CN101443051A - 放射性标记镓复合物、其合成方法及其在恶性肿瘤中egfr表达的pet成像中的应用 - Google Patents

放射性标记镓复合物、其合成方法及其在恶性肿瘤中egfr表达的pet成像中的应用 Download PDF

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Abstract

提供了微波活化法标记合成放射性标记的镓复合物的方法。所得的镓同位素标记的化合物可用作放射性药物，特别用于正电子发射断层显像(PET)。还提供了一种用PET在肿瘤中进行EGFR过量表达成像的方法。

Description

放射性标记镓复合物、其合成方法及其在恶性肿瘤中EGFR表达的PET成像中的应用
发明领域
本发明涉及放射性标记镓复合物及其合成方法。本发明的放射性标记镓复合物可用做放射性药物，尤其是用于正电子发射断层显像(PET)，特别用于检测恶性肿瘤中表皮生长因子受体的表达。
发明背景
表皮生长因子受体(EGFR)，也就是所谓的HER1和ErbB-1，是属于酪氨酸激酶受体家族的跨膜蛋白。激活EGFR将引发导致细胞分裂、运动性增加和凋亡抑制的信号传导((Yarden Y，SliwkowskiMX.Untangling the ErbB signaling network.(ErbB信号网络揭密)，NatRev Mol Cell Biol.2001；2(2)：127-137)。在多种癌症中，EGFR基因的扩增和易位将引起转录增加及随后的EGFR高水平表达(CollinsVP.Amplified genes in human gliomas(人神经胶质瘤中扩增的基因)，Semin Cancer Biol.1993；4(1)：27-32；Bigner SH，Burger PC，Wong AJ，et al.Gene amplification in malignant human gliomas：clinical andhistopathologic aspects(人恶性神经胶质瘤中基因的扩增：临床和组织病理学方面).J Neuropathol Exp Neurol.1988；47(3)：191-205)。EGFR的过量表达已有文献报道，在如乳腺癌中(Walker RA，Dearing SJ.Expression of epidermal growth factor receptor mRNA and protein inprimary breast carcinomas(原发性乳腺癌中表皮生长因子受体mRNA和蛋白的表达).Breast Cancer Res Treat.1999；53(2)：167-176；WittonCJ，Reeves JR，Going JJ，Cooke TG，Bartlett JM.Expression of theHER1-4 family of receptor tyrosine kinases in breast cancer(乳腺癌中受体酪氨酸激酶HER1-4家族的表达).J Pathol.2003；200(3)：290-297)，在肺癌中(Hirsch FR，Varella-Garcia M，Bunn PA，Jr.，et al.Epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung carcinomascorrelation between gene copy number and protein expression and impacton prognosis(非小细胞肺癌中的表皮生长因子受体：基因拷贝数目和蛋白表达的相互关系及对预后的影响)J Clin Oncol.2003；21(20)：3798-3807))和在膀胱癌中(Nea1 DE，Mellon K.Epidermal growth factorreceptor and bladder cancer：a review(表皮生长因子受体和膀胱癌：一篇综述).Urol Int.1992；48(4)：365-371)。高水平表达的表皮生长因子受体通过促进细胞增殖、加快转移速度和降低凋亡为恶性细胞提供生存优势。目前，有多种通过去活化EGFR信号传导抑制肿瘤生长的方法正在临床中应用或正在接受积极评价。这些方法都基于或利用抗EGFR抗体阻断配体与EGFR细胞外域结合，或以选择性酪氨酸激酶抑制剂阻止细胞内信号传导(Castillo L，Etienne-Grimaldi MC，Fischel JL，Formento P，Magne N，Milano G.Pharmacologicalbackground of EGFR targeting(EGFR靶向的药理学背景).Ann Oncol.2004；15(7)：1007-1012)。
已有报道，测定肿瘤中EGFR的表达具有预后和预测价值。已发现，EGFR的过量表达与结肠癌(Resnick MB，Routhier J，Konkin T，Sabo E，Pricolo VE.Epidermal growth factor receptor，c-MET，beta-catenin，and p53 expression as prognostic indicators in stage II coloncancer：a tissue microarray study(表皮生长因子受体、c-MET、β-连环素和p53表达作为II期结肠癌预后指征：一项组织芯片研究).ClinCancer Res.2004；10(9)：3069-3075)，直肠癌(Kopp R，Rothbauer E，Mueller E，Schildberg FW，Jauch KW，Pfeiffer A.Reduced survival ofrectal cancer patients with increased tumor epidermal growth factorreceptor levels(肿瘤表皮因子水平升高的结肠癌患者生存率降低).DisColon Rectum.2003；46(10)：1391-1399)，非小细胞肺癌(Selvaggi G，Novello S，Torri V，et al.Epidermal growth factor receptoroverexpression correlates with a poor prognosis in completely resectednon-small-celllung cancer(完全切除的非细胞癌患者中表皮生长因子受体的过量表达与不良预后有关).Ann Oncol.2004；15(1)：28-32)和乳腺癌(Witton CJ，Reeves JR，Going JJ，Cooke TG，Bartlett JM.Expression of the HER1-4 family of receptor tyrosine kinases in breastcancer(乳腺癌中受体酪氨酸激酶HER1-4家族的表达).J Pathol.2003；200(3)：290-297；Tsutsui S，Kataoka A，Ohno S，Murakami S，Kinoshita J，Hachitanda Y.Prognostic and predictive value of epidermal growth factorreceptor in recurrent breast cancer(表皮生长因子受体在复发乳腺癌中的预后和预测价值).Clin Cancer Res.2002；8(11)：3454-3460)的不良预后和复发有关。