131I标记抗VEGFR2嵌合Fab及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种131I标记抗VEGFR2嵌合Fab及其应用。131I标记抗VEGFR2嵌合Fab由氯胺-T氧化法制备，具体包括：131I标记抗VEGFR2嵌合Fab、分离纯化131I-FA8H1、测定放化纯和比活度。本发明的131I标记抗VEGFR2嵌合Fab，适用于核素显像诊断肝癌；用131I-FA8H1进行靶向治疗肝癌，131I-FA8H1可有效抑制肿瘤生长，比单独用FA8H1或131I都有明显好的效果；131I-FA8H1促使肿瘤组织大片坏死，诱导肝癌细胞凋亡，并且不长时间抑制外周血wbc而降低机体免疫力的副作用，可见，抗VEGFR2嵌合Fab在制备用于治疗肝癌药物中具有很好的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种131I标记抗VEGFR2嵌合Fab及其应用。
背景技术
原发性肝癌（下简称：肝癌）是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织数据显示，全球每年新增约63万例，死亡人数约60万人，确诊的肝癌患者大多在一年内死亡。我国是世界上肝癌高发地区之一，所发生的肝癌约占全世界所有病例的55%，江苏省南通地区的启东市是我国肝癌高发区。目前对于肝癌的治疗，最有效的是肝癌早期手术，等到患者发现有症状时，肝癌已进入中晚期，常累及多个肝叶，出现侵犯门静脉和转移现象，此时传统的治疗方法，包括全身化疗、放疗、核素治疗，中药治疗，即便是异体肝移植，治疗效果都不尽如人意，寻找安全且更有效的治疗方法成为肝癌治疗研究领域关注的热点。
近年来，抗体靶向治疗肿瘤显示出良好的抗肿瘤效果，由于抗体高度特异靶向识别并结合抗原，单克隆抗体（以下简称为单抗）既可被当作一种治疗药物，也可被用作传递药物的载体。自Paul Ehrlich提出“魔弹”概念， Kohler和Milstein 1975年首次报道单抗的制备后，“魔弹”逐步进入实践运用。利用单抗将药物导向肿瘤细胞是一种理想的途径，为肿瘤治疗提供了新的手段。因鼠源单抗临床应用可产生人抗鼠（human anti-mouse antibody response，HAMA）反应，同时也降低抗体本身的治疗作用，难以在临床推广应用，所以人鼠嵌合抗体、鼠源抗体人源化、全人抗体及小分子抗体的研制成为抗体领域的研发重点。上市的单抗中绝大部分是通过基因工程抗体技术，从鼠单抗演变来的人鼠嵌合抗体。因抗体Fab片段由重链Fd段和完整的轻链组成，是完整抗体分子的三分之一，属于小分子抗体，具穿透力强，半衰期短的优势，所以人鼠嵌合Fab适用于人体疾病的靶向治疗。
最理想的治疗靶点是只针对肿瘤细胞，靶向药物杀死肿瘤细胞的同时又不影响正常细胞的生长，而且在体内不会引起蓄积中毒。目前国内外研究报道显示，以血管为靶向治疗肿瘤具特异、高效、安全的特点，且无针对血管的耐药性，其中以血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）家族的三个亚型（VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3）为靶向治疗肿瘤是一个重要目标。特别是VEGFR2在机体的生理和病理状态下对血管生成起重要作用；在内皮细胞的增殖、迁移、分化，小管腔形成，增进血管通透性和维持血管的完整性中，VEGF信号通路中的VEGFR2可能起到更为重要的作用。有报道在人类多种疾病中，包括肿瘤和老年性黄斑退化症，可出现VEGF和VEGFR2的上调，也有不少报道用抗体阻断血管生成的通路，可以抑制肿瘤生长和转移，所以VEGF或其受体可以作为抗血管生成的理想靶点，VEGF/VEGFR通路被认为是调节血管生成和抗肿瘤的最重要的通路之一。