已有建议，对晚期鼻咽癌患者进行诱导化疗或放疗后，可根据EGFR表达情况确定具有不良后果的亚群。(Chua DT，Nicholls JM，Sham JS，Au GK.Prognostic value of epidermal growthfactor receptor expression in patients with advanced stage nasopharyngealcarcinoma treated with induction chemotherapy and radiotherapy(晚期鼻咽癌患者诱导化疗或放疗后表皮生长因子受体表达的预后价值).Int JRadiat Oncol Biol Phys.2004；59(1)：11-20)。有证据表明，EGFR的表达与人前列腺癌的复发及发展至雄激素非依赖型有关(Di Lorenzo G，Tortora G，D′Armiento FP，et al.Expression of epidermal growth factorreceptor correlates with disease relapse and progression to androgen-independence in human prostate cancer(EGFR的表达与的人前列腺癌的复发及发展至雄激素非依赖型有关).Clin Cancer Res.2002；8(11)：3438-3444)。很明显，临床实践中EGFR的检测有可能影响对病人的处理，包括使用EGFR靶向药物的相关问题。
用免疫组织化学法或FISH技术，在外科手术样品或细针穿刺样品中测定EGFR是可行的。但核医学可视技术可提供更多优点，因其可评价全部体积的原发肿瘤和转移肿瘤，使其得以避免与采样错误和EGFR表达异质性相关的假阴性结果。
铟-111标记的抗EGFR抗体425被成功应用于检测恶性神经胶质瘤(Dadparvar S，Krishna L，Miyamoto C，et al.Indium-111-labeled anti-EGFr-425 scintigraphy in the detection of malignant gliomas(铟-111标记的抗EGFR抗体425闪烁扫描法检测恶性神经胶质瘤).Cancer.1994；73(3 Suppl)：884-889)。
Tc-99m标记的人源化抗EGFR抗体hR3和C225正处于临床评价中(Vallis KA，Reilly RM，Chen P，et al.A phase I study of 99mTc-hR3(DiaCIM)，a humanized immunoconjugate directed towards the epidermalgrowth factor receptor(99mTc-hR3(DiaCIM)I期临床研究：一种直接针对表皮生长因子受体的人源化免疫偶联物).Nucl Med Commun.2002；23(12)：1155-1164；Schechter NR，Wendt RE，3rd，Yang DJ，et al.Radiation dosimetry of 99mTc-labeled C225 in patients with squamouscell carcinoma of the head and neck(头颈鳞癌患者中99mTc标记C225的辐射剂量).J Nucl Med.2004；45(10)：1683-1687)。但值得注意的是，应用大体积的抗体蛋白可能使放射性缀合物扩散通过健康组织并进入肿瘤变得复杂。抗EGFR抗体的另一选择是应用其天然配体—内皮生长因子(EGF)作为靶向性载体将放射性核素运送至肿瘤细胞(Schechter NR，Wendt RE，3rd，Yang DJ，et al.Radiation dosimetry of99mTc-labeled C225 in patients with squamous cell carcinoma of thehead and neck(头颈鳞癌患者中99mTc标记C225的辐射剂量).J NuclMed.2004；45(10)：1683-1687)。EGF分子量较小，为6.2kDa，能够快速穿透肿瘤并快速从血中清除，这提供了良好的图像对比度。先前，131I标记EGF已成功应用于肺癌的造影(Cuartero-Plaza A，Martinez-Miralles E，Rosell R，Vadell-Nadal C，Farre M，Real FX.Radiolocalization of squamous lung carcinoma with 131I-labeledepidermal growth factor(用131I标记的表皮生长因子放射定位肺鳞癌).Clin Cancer Res.1996；2(1)：13-20)。但放射性卤素在细胞中的不良保留导致肿瘤内聚集减少和不理想的图像对比度，应用放射性金属标记EGF可能是个不错的选择(Orlova A，Bruskin A，Sjostrom A，Lundqvist H，Gedda L，Tolmachev V.Cellular processing of(125)I-and(111)in-labeled epidermal growthfactor(EGF)bound to cultured A431tumor cells(培养A431肿瘤细胞对结合的(125)I-和(111)表皮生长因子(EGF)的处理).Nucl Med Biol.2000；27(8)：827-835)。多种单光子放射金属被推荐用于EGF标记。111In(T1/2＝2，8d)已被用单酰胺DTPA(Orlova A，Bruskin A，Sjostrom A，Lundqvist H，Gedda L，Tolmachev V.Cellular processing of(125)I-and(111)in-labeledepidermal growth factor(EGF)bound to cultured A431 tumor cells(培养A431肿瘤细胞对结合的(125)I-和(111)表皮生长因子(EGF)的处理).Nucl Med Biol.2000；27(8)：827-835；Reilly RM，Gariepy J.Factorsinfluencing the sensitivity of tumor imaging with a receptor-bindingradiopharmaceutical(影响利用受体结合放射药物进行肿瘤造影灵敏度的因素)。J Nucl Med.1998；39(6)：1036-1043)或异硫氰酸-苄基-DTPA(Sundberg AL，Orlova A，Bruskin A，et al.[(111)In]Bz-DTPA-hEGF：Preparation and in vitro characterization of a potential anti-glioblastoma targeting agent([(111)In]Bz-DTPA-hEGF：一种有潜力的抗胶质母细胞瘤靶向药物的制备和体外特征).Cancer BiotherRadiopharm.2003；18(4)：643-654)将其连接到EGF上。MAG3(Hnatowich DJ，Qu T，Chang F，Ley AC，Ladner RC，Rusckowski M.Labeling peptides with technetium-99m using a bifunctional chelator of aN-hydroxysuccinimide ester of mercaptoacetyltriglycine(用双功能螯合剂N羟基琥珀酰亚胺巯基乙酰基三甘氨酸酯，以Tc-99m标记肽).JNucl Med.1998；39(1)：56-64)，引入的-SH(Capala J，Barth RF，BaileyMQ，Fenstermaker RA，Marek MJ，Rhodes BA.Radiolabeling ofepidermal growth factor with 99mTc and in vivo localization followingintracerebral injection into normal and glioma-bearing rats(用99mTc放射性标记表皮生长因子，及其脑内注射正常大鼠和荷神经胶质瘤大鼠后的体内定位).Bioconjug Chem.1997；8(3)：289-295)或HYNIC(Tolmachev，未发表数据)已被用于以发生器产生的9mTc(T1/2＝6h)标记EGF。无论如何，用正电子发射的EGF标记物应该是有益的，因为正电子发射断层扫描(PET)与SPECT比较，在灵敏度，分辨率和定量方面是一种更好的检测技术(Lundqvist H，Lubberink M，TolmachevV.Positron Emission Tomography(正电子发射断层扫描术).EuropeanJournal of Physics.1999；19：537-552；Lundqvist H，Tolmachev V.Targeting peptides and positron emission tomography(靶向肽和正电子发射断层扫描技术).Biopolymers.2002；66(6)：381-392)。
PET成像是一种利用可发射正电子的放射性示踪分子的层析原子能成像技术，当正电子遇到电子时，二者都湮灭，结果以γ射线的形式放出能量，可以被PET扫描器所检测。以机体可利用的天然物质做为示踪分子，PET不仅可以提供机体内有关结构的信息，还提供机体或某区域有关生理功能的信息。常规的示踪剂例如2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)，它与天然产生的葡萄糖相似，加入了一个18F原子。PET扫描器可以检测到所谓正离子发射氟产生的γ射线，并显示FDG在体内某区域或组织的代谢，例如在大脑或心脏中。根据“被扫描的是什么”选择示踪分子。总而言之，选择能够在感兴趣区域聚集，或被某种类型的组织如肿瘤细胞特异性摄取的分子做为示踪剂。扫描包括或动态数列或静止的图片，可以在放射性示踪剂进入感兴趣的生物化学过程的一段时间间隔后扫描获得。PET还是一种定量成像方法，能够测量放射性示踪分子的局部浓度。
在PET示踪剂中常用的放射性核素为11C、18F、5O、13N或76Br。最近生产出了基于放射性标记金属复合物的新PET示踪剂，所述复合物包含双功能螯合剂和放射性金属。双功能螯合剂可与金属离子配位，并连接到一种能与病人体内靶点结合的靶向载体上。这种靶向载体可以是一种肽，能与身体某区域或某疾病相关的某受体结合。靶向载体也可以为一种例如激活癌基因特异的寡核甘酸，因此可以靶向肿瘤定位。这种复合物的优点是双功能螯合剂可以被许多种放射性金属所标记，如68Ga、213Bi或86Y。通过这种方式，可以为某种应用“定制”具有特定性质的放射标记复合物。
尤感兴趣的是，68Ga被用做生产Ga放射性标记金属复合物，在PET成像中被用做示踪分子。68Ga来自68Ge/68Ga发生器，这种手段不必使用回旋加速器。68Ga通过2.92MeV的正电子发射衰变至89％(68Ga decays to 89％ by positron emission of 2.92 MeV)，其半衰期为68min，足以跟踪多种体内生物化学过程，而无需多余的放射性。应用其氧化状态+III，68Ga与各种类型的螯合剂形成稳定的复合物，68Ga示踪剂已被应用到脑、肾、骨、血池、肺和肿瘤成像中。
核素68Ga的较短半衰期与EGF快速的血浆清除是相协调的。利用大环螯合剂衍生物，如DOTA或NOTA，提供了稳定的镓标记的生长抑素类似物和寡肽(Hofmann M，Maecke H，Borner R，et al.Biokinetics and imaging with the somatostatin receptor PET radioligand(68)Ga-DOTATOC：preliminary data(用生长抑素受体PET放射性配体(68)Ga-DOTATOC进行生物动力学和成像：初步数据).Eur J NuclMed.2001；28(12)：1751-1757；Ugur O，Kothari PJ，Finn RD，et al.Ga-66 labeled somatostatin analogue DOTA-DPhe1-Tyr3-octreotide as apotential agent for positron emission tomography imaging and receptormediated internal radiotherapy of somatostatin receptor positivetumors(Ga-66标记的生长抑素类似物DOTA-DPhe1-Tyr3-奥曲肽做为一种潜能药物用于生长抑素受体阳性肿瘤PET成像和受体介导的内放射治疗).Nucl Med Biol.2002；29(2)：147-157；Eisenwiener KP，PrataMI，Buschmann I，et al.NODAGATOC，a new chelator-coupledsomatostatin analogue labeled with[67/68Ga]and[111In]for SPECT，PET，and targeted therapeutic applications of somatostatin receptor(hsst2)expressing tumors(NODAGATOC，一种螯合剂偶联的，[67/68Ga]和[111In]标记的用于SPECT和PET的，和以应用治疗生长抑素受体(hsst2)表达肿瘤为目的的生长抑素类似物，).Bioconjug Chem.2002；13(3)：530-541；Froidevaux S，Eberle AN，Christe M，et al.Neuroendocrine tumor targeting：study of novel gallium-labeledsomatostatin radiopeptides in a rat pancreatic tumor model(靶向神经内分泌瘤：大鼠胰腺肿瘤模型中新型镓标记生长抑素放射性肽的研究).Int J Cancer.2002；98(6)：930-937；Velikyan I，Beyer GJ，Langstrom B.Microwave-supported preparation of(68)Ga bioconjugates with highspecific radioactivity(微波支持制备具有高放射性比活性的(68)Ga生物缀合物).Bioconjug Chem.2004；15(3)：554-560；Velikyan I，Lendvai G，Valila M，et al.Microwave accelerated Ga-68-labelling ofoligonucleotides(微波加速寡肽的Ga-68标记).Journal of LabelledCompounds & Radiopharmaceuticals.2004；47(1)：79-89)。先前的采用无环螯合剂的实验表明，它们结合到EGF并没有降低EGF与受体的结合亲和力。由于这些原因，将DOTA偶联到EGF上可为镓标记提供了一条合适的途径。但，在现有技术中还没有关于如何在肿瘤EGFR过量表达成像中应用这些科学发现的建议或教导。