VEGFR2作为一种细胞膜表面的跨膜蛋白，在多种肿瘤细胞及肿瘤新生血管上高表达，而且在肿瘤发生中起重要作用。近年来，VEGFR2在人类肿瘤中的表达研究日益增多，VEGFR2高表达现象已在非小细胞肺癌、头颈部鳞癌、直肠癌、乳腺癌，膀胱癌和肾癌等多种实体肿瘤组织中被发现，和肿瘤的生长、侵袭、转移等恶性行为关系密切，甚至直接影响到患者的预后。所以VEGFR2成为靶向治疗肿瘤的理想靶点。
肝癌的发生发展和其他肿瘤一样，和新生血管密切相关，而且肝癌组织内富于血管，特别容易出现门静脉侵犯。有文献报道显示，部分肝癌患者的肝癌细胞存在过表达VEGFR2的现象，以VEGFR2为靶点进行治疗肝癌成为可能。
有些抗肝癌药物（包括核素）即便在体外有效，在临床使用则难有好的治疗效果。其中重要的原因是肝癌组织内的血管排列无序无规则，加上肿瘤内部具高压，传统方法使用抗肿瘤药物难以取得好的效果。131I 是一种核素，释放β和γ两种射线，可用于临床诊断和治疗，它对细胞有很强的杀伤力，一般可以穿越50 个细胞，包括癌细胞和健康细胞。早在1953年Pressman就已经报道131I标记抗体的体内脏器定位显像成功；1978 年Goldenberg 报道，131I 标记CEA 抗体可用于诊断结直肠癌。这种以抗体为载体，放射性核素为“弹头”的“生物导弹”，在肿瘤的靶向治疗应用中成为热点。抗体标记放射性核素131I后，可以在尽量减少对健康细胞伤害的前提下，降低核素药物的用量进行靶向治疗，也可以配合肿瘤术后治疗，取得更好的治疗效果。
受江苏省社会科技发展计划项目（BS2007019）和江苏省卫生厅科研项目（H200938）资助，本研究首先制备具高特异性和高亲和力的鼠源抗人VEGFR2单抗，而后用基因工程抗体技术，建立一株保持原鼠抗特性的抗VEGFR2人鼠嵌合Fab；在此基础上，131I标记该嵌合Fab，以VEGFR2为靶点，进行靶向治疗肝癌的研究，探索131I标记抗VEGFR2嵌合Fab治疗肝癌的可能性和可行性。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种131I标记抗VEGFR2嵌合Fab。本发明的另一目的是提供上述131I标记抗VEGFR2嵌合Fab的应用。以期实现为治疗癌症药物的制备提供有效途径。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种131I标记抗VEGFR2嵌合Fab，由氯胺-T氧化法制备，具体包括：
1）100 μg FA8H1加200 μL PB中；同时加60 μL Na131I混和均匀，再加100 μL氧化剂氯胺-T，室温下振荡反应1 min；而后向上述溶液中加200 μL偏焦亚硫酸钠，室温振荡反应5 min；最后加入2 mL 0.2%BSA-PBS，结束标记；
2）分离纯化131I- FA8H1：将上述反应液加入PD-10脱盐柱中，待液体全部流入柱内后持续加入0.2%BSA-PBS冲洗柱子；同时收集流出液体，每10滴收集一管，共收集30管；将收集的30管分别各取5 μL置于一新管中，做好相应标记；在全自动γ计数仪上分别读取各管的γ计数；根据结果判断131I-FA8H1的收集峰管，并计算同位素标记的效率；
3）测定放化纯和比活度：取出装有131I-FA8H1的峰管（5 μL/管），分别加750 μL 0.2%BSA-PBS和750 μL 10%的三氯乙酸（TCA）溶液，充分混匀，可见乳白色沉淀；室温离心，3 000 rpm，10 min；负压吸引器吸尽管中液体，依次测定各管沉淀的γ计数；根据公式计算每个峰管的放化纯，
放化纯% = 沉淀γ计数/相应峰管γ计数×100%
选取放化纯高的峰管合并收集，置于铅盒中4℃保存备用；
根据标记率及放射性活度计算131I-FA8H1的比活度。
所述的131I标记抗VEGFR2嵌合Fab在制备用于治疗肝癌药物中的应用。