因此，在医疗团体中对可在肿瘤中检测EGFR过量表达的非侵入性PET示踪剂有着长期需求。这种示踪剂对发展一种高灵敏度的体内非侵入性PET操作是极其有用的。在很多肿瘤中检测EGFR的过量表达可提供重要的诊断信息，这可以影响病人处理。所以，非常需要提供一种基于EGFR天然配体—人重组表皮生长因子(hEGF)的正电子发射示踪剂的生产方法，并在肿瘤EGFR过量表达成像中应用这种示踪剂。
这里讨论或引用的参考文献不应被解释为承认这些文献是本专利的先有技术。
发明概述
本发明提供一种放射性标记的镓复合物标记合成方法，包括：
(a)提供68Ga3+放射性同位素，
(b)所述的68Ga3+与螯合剂在微波活化下发生反应，并且
(c)收集所得的放射性标记的镓复合物。
本发明进一步提供这种放射性标记的镓复合物，做为PET示踪剂。根据本发明，优选的示踪剂为68Ga-DOTA-hEGF。
但在另一实施方案中，本发明还提供一种用于肿瘤内EGFR过量表达成像的方法，包括给予人一种放射性同位素标记的镓复合物，其中的放射性标记的镓复合物能够被PET成像，通过PET程序检测肿瘤细胞内EGFR过量表达。本发明还在另一实施方案中提供一试剂盒，可以用来获得68Ga和能够生产68Ga放射性标记复合物的试剂盒。
附图简述
图1.显示了68Ga-DOTA-EGF结合A431癌细胞系(a)和U343神经胶质瘤细胞系(b)的特异性。在所有时间点，对照组细胞EGF受体可被100倍过量的非标记EGF阻断。这种结合是特异性的，因为结合可以被抑制。提供的数据是三次实验的均值和标准偏差。
图2.显示了68Ga-DOTA-hEGF与培养的A431癌细胞系和U343神经胶质瘤细胞系结合的饱和性。培养的A431癌细胞系和U343神经胶质瘤细胞系与不同浓度68Ga-DOTA-hEGF(对A431细胞0.26-16.9nM和对U343细胞0.14-36nM)在冰上，在加或不加未标记的hEGF情况下孵育2h，以分别获得非特异性结合和总结合。用GraphPad Prism 3.0分析数据，所有数据为至少三次实验的均值，并提供了最大变异(系数)。
图3.68Ga-DOTA-EGF结合A431癌和U343神经胶质瘤细胞后的内化。在两个不同时间点，用酸洗的方法确定68Ga-DOTA-EGF的内化。用酸缓冲液从细胞洗涤去除的放射性活性被认为是膜结合部分68Ga-DOTA-EGF，剩余部分为内化的68Ga-DOTA-EGF。提交的数据为3次实验的均值和标准偏差。
图4.显示了中断A431(实线)和U343(点线)与68Ga-DOTA-EGF孵育后，细胞相关的68Ga放射性活性与时间的函数关系。以中断孵育后0时的细胞相关的放射性活性为100％。所有数据点为3次测定的均值和标准偏差。A431和U343细胞与68Ga-DOTA-hEGF孵育4h。
图5(A)为在荷瘤裸鼠中30min时间点时，以每克组织注射剂量百分数表示的68Ga-DOTA-EGF生物分布。Fig.5(B)在荷瘤裸鼠中30min时间点时，以肿瘤-器官比表示的68Ga-DOTA-EGF生物分布。小鼠静脉注射0.016或0.16nmol的放射性示踪剂，并于30min时处死。数据以均值±SD(n＝4)提交。
图6左)显示框架(frame)20-24(x-注射后30min)的总和。在头部两侧可以清晰看到肿瘤。右)是小鼠体位图。
图7.为68Ga-DOTA-EGF(注射0.16nmol)的药动学曲线，表明快速分布于肝，肾和肿瘤。在观察期间，68Ga-DOTA-EGF连续排泄到尿液中。
发明详述
本发明的一个目的是提供一种可用做放射性药物，特别是用于PET的放射性标记的镓复合物的合成方法。所述放射性标记的镓复合物特别用于检测恶性肿瘤中表皮生长因子受体(EGFR)表达。通过本发明描述的方法可以实现。
68Ga可从68Ge/68Ga发生器获得。这种发生器是该领域所熟知的，例如见C.Loc’h et al，J.Nucl.Med.21，1980，171-173 or J.Schuhmacher et al.Int.J.appl.Radiat.Isotopes32，1981，31-36。68Ge也可用回旋加速器生产，例如通过用以20MeV质子照射Ga2(SO4)3获得。68Ge也可从商业途径获得，例如68Ge 0.5M HCl溶液。通常，将68Ge上样到一根含有有机树脂或无机金属氧化物，如氧化锡、二氧化铝或二氧化钛的柱子中。用HCl水溶液洗脱68Ga产生68GaCl3，根据本发明的方法，特别优选68Ga3+，因为其生产不需要回旋加速器，并且其半衰期为68min，足以通过PET成像跟踪多种体内生物化学过程，而无长时间照射。
用于68Ge/68Ga发生器的合适柱子包含无机氧化物，如二氧化铝、二氧化钛、二氧化锡，或如含有酚羟基(US-A-4264468)或焦酚的有机树脂(J.Schuhmacher et al.，Int.J.appl.Radiat.Isotopes 32，1981，31-36)。在一优选的实施方案中，在本发明的方法中，应用了包含填充有二氧化钛的柱的68Ge/68Ga发生器。
用于从68Ge/88Ga发生器柱中洗脱68Ga的HCl水溶液的浓度依赖于柱子填料。选用合适的0.05到5M HCl洗脱68Ga。在一优选的实施方案中，从包含填充有二氧化钛柱的68Ge/68Ga发生器得到洗脱液，并且用0.05到0.1M HCl，最优为0.1M HCl洗脱得到68Ga。
根据本发明的方法，在一优选的实施方案中，选用了(包含HCO3 -作为反电荷离子的)强阴离子交换剂，并优选包含HCO3 -作为反电荷离子的强阴离子交换剂。在一更加优选的实施方案中，强离子交换剂包含四胺功能基团。在另一更加优选的实施方案中，阴离子交换剂为一种基于聚苯乙烯-二乙烯基苯的强阴离子交换树脂。在一特别优化的实施方案中，本发明方法中所用的阴离子交换剂为包含HCO3 -作为反电荷离子，四胺功能基团的强阴离子交换树脂，并且这种树脂是以聚苯乙烯-二乙烯基苯为基础的。
相应的，根据本发明的方法，用水将68Ga从阴离子交换剂中洗脱。
根据本发明的方法获得的68Ga优先用于生产68Ga放射性标记复合物，优先生产68Ga放射性标记的PET示踪剂，所述示踪剂包含双功能鳌合剂，例如连接到靶向载体的鳌合剂。
所以，本发明另一方面是68Ga放射性标记复合物的生产方法，通过如下方法制备该复合物：
a)68Ga的获得：将从68Ge/68Ga发生器得到的洗脱液与包含HCO3 -作为反电荷离子的离子交换剂接触，然后自所述的阴离子交换剂洗脱68Ga3+得到；和
b)用鳌合剂与68Ga反应。
可用于本发明方法的优选鳌合剂是能以生理学可接受形式递呈68Ga的试剂。进一步优选的鳌合剂是可以和68Ga形成复合物的试剂，所述的复合物在利用该放射性复合物进行诊断研究所需时间内保持稳定。
合适的鳌合剂为，例如，多胺多酸鳌合剂，像DTPA、EDTA、DTPA-BMA、DOA3、DOTA、NOTA、HP-DOA3、TMT或DPDP。这些鳌合剂对放射性药物和放射诊断试剂领域是为人熟知的，其应用和合成例如见以下：US-A-4647447、US-A-5362475、US-A-5534241、US-A-5358704、US-A-5198208、US-A-4963344、EP-A-230893、EP-A-130934、EP-A-606683、EP-A-438206、EP-A-434345、WO-A-97/00087、WO-A-96/40274、WO-A-96/30377、WO-A-96/28420、WO-A-96/16678、WO-A-96/11023、WO-A-95/32741、WO-A-95/27705、WO-A-95/26754、WO-A-95/28967、WO-A-95/28392、WO-A-95/24225、WO-A-95/17920、WO-A-95/15319、WO-A-95/09848、WO-A-94/27644、WO-A-94/22368、WO-A-94/08624、WO-A-93/16375、WO-A-93/06868、WO-A-92/11232、WO-A-92/09884、WO-A-92/08707、WO-A-91/15467、WO-A-91/10669、WO-A-91/10645、WO-A-91/07191、WO-A-91/05762、WO-A-90/12050、WO-A-90/03804、WO-A-89/00052、WO-A-89/00557、WO-A-88/01178、WO-A-86/02841和WO-A-86/02005。
合适的鳌合剂包括大环鳌合剂，例如Zhang et al.，Inorg.Chem.37(5)，1998，956-963描述的卟啉类分子和五氮杂大环、酞菁颜料、冠醚例如氮冠醚如笼状化合物(sepulchrate)、穴状化合物等、氯化血红素(原卟啉IX氯)、亚铁血红素和具有正方形平面对称结构的鳌合剂。
本发明的方法优选应用大环鳌合剂。在一优选的实施方案中，大环鳌合剂至少包含一个硬供电子原子(hard donor atom)如多氮杂大环化合物和多氧大环化合物(polyoxomacrocycle)中氧和/或氮。多氮杂大环鳌合剂的优选实例包括DOTA、NOTA、TRITA、TETA和HETA，最为优选的是DOTA。
特别优选的大环鳌合剂包含非Ga3+配位所必须的功能基团如羧基或氨基，因此可用其将其它分子如靶向载体和鳌合剂偶联起来。这种包含功能基团的大环鳌合剂的实例有DOTA、NOTA、TRITA或HETA。
在一更加优化的实施方案中，根据本发明的方法，使用了双功能鳌合剂。本发明上下文中的“双功能鳌合剂”代表连接到靶向载体上的鳌合剂。可用于本发明的方法中的适合于双功能鳌合剂的靶向载体为化学或生物学分子的某部分moiety)，当给予病人包含上述靶向载体的68Ga放射性标记复合物后，所述的“化学或生物学分子的某部分”可以结合到病人体内的耙点上。可用于在本发明的方法中的，优选的双功能鳌合剂靶向载体为EGFR的天然配体-表皮生长因子(EGF)或其一部分、片段、衍生物或复合物。EGF分子量较小，为6.2kDa，能够快速穿透肿瘤，并快速从血浆清除，提供良好的图像对比度。应用正离子发射标记EGF具有独特优点，因为就灵敏度、分辨率和定量方面而言，PET与SPECT比较是一种更高级的检测技术。特别优选的靶向载体是人重组表皮生长因子(hEGF)或其部分、片段、衍生物或复合物。
在一特别优化的实施方案中，本发明方法中采用了大环双功能鳌合剂。优选的大环双功能鳌合剂包括连接到靶向载体上的DOTA、NOTA、TRITA或HETA，所连接靶向载体优选EGF或其部分、片段、衍生物或复合物，特别优选hEGF或其部分、片段、衍生物或复合物。
靶向载体可以通过连接基团或间隔分子连接到鳌合剂上。连接基团的实例为二硫化物、酯或酰胺。间隔分子的实例为链状分子，如赖氨酸、己胺或基于短肽的间隔分子。在一优选的实施方案中，放射性标记镓复合物的靶向载体和鳌合剂部分之间的连接就是这样的，使得靶向载体能与其体内耙点相互作用，而不会因标记镓复合物的存在被阻挡或掩盖。
本发明的一个优选方面是一种68Ga放射性标记复合物的生产方法，通过
a)将68Ge/68Ga发生器的洗脱液与一种含有以HCO3 -作为反电
荷离子的阴离子交换剂接触，并自上述的阴离子交换剂洗脱68Ga，获得68Ga，和
b)将68Ga与鳌合剂反应，其中用微波活化法进行该反应。
已发现，应用微波活化可显著提高68Ga鳌合剂复合物的形成效率和产率。由于微波活化，化学反应时间可被显著缩短，即反应可在2min或更短时间内完成。这是一项显而易见的改进，因反应缩短10min将节约10％的68Ga放射性活性。还有，微波活化法导致的副反应更少，放射化学产量更高，这归因于选择性的增加。
相应的，优选单峰微波炉用于微波活化。适合的微波活化法在80到120W进行，优选在90到110W，特别优选在100W。适合的微波活化时间从20s到2min，优选从30s到90s，更优选从45s到60s。
当温度敏感鳌合剂，例如包含肽或蛋白做为靶向载体的双功能鳌合剂，被应用于本发明的方法中时，控制反应温度是明智的。应按这样的方式调整微波活化的持续时间，即反应混合物的温度不应导致鳌合剂和/或靶向载体的分解。如本发明的方法应用的鳌合剂包含肽或蛋白，选用较高的温度和较短时间一般优于选用较低温度和较长反应时间。
在反应过程中，微波活化可以连续进行，或在几个活化周期中进行。
本发明另一方面提供从68Ge/68Ga发生器获得68Ga的试剂盒，包含发生器柱和另一个包含阴离子交换剂(含HCO3 -作为反电荷离子)的柱子。
在一优选的实施方案中，该试剂盒进一步包括将柱子串连的方法和/或利用HCl水溶液从发生器柱洗脱68Ga的方法和/或利用水从阴离子交换柱子洗脱68Ga的方法。HCl和水优选无菌的和封在牢牢密封的容器中。
在另一优选的实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括鳌合剂，优选双功能鳌合剂，例如连接到靶向载体上的鳌合剂。
本发明进一步提供这样的放射性标记的镓复合物作为PET示踪剂。根据本发明，优选的示踪剂为68Ga-DOTA-hEGF。
还在另一实施方案中，本发明还提供一种肿瘤内EGFR过量表达成像的方法，包括给人一种放射性标记镓复合物，其中的放射性标记镓复合物可以被正电子发射断层显像技术成像，通过正电子发射断层显像过程检测肿瘤中的EGFR过量表达。
实施例
本发明通过下述的实施例做进一步说明，绝非用来限制本发明的范围。
实施例1-68Ga-DOTA-hEGF制备的化学和放射化学
1.材料
重组的人表皮生长因子(hEGF)购自Chemicon(Temecul，CA，USA)。醋酸钠(99.995％)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、双蒸盐酸(doubly distilled hydrochloric acid)(Riedel de 