本发明用氯胺-T法把核素131I标记抗VEGFR2嵌合Fab（FA8H1），形成131I-FA8H1；分别用FA8H1经流式细胞仪、131I-FA8H1经γ计数仪，检测5株肝癌细胞系的天然VEGFR2表达水平的高低，两方法一致显示BEL-7402肝癌细胞系的VEGFR2表达最高；用BEL-7402肝癌细胞系制备肝癌裸鼠模型，进行131I-FA8H1体内分布实验，注射131I-FA8H1 3天后，血液、内脏组织的%ID/g下降幅度较大，但肿瘤组织仍维持较高的峰值，而且远远高于其他内脏组织和血液中的%ID/g，131I-FA8H1适用于核素显像诊断肝癌；用131I-FA8H1进行靶向治疗肝癌， 131I-FA8H1可有效抑制肿瘤生长，比单独用FA8H1或131I都有明显好的效果； 131I-FA8H1促使肿瘤组织大片坏死，诱导肝癌细胞凋亡，并且不长时间抑制外周血wbc而降低机体免疫力的副作用，说明该抗VEGFR2嵌合Fab可用于靶向治疗肝癌。
有益效果：与现有技术相比，本发明的抗VEGFR2嵌合FAB，适用于核素显像诊断肝癌；用131I-FA8H1进行靶向治疗肝癌， 131I-FA8H1可有效抑制肿瘤生长，比单独用FA8H1或131I都有明显好的效果； 131I-FA8H1促使肿瘤组织大片坏死，诱导肝癌细胞凋亡，并且不长时间抑制外周血wbc而降低机体免疫力的副作用，可见，抗VEGFR2嵌合Fab在制备用于治疗肝癌药物中具有很好的应用。
附图说明
图1是γ计数仪测131I- FA8H1与肝癌细胞特异性结合图；
图2是131I-FA8H1在肝癌模型中的体内分布图；
图3是各组肝癌模型的肿瘤体积变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例所使用的主要材料如下：
肝癌细胞系5株：BEL-7402、QCY-7701、SMMC-7721，HepG2和SK-HEP-1，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
鼠抗人FasL单抗，鼠抗人Caspase-3单抗，购于Abcam。
雄性4周龄BALB/c裸鼠，体重18-20g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，裸鼠饲养于动物隔离器中，并置于无特定病原体屏障环境中。
碘（131I）化钠溶液购于成都中核高通同位素股份有限公司，核纯度≥99.9%。试验操作均符合国家相关的核药品管理、核辐射防护及核废物处理的要求。
注：本专利为CN101643509A和CN101531718A的后续研究，所使用的抗VEGFR2嵌合FAB以及单克隆抗体，均为之前的研究成果，且参照CN101643509A和CN101531718A即可获得。
实施例1
1）FACS：分别培养BEL-7402、QCY-7701、SMMC-7721，HepG2和SK-HEP-1至对数生长期；参照前述方法，通过FACS检测不同肝癌细胞系天然构象VEGFR2表达水平的差异，FA8H1浓度为10 μg/mL。结果显示为：SMMC-7721 （67.21%）、SK-HEP-1 （72.35%）、 HepG2 （80.45%）、QCY-7701 （84.94%），BEL-7402 （93.73%），其中表达天然构象VEGFR2最高为肝癌细胞系BEL-7402。
2）放射性同位素131I标记FA8H1（在专业试验室的通风橱内进行）：
氯胺-T氧化法（Chloramine-T），下述为各试剂用量比例：100 μg FA8H1加200 μL PB（0.2 M, pH 8.0）中；同时加60 μL 约74 MBq Na131I（2.0 mCi）混和均匀，再加100 μL氧化剂氯胺-T（3 mg/mL），室温下振荡反应1 min；而后向上述溶液中加200 μL偏焦亚硫酸钠（5 mg/mL），室温振荡反应5 min；最后加入2 mL 0.2%BSA-PBS，结束标记。
分离纯化131I- FA8H1：将上述反应液加入PD-10脱盐柱中，待液体全部流入柱内后持续加入0.2%BSA-PBS冲洗柱子；同时收集流出液体，每10滴收集一管，共收集30管；将收集的30管分别各取5 μL置于一新管中，做好相应标记；在全自动γ计数仪上分别读取各管的γ计数；根据结果判断131I-FA8H1的收集峰管，并计算同位素标记的效率。
测定放化纯和比活度：取出装有131I-FA8H1的峰管（5 μL/管），分别加750 μL 0.2%BSA-PBS和750 μL 10%的三氯乙酸（TCA）溶液，充分混匀，可见乳白色沉淀。室温离心，3 000 rpm，10 min。负压吸引器吸尽管中液体，依次测定各管沉淀的γ计数。根据公式计算每个峰管的放化纯，
放化纯% = 沉淀γ计数/相应峰管γ计数×100%
选取放化纯高的峰管合并收集，置于铅盒中4℃保存备用。
根据标记率及放射性活度计算131I-FA8H1的比活度。结果显示，131I的FA8H1标记率为95.28%，放化纯＞95%，比活度为1.0-1.5 mci/mg。
3）131I-FA8H1与肝癌细胞膜上天然构象VEGFR2的特异性结合鉴定
培养至对数生长期的BEL-7402、QCY-7701、SMMC-7721，HepG2和SK-HEP-1，分别用pH 7.4 PBS洗细胞一遍；向每个细胞培养瓶中均加入10 mL TrypLE Express细胞分离液（不含胰酶），37℃孵育10 min；用细胞刮将细胞刮落，再加入约20 mL pH 7.4 PBS，转入50 mL的离心管中，2 000 rpm离心，5 min；弃上清，用10 mL pH 7.4 PBS重悬细胞，每株细胞各取出2×106个细胞，2 000 rmp离心5 min后弃上清；
用0.2% BSA-PBS重悬细胞，并将每株细胞各分成两组，2 000 rmp离心5 min后弃上清；一组细胞用500 μL 0.2% BSA-PBS重悬，其中含有10 μg/mL 的131I- FA8H1（标记为specific binding, SB）；另一组细胞和含有10 μg/mL 的131I- FA8H1以及200倍浓度FA8H1的500 μL 0.2% BSA-PBS混和（标记为non-specific binding, NSB），37℃水浴孵育1 h；2 000 rmp离心10 min，弃上清，用洗液PBS洗细胞两遍；彻底吸尽上清后，依次将两组沉淀置于γ计数中计数，本试验重复三次。
γ计数仪测得131I- FA8H1与各肝癌细胞天然构象VEGFR2的结合力，如图1所示，其中BEL-7402肝癌细胞最高，与上述流式细胞术检测结果一致。
4）建立裸鼠肝癌模型
筛出高表达天然构象VEGFR2的肝癌细胞系，并扩大培养至对数生长期，裸鼠右前肢（俯卧位）皮下注射肝癌细胞成瘤，每只裸鼠注射2×107个肝癌细胞 （重悬于100 μL不含血清的DMEM培养基）；成瘤后，根据肿瘤直径和实验需要，将BALB/c裸鼠随机分组。
选取BEL-7402肝癌细胞系，建立高表达天然构象VEGFR2的肝癌模型。约两周后，肿瘤直径达0.3 cm，取48只肝癌裸鼠模型用于131I-FA8H1治疗实验。其余裸鼠大约四周时，肿瘤直径达1.0 cm，取36只用于131I-FA8H1体内分布实验。
5）131I-FA8H1的体内分布
注射131I-FA8H1前，每只裸鼠灌胃2% KI溶液0.2 mL，之后将2% KI溶液加入裸鼠饮水中，使终浓度为0.1%，至本部分实验结束。
取36只肿瘤长至1.0 cm的肝癌裸鼠模型，每只裸鼠通过尾静脉注射10 μCi 131I-FA8H1溶液；留单只注射量的131I-FA8H1为标准源，作对应时间标准放射性活性矫正。
体内分布检测
给药后1 h、6 h、12 h、24 h，48 h和72 h共6个时间点，每时间点取杀裸鼠6只，进行下列步骤：
裸鼠断头放血处死，取鼠血液、肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、脑等内脏组织，称重并用γ计数仪测放射性活性 （counts per minute, CPM）；计算不同时间点每克组织的注射百分数（percentage of injected dose, %ID/g），公式如下：