Figure A200680005643D0019152444QIETU
)来自Sigma-Aldrich Sweden(Stockholm，Sweden)。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和三氟乙酸(TFA)来自Merck(Darmstadt，Germany)。DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)的N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯购自Macrocyclics(Dallas，TX，USA)。购买的化学品不进行再次纯化直接应用。重蒸水(18.2MΩ)，产自Purelab Maxima Elga system(Bucks，the UK)，用于所有反应。68Ga来自68Ge/68Ga发生器(Cyclotron C.，Obninsk，Russia)。
II.HPLC分析
在Beckman(Fullerton，CA，USA)HPLC系统上进行分析型液相(LC)操作，包括126泵，166UV检测器和串连耦合的放射性检测器。用Beckman System Gold Nouveau Chromatography软件包对数据进行收集和处理。柱子采用Vydac RP 300
Figure A200680005643D0019152516QIETU
 HPLC柱(Vydac，USA)，尺寸150mm×4.6mm，5μm粒径。应用的梯度洗脱参数如下：A＝10mM TFA；B＝70％乙腈(MeCN)，30％ H2O，10mM TFA，UV 220nm检测；流速1.2mL/min；0-2min等度20％ B，20-90％B线性梯度8min，90-20％ B线性梯度2min。68Ga-DOTA-hEGF和放射性杂质在柱上的残留量可以通过晶体闪烁计数器测定进入柱样品和出口流分的放射性活性而得知，在该系统上的总损失为10％。68Ga-DOTA-hEGF和亲水放射性杂质测定的放射性活性与HPLC图谱获得的各自数值是一致的。亲水放射性杂质和68Ga-DOTA-hEGF相应的标准偏差分别为7％和0.5％。
III.68Ga-DOTA-hEGF的制备
在搅动下，将0.08M硼酸盐缓冲液中的hEGF(32-70纳摩尔，80-180μL)加入到干燥的DOTA N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(10-20倍过量)中，通过加入硼酸盐缓冲液(240-340μL)进一步调整pH至9.0。混合物置室温3-4小时或过夜。用Bio-select RP C18C-18SPE柱(Vydac)纯化得到缀合物。将反应混合物缓慢通过提取盘，然后用2ml 0.1％ TFA洗涤。产物洗脱到1ml含0.1％TFA的70％乙腈中。用真空离心机于50℃运转挥干溶剂(Labconco CentriVap Console，Kansas City，Missouri，USA)，干燥的纯化产物保存在0℃以下。
如先前所描述(Velikyan I，Beyer GJ，Langstrom B.Microwave-supported preparation of(68)Ga bioconjugates with high specificradioactivity(微波支持制备具有高放射性比活性的(68)Ga生物缀合物).Bioconjug Chem.2004；15(3)：554-560)，用非浓缩或预浓缩的68Ga洗脱液对缀合物进行标记。在某些情况下，对两个发生器的洗脱液进行预先浓缩以增加标记反应中68Ga的应用量。标记反应中，当采用非浓缩和预浓缩的68Ga洗脱液时，DOTA-hEGF的应用量分别为6-10和2-5纳摩尔。当使用非浓缩68Ga洗脱液标记时，选用pH 5.0-5.5的乙酸钠缓冲溶液；当使用预浓缩的68Ga洗脱液标记时，选用pH 4.6-4.8的HEPES缓冲溶液。微波加热1min进行标记。如上所述，在Bio-select RP C18 C-18SPE柱上纯化产物。然后在NAP-5柱(Sephadex G-25；Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)上将溶剂转换为PBS(磷酸缓冲液)。用HPLC评价缀合物的纯度，以UV-HPLC标准曲线确定缀合物和示踪剂的浓度。
为确定68Ga结合hEGF是由DOTA介导的，还进行了一个空白实验，操作与上述一致，但采用非缀合的hEGF。
用同样的方法，天然同位素成分69，71Ga也可与DOTA-hEGF形成复合物。用LC-ESI-MS描绘69，71Ga-DOTA-hEGF的特征，以鉴定放射HPLC图谱信号。
IV.微波加热和LC-ESI-MS分析
在可产生2450MHz连续照射的SmithCreatorTM单峰微波腔(Personal Chemistry AB，Uppsala，Sweden)中进行微波加热。在反应过程中监控温度、压力和照射功率。完成照射后，以增压空气冷却反应管。
用Waters Micromass Quattro Premier质谱仪(Micromass，UK)和带二极管阵列紫外检测器的Alliance(Waters 269，UK)HPLC系统进行液相色谱-电喷雾质谱分析(LC-ESI-MS)。采用的柱子为Antlantis，dC 18，RP HPLC柱，尺寸为100mm×2.1mm，3μm粒径。等度洗脱参数为：A＝10mM甲酸；B＝100％乙腈(MeCN)，UV-检测波长210-400nm；流速为0.3mL/min。LC-ESI-MS在正电荷模式扫描和选择性离子检测(SIR)下进行，检测的离子为[M+6H]6+、[M+7H]7+和[M+8H]8+。hEGF可在m/z＝781.5检测到其[M+8H]8+峰，在m/z＝893为其[M+7H]7+峰，在z＝1042为其[M+6H]6+峰，这些数据复原得到M＝6244.67±1.15。(DOTA)1-hEGF可在m/z＝829.75检测到其[M+8H]8+峰，在m/z＝948.13为其[M+7H]7+峰和在m/z＝1105为其[M+6H]6+峰，这些数据复原得到M＝6629.95±0.05。(DOTA)2-hEGF可在m/z＝878检测到其[M+8H]8+峰，m/z＝1003.3为其[M+7H]7+峰和在m/z＝1170.36为其[M+6H]6+，这些数据复原得到M＝7016±0.08。(DOTA)3-hEGF可在m/z＝926.29检测到其[M+8H]8+峰，在m/z＝1058.47为其[M+7H]7+峰和在m/z＝1234.72为其[M+6H]6+，这些数据复原得到M＝7402±0.1。(Ga-DOTA)1-hEGF在m/z＝838.5可检测到其[M+8H]8+峰，在m/z＝958.13为其[M+7H]7+峰和在m/z＝1117.66为其[M+6H]6+峰，这些数据复原得到M＝6699.95±0.05。(Ga-DOTA)2-hEGF可在m/z＝896.05检测到其[M+8H]8+峰，在m/z＝1023.3为其[M+7H]7+峰和m/z＝1193.69为其[M+6H]6+峰，这些数据复原得到M＝7157.55±2.47。(Ga-DOTA)3-hEGF在m/z＝952.54检测到其[M+8H]8+峰，在m/z＝1088.47为其[M+7H]7+峰和m/z＝1269.72为其[M+6H]6+峰，这些数据复原得到M＝7612.31±0.05。