%ID/g=组织CPM/对照标准源CPM/组织重量（g）×100％
结果如图2所示，注射131I-FA8H1经24 h后，肿瘤%ID/g达到最高峰值，高于其他内脏组织和血液中的%ID/g；72 h后，肿瘤组织的%ID/g仍维持较高的峰值，明显高于脑、心、肝、脾，肺组织和血液中的%ID/g（F=5.33，P＜0.0001）。
6）131I-FA8H1靶向治疗肝癌
通过尾静脉注射131I-FA8H1：取48只肿瘤长至0.3 cm的肝癌裸鼠模型，按前述方法5.1保护裸鼠甲状腺，其中3组分别注射约100、200和300 μCi 131I-FA8H1溶液；另设3对照组单独注射131I（300 μCi）或FA8H1（300 μg）及等体积PBS。
观察治疗作用：治疗前第一周开始，每周测一次所有治疗组的裸鼠外周血白细胞数值，每周一次游标卡尺测肿瘤体积（tumor volume, TV）变化，计算公式为：
TV = a×b×c×π/6 其中a、b、c分别表示肿瘤长径、短径和横径
治疗第8周取杀治疗组裸鼠，取肿瘤组织，测体积并称重，评价治疗效果。
肿瘤组织投入预先配好的10％福尔马林固定液中，固定后制蜡块。
HE和IHC染色：步骤及结果判断同前，IHC中用FasL和Caspase-3为第一抗体。
由图3可见，单用131I或FA8H1可抑制肿瘤体积增大，131I-FA8H1比单用131I或FA8H1抑制肿瘤体积增大效果好；多因素方差分析结果显示，抑制作用有差异（F= 9.88，P ＜0.0001）。
通过测量各组肝癌模型治疗后的平均瘤重，不同的治疗方法，抑制瘤重效果不同（F= 701.45，P＜0.0001），131I-FA8H1剂量增大，抑制瘤重效果明显（F= 17.07，P＜0.0001）。
IHC检测肝癌组织中FasL和Caspase-3的表达，各组肝癌组织FasL和Caspase-3阳性程度的比较；经Kwallis-Wallis秩和检验，不同组别中FasL和Caspase-3表达有差异，131I-FA8H1中的表达比对照组明显高。
Claims (2)
1.一种131I标记抗VEGFR2嵌合Fab，其特征在于，由氯胺-T氧化法制备，具体包括：
1）100 μg FA8H1加200 μL PB中；同时加60 μL Na131I混和均匀，再加100 μL氧化剂氯胺-T，室温下振荡反应1 min；而后向上述溶液中加200 μL偏焦亚硫酸钠，室温振荡反应5 min；最后加入2 mL 0.2%BSA-PBS，结束标记；
2）分离纯化131I- FA8H1：将上述反应液加入PD-10脱盐柱中，待液体全部流入柱内后持续加入0.2%BSA-PBS冲洗柱子；同时收集流出液体，每10滴收集一管，共收集30管；将收集的30管分别各取5 μL置于一新管中，做好相应标记；在全自动γ计数仪上分别读取各管的γ计数；根据结果判断131I-FA8H1的收集峰管，并计算同位素标记的效率；
3）测定放化纯和比活度：取出装有131I-FA8H1的峰管（5 μL/管），分别加750 μL 0.2%BSA-PBS和750 μL 10%的三氯乙酸（TCA）溶液，充分混匀，可见乳白色沉淀；室温离心，3 000 rpm，10 min；负压吸引器吸尽管中液体，依次测定各管沉淀的γ计数；根据公式计算每个峰管的放化纯，
放化纯% = 沉淀γ计数/相应峰管γ计数×100%
选取放化纯高的峰管合并收集，置于铅盒中4℃保存备用；
根据标记率及放射性活度计算131I-FA8H1的比活度。
2.权利要求1所述的131I标记抗VEGFR2嵌合Fab在制备用于治疗肝癌药物中的应用。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160120 Termination date: 20170523 |