V.结果
通过两步法合成了68Ga-DOTA-hEGF，其中hEGF先连接到双功能螯合剂-DOTA上，然后用通过68Ga与螯合剂的配位反应将68Ga标记到DOTA-hEGF上。在连接这一步骤，DOTA螯合剂的一个羧基偶联到肽的胺官能团上，形成酰胺键(方案1)。结合反应所需的碱性pH由硼酸盐缓冲液提供。hEGF含有一个末端胺基和两个赖氨酸氨基基团，因此如LC-ESI-MS分析所确定的，hEGF连接反应结果生成分子与1个、2个或3个DOTA片段的混合物。
用非浓缩或预浓缩的发生器68Ga洗脱液进行微波加速的缀合物标记(方案1)。在使用非浓缩缀合物的情况下，标记效率为60±10％(N＝3)；使用预浓缩缀合物可提高到77±4％(N＝3)。洗脱液的预浓缩获得的放射性比活性为28MBq/nmol。68Ga连接到hEGF是由DOTA介导的，因为同样处理非缀合的hEGF，并未产生任何标记肽。本研究的示踪剂的放射化学纯度高于99％。已证明该示踪剂在PBS中稳定，在稳定性分析的4小时内，无其它放射性HPLC信号。
Figure A200680005643D00221
方案1
实施例2-细胞结合和保留实验
I.细胞培养
在所有细胞实验中使用的是人鳞癌细胞系A431(ATCC，CLR1555，Rocksville，MI)，USA)和恶性神经胶质瘤细胞系U343MGaCl2:6(Westermark B，Magnusson A，Heldin CH.Effect of epidermal growthfactor on membrane motility and cell locomotion in cultures of humanclonal glioma cells(表皮生长因子对培养的人克隆神经胶质细胞膜运动性和细胞移动的作用).J Neurosci Res.1982；8(2-3)：491-507)(从现在开始称为U343)。据报道，A431细胞系每细胞表达约2×106EGFR，而U343细胞系每细胞表达5.5×105EGFR。细胞培养在Ham′s F10培养基(Biochrom Kg)中，补充以10％胎牛血清(Sigma)、L-谷氨酰胺(2mM)和PEST(青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml)，后二者都来自Biochrom Kg。在细胞培养和细胞实验中(除非另作说明)，细胞生长在含有潮湿空气的，以5％ CO2平衡的，37℃培养箱中。用Biochrom Kg的胰蛋白酶-EDTA(0.25％胰蛋白酶，无Ca和Mg的0.02％ EDTA PBS溶液)消化细胞。
II.68Ga-DOTA-EGF与细胞的结合
在3cm培养皿中培养A431和U343细胞(分别约3.5×105和1.9×105/培养皿)。将细胞洗涤一次，加入溶于细胞培养基中的68Ga-DOTA-EGF(对A431细胞而言为35ng/培养皿、50kBq/培养皿，对U343细胞而言为5ng/培养皿、20kBq/培养皿)。加入的示踪剂的浓度对A431细胞而言为0.26-16.9nM，对U343细胞而言为0.14-36nM。对某些培养皿，将摩尔浓度过量的EGF(5或3μg/培养皿)和标记缀合物一起加入，以评估细胞对68Ga-DOTA-EGF缀合物结合的特异性。于37℃孵育0.5-6h后，用冰冷的无血清培养基洗涤细胞6次，用0.5ml胰蛋白酶-EDTA(15min，37℃)收集细胞，加入1ml细胞培养基中止胰蛋白酶消化，部分细胞悬浮液(0.5ml)用于细胞计数，而另外剩余部分在γ计数器上测量。
为评估细胞对68Ga-DOTA-EGF缀合物的内化作用，在结合实验中使用了许多额外的细胞培养皿，以将缀合物的细胞膜结合部分与内化部分的放射性活性分离开来。不用胰蛋白酶消化细胞，而代替以0.5ml冰冷0.1M甘氨酸-HCl缓冲溶液，pH 2.5，于0℃处理6min，该处理方法用以提取缀合物膜结合部分。另以0.5ml 0.1M甘氨酸-HCl缓冲溶液洗涤细胞1次，剩余的放射性活性可认为是内化的放射性活性，可用0.5ml 1M NaOH溶液于37℃处理约60min加以收集，另以0.5ml NaOH洗涤一次，收集的组分在自动γ计数器上测量。
在饱和实验中，为确定结合所需要的时间，还研究了在冰上68Ga-DOTA-EGF与A431细胞和U343细胞的结合作用。细胞培养皿在冰上与冰冷的68Ga-DOTA-EGF溶液孵育0.5-4h，洗涤细胞，胰蛋白酶消化，如上述计数。
III.细胞放射性活性的保留，饱和分析和动物肿瘤模型
在细胞与68Ga-DOTA-EGF孵育1h后研究细胞对放射性活性的保留。孵育后，细胞充分洗涤以除去未结合的缀合物，然后在新鲜细胞培养基中继续孵育。0.5-4h后，如上所述，用胰蛋白酶消化细胞，进行细胞计数和放射性活性测定。
在一项68Ga-DOTA-EGF与A431细胞和U343细胞结合饱和实验中，测定其平衡解离常数Kd。将培养在24孔培养皿中的细胞(约3.1×104A431细胞/每孔和7.8×104U343细胞/每孔)置于冰上，加入冰冷的不同浓度的68Ga-DOTA-EGF溶液(对A431而言为0.26-16.9nM和对U343而言为0.14-36nM)。对每一浓度，在某些孔中加入100倍过量的非标记EGF研究其非特异性本底结合。孵育2h后(该时间是根据冰上摄取实验底结果确定的)，细胞用冰冷的无血清培养基洗涤6次。然后用0.5ml胰蛋白酶-EDTA(15min at 37℃)消化细胞，进行细胞计数和用γ计数器测量放射性活性。
在成年雌性Balb/c无胸腺荷移植瘤鼠(
Figure A200680005643D0024152938QIETU
，Denmark)上进行体内实验。所有动物处理都根据瑞典动物福利局的指导原则，并且实验得到动物研究伦理委员会的批准。在小鼠两前肢皮下注射A431肿瘤细胞(约700万细胞于100μl细胞培养基中/每肿瘤)，在实验开展前，使肿瘤生长12-13天，达到0.1-0.8克。IV.结果
68Ga-DOTA-EGF与EGFR表达细胞系体外结合特异性见图1。在细胞实验中采用了已报道的可表达EGFR的宫颈癌A431细胞系和神经胶质瘤U343细胞系。为证明这种结合是受体特异性的，在对照实验组细胞中加入了大量非标记EGF，以饱和EGFR。结合特异性实验的结果证明在所有测定的数据点上，68Ga-DOTA-EGF与两细胞系的结合可被受体饱和所阻断，这提示标记缀合物与细胞的的结合是受体特异性的。
68Ga-DOTA-EGF对宫颈癌A431细胞系和神经胶质瘤U343细胞系的饱和实验的结果分别见图2A和2B。以amol/细胞(纵轴)对加入的放射性标记缀合物总摩尔浓度(横轴)绘制特异性结合图，用GraphPad Prism软件对结果进行非线性回归分析。两条曲线似乎都达到了最大值，提示已经饱和。得到的Kd值具有极好的一致性：A431细胞为2.0，U343细胞为2.3。U343细胞每细胞最大结合位点数目为7.8 x 105，这与先前用[111In]-Bz-DTPA-EGF缀合物(22)的测定结果5.4 x 105吻合的相当好。A431的结合位点数目为每细胞190万，也与文献数据一致。
在本研究中，用酸洗的方法评估缀合物的内化程度。用酸缓冲液洗涤除去的放射性活性被认为是膜结合部分，其余为内化部分。本实验的结果见图3，表明68Ga-DOTA-EGF在两细胞系中的内化是一快速过程。但，这些实验结果提示，神经胶质瘤U343细胞的内化速度较A431更快。这可能是归因于已报道的A431细胞将内化受体循环至细胞表面的能力。就神经胶质瘤U343细胞而言，孵育30min后，多于50％的放射性活性被内化。
中断68Ga-DOTA-EGF与A431和U343孵育后，两种细胞对放射性活性的保留模式是相似的(图4)。开始时放射性活性降低，最可能归因于于细胞膜结合的缀合物分离，然后是相对恒定量的细胞结合68Ga。中断孵育后，两种细胞系都表现出良好的保留性，其中4h内，细胞相关的放射性高于70％，而4h比标记物的3个半衰期还长。
实施例3-生物分布研究
I.在荷A431移植瘤小鼠中的生物分布
为评价缀合物注射量对肿瘤和正常组织摄取的影响，进行了一项生物分布研究。对荷A431移植瘤小鼠静脉注射50μl 68Ga-DOTA-EGF溶液(0.16nmol或0.016nmol PBS溶液/每鼠)，注射后30min，处死动物，解剖。按0.2ml每10g体重腹腔注射Rompun(1mg/ml)和Ketalar(10mg/ml)混合液麻醉小鼠，并通过心脏穿刺处死。除肿瘤外，还收集血、心脏、胰腺、脾、胃、肝、肾、肺、小肠和大肠、肌肉、骨、唾液腺，组织称重，并用自动γ计数器测量放射性活性。还测定尾巴的放射性活性含量，以确定准确的注射剂量。器官数值以每克组织注射放射性活性的百分数表示(％IA/g)。
II.结果
68Ga-DOTA-EGF在荷A431瘤小鼠中生物分布的有关总结见图5。i.v.给药68Ga-DOTA-EGF后30min，器官放射性的测定表明，两种浓度的缀合物都在肾和肝数值最高。在胰腺、唾液腺、小肠和大肠、胃和脾的放射性活性较低。注射0.016和0.16nmol68Ga-DOTA-EGF后，A431移植瘤的摄取率分别为1.51±0.16％IA/g和2.69±0.29％IA/g(p＝0.036)。放射性示踪剂具有较快的血浆清除率，两种浓度的缀合物注射后30min，体液循环中剩余小于1％IA/g(无显著性差异)。当较大剂量的缀合物给药后，胰腺、脾和胃对放射性活性的摄取在统计学上显著性降低。当考虑以肿瘤-普通器官比表示时，缀合物剂量的增加对摄取的影响更加显著。尽管注射0.016和0.16nmol缀合物后，肿瘤-血液比分别为4.42±1.81％IA/g和4.50±2.53％IA/g，并无显著性差异，但0.16nmol缀合物注射后，对心脏、胰腺、胃、脾、肺、肠、肌肉和唾液腺而言，肿瘤-器官比显著性升高。
实施例4-微PET成像
在附有电脑可控床和横向10cm轴向8cm视野(FOV)的微PETR4扫描仪(Concorde Microsystems，Inc.)上进行成像。它专用于以三维列表模式运转，并且无环间隔板。首先将所有原始数据分类列到三维正弦图中，继以傅立叶重组分装和二维滤波背投图象重建，得到2mm分辨率的图片。在实验开始前，将小鼠带至实验室。在红灯下加热一段较短时间后，将动物放入一连接异氟烷气化室的圆筒中，调整异氟烷气化室使其输送包含在45/55％氧气和空气混合物中的2％的异氟烷。当动物进入无意识状态后，将一肝素化的静脉插管安置入鼠尾静脉中，并连接含有0.9％ NaCl和10IU肝素的1ml注射器。然后将动物放置在照相机床上，腹部朝下，其附肿瘤前肢尽可能向外前伸展，远离身体，覆盖以Saran包装膜以降低热量和水分损失。向动物吹送热空气(40°C)以减少实验过程中的身体温度损失。在照相机开始工作后，将100μl示踪剂推注入小鼠体内，再注射100μl生理盐水。实验完毕，将动物在麻醉状态下断头处死，收集血液、肝和肾样品用以放射性测定。
散射校正、随机计数和死时间校正法都整合到重建算法中。示踪剂注射前用两个含有68Ge/68Ga的旋转棒源测量每只动物的放射衰减，并对图象进行放射衰减校正。所有PET研究都开始于20min的透射扫描。小鼠注射的放射性活性为2.0±0.5MBq。在本研究中采用两种成像方案。收集时间如下：方案1(持续时间120min)10 x 30s，5 x 120s和5 x 300s，8 x 600s；方案2(持续时间30min)10 x 30s，5 x 60s，10 x 120s。感兴趣区域(ROI)划定在肝、肾、膀胱、唾液腺和肿瘤。相应的测定了其药动学曲线，药动学曲线再现了放射性活性浓度(每克组织注射总量百分数)对时间的关系。摄取指数计算为器官中活性[kBq/mL]/注射总剂量[kBq] x 100％。
用PET成像确定68Ga-DOTA-EGF在荷瘤鼠中的定位(图6)，继以在断头处死动物后，测定收集的血、肝、肾样品的放射性活性。荷瘤小鼠给药2.0MBq68Ga-DOTA-EGF(放射性比活性为12-20MBq/nmol)30min后，成像见图6左。微PET成像的评价结果与血、肝、肾样品测定的放射性活性相关。左前肢和右前肢肿瘤都可见较附近背景清晰的对比度。肝脏和肾有显著摄取，放射性活性很明显从膀胱消除(图7)。肿瘤和唾液腺分布较慢。来自微PET和生物分布的摄取数据具有一致性，并与成像后组织采集样品的数据相当。
详细实施方案，引用文献
本发明并不仅限于这里描述的详细实施方案。事实上，除了这里描述的外，根据前述说明和附图，对本发明进行各种修改对本领域技术人员是显而易见的。这种修改将落入所附的权利要求范围内。
本文引用了各种出版物和专利，其公开内容通过引用整体并入本文。

Claims (17)

1.一种放射性标记的镓复合物的标记合成方法，包括：
(a)提供68Ga3+放射性同位素，
(b)用微波活化法将所述的68Ga3+放射性同位素与鳌合剂反应，和
(c)收集所得的放射性标记的镓复合物。
2.权利要求1的方法，其中所述鳌合剂为大环鳌合剂。
3.权利要求1的方法，其中所述鳌合剂包括硬供电子原子，优选O和N原子。
4.权利要求1的方法，其中所述鳌合剂为双功能鳌合剂。
5.权利要求1的方法，其中所述鳌合剂为包含靶向载体的双功能鳌合剂。
6.权利要求5的方法，其中所述靶向载体为EGF，或其部分、片段、衍生物或复合物。
7.权利要求6的方法，其中所述EGF为hEGF。
8.权利要求1的方法，其中所述微波活化在80到120W，优选90到110W实施。
9.权利要求1的方法，其中所述微波活化实施20s到2min，优选30s到90s。
10.权利要求1的方法，其中所述68Ga3+是通过将68Ge/68Ga发生器的洗脱液与阴离子交换剂接触，并自所述的阴离子交换剂洗脱68Ga3+得到的。
11.权利要求10的方法，其中所述68Ge/68Ga发生器包含填充有二氧化钛的柱子。
12.权利要求11的方法，其中所述阴离子交换剂包含HCO3 -作为反电荷离子。
13.权利要求10的方法，其中所述阴离子交换剂为强阴离子交换剂。
14.一种根据权利要求1的方法合成的放射性标记镓复合物。
15.权利要求14的放射性标记镓复合物，其式为68Ga-DOTA-hEGF。
16.一种肿瘤内EGFR过量表达的成像方法，所述方法包括给予人放射性标记的镓复合物，其中所述放射性标记镓复合物能够用PET成像，通过PET检测肿瘤内EGFR的过量表达。
17.权利要求16的方法，其中所述放射性标记的镓复合物为68Ga-DOTA-hEGF。
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